Summary
L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.
Abstract
I pesci zebra mostrano una notevole crescita per tutta la vita e capacità rigenerative. Ad esempio, nicchie di cellule staminali specializzate stabilite durante l'embriogenesi supportano la crescita continua dell'intero sistema visivo, sia nell'occhio che nel cervello. La crescita coordinata tra la retina e il tectum ottico garantisce un'accurata mappatura retinotopica quando vengono aggiunti nuovi neuroni negli occhi e nel cervello. Per capire se gli assoni retinici forniscono informazioni cruciali per la regolazione dei comportamenti delle cellule staminali e progenitrici del tectale come la sopravvivenza, la proliferazione e / o la differenziazione, è necessario essere in grado di confrontare i lobi tettoli innervati e denervati all'interno dello stesso animale e tra gli animali.
La rimozione chirurgica di un occhio dal pesce zebra larvale vivente seguita dall'osservazione del tectum ottico raggiunge questo obiettivo. Il video di accompagnamento dimostra come anestetizzare le larve, affilare elettroliticamente gli aghi di tungsteno e usarli per rimuovere un occhio. Successivamente mostra come sezionare il cervello dalle larve fisse di zebrafish. Infine, il video fornisce una panoramica del protocollo per l'immunoistochimica e una dimostrazione di come montare embrioni colorati in agarosio a basso punto di fusione per la microscopia.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di indagare come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico, il centro di elaborazione visiva nel cervello del pesce zebra. Rimuovendo un occhio e quindi confrontando i due lati del tectum ottico, è possibile osservare e normalizzare i cambiamenti tectali all'interno dello stesso campione, consentendo il confronto tra più campioni. I moderni approcci molecolari combinati con questa tecnica forniranno informazioni sui meccanismi alla base della crescita e dello sviluppo del sistema visivo, nonché della degenerazione e rigenerazione assonale.
I sistemi sensoriali - visivi, uditivi e somatosensoriali - raccolgono informazioni dagli organi esterni e trasmettono tali informazioni al sistema nervoso centrale, generando "mappe" del mondo esterno attraverso il mesencefalo 1,2. La visione è la modalità sensoriale dominante per quasi tutti i vertebrati, compresi molti pesci. La retina, il tessuto neurale dell'occhio, raccoglie informazioni con un circuito neuronale costituito principalmente da fotorecettori, cellule bipolari e cellule gangliari retiniche (RGC), i neuroni di proiezione della retina. Gli RGC hanno lunghi assoni che trovano la loro strada attraverso la superficie interna della retina fino alla testa del nervo ottico, dove si fascicolano e viaggiano insieme attraverso il cervello, terminando infine nel centro di elaborazione visiva nel mesencefalo dorsale. Questa struttura è chiamata tectum ottico nei pesci e in altri vertebrati non mammiferi ed è omologa al collicolo superiore nei mammiferi3.
Il tectum ottico è una struttura multistrato bilateralmente simmetrica nel mesencefalo dorsale. Nel pesce zebra e nella maggior parte degli altri pesci, ogni lobo del tectum ottico riceve input visivi esclusivamente dall'occhio controlaterale, in modo tale che il nervo ottico sinistro termina nel lobo tectale destro e il nervo ottico destro termina nel lobo tectale sinistro4 (Figura 1). Come la sua controparte mammifera, il collicolo superiore, il tectum ottico integra le informazioni visive con altri input sensoriali, tra cui l'audizione e la somatosensazione, controllando i cambiamenti nell'attenzione visiva e nei movimenti oculari come le saccadi 1,5,6. Tuttavia, a differenza del collicolo superiore dei mammiferi, il tectum ottico genera continuamente nuovi neuroni e glia da una nicchia di cellule staminali specializzate vicino ai bordi mediali e caudali dei lobi tettoli chiamati zona di proliferazione tectale7. Il mantenimento dei progenitori proliferativi nel tectum ottico e in altre regioni del sistema nervoso centrale contribuisce, in parte, alla notevole capacità rigenerativa documentata nel pesce zebra8.
Lavori precedenti che esaminano il cervello di pesci ciechi o con un occhio solo hanno rivelato che la dimensione del tectum ottico è direttamente proporzionale alla quantità di innervazione retinica che riceve 9,10,11. Nei pesci delle caverne adulti, i cui occhi degenerano nell'embriogenesi precoce, il tectum ottico è notevolmente più piccolo di quello dei pesci di superficie strettamente imparentati e vedenti9. La degenerazione dell'occhio di pesce delle caverne può essere bloccata sostituendo la lente endogena con una lente da un pesce di superficie durante l'embriogenesi. Quando questi pesci delle caverne con un occhio solo vengono allevati fino all'età adulta, il lobo tectale innervato contiene circa il 10% in più di cellule rispetto al lobo tectale non innervato9. Allo stesso modo, nei killifish larvali che sono stati incubati con trattamenti chimici per generare occhi di dimensioni diverse all'interno dello stesso individuo, il lato del tectum con più innervazione era più grande e conteneva più neuroni10. Le prove degli esperimenti di schiacciamento del nervo ottico nel pesce rosso adulto indicano che l'innervazione promuove la proliferazione, con la proliferazione delle cellule tettoniche che diminuisce quando l'innervazione è stata interrotta11.
Confermando ed estendendo questi studi classici, diversi rapporti recenti forniscono dati che suggeriscono che la proliferazione in risposta all'innervazione è modulata, almeno in parte, dalla via BDNF-TrkB12,13. Rimangono molte domande aperte sulla crescita e lo sviluppo del tectum ottico, incluso il modo in cui un sistema sensoriale in via di sviluppo affronta la degenerazione di lesioni e assoni, quali segnali cellulari e molecolari consentono l'input retinico per regolare la crescita del tectum ottico, quando questi meccanismi diventano attivi e se la proliferazione e la differenziazione legate all'innervazione consentono alla retina e al suo tessuto bersaglio di coordinare i tassi di crescita e garantire un'accurata mappatura retinotopica. Inoltre, ci sono domande molto più grandi sullo sviluppo dipendente dall'attività che possono essere affrontate interrogando il sistema visivo del pesce zebra con approcci chirurgici come quello descritto di seguito.
Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari con cui l'attività neurale, in particolare dall'input visivo, altera la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, l'approccio descritto confronta direttamente i lobi tettoli innervati e denervati (Figura 1) all'interno delle singole larve di zebrafish. Questo metodo consente la documentazione della degenerazione dell'assone RGC nel tectum ottico e la conferma che il numero di cellule mitotiche è correlato all'innervazione.
Figura 1: Schizzi di larve di zebrafish prima e dopo la rimozione unilaterale dell'occhio. (A) Disegno di 5 larve dpf viste al microscopio di dissezione. Ogni larva è incorporata in agarosio a basso punto di fusione e orientata lateralmente prima che un ago di tungsteno con una punta affilata e uncinata venga utilizzato per estrarre l'occhio rivolto verso l'alto (occhio sinistro in questo esempio). (B) Disegno della vista dorsale di una larva di 9 dpf risultante dall'intervento chirurgico raffigurato in A. Solo tre assoni RGC altamente schematizzati dall'occhio destro sono mostrati defascicolare e connettersi con i neuroni nel lobo tectale sinistro. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; dps = giorni dopo l'intervento; RGC = cellule gangliari retiniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
I metodi in questo documento sono stati condotti in conformità con le linee guida e l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Reed College e dell'University College di Londra. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sui ceppi di zebrafish utilizzati in questo studio.
1. Preparare materiali e strumenti
- Crea soluzioni.
- Creare un mezzo embrionale (E314) diluendo un calcio 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-diidrato e 20 mM MgCl2-esaidrato in acqua deionizzata, autoclavata e conservata a temperatura ambiente). Aggiungere 160 mL di 60x E3 a 10 L di acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente.
- Produrre agarosio a basso punto di fusione (LMP) all'1% in E3. Sciogliere 1 g di agarosio LMP in 100 ml di E3 facendo bollire nel microonde per 1-2 minuti ad alta potenza. Aliquotare l'agarosio fuso in tubi di microfuga da 1,7 mL e conservare a 4 °C. Far bollire a bagnomaria e tenere in un blocco di calore a 40 °C quando è pronto per l'uso per l'incorporamento.
- Produrre marc's Modified Ringers (MMR15) soluzione isotonica diluendo un calcio 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-diidrato, 50 mM HEPES, pH regolato a 7,5 con 10 M NaOH, quindi autoclavato e conservato a temperatura ambiente). Aggiungere 10 ml di 10x MMR a 90 ml di acqua deionizzata.
- Versare le piastre Sylgard secondo le istruzioni del produttore, consentendo loro di fissare e asciugare per diversi giorni16.
- Affilare elettroliticamente gli aghi di tungsteno (protocollo modificato da 17).
- In primo luogo, preparare una soluzione koh al 10% (p/v) aggiungendo 200 ml di acqua deionizzata a un barattolo di vetro a bocca larga con coperchio a vite. Mescolare lentamente 20 g di pellet KOH.
NOTA: Questa soluzione caustica è altamente esotermica. Indossare guanti e protezione per gli occhi e mescolare la soluzione nel cappuccio. - Tagliare una lunghezza di 2-3 cm di filo di tungsteno e inserirlo nel supporto dell'ago.
- Collegare i fili del catodo e dell'anodo all'alimentatore. Attaccare la clip a coccodrillo all'estremità del filo catodico a una graffetta parzialmente raddrizzata e inserire la graffetta nella soluzione KOH, attaccandola al lato del barattolo.
- Quindi, attaccare la clip alligatore del filo anodico al collo del supporto dell'ago. Accendere l'alimentazione (a ~ 20 V) e immergere il filo di tungsteno nella soluzione KOH, estraendo il filo dalla soluzione ad angolo per affilare elettroliticamente il filo in una punta fine.
NOTA: le bolle usciranno dalla graffetta mentre la reazione procede. - Controllare la punta dell'ago sotto il microscopio di dissezione per assicurarsi che sia abbastanza affilata.
- Risciacquare l'ago con acqua deionizzata per rimuovere tutti i residui di KOH. Fare diversi aghi in anticipo e tenerli fino agli interventi chirurgici larvali e alle dissezioni.
- In primo luogo, preparare una soluzione koh al 10% (p/v) aggiungendo 200 ml di acqua deionizzata a un barattolo di vetro a bocca larga con coperchio a vite. Mescolare lentamente 20 g di pellet KOH.
- Crea vetrini camerati per l'imaging di campioni di zebrafish con un microscopio confocale verticale.
- Ottenere vetrini per microscopio in vetro e resina epossidica in due parti (vedere la Tabella dei materiali). Mescolare la resina epossidica secondo le istruzioni sulla confezione e dipingere anelli o rettangoli spessi sui vetrini. Lasciare asciugare le diapositive e asciugare nel cappuccio per almeno 24 ore prima dell'uso.
2. Raccolta e allevamento di embrioni
- Accoppia pesci maschi e femmine adulti dei genotipi desiderati in scatole di riproduzione nel tardo pomeriggio / prima serata. La mattina dopo, dopo aver deposto le uova, raccogliere le uova appena fecondate con un colino a rete e trasferirle in E3 in piastre di Petri da 100 mm.
- Incubare gli embrioni a ~27,5 °C con un ciclo di 14 ore di luce/10 ore di buio fino al giorno dell'intervento. Cambia E3 ogni giorno o secondo necessità.
- Nutrire le larve usando un contagocce pieno di rotiferi raccolti una volta al giorno, a partire da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) o un giorno dopo l'intervento chirurgico. Dopo che le larve hanno diverse ore per mangiare, cambiare l'E3 per rimuovere eventuali rotiferi rimanenti e prodotti di scarto.
NOTA: Non nutrire le larve il giorno dell'intervento.
3. Preparare le larve per la chirurgia
- Il giorno dell'intervento, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro a foro largo per trasferire 10-15 larve in una capsula di Petri da 35 mm riempita con E3 fresco.
- Anestetizzare le larve aggiungendo 3-5 gocce di soluzione di Tricaina allo 0,4% p/v (0,4 g di Tricaina disciolta in 210 mM Tris, pH 9; soluzione finale regolata ad un pH di 7,4 se necessario18) al piatto per una concentrazione finale di ~0,0015% p/v Tricaina. Cerca la mancanza di risposta al tatto per determinare se le larve sono adeguatamente anestetizzate. Se sono ancora reattivi al tocco dopo ~ 3 minuti, aggiungere altre 2-3 gocce di 0,4% p / v di soluzione di tricaina e rivalutare.
NOTA: In questa fase dello sviluppo, è possibile monitorare il flusso sanguigno e la frequenza cardiaca oltre alla motilità al microscopio sezionante. - Immobilizzare le larve di zebrafish anestetizzate incorporandole in agarosio LMP all'1% disciolto in E3.
- Per prima cosa, posizionare il coperchio di una capsula di Petri da 35 mm rivolto verso l'alto sotto il microscopio di dissezione. Quindi, prendi una larva in una pipetta Pasteur di vetro a foro stretto con solo una piccola quantità di E3.
- Quindi, aspirare ~ 200 μL di agarosio LMP fuso, caldo (~ 40 ° C) 1% nella pipetta con la larva. Infine, spruzzare la larva e l'agarosio sul coperchio capovolto della capsula di Petri.
- Usa un ago di tungsteno opaco per manovrare rapidamente ma delicatamente la larva in modo che sia laterale, con un occhio rivolto verso l'alto. Attendere che l'agarosio si imposti (~ 5 min).
NOTA: Se l'agarosio si indurisce mentre la larva non è laterale, liberarla dall'agarosio (come descritto nel passaggio 5) e riportarla nel piatto con E3 e tricaina.
4. Rimozione degli occhi
- Una volta che l'agarosio è impostato e la larva è posizionata lateralmente, utilizzare la punta di un ago di tungsteno molto fine e affilato elettroliticamente per perforare la pelle intorno all'occhio, seguendo il bordo dell'orbita dell'occhio.
- Quindi, far scorrere il bordo dell'ago (non la punta) sotto l'occhio dal lato temporale-ventrale dell'occhio. Utilizzare una pressione controllata per rilasciare l'occhio dalla presa.
- Utilizzare pinze chirurgiche molto fini per rimuovere l'occhio pizzicando il nervo ottico e spingendo l'occhio da mediale a laterale. In alternativa, continua semplicemente a premere l'occhio dorsalmente e anteriormente con il lato dell'ago, alla fine tagliando attraverso il nervo ottico e rilasciando l'occhio.
NOTA: Se i tessuti diversi dall'occhio vengono accidentalmente pugnalati durante l'intervento chirurgico, uccidere rapidamente e umanamente la larva con una rapida decapitazione.
5. Cura postoperatoria fino all'endpoint sperimentale
- Dopo aver superato con successo la rimozione degli occhi, coprire l'agarosio con la soluzione MMR.
- Libera ogni larva dall'agarosio spazzolando delicatamente un ago di tungsteno intorno alla testa e poi intorno al corpo mentre stabilizza il coperchio della capsula di Petri con una pinza.
- Trasferire le larve con un occhio solo in una capsula di Petri da 35 mm che contiene MMR integrata con una diluizione 1:100 di un cocktail di penicillina / streptomicina. Incubare gli embrioni a ~27,5 °C con un ciclo di 14 ore di luce/10 ore di buio.
NOTA: Questa soluzione isotonica di MMR integrata con antibiotici inizialmente aiuta la guarigione e la sopravvivenza larvale. Ogni piatto può contenere fino a 15 larve di recupero. - Il giorno dopo, riporta le larve all'E3. A partire dal pomeriggio successivo all'intervento chirurgico, nutrire le larve (~ 6 dpf e oltre) usando un contagocce pieno di rotiferi raccolti una volta al giorno. Dopo che le larve hanno avuto diverse ore per mangiare, cambiare l'E3 per rimuovere eventuali rotiferi rimanenti e prodotti di scarto.
6. Fissaggio delle larve
- Una volta che le larve hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato per l'analisi, anestetizzatele con una dose letale di tricaina (~ 0,4% concentrazione finale) fino a quando i loro cuori si sono fermati.
- Pipetta fino a 30 larve per tubo di microfuga da 1,5 ml. Rimuovere l'eccesso di E3 e quindi aggiungere 0,5-1 mL di soluzione fissativa (4% paraformaldeide (PFA) e 4% saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)) per fissare il tessuto. Incubare le larve durante la notte a 4 °C.
- Lavare le larve con PBS il giorno successivo rimuovendo il fissativo e risciacquando le larve 3-4 volte con PBS. Conservare le larve a 4 °C per un massimo di 7 giorni prima della dissezione.
7. Sezionare le larve per rivelare il cervello (adattato da 15)
- Sospendere le larve fisse in goccioline PBS su una piastra Sylgard sotto un microscopio sezionante. Fissarli lateralmente posizionando due perni di tungsteno (tipicamente vecchi aghi di tungsteno che sono inferiori a 2 cm) attraverso la notocorda, con un perno appena posteriore all'area pigmentata che copre la regione aorta-gonade-mesonefros (AGM) e un altro in linea con la fine dell'estensione del tuorlo.
NOTA: Posizionare i perni di tungsteno nel minor numero possibile di tentativi perché il tessuto diventerà più friabile ad ogni puntura. - Utilizzare un ago di tungsteno molto affilato e una pinza affilata per esporre il cervello rimuovendo, in questo ordine, l'occhio (i), l'orecchio, la mascella, il tratto digestivo e la pelle cranica dorsale.
- In primo luogo, rimuovere l'occhio utilizzando una tecnica simile alla rimozione chirurgica dell'occhio nel passaggio 4. Quindi, sgancia la larva e capovolgila sul lato opposto, in modo che l'altro occhio sia accessibile e ripetuto. In alternativa, infilare l'ago attraverso la mascella dall'altra parte e rimuovere l'occhio senza staccare.
NOTA: gli occhi possono essere raccolti a questo punto se si desidera l'analisi di questo tessuto (simile a 19). - Quindi, utilizzare l'ago di tungsteno per graffiare dal lato temporale a quello ventrale dell'orecchio. Nella stessa azione/movimento, portare l'ago posteriore alla mascella e tirare delicatamente anteriormente fino a rimuovere l'orecchio e la mascella.
- Usa una pinza per estrarre gli organi ventrali e l'eventuale tuorlo rimanente.
- Infine, fare un'incisione superficiale nella pelle cranica dorsale vicino alla giunzione tra il cervello posteriore e il midollo spinale. Sollevare la pelle con la pinza e tirarla anteriormente e intorno al telencefalo. Se questo si rivela troppo difficile, iniziare dall'incisione iniziale nel cervello posteriore e tirare la pelle prima lateralmente e poi ventralmente e anteriormente, facendo molta attenzione a non graffiare i bordi laterali del tectum.
NOTA: Poiché il mesencefalo è oggetto di studio, il cervello posteriore può essere tagliato; tuttavia, un'incisione profonda può provocare la decapitazione. - Rimuovere qualsiasi tessuto rimanente con una pinza. Staccare la larva e trasferirla a PBS in un tubo di microfuga da 1,5 ml.
NOTA: lasciare la coda attaccata al cervello per una migliore visibilità quando si eseguono protocolli fullmount.
- In primo luogo, rimuovere l'occhio utilizzando una tecnica simile alla rimozione chirurgica dell'occhio nel passaggio 4. Quindi, sgancia la larva e capovolgila sul lato opposto, in modo che l'altro occhio sia accessibile e ripetuto. In alternativa, infilare l'ago attraverso la mascella dall'altra parte e rimuovere l'occhio senza staccare.
8. Disidratazione e conservazione del cervello
- Rimuovere PBS dal cervello e aggiungere 1 ml di PBS contenente lo 0,1% di TritonX-100 (PBST). Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il PBST e sostituirlo con una soluzione 50:50 metanolo:PBST. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il cervello con metanolo al 100% (MeOH) due volte per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
- Conservare il cervello in MeOH al 100% a -20 °C per almeno 16 ore prima di eseguire l'immunoistochimica o altre procedure integrali.
NOTA: I cervelli possono essere conservati in MeOH per un massimo di 2 anni a -20 °C.
9. Immunoistochimica
NOTA: i protocolli stabiliti per molte utili tecniche di montaggio intero in zebrafish possono essere trovati su ZFIN20. Questo manoscritto fornisce esempi che confrontano le larve con un occhio solo e con due occhi che sono state immunocolorate con anticorpi che riconoscono la proteina fluorescente rossa (RFP), che è espressa negli assoni del nervo ottico nella linea Tg[atoh7:RFP] (Figura 2), o l'istone fosforilato H3 (PH3), che evidenzia le cellule mitotiche (Figura 3). Un protocollo immunoistochimico standard per embrioni e larve interi è riassunto di seguito.
- In primo luogo, reidratare il cervello larvale con una serie graduata di lavaggi MeOH:PBST a temperatura ambiente incubando i campioni in 50:50 MeOH:PBST per 5 min, poi in 30:70 MeOH:PBST per 5 min, e terminando con 3 lavaggi di PBST.
- Per permeabilizzare il cervello, incubarli in PBST integrato con proteinasi K (PK) ad una concentrazione finale di 20 μg/ml PK per 30 min a 37 °C. Conservare aliquote di 10 mg/mL di PK a -20 °C e scongelarle prima dell'uso.
- Rimuovere la soluzione di PK e lavare via qualsiasi enzima rimanente risciacquando il cervello con PBST 3 volte nell'arco di 15 minuti.
- Rifiggere i cervelli permeabilizzati incubandoli in PFA al 4% per 20 minuti a 25 °C (o temperatura ambiente). Quindi, rimuovere il PFA e lavare via qualsiasi fissativo rimanente risciacquando il cervello 3 volte in 15 minuti con PBST.
- Sostituire il risciacquo PBST finale con tampone immunobloccante (IB) appena fatto (10% siero di capra normale e 1% DMSO in PBST) e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Diluire gli anticorpi primari nel tampone IB alla concentrazione appropriata (ad esempio, 1:500 per RFP e 1:300 per gli anticorpi PH3).
- Rimuovere il tampone IB dal cervello e sostituirlo con la diluizione anticorpale primaria. Incubare durante la notte a 4 °C su uno shaker orbitale con un leggero dondolo. Assicurarsi che i tubi siano saldamente appoggiati sui lati.
- La mattina successiva, rimuovere la soluzione anticorpale primaria con una micropipetta, risciacquare un paio di volte in PBST e quindi lavare il cervello in PBST a temperatura ambiente per 4 x 30 minuti.
NOTA: le diluizioni anticorpali primarie possono essere riutilizzate una volta entro ~7 giorni se conservate a 4 °C. - Risciacquare il cervello nel tampone IB mentre si diluiscono gli anticorpi secondari nel tampone IB alla concentrazione appropriata (ad esempio, 1:500 per Alexa-fluor 568 anti-coniglio).
- Rimuovere il tampone IB e sostituirlo con la diluizione anticorpale secondaria. Incubare durante la notte a 4 °C su uno shaker orbitale con un leggero dondolio dei tubi appoggiati sui lati.
- La mattina successiva, rimuovere la soluzione anticorpale secondaria, risciacquare con PBST e quindi lavare il cervello in PBST a temperatura ambiente per 4 x 30 minuti.
- Controcolorazione con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o ToPro3 (1:5.000 in PBST a 4 °C durante la notte).
- La mattina successiva, trasferire il cervello larvale in PBS e procedere alle fasi di montaggio e imaging elencate di seguito.
10. Montaggio e imaging
- Fissare una diapositiva camerata nel coperchio di una capsula di Petri da 100 mm con grasso sottovuoto.
- Trasferire le larve immunocolorate e lavorate su una piastra di pozzo o un vetrino di depressione per visualizzarle con un microscopio di dissezione.
- Montare le larve sul vetrino camerato in colonne di agarosio LMP all'1%.
- Usando una pipetta Pasteur di vetro, metti una larva sul vetrino camerato, depositando il minor PBS possibile. Con la stessa pipetta, coprire la larva con agarosio LMP fuso all'1% (~ 40 °C).
- Con un ago o una pinza di tungsteno smussata, disegnare l'agarosio in una colonna e quindi posizionare la larva nel modo più simmetrico possibile, con la superficie dorsale visibile.
- Ripeti questa procedura per le larve rimanenti.
- Una volta che l'agarosio si è gelificato, coprirlo con alcune gocce di PBS e poi posizionarlo sul palco del microscopio confocale.
- Allineare la lente dell'obiettivo con il campione, mettere a fuoco il microscopio utilizzando la luce trasmessa e illuminare il campione con i laser appropriati.
NOTA: in questo esempio, le lunghezze d'onda di 405 nm e 568 nm sono state utilizzate rispettivamente per eccitare DAPI e RFP. - Regolare il guadagno, l'offset e la potenza del laser spostando le barre di scorrimento a un livello appropriato rispetto al segnale e al rilevatore utilizzato. Controllare gli istogrammi per ciascun canale e fare clic sul pulsante Indicatore di stato di saturazione sopra l'immagine per misurare il livello di esposizione, assicurandosi che nessuno dei pixel sia saturo e che il rapporto segnale-rumore sia elevato. Per un esempio di parametri di imaging confocale ottimali per la risoluzione cellulare e subcellulare all'interno del pesce zebra, vedere 21.
- Impostare i limiti superiore e inferiore della pila di piani z utilizzando la rotellina di scorrimento del mouse per trovare la parte superiore e inferiore del campione. Fare clic sui limiti superiore e inferiore per l'acquisizione delle immagini, quindi attivare l'acquisizione z-stack facendo clic sul pulsante Esegui ora .
NOTA: A seconda di quanto simmetricamente è montato il cervello, la profondità z totale per un cervello larvale di zebrafish da 9 dpf sarà ~ 150-200 μm. - Elabora e colora le immagini tenendo presente l'accessibilità daltonica (ad esempio, usa blu e arancione o magenta e verde per le immagini a due colori). Imposta le tabelle di ricerca nel software utilizzato per acquisire le immagini o il software di elaborazione delle immagini come Photoshop da Adobe.
- In Photoshop, fotomicrografie raw a colori salvate come TIFF (Tagged Image File Format) a 8 bit (i) convertendo la modalità immagine in RGB e (ii) accedendo all'opzione Curve sotto image | Regola i menu e poi (iii) fa scorrere le emissioni di luce colorata appropriate a 0 o 255 livelli per ottenere il colore desiderato. Ad esempio, per ottenere un segnale verde, selezionare il canale rosso e far scorrere la sua uscita su 0; quindi, seleziona il canale blu e fai scorrere anche il suo output su 0 . Allo stesso modo, per ottenere un segnale magenta, selezionare il canale Verde e far scorrere la sua uscita su 0; lascia i canali rosso e blu così come sono.
NOTA: Passaggi simili possono essere eseguiti nel programma gratuito Gnu Image Manipulation Program (GIMP). - Quantificare manualmente il numero di celle che visualizzano un marcatore specifico utilizzando il plug-in del contatore di celle in ImageJ22, disponibile in Analizza nel menu Plugin. Esempi di come utilizzare ImageJ per il conteggio delle celle possono essere trovati in molti tutorial, tra cui 23.
- Generare rappresentazioni grafiche dei dati in software statistici come RStudio (vedere dati supplementari per . Rmd).
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Representative Results
Per confermare se la rimozione dell'occhio fosse completa e valutare come cambia il tectum ottico, sono stati eseguiti interventi chirurgici nel ceppo Tg[atoh7:RFP], che etichetta tutti gli RGC con una RFP mirata alla membrana e, quindi, tutti gli assoni che proiettano dalla retina e formano il nervo ottico24. Sebbene l'uso di questo ceppo non sia assolutamente necessario, consente l'osservazione e la visualizzazione semplici dei termini del nervo ottico nel neuropil del tectum ottico. Sarebbero possibili anche altri approcci per etichettare il nervo ottico, come il tracciamento degli assoni con coloranti lipofili DiI o DiO 25,26 o l'etichettatura multispettrale con brainbow27.
Come mostrato nella Figura 2, la degenerazione progressiva degli assoni retinici nel neuropil del tectum ottico è stata osservata dopo la rimozione dell'occhio. Due giorni dopo l'intervento chirurgico, gli assoni marcati con RFP hanno mostrato segni distintivi di rapida degenerazione walleriana28 come blebbing e frammentazione (Figura 2A, B). Lavori recenti hanno dimostrato che le microglia inghiottono più materiale mielinico quando i neuroni vengono silenziati29. Coerentemente con la microglia che inghiotte frammenti degli assoni RGC degenerativi e migra lontano dalla fonte della degenerazione, sono stati notati punti luminosi marcati RFP all'interno e all'esterno del neuropil tectale (Figura 1B, frecce). Quattro giorni dopo l'intervento chirurgico, gli assoni frammentati e i detriti assonali marcati RFP sono considerevolmente ridotti in entrambi i lobi tectali, indicando una clearance relativamente rapida degli assoni morenti e degenerativi (Figura 2C, D).
Per eseguire l'immunoistochimica a tutto volume e visualizzare il tectum ottico del pesce zebra larvale, il cervello è stato esposto sezionando gli occhi, la mascella, le orecchie e la calotta cranica della pelle e dei tessuti connettivi. Idealmente, il cervello rimane intatto durante questa procedura (ad esempio, Figura 2C, D). Tuttavia, parti del proencefalo, in particolare il bulbo olfattivo, sono suscettibili di essere danneggiate o completamente rimosse quando viene rimosso il cappuccio cranico della pelle o della mascella (Figura 2A, punta di freccia). Inoltre, a volte il bordo laterale del tectum può essere tagliato quando si perfora o si pizzica la pelle per estrarla dal cervello (ad esempio, Figura 2A; lacerazione sul lobo tectale destro).
L'immunoistochimica è stata anche utilizzata per valutare il numero di cellule mitotiche nei lobi innervati e non innervati del tectum ottico colorando l'intero cervello con un anticorpo PH3. Questi dati mostrano un numero significativamente inferiore di cellule mitotiche sul lato denervato del pesce larvale con un occhio solo (p = 0,00033, il t-test di Welch; Figura 3).
Figura 2: La rimozione dell'occhio a 5 dpf innesca la degenerazione degli assoni del nervo ottico. (A-D) Proiezioni rappresentative di massima intensità che mostrano viste dorsali di cervelli selvatici da larve intatte fissate a 7 dpf (A) o 9 dpf (C), o larve con un occhio solo da interventi chirurgici di estirpazione oculare a 5 dpf, fissati 2 dps (B) o 4 dps (D). Tutti i nuclei sono colorati con DAPI (verde) e gli assoni del nervo ottico che terminano nel neuropil del tectum ottico sono etichettati dal transgene atoh7: RFP (magenta). L'asterisco indica il neuropil tectale innervato nelle larve con solo l'occhio destro intatto. Le frecce indicano esempi di frammenti di assoni RGC degenerati provenienti dal tectum ottico denervato. La punta di freccia indica le parti mancanti del proencefalo. Barra della scala = 50 μm. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; dps = giorni dopo l'intervento; RGC = cellule gangliari retiniche; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il numero di cellule mitotiche nel tectum ottico aumenta con l'innervazione. (A-B) Proiezioni rappresentative di massima intensità che mostrano viste dorsali di cervelli selvatici da larve intatte (A) o con un occhio solo (B) 9 dpf immunocolorate con anticorpi per il marcatore mitotico PH3 (magenta) e nuclei controcolorati con DAPI (verde). L'asterisco indica il neuropil tectale innervato dall'occhio destro intatto. (C) Box plot con tutti i singoli punti dati sovrapposti che mostrano la quantificazione del rapporto tra cellule PH3+ nel lobo tectale innervato (sinistro) e denervato (destro) come rapporto di differenza (sinistra-destra/totale) per larve con un occhio solo (n = 12) e due occhi (n = 8) 9 dpf. Mezzi delle due condizioni rispetto al t-test di Welch (***, p < 0,0005). Barra della scala = 50 μm. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; dps = giorni dopo l'intervento; PH3 = istone fosforilato H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare: Schema e istruzioni per il grafico mostrati nella Figura 3C. Questo file contiene tutti i dati e il codice in modo che chiunque possa riprodurre il box plot con tutti i punti dati sovrapposti, come illustrato nella Figura 3C. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Le tecniche descritte in questo articolo illustrano uno dei tanti approcci per lo studio dello sviluppo del sistema visivo dei vertebrati nel pesce zebra. Altri ricercatori hanno pubblicato metodi per sezionare la retina embrionale ed eseguire analisi di espressione genica19 o visualizzare l'attività neuronale nel tectum ottico30. Questo documento fornisce un approccio per esplorare come l'input retinico differenziale può influenzare i comportamenti cellulari nel tectum ottico.
Per garantire il successo dell'estirpazione oculare e la sopravvivenza larvale dopo l'intervento chirurgico, è importante che le larve siano sane, adeguatamente anestetizzate e immobilizzate in agarosio all'1%. È anche fondamentale che le pinze e gli aghi di tungsteno siano molto affilati e puliti. Le larve sopravvivono meglio quando non vengono nutrite 24 ore prima o dopo l'intervento chirurgico e l'allevamento di larve in MMR integrato con antibiotici accelera il processo di guarigione. È importante sottolineare che la maggiore forza ionica di MMR e soprattutto la maggiore concentrazione di calcio promuove la guarigione14. Tuttavia, un'esposizione più lunga alla salinità più elevata può ridurre la sopravvivenza, simile a quanto documentato nel pesce zebra embrionale31. Un passo più critico è la fissazione per garantire il successo delle dissezioni cerebrali, che sono essenziali per l'analisi dei dati delle immagini di campioni immunocolorati. L'uso di PFA al 4% appena fatto integrato con il 4% di saccarosio (affettuosamente chiamato sweet fix) tende ad aumentare la facilità di rimozione della pelle e la conservazione del tessuto cerebrale. Come per gli interventi chirurgici, gli strumenti affilati e puliti sono un must per sezionare il cervello.
Una delle maggiori sfide di questo protocollo è l'incorporamento di larve per estirpazioni oculari. È importante che ogni persona trovi il modo che funziona meglio per loro in modo che possano rimuovere con sicurezza e rapidamente l'occhio larvale. Se la larva viene accidentalmente pugnalata durante l'intervento chirurgico, ucciderla umanamente per decapitazione. Un'altra sfida è determinare le concentrazioni di anticorpi più efficaci per l'immunocolorazione a tutto volume. Nel determinare le concentrazioni di anticorpi appropriate, utilizzare la letteratura pubblicata come punto di partenza e ottimizzare il protocollo in quanto l'utilizzo di reagenti pubblicati su tessuti diversi (specialmente su tessuti più grandi o animali più anziani) può richiedere concentrazioni e / o tempi di incubazione aumentati.
Il principale limite di questo metodo è il tempo impiegato da un singolo esperimento dall'inizio alla fine e il numero di pesci che possono essere studiati in un dato momento. Ad esempio, tutti i dati mostrati nella Figura 3 hanno richiesto circa un mese dall'accoppiamento iniziale dei pesci alla raccolta e all'analisi dei dati finali. Questo approccio relativamente a basso rendimento potrebbe essere completato da approcci genetici eterologhi che silenziano selettivamente l'attività neurale nel sistema visivo32,33 o da mutanti privi di assoni RGC o attività34,35.
Il significato di questo metodo è che porta una tecnica embriologica tradizionale alle moderne linee transgeniche di pesce, consentendo il confronto diretto dei meccanismi cellulari e genetici che operano in ciascuno dei lobi tettoriali all'interno dello stesso individuo. Inoltre, questo metodo è maturo per l'applicazione ad altri sistemi sperimentali, tra cui il pesce di superficie Astyanax 36 e / o larve transgeniche di zebrafish con microglia37,38,39 marcate fluorescenti e astrociti40 per studiare come il sistema nervoso dei pesci in via di sviluppo risponde a una lesione così drammatica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo lavoro è stato sostenuto principalmente da fondi di start-up dal Reed College a KLC, dai fondi Helen Stafford Research Fellowship a OLH e da una Reed College Science Research Fellowship a YK. Questo progetto è iniziato nel laboratorio di Steve Wilson come collaborazione con le risorse umane, che è stato supportato da un Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Ringraziamo Máté Varga, Steve Wilson e altri membri del laboratorio Wilson per le discussioni iniziali su questo progetto, e ringraziamo in particolare Florencia Cavodeassi e Kate Edwards, che sono state le prime a insegnare a KLC come montare embrioni in agarosio ed eseguire dissezioni cerebrali di zebrafish. Ringraziamo anche Greta Glover e Jay Ewing per l'aiuto nell'assemblaggio del nostro dispositivo di affilatura ad ago in tungsteno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and supplies: | |||
| Breeding boxes | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma or equivalent supplier | Z273554 | |
| Erlenmeyer flasks (125 mL) | For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation. | ||
| Fine forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-20 | |
| Glass Pasteur pipettes | DWK Lifescience | 63A53 & 63A53WT | For pipetting embryos and larvae. |
| Glass slides for microscopy | VWR or equivalent supplier | 48311-703 | Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers. |
| Glassware including graduated bottles and graduated cylinders | For making and storing solutions. | ||
| 2-part epoxy resin | ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent | 0.85 oz syringe | https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 |
| Microcentrifuge tube (1.7 mL) | VWR or equivalent supplier | 22234-046 | |
| Nickel plated pin holder (17 cm length) | Fine Science Tools (FST) | 26018-17 | To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections. |
| Nylon mesh tea strainer or equivalent | Ali Express or equivalent | For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html | |
| Paper clip | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Petri dishes 100 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 50-190-0267 | |
| Petri dishes 35 mm | Fischer Scientific or equivalent supplier | 08-757-100A | |
| Pipette pump | SP Bel-Art or equivalent | F37898-0000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 909122 | For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water. |
| Power supply (variable voltage) | For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis). | ||
| Sylgard 184 Elastomer kit | Dow Corning | 3097358 | |
| Tungsten wire (0.125 mm diameter) | World Precision Instruments (WPI) | TGW0515 | Sharpen to remove eye and dissect larvae. |
| Variable temperature heat block | The Lab Depot or equivalent supplier | BSH1001 or BSH1002 | Set to 40-42 °C ahead of experiments. |
| Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Wires with alligator clip leads | For Tungsten needle sharpening device. | ||
| Microscopes: | |||
| Dissecting microscope | Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred. | ||
| Laser scanning confocal microscope | High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work. |
||
| Reagents for surgeries and dissections: | |||
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| HEPES | Sigma | H7006 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | 1374248 | For embryo medium (E3). |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | For Marc's Modified Ringers (MMR). |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock). |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333-20ML | Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | Diagnostic BioSystems | DMR E404-01 | Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration. |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3). |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4. |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tricaine-S | Pentair | 100G #TRS1 | Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE |
| Reagents for immunohistochemistry: | |||
| Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG | Invitrogen | A-11011 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| DAPI or ToPro3 | Invitrogen | 1306 or T3605 | Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | A component of immunoblock buffer. |
| Methanol (MeOH) | Sigma | 34860 | Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using. |
| Normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 50-062Z | A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C. |
| Primary antibody to detect phosphohistone H3 | Millipore | 06-570 | Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) | MBL International | PM005 | Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry. |
| Proteinase K (PK) | Sigma | P2308-10MG | Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS. |
| Software for data analysis | |||
| ImageJ (Fiji) | Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| RStudio | Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | ||
| Adobe Photoshop or GIMP | Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/) | ||
| Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. | Available from the Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication. |
References
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