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Developmental Biology

जीवित ज़ेबराफ़िश लार्वा में आंखों को हटाने के लिए इनरवेशन-निर्भर विकास और दृश्य प्रणाली के विकास की जांच करने के लिए

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63509
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

लेख बताता है कि जीवित ज़ेब्राफ़िश लार्वा से आंखों को शल्य चिकित्सा से कैसे हटाया जाए, यह जांचने की दिशा में पहला कदम है कि रेटिना इनपुट ऑप्टिक टेक्टम विकास और विकास को कैसे प्रभावित करता है। इसके अलावा, लेख लार्वा एनेस्थेटाइजेशन, फिक्सेशन और मस्तिष्क विच्छेदन के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसके बाद इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और कॉन्फोकल इमेजिंग होती है।

Abstract

ज़ेब्राफ़िश उल्लेखनीय जीवन भर की वृद्धि और पुनर्योजी क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं। उदाहरण के लिए, भ्रूणजनन के दौरान स्थापित विशेष स्टेम सेल niches आंख और मस्तिष्क दोनों में पूरे दृश्य प्रणाली के निरंतर विकास का समर्थन करते हैं। रेटिना और ऑप्टिक टेकटम के बीच समन्वित विकास सटीक रेटिनोटोपिक मैपिंग सुनिश्चित करता है क्योंकि आंखों और मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स जोड़े जाते हैं। यह पता लगाने के लिए कि क्या रेटिना अक्षतंतु टेक्टल स्टेम और पूर्वज सेल व्यवहार जैसे अस्तित्व, प्रसार और / या भेदभाव को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं, एक ही जानवर के भीतर और जानवरों में इनरवेटेड और डिनेरवेटेड टेक्टल लोब की तुलना करने में सक्षम होना आवश्यक है।

ऑप्टिक टेक्टम के अवलोकन के बाद जीवित लार्वा ज़ेबराफ़िश से एक आंख को सर्जिकल रूप से हटाने से इस लक्ष्य को प्राप्त किया जाता है। साथ का वीडियो दर्शाता है कि लार्वा को एनेस्थेटिक कैसे किया जाए, इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से टंगस्टन सुइयों को तेज किया जाए, और एक आंख को हटाने के लिए उनका उपयोग किया जाए। यह अगले से पता चलता है कि कैसे निश्चित zebrafish लार्वा से मस्तिष्क विच्छेदन करने के लिए. अंत में, वीडियो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन प्रदान करता है और माइक्रोस्कोपी के लिए कम-पिघलने-बिंदु एगारोज़ में दाग वाले भ्रूण को माउंट करने के तरीके का एक प्रदर्शन प्रदान करता है।

Introduction

इस विधि का लक्ष्य यह जांचना है कि रेटिना इनपुट ऑप्टिक टेक्टम के विकास और विकास को कैसे प्रभावित करता है, जो ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में दृश्य प्रसंस्करण केंद्र है। एक आंख को हटाकर और फिर ऑप्टिक टेक्टम के दो पक्षों की तुलना करके, एक ही नमूने के भीतर टेक्टल परिवर्तनों को देखा जा सकता है और सामान्यीकृत किया जा सकता है, जिससे कई नमूनों में तुलना की जा सकती है। इस तकनीक के साथ संयुक्त आधुनिक आणविक दृष्टिकोण दृश्य प्रणाली के विकास और विकास के अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करेंगे, साथ ही साथ अक्षीय अध: पतन और पुनर्जनन भी।

संवेदी प्रणालियां - दृश्य, श्रवण, और सोमाटोसेंसरी - बाहरी अंगों से जानकारी इकट्ठा करती हैं और उस जानकारी को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को रिले करती हैं, जिससे मिडब्रेन 1,2 में बाहरी दुनिया के "मानचित्र" उत्पन्न होते हैं। दृष्टि लगभग सभी कशेरुकियों के लिए प्रमुख संवेदी रूपरेखा है, जिसमें कई मछलियां भी शामिल हैं। रेटिना, आंखों में तंत्रिका ऊतक, एक न्यूरोनल सर्किट के साथ जानकारी एकत्र करता है जिसमें मुख्य रूप से फोटोरिसेप्टर, द्विध्रुवी कोशिकाएं और रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी), रेटिना के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स शामिल होते हैं। आरजीसी में लंबे अक्षतंतु होते हैं जो रेटिना की आंतरिक सतह पर ऑप्टिक तंत्रिका सिर तक अपना रास्ता ढूंढते हैं, जहां वे मस्तिष्क के माध्यम से एक साथ यात्रा करते हैं, अंततः पृष्ठीय मिडब्रेन में दृश्य प्रसंस्करण केंद्र में समाप्त हो जाते हैं। इस संरचना को मछली और अन्य गैर-स्तनधारी कशेरुकियों में ऑप्टिक टेक्टम कहा जाता है और स्तनधारियों में बेहतर कोलिकुलस के लिए समरूप है।

ऑप्टिक टेक्टम पृष्ठीय मध्यस्तिष्क में एक द्विपक्षीय सममित बहुस्तरीय संरचना है। ज़ेब्राफ़िश और अधिकांश अन्य मछलियों में, ऑप्टिक टेकटम का प्रत्येक लोब पूरी तरह से contralateral आंख से दृश्य इनपुट प्राप्त करता है, जैसे कि बाएं ऑप्टिक तंत्रिका दाएं टेक्टल लोब में समाप्त हो जाती है और दाईं ऑप्टिक तंत्रिका बाएं टेक्टल लोब4 (चित्रा 1) में समाप्त हो जाती है। अपने स्तनधारी समकक्ष की तरह, बेहतर कोलिकुलस, ऑप्टिक टेकटम अन्य संवेदी इनपुट के साथ दृश्य जानकारी को एकीकृत करता है, जिसमें ऑडिशन और सोमाटोसेंसेशन शामिल हैं, दृश्य ध्यान और आंखों के आंदोलनों में बदलाव को नियंत्रित करते हैं जैसे कि सैकेड्स 1,5,6। हालांकि, स्तनधारी बेहतर कोलिकुलस के विपरीत, ऑप्टिक टेकटम लगातार टेक्टल लोब के औसत दर्जे के और पुच्छल किनारों के पास एक विशेष स्टेम सेल आला से नए न्यूरॉन्स और ग्लिया उत्पन्न करता है जिसे टेक्टल प्रसार क्षेत्र7 कहा जाता है। ऑप्टिक टेकटम और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों में प्रोलिफेरेटिव पूर्वजों का रखरखाव, भाग में, ज़ेबराफ़िश 8 में प्रलेखित उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता में योगदान देताहै।

अंधे या एक आंखों वाली मछलियों के दिमाग की जांच करने वाले पिछले काम से पता चला कि ऑप्टिक टेक्टम का आकार रेटिना इनर्वेशन की मात्रा के लिए सीधे आनुपातिक है जोइसे 9,10,11 प्राप्त करता है। वयस्क गुफा मछली में, जिनकी आंखें प्रारंभिक भ्रूणजनन में पतित होती हैं, ऑप्टिक टेकटम निकटता से संबंधित, दृष्टिहीन सतह मछली9 की तुलना में काफी छोटा होता है। गुफा मछली आंख अध: पतन भ्रूणजनन के दौरान एक सतह मछली से एक लेंस के साथ अंतर्जात लेंस को बदलकर अवरुद्ध किया जा सकता है। जब इन एक आंखों वाली गुफा मछलियों को वयस्कता में पाला जाता है, तो इनरवेटेड टेक्टल लोब में गैर-इनरवेटेड टेक्टल लोब 9 की तुलना में लगभग 10% अधिक कोशिकाएं होतीहैं। इसी तरह, लार्वा किलीफ़िश में जो एक ही व्यक्ति के भीतर विभिन्न आकारों की आंखों को उत्पन्न करने के लिए रासायनिक उपचार के साथ इनक्यूबेट किए गए थे, अधिक संरक्षण के साथ टेक्टम का पक्ष बड़ा था और इसमें अधिक न्यूरॉन्स10 शामिल थे। वयस्क सुनहरी मछली में ऑप्टिक तंत्रिका क्रश प्रयोगों से सबूत इंगित करता है कि संरक्षण प्रसार को बढ़ावा देता है, टेक्टल सेल प्रसार के साथ कम हो जाता है जब इनरवेशन बाधित हो गया था11।

इन शास्त्रीय अध्ययनों की पुष्टि और विस्तार करते हुए, कई हालिया रिपोर्टें डेटा प्रदान करती हैं जो सुझाव देती हैं कि इनरवेशन के जवाब में प्रसार को कम से कम भाग में, BDNF-TrkB Pathway12,13 द्वारा संशोधित किया जाता है। ऑप्टिक टेक्टम विकास और विकास के बारे में कई खुले प्रश्न बने हुए हैं, जिसमें यह भी शामिल है कि एक विकासशील संवेदी प्रणाली चोट और अक्षतंतु अध: पतन के साथ कैसे सामना करती है, जो सेलुलर और आणविक संकेत ऑप्टिक टेकटम विकास को विनियमित करने के लिए रेटिना इनपुट को सक्षम करते हैं, जब ये तंत्र सक्रिय हो जाते हैं, और क्या इनरवेशन-लिंक्ड प्रसार और भेदभाव रेटिना और इसके लक्ष्य ऊतक को विकास दरों का समन्वय करने और सटीक रेटिनोटोपिक मैपिंग सुनिश्चित करने में सक्षम बनाते हैं। इसके अलावा, गतिविधि-निर्भर विकास के बारे में बहुत बड़े प्रश्न हैं जिन्हें सर्जिकल दृष्टिकोण के साथ ज़ेब्राफ़िश दृश्य प्रणाली से पूछताछ करके संबोधित किया जा सकता है जैसे कि नीचे वर्णित एक।

सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए जिसके द्वारा तंत्रिका गतिविधि, विशेष रूप से दृश्य इनपुट से, सेल अस्तित्व और प्रसार को बदल देती है, वर्णित दृष्टिकोण सीधे व्यक्तिगत ज़ेब्राफ़िश लार्वा के भीतर आंतरिक और व्युत्पन्न टेक्टल लोब (चित्रा 1) की तुलना करता है। यह विधि ऑप्टिक टेकटम में आरजीसी अक्षतंतु अध: पतन के प्रलेखन और पुष्टि के लिए अनुमति देती है कि माइटोटिक कोशिकाओं की संख्या इनरवेशन के साथ सहसंबंधित है।

Figure 1
चित्र 1: एकतरफा आंख हटाने से पहले और बाद में ज़ेब्राफ़िश लार्वा के स्केच। (A) विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे देखे गए 5 dpf लार्वा का आरेखण। प्रत्येक लार्वा कम पिघलने-बिंदु agarose में एम्बेडेड है और एक तेज, झुका हुआ टिप के साथ एक टंगस्टन सुई से पहले पार्श्व रूप से उन्मुख है, ऊपर का सामना कर रही आंख (इस उदाहरण में बाईं आंख) का सामना कर रही आंख को स्कूप करने के लिए उपयोग किया जाता है। (बी) ए में दर्शाई गई सर्जरी के परिणामस्वरूप 9 डीपीएफ लार्वा के पृष्ठीय दृश्य का ड्राइंग। दाईं आंख से केवल तीन अत्यधिक योजनाबद्ध आरजीसी अक्षतंतुओं को बाएं टेक्टल लोब में न्यूरॉन्स के साथ विघटित और कनेक्ट करते हुए दिखाया गया है। संक्षेप: dpf = निषेचन के बाद के दिन; डीपीएस = सर्जरी के बाद के दिन; RGC = रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

इस पेपर में विधियों को रीड कॉलेज और यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के दिशानिर्देशों और अनुमोदन के अनुसार आयोजित किया गया था। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ज़ेब्राफ़िश उपभेदों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. सामग्री और उपकरण तैयार करें

  1. समाधान करें।
    1. एक 60x स्टॉक (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihydrate, और20 mM MgCl 2-hexahydrate विआयनीकृत पानी में पतला करके भ्रूण माध्यम (E314) बनाएं, autoclaved, और कमरे के तापमान पर संग्रहीत)। विआयनीकृत पानी के 10 लीटर के लिए 60x E3 के 160 mL जोड़ें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. E3 में 1% कम पिघलने बिंदु (LMP) agarose बनाओ। उच्च शक्ति पर 1-2 मिनट के लिए माइक्रोवेव में उबलते हुए E3 के 100 mL में LMP agarose के 1 ग्राम भंग। एलीकोट 1.7 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में पिघला हुआ एगारोज़, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है। एक पानी के स्नान में उबालें और एम्बेडिंग के लिए उपयोग करने के लिए तैयार होने पर 40 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में रखें।
    3. मार्क के संशोधित रिंगर्स (MMR15) को 10x स्टॉक (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihydrate, 50 mM HEPES, pH को 10 M NaOH के साथ 7.5 में समायोजित करके आइसोटोनिक समाधान बनाएं, फिर ऑटोक्लेव्ड, और कमरे के तापमान पर संग्रहीत)। विआयनीकृत पानी के 90 मिलीलीटर में 10x एमएमआर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिलगार्ड प्लेटों को डालें, जिससे उन्हें कई दिनों के लिए सेट और सूखने की अनुमतिमिलती है।
  3. इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से टंगस्टन सुइयों को तेज करें (प्रोटोकॉल 17 से संशोधित)।
    1. सबसे पहले, एक स्क्रू-टॉप ढक्कन के साथ एक चौड़े मुंह वाले ग्लास जार में 200 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी जोड़कर एक 10% (डब्ल्यू / वी) KOH समाधान तैयार करें। धीरे-धीरे KOH छर्रों के 20 ग्राम में हलचल।
      नोट: यह कास्टिक समाधान अत्यधिक एक्सोथर्मिक है। दस्ताने और आंखों की सुरक्षा पहनें, और हुड में समाधान को हिलाएं।
    2. टंगस्टन तार की 2-3 सेमी लंबाई काटें और इसे सुई धारक में डालें।
    3. कैथोड और एनोड तारों को बिजली की आपूर्ति से कनेक्ट करें। कैथोड तार के अंत में मगरमच्छ क्लिप को आंशिक रूप से सीधे पेपर क्लिप में संलग्न करें और पेपर क्लिप को कोह समाधान में डालें, इसे जार के किनारे से संलग्न करें।
    4. इसके बाद, सुई धारक की गर्दन के लिए एनोड तार के मगरमच्छ क्लिप संलग्न करें। पर शक्ति बारी (~ 20 वी करने के लिए) और KOH समाधान में टंगस्टन तार डुबकी, एक कोण पर समाधान से बाहर तार खींच एक ठीक टिप में electrolytically तार तेज.
      नोट: बुलबुले प्रतिक्रिया आगे बढ़ने के रूप में कागज क्लिप से आ जाएगा।
    5. यह सुनिश्चित करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे सुई की नोक की जांच करें कि यह पर्याप्त तेज है।
    6. सभी KOH अवशेषों को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ सुई कुल्ला। समय से पहले कई सुइयों को बनाएं और उन्हें लार्वा सर्जरी और विच्छेदन तक रखें।
  4. एक ईमानदार confocal माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग zebrafish नमूनों के लिए चेंबर्ड स्लाइड बनाएँ।
    1. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड और दो-भाग एपॉक्सी राल प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। पैकेज पर निर्देशों के अनुसार epoxy मिश्रण, और कांच स्लाइड पर मोटी छल्ले या आयतों पेंट. स्लाइड्स को उपयोग करने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए हुड में इलाज और सूखने की अनुमति दें।

2. भ्रूण संग्रह और पालन

  1. देर से दोपहर / जल्दी शाम को प्रजनन बक्से में वांछित जीनोटाइप की वयस्क नर और मादा मछली जोड़ी। अगली सुबह, जब वे पैदा हो जाते हैं, तो एक जाल छलनी के साथ नए निषेचित अंडे एकत्र करें और उन्हें 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में ई 3 में स्थानांतरित करें।
  2. सर्जरी के दिन तक 14 घंटे के प्रकाश / 10 घंटे के अंधेरे चक्र के साथ ~ 27.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इनक्यूबेट करें। E3 को दैनिक रूप से या आवश्यकतानुसार बदलें।
  3. दिन में एक बार काटे गए रोटिफ़र्स से भरे ड्रॉपर का उपयोग करके लार्वा को खिलाएं, या तो निषेचन के बाद 5 दिनों (डीपीएफ) या सर्जरी के एक दिन बाद शुरू करें। लार्वा के खाने के लिए कई घंटे होने के बाद, किसी भी शेष रोटिफर्स और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए ई 3 को बदलें।
    नोट: सर्जरी के दिन लार्वा को न खिलाएं।

3. सर्जरी के लिए लार्वा तैयार करें

  1. सर्जरी के दिन, ताजा ई 3 से भरे 35 मिमी पेट्री डिश में 10-15 लार्वा स्थानांतरित करने के लिए एक व्यापक-बोर, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
  2. 0.4% w / v Tricaine समाधान (0.4 g Tricaine 210 mM Tris, pH 9 में भंग 0.4 g Tricaine) की 3-5 बूँदें जोड़कर लार्वा को एनेस्थेटिक करें; अंतिम समाधान 7.4 के पीएच में समायोजित यदि आवश्यक होतो 18) ~ 0.0015% w / v Tricaine की अंतिम एकाग्रता के लिए पकवान के लिए। यह निर्धारित करने के लिए स्पर्श करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी की तलाश करें कि लार्वा पर्याप्त रूप से एनेस्थेटिक हैं या नहीं। यदि वे अभी भी ~ 3 मिनट के बाद स्पर्श करने के लिए उत्तरदायी हैं, तो 0.4% डब्ल्यू / वी ट्राइकेन समाधान और पुनर्मूल्यांकन की 2-3 और बूंदें जोड़ें।
    नोट: विकास के इस चरण में, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत गतिशीलता के अलावा रक्त प्रवाह और हृदय गति की निगरानी करना संभव है।
  3. E3 में भंग 1% LMP agarose में उन्हें एम्बेड करके anesthetized zebrafish लार्वा immobilize.
    1. सबसे पहले, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे एक 35 मिमी पेट्री डिश चेहरे का ढक्कन रखें। इसके बाद, एक लार्वा को एक संकीर्ण-बोर में लें, ग्लास पाश्चर पिपेट केवल ई 3 की एक छोटी राशि के साथ।
    2. फिर, एस्पिरेट ~ 200 μL पिघला हुआ, गर्म (~ 40 डिग्री सेल्सियस) लार्वा के साथ पिपेट में 1% एलएमपी agarose। अंत में, लार्वा और उल्टा पेट्री डिश ढक्कन पर agarose धारा निकलना.
    3. लार्वा को जल्दी से लेकिन धीरे से पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक सुस्त टंगस्टन सुई का उपयोग करें ताकि यह पार्श्व हो, जिसमें एक आंख का सामना करना पड़ रहा हो। सेट करने के लिए agarose के लिए प्रतीक्षा करें (~ 5 मिनट).
      नोट: यदि लार्वा पार्श्व नहीं होने पर agarose सख्त हो जाता है, तो इसे agarose से मुक्त करें (जैसा कि चरण 5 में वर्णित है) और इसे E3 और tricaine के साथ पकवान में वापस करें।

4. आंखों को हटाने

  1. एक बार जब एगारोज़ सेट हो जाता है, और लार्वा को पार्श्व रूप से तैनात किया जाता है, तो आंखों की कक्षा के किनारे के बाद, आंखों के चारों ओर की त्वचा को छेदने के लिए एक बहुत ही महीन, इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से तेज टंगस्टन सुई की नोक का उपयोग करें।
  2. इसके बाद, आंख के अस्थायी-वेंट्रल पक्ष से आंख के नीचे सुई के किनारे (टिप नहीं) को स्लाइड करें। सॉकेट से आंखों को छोड़ने के लिए नियंत्रित दबाव का उपयोग करें।
  3. ऑप्टिक तंत्रिका को चुटकी मारकर आंख को हटाने के लिए बहुत ठीक सर्जिकल संदंश का उपयोग करें और आंख को औसत दर्जे के से पार्श्व तक धकेल दें। वैकल्पिक रूप से, बस सुई के पक्ष के साथ आंखों को पृष्ठीय और पूर्वकाल में दबाते रहें, अंततः ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से टुकड़ा करना और आंख को जारी करना।
    नोट: यदि सर्जरी के दौरान आंख के अलावा अन्य ऊतकों को गलती से छुरा घोंपा जाता है, तो जल्दी और मानवीय रूप से लार्वा को तेजी से डिकैपिटेशन द्वारा मार दिया जाता है।

5. प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक पश्चात की देखभाल

  1. सफल आंखों को हटाने के बाद, एमएमआर समाधान के साथ एगारोज़ को कवर करें।
  2. धीरे से अपने सिर के चारों ओर एक टंगस्टन सुई ब्रश करके और फिर उनके शरीर के चारों ओर एक टंगस्टन सुई ब्रश करके agarose से प्रत्येक लार्वा मुक्त, जबकि संदंश के साथ पेट्री डिश ढक्कन स्थिर.
  3. एक आंख वाले लार्वा को 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें एमएमआर होता है जो पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कॉकटेल के 1: 100 कमजोर पड़ने के साथ पूरक होता है। एक 14 घंटे प्रकाश / 10 घंटे अंधेरे चक्र के साथ ~ 27.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इनक्यूबेट करें।
    नोट: एमएमआर का यह आइसोटोनिक समाधान एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक शुरू में लार्वा उपचार और अस्तित्व में सहायता करता है। प्रत्येक डिश 15 पुनर्प्राप्त लार्वा तक पकड़ सकता है।
  4. अगले दिन, लार्वा को E3 पर वापस कर दें। सर्जरी के बाद दोपहर से शुरू करते हुए, दिन में एक बार काटे गए रोटिफर्स से भरे ड्रॉपर का उपयोग करके लार्वा (~ 6 डीपीएफ और पुराने) को खिलाएं। लार्वा के खाने के लिए कई घंटे होने के बाद, किसी भी शेष रोटिफर्स और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए ई 3 को बदलें।

6. फिक्सिंग लार्वा

  1. एक बार जब लार्वा विश्लेषण के लिए वांछित विकास के चरण तक पहुंच जाते हैं, तो उन्हें ट्राइकेन (~ 0.4% अंतिम एकाग्रता) की घातक खुराक के साथ बेहोश करें जब तक कि उनके दिल बंद नहीं हो जाते।
  2. पिपेट 1.5 mL माइक्रोफ्यूज ट्यूब प्रति 30 लार्वा तक। अतिरिक्त E3 निकालें और फिर ऊतक को ठीक करने के लिए फिक्सेटिव समाधान (4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में 4% सुक्रोज) के 0.5-1 मिलीलीटर जोड़ें। लार्वा को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. अगले दिन पीबीएस के साथ लार्वा को ठीक करने वाले को हटाकर और लार्वा को पीबीएस के साथ 3-4 बार धोएं। विच्छेदन से पहले 7 दिनों तक लार्वा को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. विच्छेदन लार्वा मस्तिष्क प्रकट करने के लिए ( 15 से अनुकूलित)

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक सिलगार्ड प्लेट पर पीबीएस बूंदों में निश्चित लार्वा को निलंबित करें। नोटोकॉर्ड के माध्यम से दो टंगस्टन पिन (आमतौर पर पुरानी टंगस्टन सुई जो 2 सेमी से कम होती हैं) रखकर उन्हें पार्श्व रूप से सुरक्षित करें, जिसमें एक पिन महाधमनी-गोनाड-मेसोनेफ्रोस (एजीएम) क्षेत्र को कवर करने वाले पिगमेंटेड क्षेत्र के पीछे है और दूसरा जर्दी विस्तार के अंत के अनुरूप है।
    नोट: टंगस्टन पिन को यथासंभव कुछ प्रयासों में रखें क्योंकि ऊतक प्रत्येक पंचर के साथ अधिक friable हो जाएगा।
  2. इस क्रम में, आंख (ओं), कान, जबड़े, पाचन तंत्र और पृष्ठीय कपाल त्वचा को हटाने के द्वारा मस्तिष्क को उजागर करने के लिए एक बहुत तेज टंगस्टन सुई और सुई-तेज संदंश का उपयोग करें।
    1. सबसे पहले, चरण 4 में सर्जिकल आंखों को हटाने के समान तकनीक का उपयोग करके आंख को हटा दें। फिर, लार्वा को अनपिन करें और इसे विपरीत पक्ष में फ्लिप करें, इसलिए दूसरी आंख सुलभ और दोहराई जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, सुई को जबड़े के माध्यम से दूसरी तरफ प्रहार करें और बिना पिनिंग के आंख को हटा दें।
      नोट: इस बिंदु पर आंखें एकत्र की जा सकती हैं यदि इस ऊतक का विश्लेषण वांछित है ( 19 के समान)।
    2. अगला, कान के अस्थायी से वेंट्रल पक्ष तक खरोंच करने के लिए टंगस्टन सुई का उपयोग करें। उसी क्रिया / गति में, सुई को जबड़े में पीछे लाएं और धीरे से पूर्वकाल में खींचें जब तक कि कान और जबड़े को हटा नहीं दिया जाता है।
    3. वेंट्रल अंगों और किसी भी शेष जर्दी को बाहर निकालने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    4. अंत में, हिंदब्रेन और रीढ़ की हड्डी के बीच जंक्शन के पास पृष्ठीय कपाल त्वचा में एक उथला चीरा बनाएं। संदंश के साथ त्वचा को उठाएं और इसे पूर्वकाल में और टेलेन्सेफेलन के चारों ओर खींचें। यदि यह बहुत मुश्किल साबित होता है, तो हिंडब्रेन में प्रारंभिक चीरा पर शुरू करें और त्वचा को पहले पार्श्व रूप से और फिर वेंट्रलली और पूर्वकाल में खींचें, बहुत ध्यान रखें कि टेक्टम के पार्श्व किनारों को खरोंच न करें।
      नोट: क्योंकि मिडब्रेन अध्ययन की वस्तु है, हिंदब्रेन को काटा जा सकता है; हालांकि, एक गहरी चीरा decapitation में परिणाम हो सकता है.
    5. संदंश के साथ किसी भी शेष ऊतक को हटा दें। लार्वा unpin और एक 1.5 mL microfuge ट्यूब में PBS के लिए स्थानांतरण.
      नोट:: होलमाउंट प्रोटोकॉल करते समय बेहतर दृश्यता के लिए मस्तिष्क से जुड़ी पूंछ को छोड़ दें।

8. मस्तिष्क निर्जलीकरण और भंडारण

  1. दिमाग से पीबीएस निकालें और 0.1% TritonX-100 (PBST) युक्त PBS के 1 mL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. PBST निकालें और इसे 50:50 मेथनॉल: PBST समाधान के साथ बदलें। कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कमरे के तापमान पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए 100% मेथनॉल (MeOH) के साथ दो बार मस्तिष्क को धोएं।
  4. इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री या अन्य होलमाउंट प्रक्रियाओं को करने से पहले कम से कम 16 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% MeOH में दिमाग को स्टोर करें।
    नोट: मस्तिष्क को -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 साल तक के लिए MeOH में संग्रहीत किया जा सकता है।

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

नोट: Zebrafish में कई उपयोगी wholemount तकनीकों के लिए स्थापित प्रोटोकॉल ZFIN20 पर पाया जा सकता है। यह पांडुलिपि एक आंखों वाले और दो आंखों वाले लार्वा की तुलना करने वाले उदाहरण प्रदान करती है जो एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन्ड थे जो या तो लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) को पहचानते हैं, जिसे टीजी [atoh7: RFP] लाइन (चित्रा 2), या फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएच 3) में ऑप्टिक तंत्रिका अक्षतंतुओं में व्यक्त किया जाता है, जो माइटोटिक कोशिकाओं (चित्रा 3) पर प्रकाश डालता है। होलमाउंट भ्रूण और लार्वा के लिए एक मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल नीचे संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

  1. सबसे पहले, MeOH की एक वर्गीकृत श्रृंखला के साथ लार्वा दिमाग को फिर से हाइड्रेट करें: PBST 5 मिनट के लिए 50:50 MeOH: PBST में नमूनों को इनक्यूबेट करके कमरे के तापमान पर धोता है, फिर 30:70 MeOH: PBST में 5 मिनट के लिए, और PBST के 3 धोने के साथ समाप्त होता है।
  2. मस्तिष्क को permeabilize करने के लिए, उन्हें PBST में प्रोटीनेज K (PK) के साथ 37 °C पर 30 मिनट के लिए 20 μg / ml PK की अंतिम एकाग्रता पर पूरक incubate करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीग्राम / एमएल पीके के ऐलीकोट स्टोर करें और उपयोग से पहले उन्हें पिघलाएं।
  3. पीके समाधान निकालें और 15 मिनट से अधिक 3 बार पीबीएसटी के साथ दिमाग को धोकर किसी भी शेष एंजाइम को धो लें।
  4. 25 डिग्री सेल्सियस (या कमरे के तापमान) पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए में उन्हें इनक्यूबेट करके permeabilized दिमाग को फिर से निर्धारित करें। फिर, पीएफए को हटा दें और पीबीएसटी के साथ 15 मिनट से अधिक 3 बार दिमाग को धोकर किसी भी शेष फिक्सेटिव को धो लें।
  5. ताजा बनाया immunoblocking (आईबी) बफर (10% सामान्य बकरी सीरम और PBST में 1% DMSO) के साथ अंतिम PBST कुल्ला की जगह और कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  6. उचित एकाग्रता पर आईबी बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें (उदाहरण के लिए, आरएफपी के लिए 1: 500 और पीएच 3 एंटीबॉडी के लिए 1: 300)।
  7. मस्तिष्क से आईबी बफर निकालें और इसे प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ बदलें। कोमल रॉकिंग के साथ एक कक्षीय शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब सुरक्षित रूप से उनके किनारों पर आराम कर रहे हैं।
  8. अगली सुबह, एक माइक्रोपिपेट के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें, पीबीएसटी में कुछ बार कुल्ला करें, और फिर 4 x 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएसटी में दिमाग को धोएं।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी dilutions ~ 7 दिनों के भीतर एक बार पुन: उपयोग किया जा सकता है यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  9. उचित एकाग्रता पर आईबी बफर में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करते समय आईबी बफर में दिमाग को कुल्ला करें (उदाहरण के लिए, एलेक्सा-फ्लोर 568 एंटी-खरगोश के लिए 1: 500)।
  10. आईबी बफर को निकालें और इसे द्वितीयक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ बदलें। उनके किनारों पर आराम करने वाली ट्यूबों के कोमल रॉकिंग के साथ एक कक्षीय शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  11. अगली सुबह, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें, पीबीएसटी के साथ कुल्ला करें, और फिर 4 x 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएसटी में दिमाग को धोएं।
  12. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) या ToPro3 (PBST में 1:5,000 PBST में 4 °C रात भर में) के साथ counterstain.
  13. अगली सुबह, लार्वा दिमाग को पीबीएस में स्थानांतरित करें और नीचे सूचीबद्ध बढ़ते और इमेजिंग चरणों पर आगे बढ़ें।

10. बढ़ते और इमेजिंग

  1. वैक्यूम तेल के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन में एक चेंबर्ड स्लाइड सुरक्षित करें।
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ उन्हें देखने के लिए एक अच्छी तरह से प्लेट या अवसाद स्लाइड के लिए immunostained और संसाधित लार्वा हस्तांतरण।
  3. 1% LMP agarose के स्तंभों में कक्ष स्लाइड पर लार्वा माउंट.
    1. एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, चेम्बर्ड स्लाइड पर एक लार्वा डालें, जितना संभव हो उतना कम पीबीएस जमा करें। एक ही पिपेट के साथ, पिघला हुआ 1% एलएमपी agarose (~ 40 डिग्री सेल्सियस) के साथ लार्वा को कवर करें।
    2. एक कुंद टंगस्टन सुई या संदंश के साथ, एगारोज़ को एक कॉलम में खींचें और फिर लार्वा को यथासंभव सममित रूप से रखें, पृष्ठीय सतह दिखाई देती है।
    3. शेष लार्वा के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    4. एक बार जब एगरोज जेल हो जाता है, तो इसे पीबीएस की कुछ बूंदों के साथ कवर करें और फिर इसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें।
  4. नमूने के साथ उद्देश्य लेंस संरेखित करें, संचारित प्रकाश का उपयोग करके माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें, और उचित लेजर के साथ नमूने को रोशन करें।
    नोट: इस उदाहरण में, 405 nm और 568 nm तरंग दैर्ध्य क्रमशः DAPI और RFP को उत्तेजित करने के लिए उपयोग किया गया था।
  5. सिग्नल और उपयोग किए गए डिटेक्टर के सापेक्ष एक उपयुक्त स्तर पर स्लाइडर सलाखों को स्थानांतरित करके लाभ, ऑफसेट और लेजर पावर को समायोजित करें। प्रत्येक चैनल के लिए हिस्टोग्राम की जाँच करें और एक्सपोज़र के स्तर को मापने के लिए छवि के ऊपर संतृप्ति संकेतक बटन की स्थिति पर क्लिक करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई भी पिक्सेल संतृप्त नहीं है और सिग्नल-टू-शोर अनुपात अधिक है। ज़ेब्राफ़िश के भीतर सेलुलर और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के लिए इष्टतम कॉन्फोकल इमेजिंग पैरामीटर के एक उदाहरण के लिए, 21 देखें।
  6. नमूने के ऊपर और नीचे खोजने के लिए माउस पर स्क्रॉलव्हील का उपयोग करके जेड-विमानों के स्टैक की ऊपरी और निचली सीमाएं सेट करें। छवि अधिग्रहण के लिए ऊपर और नीचे की सीमाओं पर क्लिक करें और फिर अब चलाएँ बटन पर क्लिक करके z-स्टैक कैप्चर को ट्रिगर करें।
    नोट: इस बात पर निर्भर करता है कि मस्तिष्क को कैसे सममित रूप से माउंट किया जाता है, 9 डीपीएफ लार्वा ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क के लिए कुल जेड-गहराई ~ 150-200 μm होगी।
  7. प्रक्रिया और मन में colorblind पहुँच के साथ छवियों colorize (उदाहरण के लिए, नीले और नारंगी या मैजेंटा और दो रंग छवियों के लिए हरे रंग का उपयोग करें). एडोब से फ़ोटोशॉप जैसे छवियों या छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर को कैप्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर में लुकअप टेबल सेट करें.
  8. फ़ोटोशॉप में, रंग कच्चे photomicrographs 8 बिट टैग की गईं छवि फ़ाइल स्वरूप (TIFF) के रूप में सहेजा (i) द्वारा छवि मोड RGB करने के लिए छवि मोड परिवर्तित करने और (ii) छवि | के तहत घटता विकल्प तक पहुँचने समायोजन मेनू और फिर (iii) वांछित रंग प्राप्त करने के लिए 0 या 255 स्तरों के लिए उपयुक्त रंगीन प्रकाश outputs स्लाइडिंग। उदाहरण के लिए, ग्रीन सिग्नल प्राप्त करने के लिए, लाल चैनल का चयन करें और इसके आउटपुट को 0 पर स्लाइड करें; फिर, ब्लू चैनल का चयन करें और इसके आउटपुट को 0 पर भी स्लाइड करें। इसी तरह, एक मैजेंटा सिग्नल प्राप्त करने के लिए, ग्रीन चैनल का चयन करें और इसके आउटपुट को 0 पर स्लाइड करें; लाल और नीले चैनलों के रूप में वे कर रहे हैं छोड़ दो.
    नोट: इसी तरह के चरणों को मुक्त Gnu छवि हेरफेर कार्यक्रम (GIMP) में किया जा सकता है।
  9. मैन्युअल रूप से ImageJ22 में सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग कर एक विशिष्ट मार्कर प्रदर्शित करने वाले कक्षों की संख्या को निर्धारित करें, जो प्लगइन्स मेनू में विश्लेषण के तहत उपलब्ध है। सेल गिनती के लिए ImageJ का उपयोग करने के तरीके के उदाहरण 23 सहित कई ट्यूटोरियल में पाए जा सकते हैं।
  10. RStudio जैसे सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर में डेटा के ग्राफिकल अभ्यावेदन उत्पन्न करें (के लिए पूरक डेटा देखें)। Rmd फ़ाइल)।

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Representative Results

यह पुष्टि करने के लिए कि क्या आंखों को हटाना पूरा हो गया था और यह आकलन करने के लिए कि ऑप्टिक टेक्टम कैसे बदलता है, टीजी [atoh7: RFP] तनाव में सर्जरी की गई थी, जो झिल्ली-लक्षित आरएफपी के साथ सभी आरजीसी को लेबल करता है और इस प्रकार, सभी अक्षतंतु जो रेटिना से प्रोजेक्ट करते हैं और ऑप्टिक तंत्रिका24 बनाते हैं। यद्यपि इस तनाव का उपयोग करना बिल्कुल आवश्यक नहीं है, यह ऑप्टिक टेकटम न्यूरोपिल में ऑप्टिक तंत्रिका टर्मिनी के सीधे अवलोकन और विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। ऑप्टिक तंत्रिका को लेबल करने के लिए अन्य दृष्टिकोण, जैसे कि लिपोफिलिक डीआईआई या डीआईओ रंजक25,26 या ब्रेनबो 27 के साथ मल्टीस्पेक्ट्रल लेबलिंग के साथ अक्षतंतु ट्रेसिंग, भी संभव होगा।

जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, ऑप्टिक टेकटम न्यूरोपिल में रेटिना अक्षतंतुओं का प्रगतिशील अध: पतन आंखों को हटाने के बाद देखा गया था। सर्जरी के बाद दो दिनों तक, आरएफपी-लेबल वाले अक्षतंतुओं ने तेजी से वॉलेरियन अध: पतन28 जैसे ब्लेबिंग और विखंडन (चित्रा 2 ए, बी) के हॉलमार्क का प्रदर्शन किया। हाल के काम से पता चला है कि माइक्रोग्लिया अधिक माइलिन सामग्री को निगल लेता है जब न्यूरॉन्स को चुप कर दिया जाताहै 29। माइक्रोग्लिया के साथ संगत RGC अक्षतंतुओं को विघटित करने और अध: पतन के स्रोत से दूर पलायन, चमकीले RFP-लेबल puncta के भीतर और tectal neuropil के बाहर नोट किया गया था (चित्रा 1B, तीर). सर्जरी के बाद चार दिनों तक, खंडित अक्षतंतु और आरएफपी-लेबल वाले चेताक्षीय मलबे को या तो टेक्टल लोब में काफी कम कर दिया जाता है, जो मरने और विघटित अक्षतंतुओं की अपेक्षाकृत तेजी से निकासी का संकेत देता है (चित्रा 2 सी, डी)।

होलमाउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करने और लार्वा ज़ेबराफ़िश के ऑप्टिक टेक्टम की कल्पना करने के लिए, मस्तिष्क को आंखों (ओं), जबड़े, कानों और त्वचा और संयोजी ऊतकों की खोपड़ी की टोपी को विच्छेदन करके उजागर किया गया था। आदर्श रूप से, मस्तिष्क इस प्रक्रिया के दौरान बरकरार रहता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 2 सी, डी)। हालांकि, फोरब्रेन के कुछ हिस्सों, विशेष रूप से घ्राण बल्ब, क्षतिग्रस्त होने या पूरी तरह से हटा दिए जाने की संभावना है जब त्वचा या जबड़े की खोपड़ी टोपी को हटा दिया जाता है (चित्रा 2 ए, एरोहेड)। इसके अलावा, कभी-कभी टेक्टम के पार्श्व किनारे को त्वचा को मस्तिष्क से खींचने के लिए छेदने या चुटकी लेते समय कटा हुआ किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 2 ए; सही टेक्टल लोब पर आंसू)।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग पीएच 3 एंटीबॉडी के साथ पूरे दिमाग को धुंधला करके ऑप्टिक टेकटम के इनरवेटेड और गैर-इनरवेटेड लोब में माइटोटिक कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए भी किया गया था। ये डेटा एक आंखों वाली लार्वा मछली के denervated पक्ष पर काफी कम माइटोटिक कोशिकाओं को दिखाते हैं (पी = 0.00033, वेल्च का टी-टेस्ट; चित्रा 3)।

Figure 2
चित्रा 2: 5 डीपीएफ पर आंखों को हटाने से ऑप्टिक तंत्रिका अक्षतंतुओं के अध: पतन को ट्रिगर करता है। (A-D) प्रतिनिधि अधिकतम-तीव्रता के अनुमानों में 7 डीपीएफ (ए) या 9 डीपीएफ (सी) पर तय अक्षुण्ण लार्वा से जंगली-प्रकार के दिमाग के पृष्ठीय दृश्यों को दिखाया गया है, या 5 डीपीएफ, फिक्स्ड 2 डीपीएस (बी) या 4 डीपीएस (डी) पर आंखों के निष्कासन सर्जरी से एक आंख वाले लार्वा। सभी नाभिक DAPI (हरे रंग) के साथ दाग रहे हैं, और ऑप्टिक tectum के neuropil में समाप्त ऑप्टिक तंत्रिका अक्षतंतु atoh7: RFP ट्रांसजीन (magenta) द्वारा लेबल कर रहे हैं। तारांकन केवल दाहिनी आंख बरकरार रखने के साथ लार्वा में innervated tectal neuropil इंगित करता है। तीर denervated ऑप्टिक tectum से निकलने वाले degenerated RGC अक्षतंतुओं के टुकड़ों के उदाहरणों को इंगित करते हैं। एरोहेड अग्रमस्तिष्क के लापता भागों को इंगित करता है। स्केल बार = 50 μm. संक्षेप: dpf = निषेचन के बाद के दिन; डीपीएस = सर्जरी के बाद के दिन; RGC = रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ऑप्टिक टेक्टम में माइटोटिक कोशिकाओं की संख्या इनरवेशन के साथ बढ़ जाती है। (ए-बी) प्रतिनिधि अधिकतम-तीव्रता के अनुमान बरकरार (ए) या एक आंखों वाले (बी) से जंगली प्रकार के मस्तिष्क के पृष्ठीय दृश्यों को दर्शाते हैं 9 डीपीएफ लार्वा माइटोटिक मार्कर PH3 (मैजेंटा) के लिए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन्ड और नाभिक DAPI (हरे रंग) के साथ काउंटररेंटेड। तारांकन अक्षुण्ण दाहिनी आंख से इनरवेटेड टेक्टल न्यूरोपिल को इंगित करता है। (सी) सभी व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं के साथ बॉक्स प्लॉट ओवरलेड है, जिसमें एक आंखों वाले (एन = 12) और दो आंखों वाले (एन = 8) 9 डीपीएफ लार्वा के लिए अंतर अनुपात (बाएं-दाएं / कुल) के रूप में अंतर अनुपात (बाएं-दाएं / कुल) के रूप में इनरवेटेड (बाएं) बनाम डिनेरवेटेड (दाएं) टेक्टल लोब में पीएच 3 + कोशिकाओं के अनुपात की मात्रा को दिखाया गया है। वेल्च के टी-टेस्ट (***, पी < 0.0005) की तुलना में दो स्थितियों का मतलब है। स्केल बार = 50 μm. संक्षेप: dpf = निषेचन के बाद के दिन; डीपीएस = सर्जरी के बाद के दिन; PH3 = फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन H3; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल: आकृति 3C में दिखाए गए प्लॉट के लिए रूपरेखा और निर्देश। इस फ़ाइल में सभी डेटा और कोड होते हैं ताकि कोई भी सभी डेटा बिंदुओं के साथ बॉक्स प्लॉट को पुन: उत्पन्न कर सके, जैसा कि चित्र 3 C में दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस पेपर में वर्णित तकनीकें ज़ेब्राफ़िश में कशेरुक दृश्य प्रणाली के विकास का अध्ययन करने के लिए कई दृष्टिकोणों में से एक को दर्शाती हैं। अन्य शोधकर्ताओं ने भ्रूण रेटिना को विच्छेदित करने और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के तरीकों को प्रकाशित कियाहै 19 या ऑप्टिक टेक्टम30 में न्यूरोनल गतिविधि की कल्पना की है। यह पेपर यह पता लगाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है कि विभेदक रेटिना इनपुट ऑप्टिक टेकटम में सेल व्यवहार को कैसे प्रभावित कर सकता है।

सर्जरी के बाद सफल आंखों के निष्कासन और लार्वा अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि लार्वा स्वस्थ, पर्याप्त रूप से संवेदनाहारी, और 1% एगारोज़ में स्थिर हों। यह भी महत्वपूर्ण है कि संदंश और टंगस्टन सुइयों बहुत तेज और साफ कर रहे हैं. लार्वा सबसे अच्छा जीवित रहते हैं जब उन्हें सर्जरी से पहले या बाद में 24 घंटे नहीं खिलाया जाता है, और एमएमआर में लार्वा को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक करने से उपचार प्रक्रिया को गति मिलती है। महत्वपूर्ण रूप से, एमएमआर की उच्च आयनिक ताकत और विशेष रूप से कैल्शियम की उच्च एकाग्रता उपचार को बढ़ावा देती है14। हालांकि, उच्च लवणता के लंबे समय तक संपर्क में रहने से अस्तित्व कम हो सकता है, जैसा कि भ्रूण जेब्राफ़िश31 में प्रलेखित किया गया है। एक सबसे महत्वपूर्ण कदम सफल मस्तिष्क विच्छेदन सुनिश्चित करने के लिए निर्धारण है, जो immunostained नमूनों की छवियों के डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं। 4% सुक्रोज (प्यार से मीठा फिक्स कहा जाता है) के साथ पूरक ताजा निर्मित 4% पीएफए का उपयोग करना त्वचा को हटाने और मस्तिष्क के ऊतक संरक्षण की आसानी को बढ़ाता है। सर्जरी के साथ के रूप में, तेज और साफ उपकरण मस्तिष्क विच्छेदन के लिए एक जरूरी है।

इस प्रोटोकॉल की सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक आंखों के उत्सर्जन के लिए लार्वा एम्बेड करना है। यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक व्यक्ति को वह तरीका मिले जो उनके लिए सबसे अच्छा काम करता है ताकि वे आत्मविश्वास से और जल्दी से लार्वा आंख को हटा सकें। यदि सर्जरी के दौरान लार्वा को गलती से छुरा घोंपा जाता है, तो मानवीय रूप से इसे डिकैपिटेशन द्वारा मार दिया जाता है। एक और चुनौती होलमाउंट इम्युनोस्टेनिंग के लिए सबसे प्रभावी एंटीबॉडी सांद्रता का निर्धारण कर रही है। उपयुक्त एंटीबॉडी सांद्रता का निर्धारण करते समय, प्रकाशित साहित्य को एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग करें और प्रोटोकॉल को अनुकूलित करें क्योंकि विभिन्न ऊतकों (विशेष रूप से बड़े ऊतकों या पुराने जानवरों पर) पर प्रकाशित अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए बढ़ी हुई सांद्रता और / या इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता हो सकती है।

इस विधि की प्रमुख सीमा वह समय है जब एक एकल प्रयोग शुरू से अंत तक लेता है और मछली की संख्या जो किसी भी समय अध्ययन की जा सकती है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में दिखाए गए सभी डेटा में मछली की प्रारंभिक जोड़ी से अंतिम डेटा संग्रह और विश्लेषण तक लगभग एक महीने का समय लगा। इस अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट दृष्टिकोण को हेटरोलॉगस आनुवांशिक दृष्टिकोणों द्वारा पूरक किया जा सकता है जो या तो दृश्य प्रणाली32,33 में तंत्रिका गतिविधि को चुनिंदा रूप से चुप कर देते हैं या उत्परिवर्ती द्वारा जो आरजीसी अक्षतंतु या गतिविधि34,35 की कमी करते हैं।

इस विधि का महत्व यह है कि यह आधुनिक ट्रांसजेनिक मछली लाइनों पर सहन करने के लिए एक पारंपरिक भ्रूणविज्ञान तकनीक लाता है, जिससे एक ही व्यक्ति के भीतर टेक्टल लोब में से प्रत्येक में संचालित सेलुलर और आनुवंशिक तंत्र की सीधी तुलना की जा सकती है। इसके अलावा, यह विधि अन्य प्रयोगात्मक प्रणालियों के लिए आवेदन के लिए परिपक्व है, जिसमें Astyanax सतह मछली36 और / या ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लार्वा फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले माइक्रोग्लिया37,38,39 और एस्ट्रोसाइट्स40 के साथ अध्ययन करने के लिए यह अध्ययन करने के लिए कि विकासशील मछली तंत्रिका तंत्र इस तरह की नाटकीय चोट का जवाब कैसे देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के लिए धन मुख्य रूप से रीड कॉलेज से केएलसी तक स्टार्ट-अप फंड, ओएलएच के लिए हेलेन स्टैफोर्ड रिसर्च फेलोशिप फंड, और वाईके के लिए रीड कॉलेज साइंस रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित था। यह परियोजना स्टीव विल्सन की प्रयोगशाला में एचआर के सहयोग के रूप में शुरू हुई, जिसे वेलकम ट्रस्ट स्टूडेंटशिप (2009-2014) द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस परियोजना के बारे में प्रारंभिक चर्चा के लिए मैटे वर्गा, स्टीव विल्सन और विल्सन प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, और हम विशेष रूप से फ्लोरेंसिया कैवोडेसी और केट एडवर्ड्स को धन्यवाद देते हैं, जो केएलसी को सिखाने वाले पहले व्यक्ति थे कि एगारोज़ में भ्रूण कैसे माउंट करें और ज़ेबराफ़िश मस्तिष्क विच्छेदन कैसे करें। हम ग्रेटा ग्लोवर और जे इविंग को हमारे टंगस्टन सुई-शार्पनिंग डिवाइस को इकट्ठा करने में मदद के लिए भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes Aquaneering ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease Sigma or equivalent supplier Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL) For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5 Fine Science Tools (FST) 11252-20
Glass Pasteur pipettes DWK Lifescience 63A53 & 63A53WT For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy VWR or equivalent supplier 48311-703 Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders For making and storing solutions.
2-part epoxy resin ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent 0.85 oz syringe https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL) VWR or equivalent supplier 22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length) Fine Science Tools (FST) 26018-17 To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent Ali Express or equivalent For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 50-190-0267
Petri dishes 35 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 08-757-100A
Pipette pump SP Bel-Art or equivalent F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 909122 For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage) For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit Dow Corning 3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter) World Precision Instruments (WPI) TGW0515 Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block The Lab Depot or equivalent supplier BSH1001 or BSH1002 Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended.
Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES Sigma H7006 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 1374248 For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate Sigma M7506 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210 Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333-20ML Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets Diagnostic BioSystems DMR E404-01 Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride Sigma P3911 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride Sigma S9888 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide Sigma S5881 Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose Sigma S9378
Tricaine-S Pentair 100G #TRS1 Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG Invitrogen A-11011 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3 Invitrogen 1306 or T3605 Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418 A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH) Sigma 34860 Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum ThermoFisher Scientific 50-062Z A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3 Millipore 06-570 Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) MBL International PM005 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK) Sigma P2308-10MG Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100 Sigma T8787 Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji) Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.

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References

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 180 Zebrafish दृश्य प्रणाली ऑप्टिक tectum नेत्र extirpation मस्तिष्क विच्छेदन Immunohistochemistry प्रसार क्षैतिज अध: पतन
जीवित ज़ेबराफ़िश लार्वा में आंखों को हटाने के लिए इनरवेशन-निर्भर विकास और दृश्य प्रणाली के विकास की जांच करने के लिए
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Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski,… More

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski, E., Rouse, H., Cerveny, K. L. Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System. J. Vis. Exp. (180), e63509, doi:10.3791/63509 (2022).

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