Summary
DNA curtain 是一种高通量单分子成像技术，为实时可视化各种蛋白质-DNA 相互作用提供了一个平台。本方案利用DNA帘技术研究了含有裂 殖酵 母的溴结构域AAA+ ATP酶Abo1的生物学作用和分子机制。
Abstract
染色质是包装真核 DNA 的高级结构。染色质根据细胞周期阶段和响应环境刺激而发生动态变化。这些变化对于基因组完整性、表观遗传调控和 DNA 代谢反应（如复制、转录和修复）至关重要。染色质组装对染色质动力学至关重要，并由组蛋白伴侣催化。尽管进行了广泛的研究，但组蛋白伴侣使染色质组装的机制仍然难以捉摸。此外，对组蛋白伴侣组织的核小体的全局特征知之甚少。为了解决这些问题，本文描述了一种独特的单分子成像技术，称为DNA帘，该技术有助于研究组蛋白伴侣对核小体组装的分子细节。DNA 幕是一种混合技术，它结合了脂质流动性、微流体和全内反射荧光显微镜 （TIRFM），为各种蛋白质-DNA 相互作用的实时成像提供了一个通用平台。利用DNA帷幕，研究了含有AAA+ ATP酶的 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe bromodomain containing AAA+ ATPase）Abo1的组蛋白伴侣功能，并揭示了Abo1组蛋白组装的分子机制。DNA帷幕为研究染色质动力学提供了一种独特的方法。
Introduction
真核 DNA 被包装成称为染色质 1,2 的高级结构。核小体是染色质的基本单位，染色质由大约 147 bp 的 DNA 包裹在八聚体核心组蛋白周围 3,4 组成。染色质在真核细胞中起着关键作用;例如，紧凑的结构可保护 DNA 免受内源性因素和外源性威胁的影响 5。染色质结构根据细胞周期阶段和环境刺激而动态变化，这些变化控制 DNA 交易（如复制、转录和修复）过程中的蛋白质获取6。染色质动力学对于基因组稳定性和表观遗传信息也很重要。
染色质受多种因素的动态调控，包括组蛋白尾部修饰和染色质组织者，如染色质重塑因子、多梳基团蛋白和组蛋白伴侣7。组蛋白伴侣通过核心组蛋白的沉积或分离来协调核小体的组装和拆卸 8,9。组蛋白伴侣的缺陷诱导基因组不稳定并导致发育障碍和癌症 9,10。各种组蛋白伴侣不需要像 ATP 水解那样消耗化学能来组装或拆卸核小体9、11、12、13。最近，研究人员报告说，含有溴结构域的 AAA+（与多种细胞活动相关的 ATP 酶）ATP 酶作为组蛋白伴侣在染色质动力学中发挥作用 14,15,16,17。人 ATAD2（ATP 酶家族 AAA 结构域蛋白 2）促进染色质可及性以增强基因表达18。ATAD2 作为转录辅助调节因子，调节致癌转录因子14 的染色质，ATAD2 的过表达与许多类型癌症的不良预后有关19。Yta7 是 ATAD2 的酿酒酵母 （S. cerevisiae） 同源物，可降低染色质15 中的核小体密度。相反，ATAD2 的裂殖酵母 （S. pombe） 同源物 Abo1 增加了核小体密度16。使用独特的单分子成像技术，DNA幕，Abo1是否有助于核小体组装或分解，已得到解决17,20。
传统上，生物分子的生化性质是通过大量实验来检查的，例如电泳迁移率位移测定 （EMSA） 或免疫共沉淀 （co-IP），其中探测了大量分子，并表征了它们的平均性质21,22。在批量实验中，分子亚态被集成平均效应所掩盖，并且探测生物分子相互作用受到限制。相比之下，单分子技术规避了批量实验的局限性，并能够详细表征生物分子相互作用。特别是，单分子成像技术已被广泛用于研究DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用23。其中一种技术是 DNA 帷幕，这是一种基于微流体和全内反射荧光显微镜 （TIRFM） 的独特单分子成像技术24,25。在 DNA 幕中，数百个单独的 DNA 分子锚定在脂质双层上，由于脂质流动性，允许 DNA 分子进行二维运动。当施加流体动力流时，DNA分子沿着双层上的流动移动并卡在扩散屏障处，在那里它们被对齐和拉伸。当DNA用嵌入剂染色时，注入荧光标记的蛋白质，TIRFM用于在单分子水平23上实时可视化蛋白质-DNA相互作用。DNA幕平台有助于观察蛋白质运动，如扩散、易位和碰撞26,27,28。此外，DNA帷幕可用于DNA上具有明确位置、取向和拓扑结构的蛋白质图谱，或应用于蛋白质和核酸的相分离研究29,30,31。
在这项工作中，DNA幕技术用于通过对特定蛋白质的直接可视化来为伴侣的功能提供证据。此外，由于DNA幕是一个高通量平台，它有助于在一定程度上收集数据，足以达到统计可靠性。本文详细描述了如何进行DNA幕式测定，以研究含有 A.pombe 溴结构域的AAA+ ATPase Abo1的分子作用。
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Protocol
1. 流通池的制备
- 按照先前发布的报告25准备一个清洁的熔融石英载玻片，其中包含纳米沟槽图案。
- 使用金刚石涂层钻头在清洁的熔融石英载玻片（图 1A）中钻两个直径为 1 mm 的孔（参见 材料表）。
- 使用直流溅射32 （参见 材料表）和 10 mTorr 氩气在载玻片上沉积 250 nm 厚铝 （Al）。
- 在4,000rpm下旋涂310nm厚的4%950K聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）（参见 材料表）1分钟，然后在180°C的热板上烘烤3分钟。
- 使用电子束（ebeam）光刻33 在两个孔之间的PMMA层上绘制纳米沟槽图案，在80 kV时电流为0.724 nA。
注：纳米沟槽图案的结构和尺寸如 图1A所示。 - 通过将载玻片浸泡在显影溶液（甲基异丁基酮和异丙醇的1：3比例，参见 材料表）中2分钟，除去暴露的电子束PMMA。
- 使用氯 （Cl2） 和三氯化硼 （BCl 3） 气体进行电感耦合等离子体离子蚀刻 （ICP-RIE） 的蚀刻 Al 层。
注意：这两种气体可以从电子束暴露区域去除铝。 - 使用四氟化硫 （SF4）、四氟甲烷 （CF4） 和氧气 （O2） 气体在载玻片上雕刻纳米沟槽（参见 材料表）。
- 通过将载玻片浸泡在铝蚀刻剂（AZ 300 MIF显影剂，参见 材料表）中10分钟来去除剩余的Al层。
- 制备后，用去离子水冲洗载玻片，并使用浴式超声仪在丙酮中超声处理30分钟。
- 用磁力搅拌在2%Hellmanex III溶液（见 材料表）中清洁载玻片至少1天。
- 将载玻片在丙酮中超声处理30分钟，在1M NaOH中连续超声处理30分钟。
- 用去离子水冲洗载玻片并用氮气（N2）气体干燥。
- 将一张干净的纸（5 mm x 35 mm）放在双面胶带的中心。将胶带贴在载玻片上，用纸盖住两个孔和纳米图案。
- 使用干净的刀片切除纸张（图1A）。
- 将玻璃盖玻片放在双面胶带的顶部，并使用移液器吸头摩擦盖玻片以形成微流体室（图1A）。
- 将组装好的流通池放在两个显微镜载玻片之间并夹住它们。
- 将流通池在120°C真空烘箱中烘烤45分钟。
- 使用热胶枪将用于基于芯片的分析的流体连接器（Nanoport）（参见 材料表）连接到每个开孔，并连接两条鲁尔锁管线。
- 连接含有 3 mL 去离子水的鲁尔锁注射器并清洗腔室。
- 用 3 mL 脂质缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0 和 100 mM NaCl） 通过 滴滴连接洗涤腔室。
注意： 逐滴连接将所有注射器连接到流通池，以避免将气泡注入腔室。 - 将脂质缓冲液中的 1 mL 0.04x 生物素化脂质分两次注射到腔室中，每次注射孵育 5 分钟。
注：1x生物素化脂质原液的制备在先前发表的报告34中进行了描述。 - 用 3 mL 脂质缓冲液洗涤腔室并孵育 20 分钟，使脂质双层在载玻片表面上成熟。
- 加入 1 mL BSA 缓冲液（40 mM Tris-HCl，pH 8.0、50 mM NaCl、2 mM MgCl2 和 0.2 mg/mL BSA）并孵育 5 分钟以钝化载玻片表面。
注意：此步骤可以减少蛋白质与载玻片表面的非特异性结合。 - 将 0.025 mg/mL 链霉亲和素注射到 1 mL BSA 缓冲液中，两次注射，每次注射孵育 10 分钟。
- 用 3 mL BSA 缓冲液洗去残留的链霉亲和素。
- 将 ~300 pM （30 μL） 生物素化的 lambda 噬菌体 DNA 在 1 mL BSA 缓冲液中注入腔室，两次注射，每次注射孵育 10 分钟。
注：生物素化λ DNA的制备在先前发表的报告34中进行了描述。
2. 将流通池连接到微流控系统并将其加载到显微镜上
- 制备Abo1成像缓冲液（50mM的Tris-HCl，pH 8.0,100mM的NaCl，1mM的DTT，1mM的ATP，2mM的MgCl 2,1.6%葡萄糖和0.1x的gloxy，参见材料表）。
注意：Gloxy 是一种除氧系统，可减少荧光染料的光漂白。用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备100x光氧原液的方法见参考文献35。 - 将含有 10 mL 成像缓冲液的注射器连接到注射泵，并去除微流控系统中所有管路中的气泡。
- 通过滴对滴连接将制备的流通池与微流体系统耦合，以避免气泡注入流通池（图1B）。
- 组装流通池和流通池支架，并将组件安装在定制的TIRF显微镜上（图1C）。
注意：将流通池置于显微镜下时，请小心设置物镜的高度。流通池不得接触物镜。这会损坏镜头。 - 在流通池的中心滴上与油相匹配的指数，并在油滴上放置一个定制的鸽子棱镜（见 材料表）。
3. 使用 DNA 幕通过 Abo1 组装组蛋白
- 将 5 nM 的 Abo1 和 12.5 nM 的 Cy5 标记的 H3-H4 组蛋白二聚体 （Cy5-H3-H4）（参见 材料表）混合在 150 μL 成像缓冲液中。所有蛋白质均根据先前发表的报告17制备。
- 将混合物在冰上孵育15分钟。
注意：为避免Cy5的光漂白，必须在黑暗中孵育。 - 通过 100 μL 样品环在成像缓冲液中注入 ~20 pM （2 μL） YOYO-1 染料以染色 lambda DNA 分子。
- 运行成像软件（见 材料表）并打开 488 nm 激光器以检查 DNA 幕是否形成良好。
注意：如果DNA幕形成良好，则用YOYO-1染色的DNA分子在存在流动的情况下显示为屏障处的对齐线。当水流关闭时，拉伸的管线会反冲并扩散到远离屏障的地方。 - 进样 2 mL 高盐缓冲液（200 mM NaCl 和 40 mM MgCl2）以消除 DNA 中的 YOYO-1 染料。
- 去除YOYO-1染料后，注入预孵育的蛋白质样品。
- 当蛋白质到达 DNA 幕时，关闭注射泵，关闭截止阀，孵育 15 分钟，通过 Abo1 加载组蛋白。
- 洗出未结合的Abo1和组蛋白5分钟。
- 打开截止阀并恢复流量注入。
- 打开 637 nm 激光器，在缓冲液流开启时对荧光蛋白进行成像。
- 瞬时关闭缓冲液流以检查组蛋白是否加载到DNA上（图2C）。
- 使用图像采集程序收集DNA窗帘图像（参见 材料表）。
注意：当缓冲液流动暂时停止时，DNA从全内反射的倏逝场中回退，与DNA结合的荧光标记蛋白质消失。
4. 数据分析
- 将图像采集程序拍摄的图像转换为TIFF格式作为图像序列。
注：所有数据均使用参考文献20 中所述的图像 J （NIH） 进行分析。 - 从图像序列中挑选一个DNA分子并绘制一个kymograph。
注意：kymograph可以显示与单个DNA分子结合的每种组蛋白的荧光强度随时间的变化。 - 从kymograph创建荧光强度曲线，并将其与多个高斯函数拟合。
- 从荧光强度分布中收集峰的中心坐标。在该步骤中，可以获得组蛋白荧光的最小强度。
- 将从剖面收集的所有峰强度除以最小强度。在此步骤中估计与DNA结合的H3-H4二聚体的数量。
- 对其他 DNA 分子执行步骤 4.2-4.5。
- 为 1 kbp bin 大小的 H3-H4 二聚体的结合分布创建直方图。分析的分子数量至少为 300 个。
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Representative Results
本工作描述了用于DNA幕式测定的流通池制备程序（图1A）。DNA Curtain 测定有助于 Abo1 在 DNA 上研究组蛋白 H3-H4 二聚体组装。首先，通过用嵌入染料YOYO-1染色DNA分子来检查DNA窗帘的形成。绿线以平行阵列显示，表明 YOYO-1 插入到 DNA 分子中，这些分子在流体动力流下在扩散屏障处排列均匀和拉伸（图 2A）。为了排除 YOYO-1 阻碍 DNA 和组蛋白相互作用的可能性，在添加组蛋白之前，用高盐缓冲液从 DNA 中去除 YOYO-1。在没有 Abo1 的情况下将 Cy5-H3-H4 二聚体注射到 DNA 幕中时，Cy5-H3-H4 不与 DNA 结合，表明 H3-H4 二聚体与 DNA 缺乏自发结合（图 2B）。当 Cy5-H3-H4 注射 Abo1 时，DNA 分子上出现红色荧光点，表明 Abo1 将 H3-H4 二聚体加载到 DNA 上（图 2C）。缓冲液流瞬时关闭，以确保Cy5-H3-H4二聚体在与DNA结合时不会与载玻片表面结合。当流动关闭时，荧光标记的与DNA结合的蛋白质消失了，因为DNA分子从消逝场中退缩了。相比之下，吸附在表面的蛋白质保持不变。荧光信号在没有流动的情况下消失，并在恢复流动时重新出现，表明 H3-H4 二聚体与 DNA 结合（图 2C）。Kymograph也证实了H3-H4二聚体与DNA的结合，其中每当流动关闭时，荧光信号就会消失（图2D）。由于 Abo1 是一种 AAA+ ATP 酶，因此研究了 ATP 水解对 Abo1 组蛋白加载活性的影响16。在没有核苷酸（Apo）或ADP存在的情况下，DNA幕中很少出现荧光点（图2E），表明H3-H4二聚体在Apo状态或ADP存在下很少与DNA结合。图2F显示了图2B，C和图2E的定量分析，表明在ATP存在下，与DNA结合的H3-H4二聚体的数量增加。结果表明，ATP水解对于Abo1将H3-H4负载到DNA上是必不可少的（图2E，F）。
接下来，测试了 Abo1 是否优先将组蛋白加载到 Widom 601 序列中，该序列对组蛋白的结合亲和力是体外随机序列的十倍，尽管核小体在体内对 Widom 601 序列没有特异性 36,37,38,39,40。DNA幕是用lambda DNA形成的，lambda DNA的一端或内部含有Widom 601重复序列（图3A，B）。获得了每个DNA构建体上H3-H4二聚体的结合图（图3C，D）。Cy5-H3-H4 的结合位置是从每个荧光点的 2D 高斯拟合中心位置估计的17,41。如果 Abo1 的 H3-H4 负载活性取决于 DNA 序列，则结合分布将偏向 Widom 601 序列。图3C，D显示了Abo1在含有Widom 601重复序列的λDNA上H3-H4二聚体的结合分布直方图，分别在末端（10次重复）和内部（5次重复）。对多个 Widom 601 重复序列没有优先结合，并且结合分布是随机的，这表明 Abo1 对 Widom 601 序列没有任何偏好，而是以序列非依赖性方式将 H3-H4 加载到 DNA 上（图 3C，D）。
图1：流通池的制备。 （A） 流通池组装和DNA幕式示意图。微流体腔室可以在熔融石英载玻片和用双面胶带粘在一起的玻璃盖玻片之间形成。在腔室中的流体动力流下，由于脂质双层的流动性，大量的λ DNA分子在扩散屏障（此处为纳米沟）处排列，并像窗帘一样拉伸。在扩散势垒的放大图中，纳米沟槽具有 1.5 μm 间距、350 nm 宽和 1.4 μm 深度的锯齿图案。（B） 由注射泵、截止阀和带样品回路的 6 通样品注射阀组成的微流控系统的照片。（C） 载玻片支架组件（左）、支架和流通池的组装（中）以及安装在定制 TIRF 显微镜上的完全组装的流通池（右）的图片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用单分子 DNA 幕对 Abo1 上样组蛋白的可视化。 （A） DNA 幕图像，其中用 YOYO-1（绿色）染色的 DNA 分子在扩散屏障处对齐良好。（B） 不含 Abo1 的 Cy5-H3-H4（红色）图像。（C） Abo1 在存在（上）和不存在（下）缓冲流的情况下加载的 Cy5-H3-H4（红色）的图像。（D） 从 （C） 的单个 DNA 分子中提取的 Kymograph。当流动暂时关闭时，Cy5荧光信号消失，表明Cy5-H3-H4与DNA结合，但不与载玻片表面结合。（E） Abo1 加载的 Cy5-H3-H4 无核苷酸 （Apo） 的图像（上图）。Abo1 在 ADP 存在下加载的 Cy5-H3-H4 图像（底部）。（F） 根据核苷酸定量 Abo1 负载的 Cy5-H3-H4。误差线一式三份地描述标准差。每个实验都涉及对100-200个分子的分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：Abo1 对 H3-H4 的序列非依赖性加载。 （A） λ DNA 的一端通过链霉亲和素锚定在生物素化的脂质上，另一端包含 Widom 601 序列的十个重复序列（顶部）。另一个 lambda DNA 包含 lambda DNA 内 Widom 601 序列的五个重复序列（底部）。（B） 含有 Widom 601 重复序列的 lambda DNA 的 DNA 幕测定示意图。（C，D）Cy5-H3-H4 在含有 Widom 601 的 lambda DNA 上的结合分布直方图在末端 （C） 和内部 （D） 重复。当 H3-H4 由 Abo1 组装时，DNA 没有序列特异性。误差线是通过以 70% 置信区间引导42 获得的。（C）和（D）的事件总数分别为312和252。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
作为一种单分子成像技术，DNA帘已被广泛用于探测DNA代谢反应43。DNA 帷幕是一种混合系统，将脂质流动性、微流控和 TIRFM 连接起来。与其他单分子技术不同，DNA curtain 能够实现蛋白质-DNA 相互作用的高通量实时可视化。因此，DNA帘技术适用于探究分子相互作用背后的机制，包括序列特异性关联、蛋白质与DNA一起运动以及DNA上的蛋白质-蛋白质碰撞17,20,26。此外，DNA幕的高通量特性能够收集足够的数据，以确保统计可靠性。DNA帷幕有助于研究蛋白质的生物物理化学性质，包括动力学参数、扩散系数、速度和合成能力17,26,27,30。重要的是，DNA幕可用于确定核小体沉积的结合景观，这表明核小体30的内在序列偏好。
要从DNA窗帘测定中获得高质量的数据，需要考虑几点。首先，必须在载玻片表面上适当地形成脂质双层。脂质双层的流动性允许DNA分子在载玻片上移动，并在流体动力流存在的情况下在扩散屏障处对齐。脂质双层还钝化微流控室的表面，以防止蛋白质非特异性吸附到表面。由于脂质双层的钝化不完全，荧光标记的蛋白质被非特异性地吸附到表面，导致对结果的错误解释。然而，表面卡住的蛋白质可以通过打开和关闭瞬态流动来区分与DNA结合的蛋白质，因为当流动停止时，DNA结合的蛋白质会消失。其次，需要抑制荧光基团的光漂白。许多单分子荧光成像方法采用除氧系统来减少光漂白。已经开发了几种除氧系统，其中最受欢迎的是 gloxy。Gloxy由葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶组成，可酶促还原溶液中的分子氧，但会降低pH值44,45,46。低pH值与生理条件不相容，会降低脂质流动性。为了延缓pH值的降低，（1）成像缓冲液需要用脱气去离子水制备，（2）必须立即使用缓冲液，（3）缓冲液必须密封并储存在冰上直至使用。
开发了一个独特的平台来改进DNA幕系统，其中雕刻的纳米沟作为扩散屏障，而不是铬纳米图案25。由于这些纳米沟槽在强溶剂的恶劣清洁条件下更加坚固，因此它们可以实现可重复、更清晰的成像。然而，DNA帘技术有几个局限性。在连续激光照射下，标记蛋白质的荧光团被光漂白，这使得长时间测量具有挑战性。DNA 幕在低 pH 值（低于 ~6）下不起作用，因为脂质双层不是流体的。此外，当蛋白质浓度高时，荧光背景和蛋白质与载玻片表面的非特异性结合会干扰单分子成像。DNA幕的另一个缺点是DNA幕的空间分辨率为~1 kbp/像素，因此无法观察到蛋白质在小于1 kbp时的运动。此外，DNA幕不断对DNA上的蛋白质施加流体动力。但是流动力很弱（小于 1 pN），因此组蛋白或核小体沿着帘子中的 DNA 移动具有挑战性。还有报道称，如果没有染色质重塑剂，核小体很少沿着 DNA 滑动47。如果组蛋白或核小体沿着 DNA 滑动，它们中的大多数将停留在帘子中 DNA 的末端区域。但是，我们没有看到有偏差的分布。另一方面，如果组蛋白或核小体从 DNA 末端流出，它们将在 DNA 末端耗尽。我们也没有观察到这一点。
这项工作表明，DNA帘式测定法是一种单分子成像平台，是研究染色质动力学的理想选择。DNA 幕可用于研究组蛋白伴侣（如含溴结构域的 AAA+ ATP 酶）组装染色质的过程。含溴结构域的 AAA+ ATP 酶的生物学功能存在争议。缺乏人 ATAD2 或酿酒酵母 Yta7 通过染色质凝聚下调基因表达18。相反，S. pombe Abo1 增加核小体密度16。单分子研究表明，Abo1 催化组蛋白 H3-H4 负载到 DNA 上。结果表明，Abo1的组蛋白加载活性取决于ATP水解（图2C，E，F）。此外，H3-H4二聚体的结合分布表明，H3-H4二聚体以序列非依赖性方式被Abo1加载到DNA上（图3）。总之，DNA幕可用于揭示Abo1在组蛋白组装中作为组蛋白伴侣的生物学作用。使用DNA帘技术，未来将研究Abo1和其他组蛋白伴侣（如CAF-1和FACT）的核小体形成。
基于该协议，DNA幕测定可用于通过重塑易位和重排核小体的复合物来观察染色质重组。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢韩国科学技术院的Ji-Joon Song教授、Carol Cho博士和Juwon Jang博士对Abo1和Cy5-H3-H4的大力支持。这项工作得到了国家研究基金会资助（NRF-2020R1A2B5B01001792），蔚山国立科学技术研究所校内研究基金（1.210115.01）和基础科学研究所（IBS-R022-D1）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
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