Summary
Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.
Abstract
Zebra balığı, yaşam boyu olağanüstü büyüme ve rejeneratif yetenekler sergiler. Örneğin, embriyogenez sırasında kurulan özel kök hücre nişleri, hem gözde hem de beyinde tüm görsel sistemin sürekli büyümesini destekler. Retina ve optik tektum arasındaki koordineli büyüme, gözlere ve beyne yeni nöronlar eklendikçe doğru retinotopik haritalamayı sağlar. Retinal aksonların hayatta kalma, proliferasyon ve / veya farklılaşma gibi tektal kök ve progenitör hücre davranışlarını düzenlemek için önemli bilgiler sağlayıp sağlamadığını ele almak için, aynı hayvan içindeki ve hayvanlar arasındaki innerve ve denervated tektal lobları karşılaştırabilmek gerekir.
Canlı larva zebra balığından bir gözün cerrahi olarak çıkarılması ve ardından optik tektumun gözlemlenmesi bu amaca ulaşır. Eşlik eden video, larvaların nasıl anestezi altına alınacağını, tungsten iğnelerinin elektrolitik olarak keskinleştirileceğini ve bir gözü çıkarmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Daha sonra beyinlerin sabit zebra balığı larvalarından nasıl disseke edileceğini gösterir. Son olarak, video immünohistokimya protokolüne genel bir bakış ve mikroskopi için düşük erime noktalı agarozda boyalı embriyoların nasıl monte edileceğine dair bir gösteri sunmaktadır.
Introduction
Bu yöntemin amacı, retinal girdinin zebra balığı beynindeki görsel işlem merkezi olan optik tektumun büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaktır. Bir gözün çıkarılması ve ardından optik tektumun iki tarafının karşılaştırılmasıyla, aynı numunedeki tektal değişiklikler gözlemlenebilir ve normalleştirilebilir, böylece birden fazla örnek arasında karşılaştırma yapılabilir. Bu teknikle birleştirilen modern moleküler yaklaşımlar, görsel sistem büyümesi ve gelişiminin altında yatan mekanizmaların yanı sıra aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon hakkında fikir verecektir.
Duyusal sistemler - görsel, işitsel ve somatosensoriyel - dış organlardan bilgi toplar ve bu bilgiyi merkezi sinir sistemine iletir, orta beyindeki dış dünyanın "haritalarını" oluşturur 1,2. Görme, birçok balık da dahil olmak üzere neredeyse tüm omurgalılar için baskın duyusal modalitedir. Gözdeki nöral doku olan retina, öncelikle retinanın projeksiyon nöronları olan fotoreseptörler, bipolar hücreler ve retinal ganglion hücrelerinden (RGC'ler) oluşan nöronal bir devre ile bilgi toplar. RGC'ler, retinanın iç yüzeyinden optik sinir kafasına giden yolu bulan uzun aksonlara sahiptir, burada beyinde büyülenir ve birlikte hareket ederler, sonuçta dorsal orta beyindeki görsel işlem merkezinde sona ererler. Bu yapıya balıklarda ve diğer memeli olmayan omurgalılarda optik tektum denir ve memelilerdeki üstün kollikulusa homologdur3.
Optik tektum, dorsal orta beyinde bilateral simetrik çok katmanlı bir yapıdır. Zebra balıklarında ve diğer balıkların çoğunda, optik tektumun her bir lobu yalnızca kontralateral gözden görsel girdi alır, böylece sol optik sinir sağ tektal lobda sona erer ve sağ optik sinir sol tektallobda sona erer 4 (Şekil 1). Memeli meslektaşı olan üstün kollikulus gibi, optik tektum da görsel bilgiyi seçmeler ve somatosensation dahil olmak üzere diğer duyusal girdilerle bütünleştirir, görsel dikkatteki kaymaları ve sakkadlar 1,5,6 gibi göz hareketlerini kontrol eder. Bununla birlikte, memeli superior kollikulusundan farklı olarak, optik tektum, tektal proliferasyon bölgesi7 olarak adlandırılan tektal lobların medial ve kaudal kenarlarının yakınındaki özel bir kök hücre nişinden sürekli olarak yeni nöronlar ve glia üretir. Optik tektumda ve merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde proliferatif progenitörlerin bakımı, kısmen, zebra balığı8'de belgelenen olağanüstü rejeneratif kapasiteye katkıda bulunur.
Kör veya tek gözlü balıkların beyinlerini inceleyen önceki çalışmalar, optik tektum büyüklüğünün aldığı retinal innervasyon miktarıile doğru orantılı olduğunu ortaya koymuştur 9,10,11. Gözleri erken embriyogenezde dejenere olan yetişkin mağara balıklarında, optik tektum, yakından ilişkili, gören yüzey balıklarından belirgin şekilde daha küçüktür9. Mağara balık gözü dejenerasyonu, embriyogenez sırasında endojen lensin yüzey balığından bir mercekle değiştirilmesiyle engellenebilir. Bu tek gözlü mağara balıkları yetişkinliğe yetiştirildiğinde, innerve tektal lob, innerve edilmemiş tektal lobdan yaklaşık% 10 daha fazla hücre içerir9. Benzer şekilde, aynı birey içinde farklı boyutlarda gözler üretmek için kimyasal işlemlerle inkübe edilen larva killifish'te, tektumun daha fazla innervasyona sahip tarafı daha büyüktü ve daha fazla nöron içeriyordu10. Yetişkin akvaryum balıklarında optik sinir ezme deneylerinden elde edilen kanıtlar, innervasyonun proliferasyonu desteklediğini, innervasyon bozulduğunda tektal hücre proliferasyonunun azaldığını göstermektedir11.
Bu klasik çalışmaları doğrulayan ve genişleten birkaç yeni rapor, innervasyona yanıt olarak proliferasyonun, en azından kısmen, BDNF-TrkB yolu12,13 tarafından modüle edildiğini gösteren veriler sunmaktadır. Gelişmekte olan bir duyusal sistemin yaralanma ve akson dejenerasyonu ile nasıl başa çıktığı, hangi hücresel ve moleküler sinyallerin retina girişinin optik tektum büyümesini düzenlemesini sağladığı, bu mekanizmaların ne zaman aktif hale geldiği ve innervasyona bağlı proliferasyon ve farklılaşmanın retina ve hedef dokusunun büyüme oranlarını koordine etmesini ve doğru retinotopik haritalamayı sağlamasını sağlayıp sağlamadığı da dahil olmak üzere optik tektum büyümesi ve gelişimi hakkında birçok açık soru devam etmektedir. Ek olarak, zebra balığı görsel sistemini aşağıda tarif edilenler gibi cerrahi yaklaşımlarla sorgulayarak ele alınabilecek aktiviteye bağlı gelişim hakkında çok daha büyük sorular vardır.
Nöral aktivitenin, özellikle görsel girdiden, hücre sağkalımını ve proliferasyonunu değiştirdiği hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için, tarif edilen yaklaşım, bireysel zebra balığı larvaları içindeki innerve ve denervated tektal lobları (Şekil 1) doğrudan karşılaştırmaktadır. Bu yöntem, optik tektumdaki RGC akson dejenerasyonunun belgelenmesine ve mitotik hücrelerin sayısının innervasyon ile ilişkili olduğunun doğrulanmasına izin verir.
Şekil 1: Zebra balığı larvalarının tek taraflı göz çıkarılmasından önce ve sonra çizikleri . (A) Diseksiyon mikroskobu altında görüldüğü gibi 5 dpf larvasının çizimi. Her larva, düşük erime noktalı agaroza gömülür ve gözü yukarı bakacak şekilde çıkarmak için keskin, kancalı bir ucu olan bir tungsten iğnesi kullanılmadan önce yanal olarak yönlendirilir (bu örnekte sol göz). (B) A'da tasvir edilen ameliyattan kaynaklanan 9 dpf larvanın dorsal görünümünün çizilmesi. Sağ gözden sadece üç yüksek şematize RGC aksonunun defasciculating olduğu ve sol tektal lobdaki nöronlarla bağlandığı gösterilmiştir. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; dps = ameliyat sonrası günler; RGC = retinal ganglion hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makaledeki yöntemler, Reed College ve University College London'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitelerinin kılavuzlarına ve onayına uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada kullanılan zebra balığı suşları hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Malzeme ve araçlar hazırlayın
- Çözümler üretin.
- 60x'lik bir stoğu (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihidrat ve 20 mM MgCl2-hekzahidrat) deiyonize suda seyrelterek, otoklavlanmış ve oda sıcaklığında saklanarak embriyo ortamı (E314) yapın. 10 L deiyonize suya 160 mL 60x E3 ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
- E3'te% 1 düşük erime noktası (LMP) agarozu yapın. 1 g LMP agarozunu mikrodalgada yüksek güçte 1-2 dakika kaynatarak 100 mL E3 içine çözün. Aliquot erimiş agaroz 1.7 mL mikrofüj tüplerine dönüşür ve 4 ° C'de saklanır. Bir su banyosunda kaynatın ve gömme için kullanıma hazır olduğunda 40 ° C'lik bir ısı bloğunda tutun.
- Marc'ın Modifiye Zil Seslerini (MMR15) izotonik solüsyonunu 10x stoğu seyrelterek yapın (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihidrat, 50 mM HEPES, pH 10 M NaOH ile 7,5'e ayarlanmış, daha sonra otoklavlanmış ve oda sıcaklığında saklanmış). 90 mL deiyonize suya 10 mL 10x MMR ekleyin.
- Sylgard plakalarını üreticinin talimatlarına göre dökün, birkaç gün boyunca ayarlamalarına ve kurutmalarına izin verin16.
- Tungsten iğnelerini elektrolitik olarak keskinleştirin ( protokol 17'den değiştirildi).
- İlk olarak, vidalı kapaklı geniş ağızlı bir cam kavanoza 200 mL deiyonize su ekleyerek% 10'luk bir (w / v) KOH çözeltisi hazırlayın. 20 g KOH peletinde yavaşça karıştırın.
NOT: Bu kostik çözelti oldukça ekzotermiktir. Eldiven ve göz koruması giyin ve solüsyonu kaputta karıştırın. - 2-3 cm uzunluğunda tungsten tel kesin ve iğne tutucuya yerleştirin.
- Katot ve anot tellerini güç kaynağına bağlayın. Katot telinin ucundaki timsah klipsini kısmen düzleştirilmiş bir ataşa takın ve ataşı kavanozun yanına takarak KOH çözeltisine yerleştirin.
- Ardından, anot telinin timsah klipsini iğne tutucunun boynuna takın. Gücü açın (~ 20 V'a) ve tungsten telini KOH çözeltisine batırın, teli elektrolitik olarak ince bir uca keskinleştirmek için teli çözeltiden bir açıyla çekin.
NOT: Reaksiyon ilerledikçe kabarcıklar ataştan gelecektir. - Yeterince keskin olduğundan emin olmak için iğnenin ucunu diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin.
- Tüm KOH kalıntılarını gidermek için iğneyi deiyonize suyla durulayın. Önceden birkaç iğne yapın ve larva ameliyatlarına ve diseksiyonlarına kadar saklayın.
- İlk olarak, vidalı kapaklı geniş ağızlı bir cam kavanoza 200 mL deiyonize su ekleyerek% 10'luk bir (w / v) KOH çözeltisi hazırlayın. 20 g KOH peletinde yavaşça karıştırın.
- Zebra balığı örneklerini dik konfokal mikroskopla görüntülemek için odacıklı slaytlar yapın.
- Cam mikroskop slaytları ve iki parçalı epoksi reçine elde edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Epoksiyi paketin üzerindeki talimatlara göre karıştırın ve cam slaytlara kalın halkalar veya dikdörtgenler boyayın. Kullanmadan önce kızakların davlumbazda en az 24 saat sertleşmesine ve kurumasına izin verin.
2. Embriyo toplama ve yetiştirme
- İstenilen genotiplerdeki yetişkin erkek ve dişi balıkları öğleden sonra / akşamın erken saatlerinde üreme kutularında eşleştirin. Ertesi sabah, yumurtladıktan sonra, yeni döllenmiş yumurtaları bir ağ süzgeci ile toplayın ve 100 mm Petri tabaklarında E3'e aktarın.
- Embriyoları ameliyat gününe kadar 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngü ile ~ 27.5 ° C'de inkübe edin. E3'ü günlük olarak veya gerektiğinde değiştirin.
- Larvaları, döllenmeden (dpf) 5 gün sonra veya ameliyattan bir gün sonra başlayarak, günde bir kez hasat edilmiş rotiferlerle dolu bir damlalık kullanarak besleyin. Larvaların yemek için birkaç saati olduktan sonra, kalan rotiferleri ve atık ürünleri çıkarmak için E3'ü değiştirin.
NOT: Ameliyat günü larvaları beslemeyin.
3. Larvaları ameliyat için hazırlayın
- Ameliyat gününde, 10-15 larvayı taze E3 ile doldurulmuş 35 mm'lik bir Petri kabına aktarmak için geniş delikli, cam bir Pasteur pipet kullanın.
- Larvaları, ~% 0.0015 w / v Trikain çözeltisi (210 mM Tris, pH 9'da çözünmüş 0.4 g Trikain; gerekirse 7.4 pH'a ayarlanmış son çözelti18) ile 3-5 damla% 0.4 / v Trikain çözeltisi ekleyerek anestezi yapın. Larvaların yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını belirlemek için dokunmaya yanıt eksikliğini arayın. ~ 3 dakika sonra dokunmaya hala duyarlılarsa, Trikain çözeltisi ile% 0.4'lük 2-3 damla daha ekleyin ve yeniden değerlendirin.
NOT: Gelişimin bu aşamasında, diseksiyon mikroskobu altında hareketliliğe ek olarak kan akışını ve kalp atış hızını izlemek mümkündür. - Anestezi uygulanan zebra balığı larvalarını, E3'te çözünmüş% 1 LMP agarozuna gömerek hareketsiz hale getirin.
- İlk olarak, 35 mm'lik bir Petri kabının kapağını diseksiyon mikroskobunun altına yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, bir larvayı sadece az miktarda E3 içeren dar delikli, cam bir Pasteur pipetine alın.
- Daha sonra, ~ 200 μL erimiş, ılık (~ 40 ° C)% 1 LMP agarozunu larva ile pipete aspire edin. Son olarak, larva ve agarozu baş aşağı Petri kabı kapağına fışkırtın.
- Larvaları hızlı ama nazik bir şekilde manevra yapmak için donuk bir tungsten iğnesi kullanın, böylece bir gözü yukarı bakacak şekilde yanal olur. Agarozun ayarlanmasını bekleyin (~ 5 dk).
NOT: Larva yanal değilken agaroz sertleşirse, agarozdan (adım 5'te açıklandığı gibi) serbest bırakın ve E3 ve trikain ile yemeğe geri koyun.
4. Göz giderme
- Agaroz ayarlandıktan ve larva yanal olarak konumlandırıldıktan sonra, göz yörüngesinin kenarını takip ederek göz çevresindeki cildi delmek için çok ince, elektrolitik olarak keskinleştirilmiş bir tungsten iğnesinin ucunu kullanın.
- Daha sonra, iğnenin kenarını (ucu değil) gözün altından gözün zamansal-ventral tarafından kaydırın. Gözü soketten çıkarmak için kontrollü basınç kullanın.
- Optik siniri sıkıştırarak ve gözü medialden laterale iterek gözü çıkarmak için çok ince cerrahi forseps kullanın. Alternatif olarak, gözü iğnenin yan tarafıyla dorsal ve ön olarak bastırmaya devam edin, sonunda optik siniri dilimleyin ve gözü serbest bırakın.
NOT: Ameliyat sırasında göz dışındaki dokular yanlışlıkla bıçaklanırsa, larvaları hızlı ve insancıl bir şekilde hızlı bir şekilde kafa keserek öldürün.
5. Deneysel son noktaya kadar ameliyat sonrası bakım
- Başarılı bir göz çıkarılmasından sonra, agarozu MMR çözeltisi ile örtün.
- Petri kabı kapağını forsepslerle stabilize ederken, başlarının etrafına ve daha sonra vücutlarının etrafına bir tungsten iğnesi hafifçe fırçalayarak her larvayı agarozdan kurtarın.
- Tek gözlü larvaları, bir penisilin / streptomisin kokteylinin 1:100 seyreltilmesiyle desteklenmiş MMR içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Embriyoları ~ 27.5 ° C'de 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngü ile inkübe edin.
NOT: Antibiyotiklerle desteklenen MMR'nin bu izotonik çözeltisi başlangıçta larva iyileşmesine ve hayatta kalmasına yardımcı olur. Her yemek 15'e kadar iyileşen larva tutabilir. - Ertesi gün larvaları E3'e geri döndürün. Ameliyattan sonraki öğleden sonra başlayarak, larvaları (~ 6 dpf ve üstü) günde bir kez hasat edilmiş rotiferlerle dolu bir damlalık kullanarak besleyin. Larvaların yemek için birkaç saati olduktan sonra, kalan rotiferleri ve atık ürünleri çıkarmak için E3'ü değiştirin.
6. Larvaların sabitlenmesi
- Larvalar analiz için istenen gelişim aşamasına ulaştıktan sonra, kalpleri durana kadar ölümcül bir trikain dozu (~% 0.4 nihai konsantrasyon) ile uyuşturun.
- 1.5 mL mikrofüj tüpü başına 30 larvaya kadar pipet. Fazla E3'ü çıkarın ve daha sonra dokuyu sabitlemek için 0.5-1 mL fiksatif çözelti (% 4 paraformaldehit (PFA) ve% 4 sakkaroz fosfat tamponlu salin (PBS)) ekleyin. Larvaları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Fiksatifi çıkararak ve larvaları PBS ile 3-4 kez durulayarak larvaları ertesi gün PBS ile yıkayın. Larvaları diseksiyondan önce 7 güne kadar 4 ° C'de saklayın.
7. Beyinleri ortaya çıkarmak için larvaları parçalara ayırmak ( 15'ten uyarlanmıştır)
- PBS damlacıklarındaki sabit larvaları, diseksiyon mikroskobu altında bir Sylgard plakası üzerinde askıya alın. Notochord'dan iki tungsten pimi (tipik olarak 2 cm'den az olan eski tungsten iğneleri) yerleştirerek, bir pim aort-gonad-mezonefros (AGM) bölgesini kaplayan pigmentli alanın hemen arkasında, diğeri ise yumurta sarısı uzantısının sonuna uygun olarak yerleştirilerek yanal olarak sabitleyin.
NOT: Tungsten pimlerini mümkün olduğunca az denemede konumlandırın, çünkü doku her delinme ile daha gevrek hale gelecektir. - Bu sırayla gözleri, kulağı, çeneyi, sindirim sistemini ve dorsal kraniyal cildi çıkararak beyni açığa çıkarmak için çok keskin bir tungsten iğnesi ve iğne keskinliğinde forseps kullanın.
- İlk olarak, 4. adımda cerrahi göz çıkarmaya benzer bir teknik kullanarak gözü çıkarın. Ardından, larvaları çıkarın ve karşı tarafa çevirin, böylece diğer göze erişilebilir ve tekrarlayın. Alternatif olarak, iğneyi çeneden diğer tarafa doğru dürtün ve gözü iğneyi açmadan çıkarın.
NOT: Bu dokunun analizi isteniyorsa gözler bu noktada toplanabilir ( 19'a benzer). - Daha sonra, temporal olandan kulağın ventral tarafına çizmek için tungsten iğnesini kullanın. Aynı harekette/harekette, iğneyi arka taraftan çeneye getirin ve kulak ve çene çıkarılana kadar yavaşça önden çekin.
- Ventral organları ve kalan yumurta sarısını çıkarmak için forseps kullanın.
- Son olarak, arka beyin ve omurilik arasındaki kavşağın yakınındaki dorsal kraniyal deride sığ bir kesi yapın. Cildi forseps ile kaldırın ve önden ve telensefalonun etrafına çekin. Bunun çok zor olduğu kanıtlanırsa, arka beyindeki ilk kesiden başlayın ve cildi önce yanal, sonra ventral ve ön olarak çekin, tektumun yanal kenarlarını çizmemeye büyük özen gösterin.
NOT: Orta beyin çalışmanın konusu olduğundan, arka beyin kesilebilir; Bununla birlikte, derin bir kesi dekapitasyona neden olabilir. - Forseps ile kalan dokuları çıkarın. Larvaları çıkarın ve 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde PBS'ye aktarın.
NOT: Bütünsel protokolleri gerçekleştirirken daha iyi görünürlük için kuyruğu beyne bağlı bırakın.
- İlk olarak, 4. adımda cerrahi göz çıkarmaya benzer bir teknik kullanarak gözü çıkarın. Ardından, larvaları çıkarın ve karşı tarafa çevirin, böylece diğer göze erişilebilir ve tekrarlayın. Alternatif olarak, iğneyi çeneden diğer tarafa doğru dürtün ve gözü iğneyi açmadan çıkarın.
8. Beyin dehidrasyonu ve depolanması
- PBS'yi beyinlerden çıkarın ve% 0.1 TritonX-100 (PBST) içeren 1 mL PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
- PBST'yi çıkarın ve 50:50 metanol:PBST çözeltisiyle değiştirin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Beyinleri oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca iki kez% 100 metanol (MeOH) ile yıkayın.
- İmmünohistokimya veya diğer bütünsel prosedürleri uygulamadan önce beyinleri -20 ° C'de% 100 MeOH'de en az 16 saat saklayın.
NOT: Beyinler MeOH'de -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir.
9. İmmünohistokimya
NOT: Zebra balığında birçok faydalı bütünleme tekniği için belirlenmiş protokoller ZFIN20'de bulunabilir. Bu makale, immünoboyalı tek gözlü ve iki gözlü larvaları, Tg [atoh7: RFP] hattındaki optik sinir aksonlarında eksprese edilen kırmızı floresan proteini (RFP) veya mitotik hücreleri vurgulayan fosforile histon H3'ü (PH3) tanıyan antikorlarla karşılaştıran örnekler sunmaktadır (Şekil 3). Embriyo ve larvalar için standart bir immünohistokimya protokolü aşağıda özetlenmiştir.
- İlk olarak, larva beyinlerini derecelendirilmiş bir dizi MeOH: PBST ile oda sıcaklığında yıkayın, örnekleri 5 dakika boyunca 50: 50 MeOH: PBST'de, daha sonra 30: 70 MeOH: PBST'de 5 dakika boyunca inkübe ederek ve 3 PBST yıkamasıyla bitirin.
- Beyinleri geçirgenleştirmek için, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 20 μg / ml PK'lik son konsantrasyonda proteinaz K (PK) ile desteklenmiş PBST'de inkübe edin. 10 mg/mL PK'lik alikotları -20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce çözün.
- PK çözeltisini çıkarın ve beyinleri 15 dakika boyunca PBST ile 3 kez durulayarak kalan enzimleri yıkayın.
- Geçirgenleştirilmiş beyinleri, 25 ° C'de (veya oda sıcaklığında) 20 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe ederek yeniden sabitleyin. Daha sonra, PFA'yı çıkarın ve beyinleri PBST ile 15 dakika boyunca 3 kez durulayarak kalan fiksatif maddeleri yıkayın.
- Son PBST durulamasını taze yapılmış immünobloke edici (IB) tamponla (PBST'de %10 normal keçi serumu ve %1 DMSO) değiştirin ve oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
- Birincil antikorları uygun konsantrasyonda IB tamponuna seyreltin (örneğin, RFP için 1:500 ve PH3 antikorları için 1:300).
- IB tamponunu beyinlerden çıkarın ve birincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Hafif sallanan bir yörüngesel çalkalayıcıda 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Tüplerin yanlarında güvenli bir şekilde durduğundan emin olun.
- Ertesi sabah, birincil antikor çözeltisini bir mikropipetle çıkarın, PBST'de birkaç kez durulayın ve ardından beyinleri PBST'de oda sıcaklığında 4 x 30 dakika yıkayın.
NOT: Birincil antikor seyreltileri, 4 ° C'de saklanırsa ~ 7 gün içinde bir kez tekrar kullanılabilir. - Sekonder antikorları uygun konsantrasyonda IB tamponuna seyreltirken beyinleri IB tamponunda durulayın (örneğin, Alexa-fluor 568 anti-tavşan için 1:500).
- IB tamponunu çıkarın ve ikincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Yörüngesel bir çalkalayıcıda 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin ve tüplerin yanlarında duran hafifçe sallanmasıyla inkübe edin.
- Ertesi sabah, ikincil antikor çözeltisini çıkarın, PBST ile durulayın ve ardından beyinleri PBST'de oda sıcaklığında 4 x 30 dakika yıkayın.
- 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) veya ToPro3 (gece boyunca 4 °C'de PBST'de 1:5.000) ile karşı boyama.
- Ertesi sabah, larva beyinlerini PBS'ye aktarın ve aşağıda listelenen montaj ve görüntüleme adımlarına geçin.
10. Montaj ve görüntüleme
- Odacıklı bir sürgüyü vakum gresi ile 100 mm'lik bir Petri kabının kapağına sabitleyin.
- İmmün boyalı ve işlenmiş larvaları, diseksiyon mikroskobu ile görüntülemek için bir kuyu plakasına veya depresyon slaytına aktarın.
- Larvaları% 1 LMP agaroz sütunlarına odacıklı slayt üzerine monte edin.
- Bir cam Pasteur pipet kullanarak, odacıklı slayta bir larva koyun ve mümkün olduğunca az PBS biriktirin. Aynı pipetle larvaları erimiş% 1 LMP agarozu (~ 40 ° C) ile örtün.
- Künt bir tungsten iğne veya forseps ile, agarozu bir sütuna çekin ve ardından larvayı dorsal yüzey görülebilecek şekilde mümkün olduğunca simetrik olarak konumlandırın.
- Kalan larvalar için bu prosedürü tekrarlayın.
- Agaroz jelleştikten sonra, birkaç damla PBS ile örtün ve ardından konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin.
- Objektif lensi numuneyle hizalayın, iletilen ışığı kullanarak mikroskopu odaklayın ve numuneyi uygun lazerlerle aydınlatın.
NOT: Bu örnekte, DAPI ve RFP'yi uyarmak için sırasıyla 405 nm ve 568 nm dalga boyları kullanılmıştır. - Kaydırıcı çubuklarını sinyale ve kullanılan dedektöre göre uygun bir seviyeye getirerek kazancı, ofseti ve lazer gücünü ayarlayın. Her kanalın histogramlarını kontrol edin ve pozlama düzeyini ölçmek için görüntünün üstündeki Doygunluk Durumu göstergesi düğmesini tıklatarak piksellerin hiçbirinin doygun olmadığından ve sinyal-gürültü oranının yüksek olduğundan emin olun. Zebra balığı içindeki hücresel ve hücre altı çözünürlük için optimum konfokal görüntüleme parametrelerinin bir örneği için, bkz. 21.
- Numunenin üst ve alt kısımlarını bulmak için faredeki kaydırma tekerleğini kullanarak z düzlemi yığınının üst ve alt sınırlarını ayarlayın. Görüntü alma için üst ve alt sınırları tıklatın ve ardından Şimdi çalıştır düğmesini tıklatarak z-yığını yakalamayı tetikleyin.
NOT: Beynin ne kadar simetrik olarak monte edildiğine bağlı olarak, 9 dpf larva zebra balığı beyni için toplam z-derinliği ~ 150-200 μm olacaktır. - Görüntüleri renk körü erişilebilirliğini göz önünde bulundurarak işleyin ve renklendirin (ör. iki renkli görüntüler için mavi ve turuncu veya macenta ve yeşil kullanın). Görüntüleri yakalamak için kullanılan yazılımda arama tabloları veya Adobe'den Photoshop gibi görüntü işleme yazılımlarını ayarlayın.
- Photoshop'ta, renkli ham fotomikrograflar (i) Görüntü Modu'nu RGB'ye dönüştürerek ve (ii) Görüntü Modu'nun altındaki Eğriler seçeneğine erişerek 8 bit Etiketli Görüntü Dosyası Formatı (TIFF) olarak | Ayar menüleri ve ardından (iii) istenen rengi elde etmek için uygun renkli ışık çıkışlarını 0 veya 255 seviyelerine kaydırır. Örneğin, yeşil bir sinyal elde etmek için Kırmızı kanalı seçin ve çıkışını 0'a kaydırın; ardından Mavi kanalı seçin ve çıktısını da 0'a kaydırın. Benzer şekilde, bir macenta sinyali elde etmek için Yeşil kanalı seçin ve çıkışını 0'a kaydırın; kırmızı ve mavi kanalları olduğu gibi bırakın.
NOT: Benzer adımlar ücretsiz Gnu Görüntü İşleme Programı'nda (GIMP) gerçekleştirilebilir. - Eklentiler menüsündeki Analiz altında bulunan ImageJ22'deki hücre sayacı eklentisini kullanarak belirli bir işaretçiyi görüntüleyen hücre sayısını manuel olarak ölçün. Hücre sayımı için ImageJ'nin nasıl kullanılacağına ilişkin örnekler, 23 de dahil olmak üzere birçok öğreticide bulunabilir.
- RStudio gibi istatistiksel yazılımlarda verilerin grafiksel gösterimlerini oluşturun (bkz. Rmd dosyası).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Göz çıkarmanın tamamlanıp tamamlanmadığını doğrulamak ve optik tektumun nasıl değiştiğini değerlendirmek için, tüm RGC'leri membran hedefli bir RFP ile etiketleyen Tg [atoh7: RFP] suşunda ameliyatlar yapıldı ve böylece retinadan yansıyan ve optik sinir24'ü oluşturan tüm aksonlar yapıldı. Bu suşun kullanılması kesinlikle gerekli olmasa da, optik tektum nöropilindeki optik sinir termininin doğrudan gözlemlenmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Lipofilik DiI veya DiO boyaları 25,26 ile akson izleme veya beyin yayı27 ile multispektral etiketleme gibi optik siniri etiketlemek için diğer yaklaşımlar da mümkün olacaktır.
Şekil 2'de gösterildiği gibi, gözün çıkarılmasından sonra optik tektum nöropilindeki retinal aksonların ilerleyici dejenerasyonu gözlendi. Ameliyattan iki gün sonra, RFP etiketli aksonlar, kanama ve parçalanma gibi hızlı Walleriandejenerasyonu 28'in özelliklerini sergiledi (Şekil 2A, B). Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronlar susturulduğunda mikroglia'nın daha fazla miyelin materyali yuttuğunu göstermiştir29. Dejenere RGC aksonlarının mikroglia yutan bitleri ile tutarlı olarak ve dejenerasyon kaynağından uzaklaşırken, tektal nöropilin içinde ve dışında parlak RFP etiketli punkta kaydedildi (Şekil 1B, oklar). Ameliyattan dört gün sonra, parçalanmış aksonlar ve RFP etiketli aksonal döküntüler, her iki tektal lobda da önemli ölçüde azalır, bu da ölmekte olan ve dejenere aksonların nispeten hızlı bir şekilde temizlendiğini gösterir (Şekil 2C, D).
Tüm immünohistokimyayı gerçekleştirmek ve larva zebra balıklarının optik tektumunu görselleştirmek için beyin, cildin ve bağ dokularının göz (ler), çene, kulaklar ve kafatası kapağı diseksiyonu ile açığa çıkarıldı. İdeal olarak, beyin bu prosedür sırasında bozulmadan kalır (örneğin, Şekil 2C, D). Bununla birlikte, ön beynin bazı kısımlarının, özellikle koku alma ampulünün, cildin veya çenenin kafatası kapağı çıkarıldığında hasar görmesi veya tamamen çıkarılması muhtemeldir (Şekil 2A, ok ucu). Dahası, bazen tektumun lateral kenarı, beyni çıkarmak için cildi delerken veya sıkıştırırken dilimlenebilir (örneğin, Şekil 2A; sağ tektal lobda yırtılma).
İmmünohistokimya ayrıca optik tektumun innerve ve innerve olmayan loblarındaki mitotik hücrelerin sayısını, tüm beyinleri bir PH3 antikoru ile boyayarak değerlendirmek için kullanıldı. Bu veriler, tek gözlü larva balıklarının denervated tarafında anlamlı derecede daha az mitotik hücre göstermektedir (p = 0.00033, Welch'in t-testi; Şekil 3).
Şekil 2: 5 dpf'de gözün çıkarılması optik sinir aksonlarının dejenerasyonunu tetikler. (A-D) 7 dpf (A) veya 9 dpf (C)'de sabitlenmiş bozulmamış larvalardan vahşi tip beyinlerin dorsal görünümlerini veya 5 dpf'de sabit 2 dps (B) veya 4 dps'de (D) göz ekstirpasyon ameliyatlarından tek gözlü larvaları gösteren temsili maksimum yoğunluklu projeksiyonlar. Tüm çekirdekler DAPI (yeşil) ile boyanır ve optik tektumun nöropilinde sonlanan optik sinir aksonları atoh7: RFP transgeni (macenta) tarafından etiketlenir. Yıldız işareti, larvalarda sadece sağ gözün sağlam olduğu innerve tektal nöropili gösterir. Oklar, denervated optik tektumdan çıkan dejenere RGC aksonlarının parçalarının örneklerini gösterir. Ok ucu, ön beynin eksik kısımlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; dps = ameliyat sonrası günler; RGC = retinal ganglion hücreleri; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Optik tektumdaki mitotik hücrelerin sayısı innervasyonla birlikte artar. (A-B) Vahşi tip beyinlerin bozulmamış (A) veya tek gözlü (B) mitotik belirteç PH3 (macenta) ve DAPI (yeşil) ile karşı boyanmış çekirdekler için antikorlarla boyanmış 9 dpf larvadan dorsal görünümlerini gösteren temsili maksimum yoğunluklu projeksiyonlar. Yıldız işareti, sağlam sağ gözden innerve tektal nöropili gösterir. (C) İnnerve (sol) ve denervated (sağ) tektal lobdaki PH3+ hücrelerinin oranının, tek gözlü (n = 12) ve iki gözlü (n = 8) 9 dpf larvalar için bir fark oranı (sol-sağ / toplam) olarak niceliğini gösteren tüm bireysel veri noktalarının üst üste bindiği kutu grafiği. Welch'in t-testi ile karşılaştırıldığında iki koşulun anlamı (***, p < 0.0005). Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; dps = ameliyat sonrası günler; PH3 = fosforile histon H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek dosya: Şekil 3C'de gösterilen çizim için anahat ve talimatlar. Bu dosya tüm verileri ve kodu içerir, böylece herkes Şekil 3C'de gösterildiği gibi tüm veri noktalarının üzerine bindirilmiş olarak kutu grafiğini yeniden oluşturabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan teknikler, zebra balıklarında omurgalı görsel sistem gelişimini incelemek için birçok yaklaşımdan birini göstermektedir. Diğer araştırmacılar, embriyonik retinayı incelemek ve gen ekspresyon analizleri yapmak için yöntemler yayınladılar19 veya optik tektum30'daki nöronal aktiviteyi görselleştirdiler. Bu makale, diferansiyel retinal girdinin optik tektumdaki hücre davranışlarını nasıl etkileyebileceğini araştırmak için bir yaklaşım sunmaktadır.
Ameliyat sonrası başarılı göz ekstirpasyonu ve larva sağkalımı sağlamak için larvaların sağlıklı, yeterli anestezi uygulanmış ve %1 agarozda hareketsiz hale getirilmesi önemlidir. Forseps ve tungsten iğnelerinin çok keskin ve temiz olması da çok önemlidir. Larvalar, ameliyattan 24 saat önce veya sonra beslenmediklerinde en iyi şekilde hayatta kalırlar ve antibiyotiklerle desteklenmiş MMR'de larva yetiştirmek iyileşme sürecini hızlandırır. Önemli olarak, MMR'nin daha yüksek iyonik gücü ve özellikle daha yüksek kalsiyum konsantrasyonu iyileşmeyi teşvik eder14. Bununla birlikte, daha yüksek tuzluluğa daha uzun süre maruz kalmak, embriyonik zebra balığı31'de belgelenene benzer şekilde hayatta kalmayı azaltabilir. En kritik adım, immünoboyalı örneklerin görüntülerinin veri analizi için gerekli olan başarılı beyin diseksiyonlarını sağlamak için sabitlemedir. % 4 sakkaroz (sevgiyle tatlı düzeltme olarak adlandırılır) ile desteklenmiş taze yapılmış% 4 PFA kullanmak, cildin çıkarılması ve beyin dokusunun korunmasının kolaylığını artırma eğilimindedir. Ameliyatlarda olduğu gibi, keskin ve temiz aletler beyinleri diseke etmek için bir zorunluluktur.
Bu protokolün en büyük zorluklarından biri, göz ekstirpasyonları için larvaların gömülmesidir. Her insanın kendileri için en uygun yolu bulması önemlidir, böylece larva gözünü güvenle ve hızlı bir şekilde çıkarabilir. Larva ameliyat sırasında yanlışlıkla bıçaklanırsa, insancıl bir şekilde kafasını keserek öldürün. Diğer bir zorluk, bütünsel immün boyama için en etkili antikor konsantrasyonlarının belirlenmesidir. Uygun antikor konsantrasyonlarını belirlerken, yayınlanmış literatürü bir başlangıç noktası olarak kullanın ve farklı dokularda (özellikle daha büyük dokularda veya daha yaşlı hayvanlarda) yayınlanmış reaktiflerin kullanılması, artan konsantrasyonlar ve / veya inkübasyon süreleri gerektirebileceğinden protokolü optimize edin.
Bu yöntemin en büyük sınırlaması, tek bir deneyin baştan sona sürdüğü süre ve herhangi bir zamanda çalışılabilecek balık sayısıdır. Örneğin, Şekil 3'te gösterilen tüm veriler, balıkların ilk eşleşmesinden nihai veri toplama ve analizine kadar yaklaşık bir ay sürdü. Bu nispeten düşük verimli yaklaşım, görsel sistem32,33'teki nöral aktiviteyi seçici olarak susturan heterolog genetik yaklaşımlarla veya RGC aksonları veya aktivitesi34,35'ten yoksun mutantlarla tamamlanabilir.
Bu yöntemin önemi, modern transgenik balık hatlarına dayanmak için geleneksel bir embriyolojik teknik getirmesi ve aynı bireydeki tektal lobların her birinde çalışan hücresel ve genetik mekanizmaların doğrudan karşılaştırılmasına izin vermesidir. Dahası, bu yöntem, gelişmekte olan balık sinir sisteminin böyle dramatik bir yaralanmaya nasıl tepki verdiğini incelemek için Astyanax yüzey balığı36 ve / veya floresan etiketli mikroglia 37,38,39 ve astrositler40 ile transgenik zebra balığı larvaları dahil olmak üzere diğer deneysel sistemlere uygulanmak üzere olgunlaşmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmanın finansmanı öncelikle Reed College'dan KLC'ye, Helen Stafford Research Fellowship fonlarından OLH'ye ve Reed College Science Research Fellowship'ten YK'ya başlangıç fonları ile desteklendi. Bu proje, Steve Wilson'ın laboratuvarında, Wellcome Trust Studentship (2009-2014) tarafından desteklenen İK ile işbirliği içinde başladı. Máté Varga, Steve Wilson ve Wilson laboratuvarının diğer üyelerine bu proje hakkındaki ilk tartışmalar için teşekkür ediyoruz ve özellikle KLC'ye agarozda embriyoların nasıl monte edileceğini ve zebra balığı beyin diseksiyonlarının nasıl yapılacağını öğreten ilk Florencia Cavodeassi ve Kate Edwards'a teşekkür ediyoruz. Ayrıca Greta Glover ve Jay Ewing'e tungsten iğne bileme cihazımızın montajında yardımcı oldukları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation. | ||
| Fine forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae. |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions. | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. | Available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
References
- Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
- Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
- Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
- Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
- Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
- Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
- Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
- White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
- Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
- Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
- Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A.
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
- Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
- ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
- Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
- ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
- Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
- Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
- Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
- de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
- Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
- Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
- Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
- Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
- Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
- Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
- Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
- Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
- Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
- Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).
