Summary
Artikeln förklarar hur man kirurgiskt tar bort ögon från levande zebrafisklarver som det första steget mot att undersöka hur retinal inmatning påverkar optisk tektumtillväxt och utveckling. Dessutom ger artikeln information om larvbedövning, fixering och hjärndissektion, följt av immunohistokemi och konfokal avbildning.
Abstract
Zebrafisk uppvisar anmärkningsvärd livslång tillväxt och regenerativa förmågor. Till exempel stöder specialiserade stamcellsnischer som etablerats under embryogenes kontinuerlig tillväxt av hela det visuella systemet, både i ögat och hjärnan. Koordinerad tillväxt mellan näthinnan och det optiska tectum säkerställer noggrann retinotopisk kartläggning när nya neuroner läggs till i ögonen och hjärnan. För att ta itu med huruvida retinala axoner ger avgörande information för att reglera tektala stam- och stamcellsbeteenden som överlevnad, proliferation och / eller differentiering, är det nödvändigt att kunna jämföra innerverade och denerverade tektallober inom samma djur och över djur.
Kirurgiskt avlägsnande av ett öga från levande larvzebrafisk följt av observation av det optiska tectumet uppnår detta mål. Den medföljande videon visar hur man bedövar larver, elektrolytiskt skärper volframnålar och använder dem för att ta bort ett öga. Det visar sedan hur man dissekerar hjärnor från fasta zebrafisklarver. Slutligen ger videon en översikt över protokollet för immunohistokemi och en demonstration av hur man monterar färgade embryon i lågsmältpunktsagaros för mikroskopi.
Introduction
Målet med denna metod är att undersöka hur retinal inmatning påverkar tillväxten och utvecklingen av det optiska tectumet, det visuella bearbetningscentret i zebrafiskhjärnan. Genom att ta bort ett öga och sedan jämföra de två sidorna av det optiska tectumet kan tektala förändringar inom samma prov observeras och normaliseras, vilket möjliggör jämförelse över flera prover. Moderna molekylära tillvägagångssätt i kombination med denna teknik kommer att ge insikter i mekanismerna bakom visuell systemtillväxt och utveckling, liksom axonal degeneration och regenerering.
Sensoriska system - visuella, auditiva och somatosensoriska - samlar in information från yttre organ och vidarebefordrar den informationen till centrala nervsystemet och genererar "kartor" över den yttre världen över mitthjärnen 1,2. Vision är den dominerande sensoriska modaliteten för nästan alla ryggradsdjur, inklusive många fiskar. Näthinnan, den neurala vävnaden i ögat, samlar information med en neuronal krets som huvudsakligen består av fotoreceptorer, bipolära celler och retinala ganglionceller (RGC), näthinnans projektionsneuroner. RGC har långa axoner som hittar sin väg över näthinnans inre yta till synnervshuvudet, där de fascikulaterar och reser tillsammans genom hjärnan och slutligen slutar i det visuella bearbetningscentret i dorsala mitthjärnan. Denna struktur kallas optisk tectum hos fisk och andra icke-däggdjursryggradsdjur och är homolog mot den överlägsna colliculus hos däggdjur3.
Det optiska tectumet är en bilateralt symmetrisk flerskiktad struktur i dorsala mitthjärna. Hos zebrafiskar och de flesta andra fiskar får varje lob i det optiska tektumet visuell inmatning enbart från det kontralaterala ögat, så att vänster synnerv slutar i höger tektallob och höger synnerv slutar i vänster tektallob4 (Figur 1). Liksom sin däggdjurs motsvarighet, den överlägsna colliculus, integrerar det optiska tectum visuell information med andra sensoriska ingångar, inklusive audition och somatosensation, som kontrollerar förändringar i visuell uppmärksamhet och ögonrörelser som saccades 1,5,6. Men till skillnad från däggdjurets överlägsna colliculus genererar det optiska tectum kontinuerligt nya neuroner och glia från en specialiserad stamcellsnisch nära de mediala och kaudala kanterna på tektalloberna som kallas tectal proliferationszon7. Upprätthållande av proliferativa förfäder i det optiska tectumet och andra regioner i centrala nervsystemet bidrar delvis till den anmärkningsvärda regenerativa kapacitet som dokumenteras i zebrafisk8.
Tidigare arbete som undersökte hjärnorna hos blinda eller enögda fiskar avslöjade att optisk tektumstorlek är direkt proportionell mot mängden retinal innervation den får 9,10,11. Hos vuxna grottfiskar, vars ögon degenererar i tidig embryogenes, är det optiska tektumet märkbart mindre än för närstående, synad ytfisk9. Grottfiskögondegeneration kan blockeras genom att ersätta den endogena linsen med en lins från en ytfisk under embryogenesen. När dessa enögda grottfiskar föds upp till vuxen ålder innehåller den innerverade tektalloben cirka 10% fler celler än den icke-innerverade tektalloben9. På samma sätt, i larvdödfisk som inkuberades med kemiska behandlingar för att generera ögon av olika storlekar inom samma individ, var sidan av tectum med mer innervation större och innehöll fler neuroner10. Bevis från optiska nervkrossexperiment hos vuxna guldfiskar indikerar att innervation främjar proliferation, med tektal cellproliferation som minskar när innervation stördes11.
Bekräftar och utvidgar dessa klassiska studier, flera nya rapporter ger data som tyder på att proliferation som svar på innervation moduleras, åtminstone delvis, av BDNF-TrkB-vägen12,13. Många öppna frågor om optisk tektumtillväxt och utveckling kvarstår, inklusive hur ett utvecklande sensoriskt system hanterar skada och axondegenerering, vilka cellulära och molekylära signaler möjliggör retinal ingång för att reglera optisk tektumtillväxt, när dessa mekanismer blir aktiva och om innervationskopplad proliferation och differentiering gör det möjligt för näthinnan och dess målvävnad att samordna tillväxthastigheter och säkerställa korrekt retinotopisk kartläggning. Dessutom finns det mycket större frågor om aktivitetsberoende utveckling som kan hanteras genom att förhöra zebrafiskens visuella system med kirurgiska tillvägagångssätt som den som beskrivs nedan.
För att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer genom vilka neural aktivitet, specifikt från visuell inmatning, förändrar cellöverlevnad och proliferation, jämför det beskrivna tillvägagångssättet direkt innerverade och denerverade tektallober (Figur 1) inom enskilda zebrafisklarver. Denna metod möjliggör dokumentation av RGC-axondegenerering i det optiska tektumet och bekräftelse på att antalet mitotiska celler korrelerar med innervation.
Figur 1: Skisser av zebrafisklarver före och efter ensidig ögonborttagning. (A) Ritning av 5 dpf larver sett under ett dissekerande mikroskop. Varje larv är inbäddad i lågsmältpunkt agaros och orienterad i sidled innan en volframnål med en skarp, krokad spets används för att skopa ut ögat uppåt (vänster öga i detta exempel). (B) Ritning av den dorsala vyn av en 9 dpf larv som härrör från den operation som avbildas i A. Endast tre mycket schematiserade RGC-axoner från höger öga visas defascikulerande och anslutande med neuroner i vänster tektallob. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; dps = dagar efter operationen; RGC = retinala ganglionceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoderna i detta dokument genomfördes i enlighet med riktlinjer och godkännande av Institutional Animal Care and Use Committees of Reed College och University College London. Se materialförteckningen för detaljer om zebrafiskstammar som används i denna studie.
1. Förbered material och verktyg
- Gör lösningar.
- Gör embryomedium (E314) genom att späda ut en 60x stam (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihydrat och 20 mM MgCl2-hexahydrat i avjoniserat vatten, autoklaverat och förvarat vid rumstemperatur). Tillsätt 160 ml 60x E3 till 10 liter avjoniserat vatten. Förvara i rumstemperatur.
- Gör 1% låg smältpunkt (LMP) agaros i E3. Lös upp 1 g LMP-agaros i 100 ml E3 genom att koka i mikrovågsugnen i 1-2 min vid hög effekt. Alikvot smält agaros i 1,7 ml mikrofugerör och förvaras vid 4 °C. Koka i ett vattenbad och håll i ett 40 ° C värmeblock när det är klart att användas för inbäddning.
- Gör Marcs modifierade ringare (MMR15) isotonlösning genom att späda ut ett 10x lager (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2-dihydrat, 50 mM HEPES, pH justerat till 7,5 med 10 M NaOH, sedan autoklaverat och lagrat vid rumstemperatur). Tillsätt 10 ml 10x MMR till 90 ml avjoniserat vatten.
- Häll Sylgard-plattor enligt tillverkarens instruktioner, så att de kan ställa in och torka i flera dagar16.
- Elektrolytiskt skärpa volframnålar (protokoll modifierat från 17).
- Förbered först en 10% (w / v) KOH-lösning genom att tillsätta 200 ml avjoniserat vatten till en glasburk med bred mun med ett skruvlock. Rör långsamt ner 20 g KOH-pellets.
OBS: Denna kaustiska lösning är mycket exoterm. Använd handskar och ögonskydd och rör om lösningen i huven. - Skär en 2-3 cm längd volframtråd och sätt in den i nålhållaren.
- Anslut katod- och anodkablarna till strömförsörjningen. Fäst alligatorklämman i slutet av katodtråden på ett delvis rakt gem och sätt in gemet i KOH-lösningen och fäst det på sidan av burken.
- Fäst sedan anodtrådens alligatorklämma på nålhållarens hals. Slå på strömmen (till ~ 20 V) och doppa volframtråden i KOH-lösningen och dra tråden ur lösningen i en vinkel för att elektrolytiskt skärpa tråden till en fin spets.
OBS: Bubblor kommer från gemet när reaktionen fortskrider. - Kontrollera nålens spets under dissekeringsmikroskopet för att säkerställa att den är tillräckligt skarp.
- Skölj nålen med avjoniserat vatten för att ta bort alla KOH-rester. Gör flera nålar i förväg och håll dem tills larvoperationerna och dissektionerna.
- Förbered först en 10% (w / v) KOH-lösning genom att tillsätta 200 ml avjoniserat vatten till en glasburk med bred mun med ett skruvlock. Rör långsamt ner 20 g KOH-pellets.
- Gör kammarbilder för avbildning av zebrafiskprover med ett upprätt konfokalmikroskop.
- Skaffa glasmikroskopglas och tvådelat epoxiharts (se materialförteckningen). Blanda epoxin enligt anvisningarna på förpackningen och måla tjocka ringar eller rektanglar på glasrutschbanorna. Låt rutschkanorna härda och torka i huven i minst 24 timmar före användning.
2. Insamling och uppfödning av embryon
- Para ihop vuxna manliga och kvinnliga fiskar av önskade genotyper i avelslådor på sen eftermiddag / tidig kväll. Nästa morgon, efter att de har gytt, samla nybefruktade ägg med en nätsil och överför dem till E3 i 100 mm petriskålar.
- Inkubera embryona vid ~ 27,5 ° C med en 14 h ljus / 10 h mörk cykel fram till operationsdagen. Byt E3 dagligen eller efter behov.
- Foder larverna med en droppare full av skördade roterare en gång om dagen, med början antingen vid 5 dagar efter befruktning (dpf) eller en dag efter operationen. När larverna har flera timmar att äta, byt E3 för att ta bort eventuella kvarvarande roterare och avfallsprodukter.
OBS: Foder inte larver på operationsdagen.
3. Förbered larver för operation
- På operationsdagen, använd en pasteurpipett i stort borrat glas för att överföra 10-15 larver till en 35 mm petriskål fylld med färsk E3.
- Bedöva larverna genom att tillsätta 3-5 droppar 0,4% w/v Trikainlösning (0,4 g Trikain upplöst i 210 mM Tris, pH 9; slutlig lösning justerad till ett pH av 7,4 vid behov18) till skålen för en slutlig koncentration av ~ 0,0015% w/v Trikain. Leta efter brist på svar på beröring för att avgöra om larverna är tillräckligt bedövade. Om de fortfarande är mottagliga för beröring efter ~ 3 minuter, tillsätt ytterligare 2-3 droppar med 0,4% w / v Tricaine-lösning och ompröva.
OBS: Vid detta utvecklingsstadium är det möjligt att övervaka blodflödet och hjärtfrekvensen förutom rörligheten under dissekeringsmikroskopet. - Immobilisera de bedövade zebrafisklarverna genom att bädda in dem i 1% LMP agaros upplöst i E3.
- Placera först locket på en 35 mm petriskål uppåt under dissekeringsmikroskopet. Ta sedan en larv upp i en pasteurpipett av smal borrning med glas med endast en liten mängd E3.
- Aspirera sedan ~ 200 μL smält, varmt (~ 40 ° C) 1% LMP agaros i pipetten med larven. Slutligen spruta larven och agarose på det upp och ner petri skållocket.
- Använd en tråkig volframnål för att snabbt men försiktigt manövrera larven så att den är lateral, med ett öga uppåt. Vänta tills agarosen har satt sig (~ 5 min).
OBS: Om agarosen härdar medan larven inte är lateral, frigör den från agarosen (som beskrivs i steg 5) och sätt tillbaka den i skålen med E3 och trikain.
4. Ögonborttagning
- När agarosen är inställd och larven är placerad i sidled, använd spetsen på en mycket fin, elektrolytiskt skärpt volframnål för att genomborra huden runt ögat och följa kanten av ögonbanan.
- Skjut sedan nålens kant (inte spetsen) under ögat från den temporala ventrala sidan av ögat. Använd kontrollerat tryck för att frigöra ögat från uttaget.
- Använd mycket fina kirurgiska pincett för att ta bort ögat genom att klämma på synnerven och trycka ögat från medial till lateral. Alternativt, fortsätt helt enkelt att trycka ögat dorsalt och främre med nålsidan, så småningom skära genom synnerven och släppa ögat.
OBS: Om andra vävnader än ögat av misstag sticks under operationen, dödar larven snabbt och humant genom snabb halshuggning.
5. Postoperativ vård fram till experimentellt effektmått
- Efter framgångsrik ögonborttagning, täck agarosen med MMR-lösning.
- Befria varje larv från agarosen genom att försiktigt borsta en volframnål runt huvudet och sedan runt kroppen medan du stabiliserar petriskållocket med pincett.
- Överför de enögda larverna till en 35 mm petriskål som innehåller MMR kompletterad med en 1:100-utspädning av en penicillin/streptomycincocktail. Inkubera embryona vid ~ 27,5 ° C med en 14 h ljus / 10 h mörk cykel.
OBS: Denna isotoniska lösning av MMR kompletterad med antibiotika hjälper initialt larvläkning och överlevnad. Varje maträtt kan rymma upp till 15 återhämtande larver. - Nästa dag, returnera larverna till E3. Från och med eftermiddagen efter operationen matar du larver (~ 6 dpf och äldre) med en droppare full av skördade roterare en gång om dagen. Efter att larverna har haft flera timmar att äta, byt E3 för att ta bort eventuella kvarvarande roterare och avfallsprodukter.
6. Fixering av larver
- När larverna har nått det önskade utvecklingsstadiet för analys, bedöva dem med en dödlig dos trikain (~ 0,4% slutlig koncentration) tills deras hjärtan har slutat.
- Pipett upp till 30 larver per 1,5 ml mikrofugerör. Ta bort överskott av E3 och tillsätt sedan 0,5-1 ml fixativ lösning (4% paraformaldehyd (PFA) och 4% sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) för att fixera vävnaden. Ruva larverna över natten vid 4 °C.
- Tvätta larverna med PBS nästa dag genom att ta bort fixeringsmedlet och skölj larverna 3-4 gånger med PBS. Förvara larverna vid 4 °C i upp till 7 dagar före dissektion.
7. Dissekera larver för att avslöja hjärnor (anpassad från 15)
- Häng upp de fasta larverna i PBS-droppar på en Sylgard-platta under ett dissekerande mikroskop. Säkra dem i sidled genom att placera två volframstift (vanligtvis gamla volframnålar som är mindre än 2 cm) genom notokordet, med en stift precis bakom det pigmenterade området som täcker aorta-gonad-mesonephros (AGM) -regionen och en annan i linje med slutet av äggulaförlängningen.
OBS: Placera volframstiften i så få försök som möjligt eftersom vävnaden blir mer spröd med varje punktering. - Använd en mycket skarp volframnål och nålskarpa pincett för att exponera hjärnan genom att i denna ordning ta bort ögat( öronen, käken, matsmältningskanalen och dorsal kranialhud.
- Ta först bort ögat med en teknik som liknar den kirurgiska ögonborttagningen i steg 4. Lossa sedan larven och vänd den till motsatt sida, så att det andra ögat är tillgängligt och upprepas. Alternativt kan du sticka nålen genom käken till andra sidan och ta bort ögat utan att lossna.
OBS: Ögon kan samlas in vid denna tidpunkt om analys av denna vävnad önskas (liknande 19). - Använd sedan volframnålen för att repa från den temporala till den ventrala sidan av örat. I samma åtgärd / rörelse, ta nålen bakom käken och dra försiktigt framåt tills örat och käken tas bort.
- Använd pincett för att dra ut de ventrala organen och eventuell kvarvarande äggula.
- Slutligen, gör ett grunt snitt i dorsalkranialhuden nära korsningen mellan bakhjärnen och ryggmärgen. Lyft huden med tången och dra den framåt och runt telencefalonen. Om detta visar sig vara för svårt, börja vid det första snittet i bakhjärnen och dra huden först i sidled och sedan ventralt och främre, var noga med att inte repa sidokanterna på tectum.
OBS: Eftersom mitthjärnen är föremål för studier kan bakhjärnen skäras; ett djupt snitt kan dock leda till halshuggning. - Ta bort eventuell kvarvarande vävnad med pincett. Lossa larven och överför till PBS i ett 1,5 ml mikrofugerör.
OBS: Lämna svansen fäst vid hjärnan för bättre synlighet när du utför fullmonterade protokoll.
- Ta först bort ögat med en teknik som liknar den kirurgiska ögonborttagningen i steg 4. Lossa sedan larven och vänd den till motsatt sida, så att det andra ögat är tillgängligt och upprepas. Alternativt kan du sticka nålen genom käken till andra sidan och ta bort ögat utan att lossna.
8. Hjärn uttorkning och lagring
- Ta bort PBS från hjärnan och tillsätt 1 ml PBS innehållande 0,1% TritonX-100 (PBST). Inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur.
- Ta bort PBST och ersätt den med en 50:50 metanol: PBST-lösning. Inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta hjärnan med 100% metanol (MeOH) två gånger i 5 minuter vardera vid rumstemperatur.
- Förvara hjärnorna i 100% MeOH vid -20 ° C i minst 16 timmar innan du utför immunohistokemi eller andra fullsatta procedurer.
OBS: Hjärnor kan lagras i MeOH i upp till 2 år vid -20 ° C.
9. Immunohistokemi
OBS: Etablerade protokoll för många användbara fullkornstekniker i zebrafisk finns på ZFIN20. Detta manuskript ger exempel som jämför enögda och tvåögda larver som immunfärgades med antikroppar som känner igen antingen det röda fluorescerande proteinet (RFP), vilket uttrycks i optiska nervaxoner i Tg [atoh7: RFP] -linjen (figur 2) eller fosforylerad histon H3 (PH3), som belyser mitotiska celler (figur 3). Ett standard immunohistokemiprotokoll för fullkorniga embryon och larver sammanfattas nedan.
- Först rehydrera larvhjärnorna med en graderad serie MeOH: PBST tvättar vid rumstemperatur genom att inkubera proverna i 50:50 MeOH: PBST i 5 min, sedan i 30:70 MeOH: PBST i 5 minuter och slutar med 3 tvättar PBST.
- För att permeabilisera hjärnorna, inkubera dem i PBST kompletterat med proteinas K (PK) vid en slutlig koncentration av 20 μg /ml PK i 30 min vid 37 °C. Förvara alikvoter på 10 mg/ml PK vid -20 °C och tina dem före användning.
- Ta bort PK-lösningen och tvätta bort eventuellt kvarvarande enzym genom att skölja hjärnan med PBST 3 gånger under 15 minuter.
- Refix de permeabiliserade hjärnorna genom att inkubera dem i 4% PFA i 20 min vid 25 ° C (eller rumstemperatur). Ta sedan bort PFA och tvätta bort eventuellt kvarvarande fixeringsmedel genom att skölja hjärnan 3 gånger under 15 minuter med PBST.
- Byt ut den slutliga PBST-sköljningen mot nytillverkad immunblockerande (IB) buffert (10% normalt getserum och 1% DMSO i PBST) och inkubera vid rumstemperatur i minst 1 timme.
- Späd ut primära antikroppar i IB-buffert vid lämplig koncentration (t.ex. 1:500 för RFP och 1:300 för PH3-antikroppar).
- Ta bort IB-buffert från hjärnor och ersätt den med den primära antikroppsutspädningen. Inkubera över natten vid 4 ° C på en orbital shaker med mild gungning. Se till att rören vilar säkert på sina sidor.
- Nästa morgon, ta bort den primära antikroppslösningen med en mikropipett, skölj ett par gånger i PBST och tvätta sedan hjärnorna i PBST vid rumstemperatur i 4 x 30 min.
OBS: Primära antikroppsutspädningar kan återanvändas en gång inom ~ 7 dagar om de förvaras vid 4 ° C. - Skölj hjärnorna i IB-buffert medan du späder sekundära antikroppar i IB-buffert i lämplig koncentration (t.ex. 1:500 för Alexa-fluor 568 antikanin).
- Ta bort IB-bufferten och ersätt den med den sekundära antikroppsutspädningen. Inkubera över natten vid 4 ° C på en orbital shaker med mild gungning av rören som vilar på sidorna.
- Nästa morgon, ta bort den sekundära antikroppslösningen, skölj med PBST och tvätta sedan hjärnor i PBST vid rumstemperatur i 4 x 30 min.
- Motfläck med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller ToPro3 (1:5 000 i PBST vid 4 °C över natten).
- Nästa morgon, överför larvhjärnorna till PBS och fortsätt till monterings- och bildstegen nedan.
10. Montering och avbildning
- Säkra en kammarrutschkana i locket på en 100 mm petriskål med vakuumfett.
- Överför de immunfärgade och bearbetade larverna till en brunnsplatta eller depressionsglidning för att se dem med ett dissekerande mikroskop.
- Montera larverna på kammarbilden i kolumner med 1% LMP agaros.
- Använd en pasteurpipett av glas och lägg en larva på kammarbilden och deponera så lite PBS som möjligt. Täck larven med smält 1% LMP agaros (~ 40 ° C) med samma pipett.
- Med en trubbig volframnål eller pincett, dra agarosen i en kolonn och placera sedan larven så symmetriskt som möjligt, med dorsalytan synlig.
- Upprepa denna procedur för de återstående larverna.
- När agarosen har gelat, täck den med några droppar PBS och placera den sedan på scenen i konfokalmikroskopet.
- Rikta in objektivlinsen mot provet, fokusera mikroskopet med överfört ljus och belysa provet med lämpliga lasrar.
OBS: I detta exempel användes 405 nm och 568 nm våglängder för att excitera DAPI respektive RFP. - Justera förstärkningen, förskjutningen och lasereffekten genom att flytta skjutreglagen till en lämplig nivå i förhållande till signalen och den använda detektorn. Kontrollera histogrammen för varje kanal och klicka på knappen Mättnadsindikator ovanför bilden för att mäta exponeringsnivån, se till att ingen av pixlarna är mättade och att signal-brusförhållandet är högt. För ett exempel på optimala konfokala avbildningsparametrar för cellulär och subcellulär upplösning inom zebrafisk, se 21.
- Ställ in de övre och nedre gränserna för stapeln med z-plan genom att använda rullningshjulet på musen för att hitta toppen och botten av provet. Klicka på de övre och nedre gränserna för bildförvärv och utlösa sedan z-stack-inspelningen genom att klicka på knappen Kör nu .
OBS: Beroende på hur symmetriskt hjärnan är monterad kommer det totala z-djupet för en 9 dpf larvzebrafiskhjärna att vara ~ 150-200 μm. - Bearbeta och färglägg bilderna med färgblind tillgänglighet i åtanke (använd t.ex. blått och orange eller magenta och grönt för tvåfärgsbilder). Ställ in uppslagstabeller i programvaran som används för att fånga bilder eller bildbehandlingsprogram som Photoshop från Adobe.
- I Photoshop sparas färgråfotomikrografer som sparats som 8-bitars taggade bildfilformat (TIFF) genom att (i) konvertera bildläget till RGB och (ii) komma åt alternativet Kurvor under bild- | Justera menyer och sedan (iii) skjuta lämpliga färgade ljusutgångar till 0 eller 255 nivåer för att uppnå önskad färg. Till exempel, för att uppnå en grön signal, välj den röda kanalen och skjut dess utgång till 0; Välj sedan den blå kanalen och skjut dess utgång till 0 också. På samma sätt, för att uppnå en magentasignal, välj den gröna kanalen och skjut dess utgång till 0; lämna de röda och blå kanalerna som de är.
OBS: Liknande steg kan utföras i det kostnadsfria Gnu Image Manipulation Program (GIMP). - Kvantifiera manuellt antalet celler som visar en specifik markör med hjälp av cellräknarens plugin i ImageJ22, som finns under Analysera i menyn Plugins. Exempel på hur du använder ImageJ för cellräkning finns i många självstudier, inklusive 23.
- Generera grafiska representationer av data i statistisk programvara som RStudio (se kompletterande data för . Rmd-fil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bekräfta om ögonborttagningen var fullständig och bedöma hur det optiska tektumet förändras utfördes operationer i Tg [atoh7: RFP] -stammen, som märker alla RGC med en membranriktad RFP och därmed alla axoner som projicerar från näthinnan och bildar synnerven24. Även om det inte är absolut nödvändigt att använda denna stam, möjliggör den enkel observation och visualisering av synnervens termini i den optiska tectum neuropilen. Andra metoder för märkning av synnerven, såsom axonspårning med lipofila DiI- eller DiO-färgämnen25,26 eller multispektral märkning med hjärnbåge27, skulle också vara möjliga.
Som visas i figur 2 observerades progressiv degeneration av retinala axoner i den optiska tectumneuropilen efter ögonborttagning. Två dagar efter operationen uppvisade RFP-märkta axoner kännetecken för snabb wallerisk degeneration28 såsom blebbing och fragmentering (figur 2A, B). Nytt arbete har visat att mikroglia uppslukar mer myelinmaterial när neuroner tystas29. I överensstämmelse med mikroglia som uppslukade bitar av de degenererande RGC-axonerna och migrerade bort från källan till degeneration, noterades ljusa RFP-märkta puncta inom och utanför tectal neuropil (Figur 1B, pilar). Fyra dagar efter operationen reduceras fragmenterade axoner och RFP-märkta axonala skräp avsevärt i endera tektalloben, vilket indikerar relativt snabb clearance av de döende och degenererande axonerna (Figur 2C, D).
För att utföra fullskalig immunohistokemi och visualisera det optiska tectumet hos larvzebrafiskar exponerades hjärnan genom att dissekera ögat, käken, öronen och skallen på huden och bindväven. Helst förblir hjärnan intakt under denna procedur (t.ex. figur 2C, D). Delar av framhjärnan, särskilt luktlampan, kommer emellertid sannolikt att skadas eller helt avlägsnas när skalllocket på huden eller käken tas bort (figur 2A, pilspets). Dessutom kan ibland tektumets sidokant skivas när man genomborrar eller klämmer på huden för att dra den från hjärnan (t.ex. figur 2A; riva på höger tektallob).
Immunohistokemi användes också för att bedöma antalet mitotiska celler i innerverade och icke-innerverade lober i det optiska tektumet genom att färga hela hjärnor med en PH3-antikropp. Dessa data visar signifikant färre mitotiska celler på den denerverade sidan av enögd larvfisk (p = 0,00033, Welchs t-test; Figur 3).
Figur 2: Ögonborttagning vid 5 dpf utlöser degenerering av optiska nervaxoner. (A-D) Representativa projektioner med maximal intensitet som visar dorsala vyer av vilda hjärnor från intakta larver fixerade vid 7 dpf (A) eller 9 dpf (C), eller enögda larver från ögonutrotningsoperationer vid 5 dpf, fasta 2 dps (B) eller 4 dps (D). Alla kärnor är färgade med DAPI (grön), och optiska nervaxoner som slutar i neuropilen i det optiska tektumet är märkta med atoh7: RFP-transgenen (magenta). Asterisk indikerar innerverad tektal neuropil hos larver med endast höger öga intakt. Pilar indikerar exempel på fragment av degenererade RGC-axoner som härrör från det denerverade optiska tectumet. Pilspetsen indikerar saknade delar av framhjärnan. Skalstång = 50 μm. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; dps = dagar efter operationen; RGC = retinala ganglionceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Antalet mitotiska celler i det optiska tektumet ökar med innervation. (A-B) Representativa projektioner med maximal intensitet som visar dorsala vyer av vilda hjärnor från intakta (A) eller enögda (B) 9 dpf larver immunfärgade med antikroppar för den mitotiska markören PH3 (magenta) och kärnor motfärgade med DAPI (grön). Asterisk indikerar innerverad tectal neuropil från det intakta högra ögat. (C) Boxdiagram med alla enskilda datapunkter överlagrade som visar kvantitation av förhållandet mellan PH3+-celler i innerverad (vänster) kontra denerverad (höger) tektallob som ett differensförhållande (vänster-höger/totalt) för enögda (n = 12) och tvåögda (n = 8) 9 dpf-larver. Medel för de två villkoren jämfört med Welchs t-test (***, p < 0,0005). Skalstång = 50 μm. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; dps = dagar efter operationen; PH3 = fosforylerad histon H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil: Disposition och instruktioner för diagram som visas i figur 3C. Den här filen innehåller all data och kod så att vem som helst kan reproducera rutdiagrammet med alla datapunkter överlagrade, som visas i figur 3C. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tekniker som beskrivs i denna uppsats illustrerar en av många metoder för att studera ryggradsdjurs visuella systemutveckling hos zebrafiskar. Andra forskare har publicerat metoder för att dissekera den embryonala näthinnan och utföra genuttrycksanalyser19 eller visualisera neuronal aktivitet i det optiska tectum30. Detta dokument ger ett tillvägagångssätt för att utforska hur differentiell retinal inmatning kan påverka cellbeteenden i det optiska tectumet.
För att säkerställa framgångsrik ögonutrotning och larvöverlevnad efter operationen är det viktigt att larverna är friska, tillräckligt bedövade och immobiliserade i 1% agaros. Det är också viktigt att pincett och volframnålar är mycket skarpa och rena. Larver överlever bäst när de inte matas 24 timmar före eller efter operationen, och uppfödning av larver i MMR kompletterat med antibiotika påskyndar läkningsprocessen. Viktigt är att den högre jonstyrkan hos MMR och särskilt den högre koncentrationen av kalcium främjar läkning14. Längre exponering för den högre salthalten kan dock minska överlevnaden, liknande vad som har dokumenterats hos embryonalazebrafiskar 31. Ett mest kritiskt steg är fixering för att säkerställa framgångsrika hjärndissektioner, som är väsentliga för dataanalys av bilder av immunfärgade prover. Att använda nytillverkad 4% PFA kompletterad med 4% sackaros (kärleksfullt kallad söt fix) tenderar att öka enkel borttagning av hud och bevarande av hjärnvävnad. Precis som med operationerna är vassa och rena verktyg ett måste för att dissekera hjärnor.
En av de största utmaningarna med detta protokoll är att bädda in larver för ögonutplåning. Det är viktigt att varje person hittar det sätt som fungerar bäst för dem så att de säkert och snabbt kan ta bort larvögat. Om larven av misstag stickas under operationen, döda den humant genom halshuggning. En annan utmaning är att bestämma de mest effektiva antikroppskoncentrationerna för fullmonterad immunfärgning. Vid bestämning av lämpliga antikroppskoncentrationer, använd den publicerade litteraturen som utgångspunkt och optimera protokollet eftersom användning av publicerade reagenser på olika vävnader (särskilt på större vävnader eller äldre djur) kan kräva ökade koncentrationer och / eller inkubationstider.
Den största begränsningen av denna metod är den tid ett enda experiment tar från början till slut och antalet fiskar som kan studeras vid varje given tidpunkt. Till exempel tog alla data som visas i figur 3 ungefär en månad från den första parningen av fisk till den slutliga datainsamlingen och analysen. Denna relativt låga genomströmningsmetod kan kompletteras med heterologa genetiska metoder som antingen selektivt tystar neural aktivitet i det visuella systemet32,33 eller av mutanter som saknar RGC-axoner eller aktivitet34,35.
Betydelsen av denna metod är att den ger en traditionell embryologisk teknik att bära på moderna transgena fisklinjer, vilket möjliggör direkt jämförelse av cellulära och genetiska mekanismer som arbetar i var och en av tektalloberna inom samma individ. Dessutom är denna metod mogen för tillämpning på andra experimentella system, inklusive Astyanax ytfisk36 och / eller transgena zebrafisklarver med fluorescerande märkta mikroglia 37,38,39 och astrocyter40 för att studera hur det utvecklande fisknervsystemet svarar på en sådan dramatisk skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering för detta arbete stöddes främst av startfonder från Reed College till KLC, Helen Stafford Research Fellowship-medel till OLH och ett Reed College Science Research Fellowship till YK. Detta projekt började i Steve Wilsons labb som ett samarbete med HR, som stöddes av ett Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Vi tackar Máté Varga, Steve Wilson och andra medlemmar av Wilson-laboratoriet för inledande diskussioner om detta projekt, och vi tackar särskilt Florencia Cavodeassi och Kate Edwards, som var de första som lärde KLC hur man monterar embryon i agaros och utför zebrafiskhjärndissektioner. Vi tackar också Greta Glover och Jay Ewing för hjälp med att montera vår volframnålslipningsenhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation. | ||
| Fine forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae. |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions. | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. | Available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
References
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
- Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
- Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
- Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
- Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
- Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
- White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
- Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
- Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
- Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A.
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
- Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
- ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
- Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
- ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
- Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
- Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
- Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
- de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
- Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
- Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
- Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
- Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
- Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
- Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
- Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
- Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
- Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
- Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).
