Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63509
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

В статье объясняется, как хирургически удалить глаза у живых личинок рыбок данио в качестве первого шага к исследованию того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие зрительного тектума. Кроме того, в статье представлена информация об обезболивании личинок, фиксации и рассечении мозга с последующей иммуногистохимией и конфокальной визуализацией.

Abstract

Рыбки данио демонстрируют замечательный пожизненный рост и регенеративные способности. Например, специализированные ниши стволовых клеток, созданные во время эмбриогенеза, поддерживают непрерывный рост всей зрительной системы, как в глазу, так и в мозге. Скоординированный рост между сетчаткой и оптическим тектумом обеспечивает точное ретинотопическое картирование по мере добавления новых нейронов в глаза и мозг. Чтобы решить, предоставляют ли аксоны сетчатки важную информацию для регулирования поведения тектальных стволовых и клеток-предшественников, таких как выживание, пролиферация и / или дифференцировка, необходимо иметь возможность сравнивать иннервированные и денервированные тектальные доли внутри одного и того же животного и у разных животных.

Хирургическое удаление одного глаза у живой личинки рыбки данио с последующим наблюдением за оптическим тектумом достигает этой цели. В сопроводительном видео показано, как обезболить личинок, электролитически заточить вольфрамовые иглы, и использовать их для удаления одного глаза. Далее показано, как препарировать мозг у неподвижных личинок рыбок данио. Наконец, видео содержит обзор протокола иммуногистохимии и демонстрацию того, как монтировать окрашенные эмбрионы в агарозу с низкой температурой плавления для микроскопии.

Introduction

Целью этого метода является исследование того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие оптического тектума, центра визуальной обработки в мозге рыбок данио. Удалив один глаз, а затем сравнив две стороны оптического тектума, можно наблюдать и нормализовать тектальные изменения в одном образце, что позволяет сравнивать несколько образцов. Современные молекулярные подходы в сочетании с этой техникой дадут представление о механизмах, лежащих в основе роста и развития зрительной системы, а также аксональной дегенерации и регенерации.

Сенсорные системы - зрительная, слуховая и соматосенсорная - собирают информацию от внешних органов и передают эту информацию в центральную нервную систему, генерируя «карты» внешнего мира по среднему мозгу 1,2. Зрение является доминирующей сенсорной модальностью почти для всех позвоночных, включая многих рыб. Сетчатка, нервная ткань в глазу, собирает информацию с помощью нейронной цепи, состоящей в основном из фоторецепторов, биполярных клеток и ганглиозных клеток сетчатки (RGC), проекционных нейронов сетчатки. RGC имеют длинные аксоны, которые находят свой путь через внутреннюю поверхность сетчатки к головке зрительного нерва, где они фасцикулируют и путешествуют вместе через мозг, в конечном итоге заканчиваясь в центре визуальной обработки в спинном среднем мозге. Эта структура называется оптическим тектумом у рыб и других позвоночных, не являющихся млекопитающими, и гомологична верхнему колликулусу у млекопитающих3.

Оптический тектум представляет собой двусторонне симметричную многослойную структуру в спинном среднем мозге. У рыбок данио и большинства других рыб каждая доля зрительного тектума получает визуальный ввод исключительно от контралатерального глаза, так что левый зрительный нерв заканчивается в правой тектальной доле, а правый зрительный нерв заканчивается в левой тектальной доле4 (рисунок 1). Как и его аналог млекопитающих, превосходный колликулус, оптический тектум интегрирует визуальную информацию с другими сенсорными входами, включая прослушивание и соматозондирование, контролируя сдвиги в зрительном внимании и движениях глаз, таких как саккады 1,5,6. Однако, в отличие от верхнего колликулуса млекопитающих, оптический тектум непрерывно генерирует новые нейроны и глию из специализированной ниши стволовых клеток вблизи медиального и каудального краев тектальных долей, называемой зоной текальной пролиферации7. Поддержание пролиферативных предшественников в тектуме зрительного нерва и других областях центральной нервной системы частично способствует замечательной регенеративной способности, задокументированной у рыбок данио8.

Предыдущая работа, изучающая мозг слепых или одноглазых рыб, показала, что размер зрительного тектума прямо пропорционален количеству иннервации сетчатки, которую он получает 9,10,11. У взрослых пещерных рыб, глаза которых вырождаются в раннем эмбриогенезе, оптический тектум заметно меньше, чем у близкородственных, видимых поверхностных рыб9. Дегенерация глаза пещерной рыбы может быть заблокирована путем замены эндогенной линзы линзой от поверхностной рыбы во время эмбриогенеза. Когда эти одноглазые пещерные рыбы выращиваются до зрелого возраста, иннервированная тектальная доля содержит примерно на 10% больше клеток, чем неиннервированная тектальная доля9. Аналогичным образом, у личинок киллифиш, которые инкубировались с помощью химической обработки для создания глаз разных размеров в пределах одного и того же человека, сторона тектума с большей иннервацией была больше и содержала больше нейронов10. Данные экспериментов по раздавливанию зрительного нерва у взрослых золотых рыбок указывают на то, что иннервация способствует пролиферации, при этом пролиферация тектальных клеток уменьшается, когда иннервация была нарушена11.

Подтверждая и расширяя эти классические исследования, несколько недавних докладов предоставляют данные, свидетельствующие о том, что пролиферация в ответ на иннервацию модулируется, по крайней мере частично, путем BDNF-TrkB12,13. Остается много открытых вопросов о росте и развитии оптического тектума, в том числе о том, как развивающаяся сенсорная система справляется с травмой и дегенерацией аксонов, какие клеточные и молекулярные сигналы позволяют входу сетчатки регулировать рост зрительного тектума, когда эти механизмы становятся активными, и позволяют ли иннервационная пролиферация и дифференцировка сетчатке и ее целевой ткани координировать темпы роста и обеспечивать точное ретинотопическое картирование. Кроме того, существуют гораздо более широкие вопросы о развитии, зависящем от активности, которые можно решить, опросив зрительную систему рыбок данио с помощью хирургических подходов, таких как описанный ниже.

Чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых нейронная активность, в частности от визуального ввода, изменяет выживание и пролиферацию клеток, описанный подход непосредственно сравнивает иннервированные и денервированные тектальные доли (рисунок 1) в отдельных личинках рыбок данио. Этот метод позволяет документировать дегенерацию аксона RGC в тектуме зрительного нерва и подтвердить, что количество митотических клеток коррелирует с иннервацией.

Figure 1
Рисунок 1: Эскизы личинок рыбок данио до и после одностороннего удаления глаз. (А) Рисование 5 личинок dpf при просмотре под рассекающим микроскопом. Каждая личинка встроена в агарозу с низкой температурой плавления и ориентирована сбоку, прежде чем вольфрамовая игла с острым крючковатым кончиком используется для вычерпывания глаза лицом вверх (левый глаз в этом примере). (B) Рисунок дорсального вида личинки 9 dpf в результате операции, изображенной в A. Только три сильно схематизированных аксона RGC от правого глаза дефасцикулируют и соединяются с нейронами в левой тектальной доле. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; dps = дни после операции; RGC = ганглиозные клетки сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Методы в этой статье были проведены в соответствии с руководящими принципами и одобрением институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию Рид-колледжа и Университетского колледжа Лондона. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о штаммах рыбок данио, используемых в этом исследовании.

1. Подготовка материалов и инструментов

  1. Принимайте решения.
    1. Получают эмбриональную среду (E314) путем разбавления 60-кратного запаса (300 мМ NaCl, 10,2 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2-дигидрата и 20 мМ MgCl2-гексагидрата в деионизированной воде, автоклавной и хранящейся при комнатной температуре). Добавьте 160 мл 60x E3 к 10 л деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
    2. Получите 1% агарозу с низкой температурой плавления (LMP) в E3. Растворить 1 г агарозы LMP в 100 мл E3 кипятить в микроволновой печи в течение 1-2 мин на высокой мощности. Аликвот расплавленную агарозу в 1,7 мл микрофьюжных пробирок и хранит при 4 °C. Кипятить на водяной бане и держать в тепловом блоке при температуре 40 °C, когда он будет готов к использованию для встраивания.
    3. Изготавливают изотонический раствор модифицированных звонарей Марка (MMR15) путем разбавления 10-кратного запаса (1 M NaCl, 20 мМ KCl, 10 мМ MgSO4, 20 мМ CaCl 2-дигидрата, 50 мМ HEPES, рН, скорректированного до 7,5 с 10 М NaOH, затем автоклавированного и хранящегося при комнатной температуре). Добавьте 10 мл 10x MMR к 90 мл деионизированной воды.
  2. Заливайте тарелки Sylgard согласно инструкции производителя, позволяя им устанавливаться и сушиться в течение нескольких дней16.
  3. Электролитически заточите вольфрамовые иглы (протокол, модифицированный из 17).
    1. Во-первых, приготовьте 10% (мас./об.) раствор KOH, добавив 200 мл деионизированной воды в стеклянную банку с широким горлом с завинчивающейся крышкой. Медленно размешать в 20 г гранул KOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот едкий раствор является высокоэкзотермическим. Наденьте перчатки и средства защиты глаз и перемешайте раствор в капюшоне.
    2. Отрежьте вольфрамовую проволоку длиной 2-3 см и вставьте ее в держатель иглы.
    3. Подключите катодные и анодные провода к источнику питания. Прикрепите зажим для аллигатора на конце катодной проволоки к частично выпрямленной скрепке и вставьте скрепку в раствор KOH, прикрепив ее к боковой части банки.
    4. Далее прикрепите зажим аллигатора анодной проволоки к шейке игольчатого держателя. Включите питание (до ~20 В) и окуните вольфрамовый провод в раствор KOH, вытащив провод из раствора под углом, чтобы электролитически заточить провод в тонкий наконечник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки будут исходить из скрепки по мере развития реакции.
    5. Проверьте кончик иглы под рассекающим микроскопом, чтобы убедиться, что он достаточно острый.
    6. Промойте иглу деионизированной водой, чтобы удалить все остатки KOH. Сделайте несколько игл заранее и держите их до личиночных операций и рассечений.
  4. Сделайте камерные слайды для визуализации образцов рыбок данио с помощью вертикального конфокального микроскопа.
    1. Получите стекла микроскопа и двухкомпонентную эпоксидную смолу (см. Таблицу материалов). Смешайте эпоксидную смолу в соответствии с инструкциями на упаковке и нанесите толстые кольца или прямоугольники на стеклянные слайды. Дайте горкам затвердеть и высохнуть в вытяжке в течение не менее 24 часов перед использованием.

2. Сбор и выращивание эмбрионов

  1. Парите взрослых самцов и самок рыб желаемых генотипов в гнездовых ящиках в конце дня / ранним вечером. На следующее утро, после того, как они нерестятся, соберите вновь оплодотворенные яйца с помощью сетчатого ситечка и перенесите их в Е3 в 100 мм чашках Петри.
  2. Инкубируйте эмбрионы при ~27,5 °C с 14-часовым световым /10-часовым темным циклом до дня операции. Меняйте E3 ежедневно или по мере необходимости.
  3. Кормите личинок с помощью капельницы, полной собранных коловраток один раз в день, начиная либо через 5 дней после оплодотворения (dpf), либо через день после операции. После того, как у личинок будет несколько часов, чтобы поесть, измените E3, чтобы удалить оставшихся коловраток и продукты жизнедеятельности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не кормите личинок в день операции.

3. Подготовьте личинок к операции

  1. В день операции используйте стеклянную пипетку Пастера с широким отверстием, чтобы перенести 10-15 личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную свежей E3.
  2. Обезболивают личинки путем добавления 3-5 капель 0,4% мас./об. раствора трикаина (0,4 г трикаина, растворенного в 210 мМ Трис, рН 9; конечный раствор, скорректированный до рН 7,4 при необходимости18) в чашку для конечной концентрации ~0,0015% мас./об.трикаина. Ищите отсутствие реакции на прикосновение, чтобы определить, адекватно личинки обезболены. Если они все еще реагируют на прикосновение через ~3 мин, добавьте еще 2-3 капли 0,4% мас./об.раствор трикаина и повторно проведите повторную оценку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии развития можно контролировать кровоток и частоту сердечных сокращений в дополнение к моторике под рассекающим микроскопом.
  3. Обездвиживают обезболенных личинок рыбок данио, встраивая их в 1% агарозу LMP, растворенную в E3.
    1. Во-первых, поместите крышку 35-миллиметровой чашки Петри лицевой стороной вверх под рассекающим микроскопом. Затем возьмите одну личинку в узкоствольную стеклянную пипетку Пастера с небольшим количеством E3.
    2. Затем аспирировать ~200 мкл расплавленной, теплой (~40 °C) 1% агарозы LMP в пипетку с личинкой. Наконец, брызните личинку и агарозу на перевернутую крышку чашки Петри.
    3. Используйте тусклую вольфрамовую иглу, чтобы быстро, но осторожно маневрировать личинкой так, чтобы она была боковой, с одним глазом, обращенным вверх. Дождитесь схватывания агарозы (~5 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если агароза затвердевает, в то время как личинка не является боковой, освободите ее от агарозы (как описано в шаге 5) и верните ее в чашку с E3 и трицином.

4. Удаление глаз

  1. Как только агароза застынет, и личинка будет расположена сбоку, используйте кончик очень тонкой, электролитически заточенной вольфрамовой иглы, чтобы проткнуть кожу вокруг глаза, следуя краю глазной орбиты.
  2. Далее сдвиньте край иглы (не кончик) под глаз с височно-вентральной стороны глаза. Используйте контролируемое давление, чтобы освободить глаз от глазницы.
  3. Используйте очень тонкие хирургические щипцы, чтобы удалить глаз, защемляя зрительный нерв и подталкивая глаз от медиального к боковому. В качестве альтернативы, просто продолжайте давить на глаз дорсально и спереди боковой стороной иглы, в конечном итоге разрезая зрительный нерв и освобождая глаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткани, отличные от глаза, случайно заколоты во время операции, быстро и гуманно убейте личинку путем быстрого обезглавливания.

5. Послеоперационный уход до экспериментальной конечной точки

  1. После успешного удаления глаз накройте агарозу раствором MMR.
  2. Освободите каждую личинку от агарозы, осторожно расчесывая вольфрамовую иглу вокруг их головы, а затем вокруг их тела, стабилизируя крышку чашки Петри щипцами.
  3. Переложите одноглазых личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, которая содержит MMR, дополненную разбавлением 1:100 коктейля пенициллин/стрептомицин. Инкубируйте эмбрионы при ~27,5 °C с темным циклом 14 ч света/10 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот изотонический раствор MMR, дополненный антибиотиками, первоначально способствует заживлению и выживанию личинок. Каждое блюдо может вместить до 15 выздоравливающих личинок.
  4. На следующий день верните личинок в Е3. Начиная с второй половины дня после операции, кормите личинок (~ 6 dpf и старше) с помощью капельницы, полной собранных коловраток один раз в день. После того, как у личинок будет несколько часов, чтобы поесть, измените E3, чтобы удалить оставшихся коловраток и отходы.

6. Фиксация личинок

  1. Как только личинки достигнут желаемой стадии развития для анализа, обезболивайте их смертельной дозой трикаина (~ 0,4% конечной концентрации), пока их сердца не остановятся.
  2. Пипетка до 30 личинок на 1,5 мл микрофьюжной трубки. Удалите избыток E3, а затем добавьте 0,5-1 мл фиксирующего раствора (4% параформальдегида (PFA) и 4% сахарозы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)) для фиксации ткани. Насиживают личинок в течение ночи при 4 °C.
  3. Промыть личинок PBS на следующий день, удалив фиксатор и промывая личинок 3-4 раза PBS. Хранить личинки при температуре 4 °C до 7 дней до рассечения.

7. Рассечение личинок для выявления мозга (адаптировано из 15)

  1. Подвешивайте неподвижные личинки в каплях PBS на пластине Сильварда под рассекающим микроскопом. Закрепите их сбоку, поместив два вольфрамовых штифта (обычно старые вольфрамовые иглы, которые составляют менее 2 см) через нотохорд, причем один штифт находится позади пигментированной области, охватывающей область аорты-гонад-мезонефрос (AGM), и другой в соответствии с концом расширения желтка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите вольфрамовые штифты в как можно меньшем количестве попыток, потому что ткань будет становиться более рыхлой с каждым проколом.
  2. Используйте очень острую вольфрамовую иглу и острые щипцы, чтобы обнажить мозг, удалив в этом порядке глаз (ы), ухо, челюсть, пищеварительный тракт и спинную черепную кожу.
    1. Во-первых, удалите глаз, используя технику, аналогичную хирургическому удалению глаза на шаге 4. Затем открепите личинку и переверните ее в противоположную сторону, чтобы другой глаз был доступен и повторился. В качестве альтернативы, проткните иглу через челюсть на другую сторону и удалите глаз, не отстегивая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза могут быть собраны в этот момент, если требуется анализ этой ткани (аналогично 19).
    2. Затем используйте вольфрамовую иглу, чтобы поцарапать от височной до вентральной стороны уха. В том же действии / движении поднесите иглу сзади к челюсти и осторожно потяните кпереди, пока ухо и челюсть не будут удалены.
    3. Используйте щипцы, чтобы вытащить вентральные органы и любой оставшийся желток.
    4. Наконец, сделайте неглубокий разрез в дорсальной черепной коже вблизи соединения между задним мозгом и спинным мозгом. Подтяните кожу щипцами и потяните ее спереди и вокруг теленцефалона. Если это окажется слишком трудным, начните с начального разреза в заднем мозге и потяните кожу сначала латерально, а затем вентрально и спереди, стараясь не поцарапать боковые края тектума.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку средний мозг является объектом исследования, задний мозг может быть разрезан; однако глубокий разрез может привести к обезглавливанию.
    5. Удалите оставшуюся ткань щипцами. Открепите личинку и перенесите на PBS в микрофрагменной трубке объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте хвост прикрепленным к мозгу для лучшей видимости при выполнении протоколов wholemount.

8. Обезвоживание и хранение мозга

  1. Удалите PBS из мозга и добавьте 1 мл PBS, содержащего 0,1% TritonX-100 (PBST). Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
  2. Удалите PBST и замените его раствором метанола: PBST 50:50. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
  3. Промывайте мозги 100% метанолом (MeOH) дважды по 5 мин при комнатной температуре.
  4. Храните мозг в 100% MeOH при -20 °C в течение не менее 16 ч перед выполнением иммуногистохимии или других процедур полного объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг может храниться в MeOH до 2 лет при -20 °C.

9. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Установленные протоколы для многих полезных методов wholemount у рыбок данио можно найти на ZFIN20. В этой рукописи приведены примеры сравнения одноглазых и двухглазых личинок, которые были ослаблены антителами, которые распознают либо красный флуоресцентный белок (RFP), который экспрессируется в аксонах зрительного нерва в линии Tg[atoh7:RFP] (рисунок 2), либо фосфорилированный гистон H3 (PH3), который выделяет митотические клетки (рисунок 3). Стандартный протокол иммуногистохимии для цельных эмбрионов и личинок кратко изложен ниже.

  1. Сначала регидратируйте личиночный мозг градуированной серией промывок MeOH:PBST при комнатной температуре путем инкубации образцов в 50:50 MeOH:PBST в течение 5 мин, затем в 30:70 MeOH:PBST в течение 5 мин и заканчивая 3 промывками PBST.
  2. Чтобы проникнуть в мозг, инкубируют его в ПБСТ, дополненном протеиназой К (ФК) в конечной концентрации 20 мкг/мл ПК в течение 30 мин при 37 °C. Храните аликвоты 10 мг/мл ПК при -20 °C и размораживайте их перед использованием.
  3. Удалите раствор ФК и смойте оставшийся фермент, промыв мозг ПБСТ 3 раза в течение 15 минут.
  4. Рефиксируйте пермеабилизированный мозг, инкубируя их в 4% PFA в течение 20 мин при 25 °C (или комнатной температуре). Затем удалите PFA и смойте все оставшиеся фиксирующие средства, промывая мозг 3 раза в течение 15 минут PBST.
  5. Замените окончательную промывку PBST свежеприготовленным буфером иммуноблокировки (IB) (10% нормальной козьей сыворотки и 1% DMSO в PBST) и инкубируйте при комнатной температуре в течение не менее 1 ч.
  6. Разбавляют первичные антитела в буфер IB в соответствующей концентрации (например, 1:500 для RFP и 1:300 для антител PH3).
  7. Удалите буфер IB из мозга и замените его первичным разведением антител. Инкубировать в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере с мягким раскачиванием. Убедитесь, что трубы надежно лежат по бокам.
  8. На следующее утро удалите раствор первичного антитела микропипеткой, промойте пару раз в ПБСТ, а затем промывайте мозги в ПБСТ при комнатной температуре в течение 4 х 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные разведения антител могут быть повторно использованы один раз в течение ~ 7 дней при хранении при 4 °C.
  9. Промывайте мозг в буфере IB, разбавляя вторичные антитела в буфер IB в соответствующей концентрации (например, 1:500 для Alexa-fluor 568 против кролика).
  10. Удалите буфер IB и замените его вторичным разведением антител. Насиживайте в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере с мягким раскачиванием трубок, опирающихся на их бока.
  11. На следующее утро удаляют раствор вторичных антител, смывают ПБСТ, а затем промывают мозги в ПБСТ при комнатной температуре в течение 4 х 30 мин.
  12. Противодействовать 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или ToPro3 (1:5,000 в ПБСТ при 4 °C в сутки).
  13. На следующее утро перенесите личиночный мозг в PBS и перейдите к этапам монтажа и визуализации, перечисленным ниже.

10. Монтаж и визуализация

  1. Закрепите камерный затвор в крышке 100-миллиметровой чашки Петри вакуумной смазкой.
  2. Перенесите иммуноокрашенные и обработанные личинки на пластину колодца или углубление, чтобы просмотреть их с помощью рассекающего микроскопа.
  3. Установите личинок на камерный затвор в колонны из 1% агарозы LMP.
    1. Используя стеклянную пипетку Пастера, положите одну личинку на камерную горку, отложив как можно меньше PBS. Той же пипеткой накройте личинку расплавленной 1% агарозой LMP (~40 °C).
    2. Тупой вольфрамовой иглой или щипцами втяните агарозу в столб, а затем расположите личинку как можно более симметрично, с видимой дорсальной поверхностью.
    3. Повторите эту процедуру для оставшихся личинок.
    4. После того, как агароза застыла, накройте ее несколькими каплями PBS, а затем поместите на сцену конфокального микроскопа.
  4. Выровняйте объектив с образцом, сфокусируйте микроскоп с помощью проходящего света и осветите образец соответствующими лазерами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере для возбуждения DAPI и RFP соответственно использовались длины волн 405 нм и 568 нм.
  5. Отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера, переместив ползунки на соответствующий уровень относительно сигнала и используемого детектора. Проверьте гистограммы для каждого канала и нажмите кнопку индикатора состояния насыщенности над изображением, чтобы измерить уровень экспозиции, убедившись, что ни один из пикселей не насыщен и что отношение сигнал/шум высокое. Пример оптимальных параметров конфокальной визуализации для клеточного и субклеточного разрешения у рыбок данио см. 21.
  6. Установите верхний и нижний пределы стека z-плоскостей с помощью колеса прокрутки мыши, чтобы найти верхнюю и нижнюю части образца. Щелкните верхний и нижний пределы для получения изображений, а затем запустите захват z-стека, нажав кнопку Выполнить сейчас .
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, насколько симметрично установлен мозг, общая z-глубина для мозга личинок рыбок данио 9 dpf составит ~ 150-200 мкм.
  7. Обрабатывайте и раскрашивайте изображения с учетом доступности дальтонизма (например, используйте синий и оранжевый или пурпурный и зеленый цвета для двухцветных изображений). Установите таблицы подстановки в программном обеспечении, используемом для захвата изображений, или программном обеспечении для обработки изображений, таком как Photoshop от Adobe.
  8. В Photoshop цветные необработанные микрофотографии сохраняются в формате TIFF с 8-битными тегами путем (i) преобразования режима изображения в RGB и (ii) доступа к параметру «Кривые» в | Настраивает меню, а затем (iii) сдвигает соответствующие цветные световые выходы до 0 или 255 уровней для достижения желаемого цвета. Например, чтобы получить зеленый сигнал, выберите Красный канал и сдвиньте его выход до 0; затем выберите синий канал и сдвиньте его выход до 0 . Аналогично, чтобы получить пурпурный сигнал, выберите зеленый канал и сдвиньте его выход до 0; оставьте красный и синий каналы такими, какие они есть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичные шаги могут быть выполнены в бесплатной программе Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
  9. Вручную количественно оцените количество ячеек, отображающих определенный маркер, с помощью плагина счетчика ячеек в ImageJ22, доступного в разделе Анализ в меню Плагины. Примеры того, как использовать ImageJ для подсчета ячеек, можно найти во многих учебниках, включая 23.
  10. Создание графических представлений данных в статистическом программном обеспечении, таком как RStudio (см. дополнительные данные для . Rmd файл).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы подтвердить, было ли удаление глаз полным, и оценить, как изменяется оптический тектум, были проведены операции в штамме Tg[atoh7:RFP], который маркирует все RGC мембранно-целевым RFP и, таким образом, все аксоны, которые проецируются из сетчатки и образуют зрительный нерв24. Хотя использование этого штамма не является абсолютно необходимым, оно позволяет легко наблюдать и визуализировать термин зрительного нерва в оптическом тектуме нейропила. Другие подходы к маркировке зрительного нерва, такие как трассировка аксонов липофильными красителями DiI или DiO 25,26 или мультиспектральная маркировка с помощью brainbow27, также были бы возможны.

Как показано на рисунке 2, прогрессирующая дегенерация аксонов сетчатки в нейропиле зрительного тектума наблюдалась после удаления глаза. Через два дня после операции аксоны, меченые RFP, демонстрировали признаки быстрой валлеровской дегенерации28 , такие как блеббинг и фрагментация (рисунок 2A, B). Недавняя работа показала, что микроглия поглощает больше миелинового материала, когда нейроны заглушаются29. В соответствии с микроглией, поглощающей биты вырождающихся аксонов RGC и мигрирующей от источника дегенерации, были отмечены яркие меченые RFP-метки внутри и снаружи тектального нейропила (рисунок 1B, стрелки). Через четыре дня после операции фрагментированные аксоны и меченый RFP аксональный мусор значительно уменьшаются в любой тектальной доле, что указывает на относительно быстрый клиренс умирающих и дегенеративных аксонов (рисунок 2C, D).

Чтобы выполнить цельного иммуногистохимию и визуализировать оптический тектум личинок рыбок данио, мозг подвергали воздействию путем рассечения глаза (глаз), челюсти, ушей и черепной шапки кожи и соединительных тканей. В идеале мозг остается нетронутым во время этой процедуры (например, рисунок 2C, D). Тем не менее, части переднего мозга, особенно обонятельная луковица, вероятно, будут повреждены или полностью удалены при удалении черепной крышки кожи или челюсти (рисунок 2A, наконечник стрелы). Более того, иногда боковой край тектума может быть разрезан при прокалывании или защемлении кожи, чтобы оттянуть ее от мозга (например, рисунок 2А; разрыв на правой тектальной доле).

Иммуногистохимия также использовалась для оценки количества митотических клеток в иннервированных и неиннервированных долях тектума зрительного нерва путем окрашивания всего мозга антителом PH3. Эти данные показывают значительно меньше митотических клеток на денервированной стороне одноглазой личиночной рыбы (p = 0,00033, t-тест Уэлча; Рисунок 3).

Figure 2
Рисунок 2: Удаление глаз при 5 dpf вызывает дегенерацию аксонов зрительного нерва. (А-Д) Репрезентативные проекции максимальной интенсивности, показывающие дорсальные виды мозга дикого типа из интактных личинок, зафиксированных при 7 dpf (A) или 9 dpf (C), или одноглазых личинок от операций по уничтожению глаз при 5 dpf, фиксированных 2 dps (B) или 4 dps (D). Все ядра окрашены DAPI (зеленый), а аксоны зрительного нерва, заканчивающиеся в нейропиле тектума зрительного нерва, помечены трансгеном atoh7: RFP (пурпурный). Звездочка указывает на иннервированный тектальный нейропил у личинок с неповрежденным только правым глазом. Стрелки указывают на примеры фрагментов вырожденных аксонов RGC, исходящих из денервированного оптического тектума. Наконечник стрелки указывает на отсутствующие части переднего мозга. Шкала бара = 50 мкм. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; dps = дни после операции; RGC = ганглиозные клетки сетчатки; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Количество митотических клеток в тектуме зрительного нерва увеличивается с иннервацией. (A-B) Репрезентативные проекции максимальной интенсивности, показывающие дорсальные виды мозга дикого типа из интактных (A) или одноглазых (B) 9 dpf личинок, иммуноокрашенных антителами к митотическому маркеру PH3 (пурпурный) и ядрам, противопоставленным DAPI (зеленый). Звездочка указывает на иннервированный тектальный нейропил из неповрежденного правого глаза. (C) Прямоугольный график с наложением всех отдельных точек данных, показывающий количественное определение соотношения клеток PH3+ в иннервированной (слева) и денервированной (справа) тектальной доле в качестве соотношения разности (влево-вправо/всего) для одноглазых (n = 12) и двухглазых (n = 8) 9 личинок dpf. Значение двух условий по сравнению с t-тестом Уэлча (***, p < 0,0005). Шкала бара = 50 мкм. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; dps = дни после операции; PH3 = фосфорилированный гистон H3; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл: Схема и инструкции для графика, показанные на рисунке 3C. Этот файл содержит все данные и код, так что любой может воспроизвести прямоугольную диаграмму со всеми наложенными точками данных, как показано на рисунке 3C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные в этой статье, иллюстрируют один из многих подходов к изучению развития зрительной системы позвоночных у рыбок данио. Другие исследователи опубликовали методы рассечения эмбриональной сетчатки и проведения анализа экспрессии генов19 или визуализации активности нейронов в зрительном тектуме30. В этой статье представлен подход к изучению того, как дифференциальный ввод сетчатки может влиять на поведение клеток в оптической тектуме.

Чтобы обеспечить успешную экстирпацию глаз и выживание личинок после операции, важно, чтобы личинки были здоровы, адекватно обезболены и обездвижены в 1% агарозе. Также важно, чтобы щипцы и вольфрамовые иглы были очень острыми и чистыми. Личинки выживают лучше всего, когда их не кормят за 24 часа до или после операции, а выращивание личинок в MMR, дополненном антибиотиками, ускоряет процесс заживления. Важно отметить, что более высокая ионная сила MMR и особенно более высокая концентрация кальция способствует заживлению14. Тем не менее, более длительное воздействие более высокой солености может снизить выживаемость, подобно тому, что было задокументировано у эмбриональных рыбок данио31. Наиболее важным шагом является фиксация для обеспечения успешных рассечений мозга, которые необходимы для анализа данных изображений иммуноокрашенных образцов. Использование свежеприготовленных 4% PFA с добавлением 4% сахарозы (ласково называемой sweet fix), как правило, увеличивает легкость удаления кожи и сохранения мозговой ткани. Как и в случае с операциями, острые и чистые инструменты являются обязательными для рассечения мозга.

Одной из самых больших проблем этого протокола является встраивание личинок для уничтожения глаз. Важно, чтобы каждый человек нашел способ, который лучше всего подходит для него, чтобы он мог уверенно и быстро удалить личиночный глаз. Если личинку случайно зарезали во время операции, гуманно убейте ее обезглавливанием. Другой проблемой является определение наиболее эффективных концентраций антител для иммуноокрашивания цельного монтажа. При определении соответствующих концентраций антител используйте опубликованную литературу в качестве отправной точки и оптимизируйте протокол, поскольку использование опубликованных реагентов на разных тканях (особенно на более крупных тканях или более старых животных) может потребовать увеличения концентраций и/или времени инкубации.

Основным ограничением этого метода является время, которое проходит один эксперимент от начала до конца, и количество рыб, которые могут быть изучены в любой момент времени. Например, все данные, показанные на рисунке 3, заняли около одного месяца от первоначального спаривания рыб до окончательного сбора и анализа данных. Этот относительно низкопроизводительный подход может быть дополнен гетерологичными генетическими подходами, которые либо избирательно подавляют нейронную активность в зрительной системе32,33, либо мутантами, у которых отсутствуют аксоны RGC или активность34,35.

Значение этого метода заключается в том, что он применяет традиционную эмбриологическую технику для современных трансгенных рыбьих линий, позволяя напрямую сравнивать клеточные и генетические механизмы, действующие в каждой из тектальных долей в пределах одного и того же человека. Кроме того, этот метод созрел для применения к другим экспериментальным системам, включая поверхностных рыб Astyanax 36 и / или трансгенных личинок рыбок данио с флуоресцентно меченой микроглией 37,38,39 и астроцитами40 для изучения того, как развивающаяся нервная система рыб реагирует на такое драматическое повреждение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Финансирование этой работы было поддержано в основном стартовыми фондами от Reed College до KLC, фондами Исследовательской стипендии Хелен Стаффорд для OLH и стипендией Reed College Science Research Fellowship для YK. Этот проект начался в лаборатории Стива Уилсона как сотрудничество с HR, который был поддержан Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Мы благодарим Мате Варгу, Стива Уилсона и других членов лаборатории Уилсона за первоначальные обсуждения этого проекта, и мы особенно благодарим Флоренсию Каводеасси и Кейт Эдвардс, которые первыми научили KLC, как вводить эмбрионы в агарозу и выполнять рассечение мозга рыбок данио. Мы также благодарим Грету Гловер и Джея Юинга за помощь в сборке нашего устройства для заточки вольфрамовой иглы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes Aquaneering ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease Sigma or equivalent supplier Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL) For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5 Fine Science Tools (FST) 11252-20
Glass Pasteur pipettes DWK Lifescience 63A53 & 63A53WT For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy VWR or equivalent supplier 48311-703 Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders For making and storing solutions.
2-part epoxy resin ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent 0.85 oz syringe https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL) VWR or equivalent supplier 22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length) Fine Science Tools (FST) 26018-17 To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent Ali Express or equivalent For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 50-190-0267
Petri dishes 35 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 08-757-100A
Pipette pump SP Bel-Art or equivalent F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 909122 For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage) For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit Dow Corning 3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter) World Precision Instruments (WPI) TGW0515 Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block The Lab Depot or equivalent supplier BSH1001 or BSH1002 Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended.
Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES Sigma H7006 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 1374248 For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate Sigma M7506 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210 Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333-20ML Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets Diagnostic BioSystems DMR E404-01 Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride Sigma P3911 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride Sigma S9888 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide Sigma S5881 Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose Sigma S9378
Tricaine-S Pentair 100G #TRS1 Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG Invitrogen A-11011 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3 Invitrogen 1306 or T3605 Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418 A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH) Sigma 34860 Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum ThermoFisher Scientific 50-062Z A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3 Millipore 06-570 Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) MBL International PM005 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK) Sigma P2308-10MG Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100 Sigma T8787 Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji) Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Tags

Биология развития Выпуск 180 Рыбки данио Зрительная система Оптический тектум Экстирпация глаз Рассечение мозга Иммуногистохимия Пролиферация Аксональная дегенерация
Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski,… More

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski, E., Rouse, H., Cerveny, K. L. Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System. J. Vis. Exp. (180), e63509, doi:10.3791/63509 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter