Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Øyefjerning i levende sebrafisk larver for å undersøke innervasjonsavhengig vekst og utvikling av det visuelle systemet

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63509
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

Summary

Artikkelen forklarer hvordan man kirurgisk fjerner øyne fra levende sebrafisk larver som det første skrittet mot å undersøke hvordan retinal input påvirker optisk tectum vekst og utvikling. I tillegg gir artikkelen informasjon om larvalbedøvelse, fiksering og hjernespredning, etterfulgt av immunhiistokjemi og konføderasjonsavbildning.

Abstract

Sebrafisk viser bemerkelsesverdig livslang vekst og regenerative evner. For eksempel støtter spesialiserte stamcellenisjer etablert under embryogenese kontinuerlig vekst av hele det visuelle systemet, både i øyet og hjernen. Koordinert vekst mellom netthinnen og det optiske tectum sikrer nøyaktig retinotopisk kartlegging etter hvert som nye nevroner tilsettes i øyne og hjerne. For å adressere om retinal aksoner gir avgjørende informasjon for regulering av tectal stamme og stamcelleoppførsel som overlevelse, spredning og / eller differensiering, er det nødvendig å kunne sammenligne innervated og denervated tectal lobes i samme dyr og på tvers av dyr.

Kirurgisk fjerning av ett øye fra levende larval sebrafisk etterfulgt av observasjon av det optiske tectum oppnår dette målet. Den medfølgende videoen demonstrerer hvordan man bedøver larver, elektrolytisk skjerper wolfram nåler, og bruker dem til å fjerne ett øye. Det neste viser hvordan å dissekere hjerner fra faste sebrafisk larver. Til slutt gir videoen en oversikt over protokollen for immunhistokjemi og en demonstrasjon av hvordan man monterer fargede embryoer i lavsmeltingspunkt agarose for mikroskopi.

Introduction

Målet med denne metoden er å undersøke hvordan retinal input påvirker veksten og utviklingen av det optiske tectum, det visuelle prosesseringssenteret i sebrafiskhjernen. Ved å fjerne ett øye og deretter sammenligne de to sidene av det optiske tectumet, kan tektalendringer i samme prøve observeres og normaliseres, noe som muliggjør sammenligning på tvers av flere prøver. Moderne molekylære tilnærminger kombinert med denne teknikken vil gi innsikt i mekanismene som ligger til grunn for visuell systemvekst og utvikling, samt axonal degenerasjon og regenerering.

Sensoriske systemer - visuelle, auditive og somatosensoriske - samler informasjon fra eksterne organer og videresender den informasjonen til sentralnervesystemet, og genererer "kart" over den ytre verden over midbrain 1,2. Visjon er den dominerende sensoriske modaliteten for nesten alle vertebrater, inkludert mange fisk. Netthinnen, nevralt vev i øyet, samler informasjon med en nevronal krets som hovedsakelig består av fotoreseptorer, bipolare celler og netthinne ganglion celler (RGCs), projeksjon nevroner av netthinnen. RGCer har lange axoner som finner veien over den indre overflaten av netthinnen til synsnerven hodet, hvor de fasciculate og reise sammen gjennom hjernen, til slutt avslutte i visuell behandling senter i dorsal midbrain. Denne strukturen kalles det optiske tectum i fisk og andre ikke-pattedyr vertebrater og er homolog til den overlegne colliculus hos pattedyr3.

Det optiske tectum er en bilateralt symmetrisk flerlagsstruktur i dorsal midbrain. I sebrafisk og de fleste andre fisk mottar hver lobe av det optiske tectum visuelle innspill utelukkende fra det kontralaterale øyet, slik at venstre optisk nerve slutter i høyre tectal lobe og høyre optisk nerve slutter i venstre tectal lobe4 (figur 1). Som sin pattedyr motpart, den overlegne colliculus, integrerer det optiske tectum visuell informasjon med andre sensoriske innganger, inkludert audition og somatosensasjon, kontrollerende skift i visuell oppmerksomhet og øyebevegelser som saccades 1,5,6. Men i motsetning til pattedyrets overlegne colliculus, genererer det optiske tectum kontinuerlig nye nevroner og glia fra en spesialisert stamcellenisje nær de mediale og kaudale kantene på tektal lobes kalt tectal proliferation zone7. Vedlikehold av proliferative forfedre i det optiske tectum og andre regioner i sentralnervesystemet bidrar delvis til den bemerkelsesverdige regenerative kapasiteten dokumentert i sebrafisk8.

Tidligere arbeid med å undersøke hjernen til blinde eller enøyde fisk avslørte at optisk tectumstørrelse er direkte proporsjonal med mengden retinal innervering den mottar 9,10,11. I voksenhulefisk, hvis øyne degener i tidlig embryogenese, er det optiske tectum merkbart mindre enn for nært beslektet, observert overflatefisk9. Cave fish eye degenerasjon kan blokkeres ved å erstatte den endogene linsen med en linse fra en overflatefisk under embryogenese. Når disse enøyde hulefiskene blir oppdrettet til voksen alder, inneholder den innerverte tectal lobe omtrent 10% flere celler enn den ikke-innerverte tectal lobe9. På samme måte, i larval killifish som ble inkubert med kjemiske behandlinger for å generere øyne av forskjellige størrelser i samme individ, var siden av tectum med mer innervasjon større og inneholdt flere nevroner10. Bevis fra optisk nerveknusing eksperimenter i voksen gullfisk indikerer at innervasjon fremmer spredning, med tectal celleproliferasjon avtagende når innervasjon ble forstyrret11.

Ved å bekrefte og utvide disse klassiske studiene, gir flere nylige rapporter data som tyder på at spredning som svar på innervering er modulert, i hvert fall delvis, av BDNF-TrkB-banen12,13. Mange åpne spørsmål om optisk tectum vekst og utvikling gjenstår, inkludert hvordan et utviklende sensorisk system håndterer skade og axon degenerasjon, hvilke cellulære og molekylære signaler som muliggjør retinal input for å regulere optisk tectum vekst, når disse mekanismene blir aktive, og om innervasjon-koblet spredning og differensiering gjør det mulig for netthinnen og målvevet å koordinere vekstrater og sikre nøyaktig retinotopisk kartlegging. I tillegg er det mye større spørsmål om aktivitetsavhengig utvikling som kan løses ved å forhøre sebrafiskens visuelle system med kirurgiske tilnærminger som den som er beskrevet nedenfor.

For å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som nevral aktivitet, spesielt fra visuell inngang, endrer celleoverlevelse og spredning, sammenligner den beskrevne tilnærmingen direkte innerverte og denerverte tektallober (figur 1) innenfor individuelle sebrafisk larver. Denne metoden tillater dokumentasjon av RGC axon degenerasjon i det optiske tectum og bekreftelse på at antall mititotiske celler korrelerer med innervasjon.

Figure 1
Figur 1: Skisser av sebrafisk larver før og etter ensidig øyefjerning. (A) Tegning av 5 dpf larver sett under et dissekerende mikroskop. Hver larve er innebygd i lavsmeltende punkt agarose og orientert lateralt før en wolfram nål med en skarp, hektet spiss brukes til å øse ut øyet vendt opp (venstre øye i dette eksemplet). (B) Tegning av dorsal utsikt over en 9 dpf larve som følge av operasjonen avbildet i A. Bare tre høyt skjemaerte RGC-axoner fra høyre øye vises defasciculating og tilkobling med nevroner i venstre tectal lobe. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; dps = dager etter operasjonen; RGC = retinal ganglion celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metodene i denne artikkelen ble utført i samsvar med retningslinjer og godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committees of Reed College og University College London. Se materialtabellen for detaljer om sebrafiskstammer som brukes i denne studien.

1. Forbered materialer og verktøy

  1. Lag løsninger.
    1. Lag embryomedium (E314) ved å fortynne en 60x lager (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl2-dihydrat og 20 mM MgCl2-heksahydrat i deionisert vann, autoklavert og lagret ved romtemperatur). Tilsett 160 ml 60x E3 til 10 L avionisert vann. Oppbevars ved romtemperatur.
    2. Gjør 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose i E3. Løs opp 1 g LMP agarose i 100 ml E3 ved å koke i mikrobølgeovnen i 1-2 min på høy effekt. Aliquot smeltet agarose i 1,7 ml mikrofuge rør, og lagre ved 4 °C. Kok i et vannbad og hold i en 40 °C varmeblokk når den er klar til bruk for innbygging.
    3. Lag Marc's Modified Ringers (MMR15) isotonisk løsning ved å fortynne en 10x lager (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2-dihydrat, 50 mM HEPES, pH justert til 7,5 med 10 M NaOH, deretter autoklaved og lagret ved romtemperatur). Tilsett 10 ml 10x MMR til 90 ml deionisert vann.
  2. Hell Sylgardplater i henhold til produsentens instruksjoner, slik at de kan stille inn og tørke i flere dager16.
  3. Elektrolytisk skjerpe wolframnåler (protokoll modifisert fra 17).
    1. Først forbereder du en 10% (w / v) KOH-løsning ved å legge til 200 ml deionisert vann til en bredmunnet glassburk med et skruelokk. Rør sakte inn 20 g KOH-pellets.
      MERK: Denne kaustiske løsningen er svært eksotermisk. Bruk hansker og vernebriller, og rør oppløsningen i hetten.
    2. Klipp en 2-3 cm lengde wolframtråd og sett den inn i nåleholderen.
    3. Koble katode- og anodledningene til strømforsyningen. Fest alligatorklemmen på enden av katodetråden til en delvis rettet binders og sett bindersen inn i KOH-oppløsningen, og fest den til siden av krukken.
    4. Fest deretter alligatorklemmen på anodledningen til halsen på nåleholderen. Slå på strømmen (til ~20 V) og dypp wolframledningen inn i KOH-løsningen, trekk ledningen ut av løsningen i en vinkel for å elektrolytisk skjerpe ledningen til en fin spiss.
      MERK: Bobler kommer fra bindersen etter hvert som reaksjonen fortsetter.
    5. Kontroller spissen på nålen under dissekeringsmikroskopet for å sikre at den er skarp nok.
    6. Skyll nålen med deionisert vann for å fjerne alle KOH-rester. Lag flere nåler på forhånd og hold dem til larveoperasjoner og disseksjoner.
  4. Lag kammerede lysbilder for avbildning av sebrafiskprøver med et oppreist konfidensisk mikroskop.
    1. Få tak i glassmikroskopsklier og todelt epoksyharpiks (se materialtabellen). Bland epoksy i henhold til instruksjonene på pakken, og mal tykke ringer eller rektangler på glasssklier. La skliene herde og tørke i hetten i minst 24 timer før bruk.

2. Embryooppsamling og oppdrett

  1. Par voksen mannlig og kvinnelig fisk av de ønskede genotypene i avlsbokser sent på ettermiddagen / tidlig på kvelden. Neste morgen, etter at de har gytet, samle nybefruktede egg med en maskesil og overfør dem til E3 i 100 mm Petri-retter.
  2. Inkuber embryoene ved ~27,5 °C med en mørk syklus på 14 timer til operasjonsdagen. Bytt E3 daglig eller etter behov.
  3. Fôr larvene ved hjelp av en dropper full av høstede rotifers en gang om dagen, som begynner enten på 5 dager etter befruktning (dpf) eller en dag etter operasjonen. Etter at larvene har flere timer å spise, bytt E3 for å fjerne eventuelle gjenværende rotiferer og avfallsprodukter.
    MERK: Ikke mate larver på operasjonsdagen.

3. Forbered larver for kirurgi

  1. På operasjonsdagen, bruk en bredboret pasteurpipette i glass for å overføre 10-15 larver til en 35 mm Petri-tallerken fylt med fersk E3.
  2. Bedøv larvene ved å tilsette 3-5 dråper 0,4% m / v Tricaine-løsning (0,4 g Tricaine oppløst i 210 mM Tris, pH 9; endelig løsning justert til en pH på 7,4 om nødvendig18) til parabolen for en endelig konsentrasjon på ~ 0,0015% w / v Tricaine. Se etter mangel på respons på berøring for å avgjøre om larvene er tilstrekkelig bedøvet. Hvis de fortsatt reagerer på berøring etter ~ 3 min, legg til 2-3 flere dråper 0,4% m / v Tricaine-løsning og revurderinger.
    MERK: På dette utviklingsstadiet er det mulig å overvåke blodstrøm og hjertefrekvens i tillegg til motilitet under dissekeringsmikroskopet.
  3. Immobiliser de bedøvede sebrafisk larver ved å legge dem inn i 1% LMP agarose oppløst i E3.
    1. Først legger du lokket på en 35 mm Petri-tallerken med forsiden opp under dissekeringsmikroskopet. Deretter tar du en larve opp i en smalboret pasteurpipette med bare en liten mengde E3.
    2. Deretter oppstod aspirat ~ 200 μL smeltet, varm (~ 40 °C) 1% LMP i pipetten med larven. Til slutt spruter larven og agarose på det opp-ned Petri parabolen lokket.
    3. Bruk en kjedelig wolfram nål for raskt, men forsiktig manøvrere larven slik at den er lateral, med ett øye vendt opp. Vent til agaroseen er satt (~5 min).
      MERK: Hvis agarose herdes mens larven ikke er lateral, frigjør du den fra agarose (som beskrevet i trinn 5) og returnerer den til parabolen med E3 og trikain.

4. Øyefjerning

  1. Når agarose er satt, og larven er plassert lateralt, bruk spissen av en veldig fin, elektrolytisk skjerpet wolframnål for å pierce huden rundt øyet, etter kanten av øyebanen.
  2. Skyv deretter kanten av nålen (ikke spissen) under øyet fra den tidsmessige ventrale siden av øyet. Bruk kontrollert trykk for å frigjøre øyet fra stikkontakten.
  3. Bruk veldig fine kirurgiske tang for å fjerne øyet ved å klemme synsnerven og skyve øyet fra medial til lateral. Alternativt kan du bare fortsette å trykke på øyet dorsalt og fremre med siden av nålen, til slutt kutte gjennom synsnerven og slippe øyet.
    MERK: Hvis andre vev enn øyet ved et uhell blir stukket under operasjonen, dreper du larven raskt og humant ved rask halshugging.

5. Postoperativ omsorg til eksperimentelt endepunkt

  1. Etter vellykket øyefjerning, dekk agarose med MMR-løsning.
  2. Frigjør hver larve fra agarose ved å forsiktig pusse en wolfram nål rundt hodet og deretter rundt kroppen mens stabilisere Petri parabolen lokket med tang.
  3. Overfør de enøyde larver til en 35 mm Petri tallerken som inneholder MMR supplert med en 1:100 fortynning av en penicillin / streptomycin cocktail. Inkuber embryoene ved ~27,5 °C med en mørk syklus på 14 timer.
    MERK: Denne isotoniske løsningen av MMR supplert med antibiotika hjelper i utgangspunktet larvalheling og overlevelse. Hver tallerken kan holde opptil 15 gjenopprettende larver.
  4. Neste dag, returner larvene til E3. Starter ettermiddagen etter operasjonen, mate larver (~ 6 dpf og eldre) ved hjelp av en dropper full av høstede rotifers en gang om dagen. Etter at larvene har hatt flere timer å spise, bytt E3 for å fjerne eventuelle gjenværende rotiferer og avfallsprodukter.

6. Fikse larver

  1. Når larvene har nådd ønsket utviklingsstadium for analyse, bedøv dem med en dødelig dose trikain (~ 0,4% endelig konsentrasjon) til hjertene deres har stoppet.
  2. Pipette opptil 30 larver per 1,5 ml mikrofugerør. Fjern overflødig E3 og tilsett deretter 0,5-1 ml fixativ løsning (4% paraformaldehyd (PFA) og 4% sukrose i fosfatbufret saltvann (PBS)) for å fikse vevet. Inkuber larvene over natten ved 4 °C.
  3. Vask larvene med PBS neste dag ved å fjerne fiksering og skylling av larver 3-4 ganger med PBS. Oppbevar larvene ved 4 °C i opptil 7 dager før disseksjon.

7. Dissekere larver for å avsløre hjerner (tilpasset fra 15)

  1. Suspender de faste larver i PBS-dråper på en Sylgard plate under et dissekerende mikroskop. Fest dem sidelengs ved å plassere to wolframpinner (vanligvis gamle wolframnåler som er mindre enn 2 cm) gjennom notokkoren, med en pinne bare bakre til pigmentert område som dekker aorta-gonad-mesonephros (AGM) -regionen og en annen i tråd med slutten av eggeplommeforlengelsen.
    MERK: Plasser wolframpinnene i så få forsøk som mulig fordi vevet blir mer skjøvet med hver punktering.
  2. Bruk en veldig skarp wolfram nål og nål-skarpe tang for å eksponere hjernen ved å fjerne, i denne rekkefølgen, øyet (e), øret, kjeven, fordøyelseskanalen og dorsal kranial hud.
    1. Fjern først øyet ved hjelp av en teknikk som ligner på kirurgisk øyefjerning i trinn 4. Deretter løsner du larven og vender den til motsatt side, slik at det andre øyet er tilgjengelig og gjentar. Alternativt kan du stikke nålen gjennom kjeven til den andre siden og fjerne øyet uten å løsne.
      MERK: Øyne kan samles inn på dette tidspunktet hvis det er ønskelig med analyse av dette vevet (lik 19).
    2. Deretter bruker du wolframnålen til å klø fra den tidsmessige til ventrale siden av øret. I samme handling/bevegelse, ta nålen bakre til kjeven og trekk forsiktig fremre til øret og kjeven er fjernet.
    3. Bruk tang til å trekke ventrale organer og eventuell gjenværende eggeplomme ut.
    4. Til slutt, gjør et grunt snitt i dorsal kranialhud nær krysset mellom hindbrain og ryggmargen. Løft huden med tang og trekk den fremre og rundt telencephalon. Hvis dette viser seg for vanskelig, start ved det første snittet i hindbrain og trekk huden først lateralt og deretter ventralt og fremre, og pass på at du ikke riper på tectumens sidekanter.
      MERK: Fordi midbrain er gjenstand for studier, kan hindbrain kuttes; Et dypt snitt kan imidlertid føre til halshugging.
    5. Fjern eventuelt gjenværende vev med tang. Løsne larven og overfør til PBS i et 1,5 ml mikrofugerør.
      MERK: La halen være festet til hjernen for bedre synlighet når du utfører helmonterte protokoller.

8. Hjernedehydrering og lagring

  1. Fjern PBS fra hjernen og tilsett 1 ml PBS som inneholder 0,1% TritonX-100 (PBST). Inkuber i 5-10 min ved romtemperatur.
  2. Fjern PBST og erstatt den med en 50:50 metanol:PBST-løsning. Inkuber i 5-10 min ved romtemperatur.
  3. Vask hjernen med 100% metanol (MeOH) to ganger i 5 minutter hver ved romtemperatur.
  4. Oppbevar hjernen i 100% MeOH ved -20 °C i minst 16 timer før du utfører immunhiistokjemi eller andre fullkomne prosedyrer.
    MERK: Hjerner kan lagres i MeOH i opptil 2 år ved -20 °C.

9. Immunohistokjemi

MERK: Etablerte protokoller for mange nyttige helmonterte teknikker i sebrafisk finnes på ZFIN20. Dette manuskriptet gir eksempler som sammenligner enøyde og toøyede larver som ble immunostert med antistoffer som gjenkjenner enten det røde fluorescerende proteinet (RFP), som uttrykkes i optiske nerveaksoner i Tg[atoh7:RFP] -linjen (figur 2), eller fosforert histone H3 (PH3), som fremhever mititotiske celler (figur 3). En standard immunhiistokjemiprotokoll for fullkomne embryoer og larver er oppsummert nedenfor.

  1. Først rehydrerer larvalhjernene med en gradert serie meoh:PBST vasker ved romtemperatur ved å inkubere prøvene i 50:50 MeOH:PBST i 5 min, deretter i 30:70 MeOH:PBST i 5 min, og slutter med 3 vasker av PBST.
  2. For å permeabilisere hjernen, inkubere dem i PBST supplert med proteinase K (PK) ved en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml PK i 30 min ved 37 °C. Oppbevar aliquots på 10 mg/ml PK ved -20 °C og tine dem opp før bruk.
  3. Fjern PK-oppløsningen og vask bort eventuelt gjenværende enzym ved å skylle hjernen med PBST 3 ganger over 15 min.
  4. Refiks de permeabiliserte hjernene ved å inkubere dem i 4% PFA i 20 min ved 25 °C (eller romtemperatur). Fjern deretter PFA og vask bort eventuelle gjenværende fikseringsmiddel ved å skylle hjernen 3 ganger over 15 min med PBST.
  5. Bytt ut den endelige PBST-skyllingen med nylaget immunblokkeringsbuffer (IB) (10 % normalt geiteserum og 1 % DMSO i PBST) og inkuber ved romtemperatur i minst 1 time.
  6. Fortynn primære antistoffer i IB-buffer ved riktig konsentrasjon (f.eks . 1:500 for RFP og 1:300 for PH3-antistoffer).
  7. Fjern IB-bufferen fra hjernen og erstatt den med den primære antistofffortynning. Inkuber over natten ved 4 °C på en orbital shaker med skånsom gynging. Sørg for at rørene hviler godt på sidene.
  8. Neste morgen, fjern den primære antistoffløsningen med en mikropipette, skyll et par ganger i PBST, og vask deretter hjernen i PBST ved romtemperatur i 4 x 30 min.
    MERK: Primære antistofffortynning kan gjenbrukes én gang innen ~7 dager hvis de oppbevares ved 4 °C.
  9. Skyll hjernen i IB-bufferen mens du fortynner sekundære antistoffer i IB-buffer ved riktig konsentrasjon (f.eks. 1:500 for Alexa-fluor 568 antikanin).
  10. Fjern IB-bufferen og erstatt den med sekundær antistofffortynning. Inkuber over natten ved 4 °C på en orbital shaker med skånsom gynging av rørene som hviler på sidene.
  11. Neste morgen, fjern den sekundære antistoffløsningen, skyll med PBST, og vask deretter hjernen i PBST ved romtemperatur i 4 x 30 min.
  12. Tellere med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) eller ToPro3 (1:5,000 i PBST ved 4 °C over natten).
  13. Neste morgen overfører du larvalhjernene til PBS og fortsetter til monterings- og bildetrinnene som er oppført nedenfor.

10. Montering og avbildning

  1. Fest en kammersklie inn i lokket på en 100 mm Petri-tallerken med vakuumfett.
  2. Overfør de immunosterte og bearbeidede larver til en brønnplate eller depresjon lysbilde for å se dem med et dissekerende mikroskop.
  3. Monter larvene på den kammeret lysbilde i kolonner på 1% LMP agarose.
    1. Bruk en glass Pasteur pipette, legg en larve på den kammerede lysbildet, og deponer så lite PBS som mulig. Med samme pipette, dekk larven med smeltet 1% LMP agarose (~ 40 °C).
    2. Med en stump wolfram nål eller tang, trekk agarose inn i en kolonne og plasser deretter larven så symmetrisk som mulig, med dorsaloverflaten synlig.
    3. Gjenta denne prosedyren for de resterende larver.
    4. Når agarose har gelled, dekk den med noen dråper PBS og plasser den deretter på scenen til det konfokale mikroskopet.
  4. Juster objektivlinsen etter prøven, fokuser mikroskopet ved hjelp av overført lys, og belys prøven med de riktige laserne.
    MERK: I dette eksemplet ble 405 nm og 568 nm bølgelengder brukt til å begeistre henholdsvis DAPI og RFP.
  5. Juster forsterknings-, forskyvnings- og lasereffekten ved å flytte glidebryterne til et passende nivå i forhold til signalet og den brukte detektoren. Kontroller histogrammene for hver kanal, og klikk metningsindikatorknappen over bildet for å måle eksponeringsnivået, slik at ingen av bildepunktene er mettet og at signal-til-støy-forholdet er høyt. For et eksempel på optimale konfektavbildningsparametere for cellulær og subcellulær oppløsning i sebrafisk, se 21.
  6. Angi øvre og nedre grense for stabelen for z-plan ved å bruke rullehjulet på musen til å finne toppen og bunnen av prøven. Klikk på de øverste og nederste grensene for bildeanskaffelse, og utløs deretter z-stack-opptaket ved å klikke Kjør nå-knappen .
    MERK: Avhengig av hvor symmetrisk hjernen er montert, vil den totale z-dybden for en 9 dpf larval sebrafiskhjerne være ~ 150-200 μm.
  7. Behandle og fargelegge bildene med tanke på fargeblind tilgjengelighet (bruk for eksempel blått og oransje eller magenta og grønt for bilder med to farger). Angi oppslagstabeller i programvaren som brukes til å ta bilder eller bildebehandlingsprogramvare, for eksempel Photoshop fra Adobe.
  8. I Photoshop lagres color raw-fotomikrografer som er lagret som 8-biters TIFF (Tagged Image File Format) ved (i) å konvertere bildemodusen til RGB og (ii) få tilgang til kurver-alternativet under bilde- | Justeringsmenyer og deretter (iii) skyve de aktuelle fargede lysutgangene til 0 eller 255 nivåer for å oppnå ønsket farge. Hvis du for eksempel vil oppnå et grønt signal, velger du den røde kanalen og skyver utdataene til 0. Velg deretter den blå kanalen og skyv utgangen til 0 også. På samme måte, for å oppnå et magentasignal, velg den grønne kanalen og skyv utgangen til 0; la de røde og blå kanalene være som de er.
    MERK: Lignende trinn kan utføres i det gratis Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
  9. Kvantifiser antall celler manuelt som viser en bestemt markør ved hjelp av celleteller-plugin-modulen i ImageJ22, som er tilgjengelig under Analyser i Plugins-menyen. Eksempler på hvordan du bruker ImageJ til celletelling finnes i mange opplæringsprogrammer, inkludert 23.
  10. Generer grafiske representasjoner av data i statistisk programvare, for eksempel RStudio (se supplerende data for . Rmd-filen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å bekrefte om øyefjerning var fullført og vurdere hvordan det optiske tectumet endres, ble det utført operasjoner i Tg[atoh7:RFP]-stammen, som merker alle RGCer med en membran-målrettet RFP og dermed alle aksoner som projiserer fra netthinnen og danner synsnerven24. Selv om det ikke er absolutt nødvendig å bruke denne stammen, muliggjør det enkel observasjon og visualisering av synsnerven termini i den optiske tectum neuropilen. Andre tilnærminger for merking av synsnerven, for eksempel axonsporing med lipofil DiI- eller DiO-fargestoffer25,26 eller multispektral merking med hjernebow27, vil også være mulig.

Som vist i figur 2 ble progressiv degenerasjon av retinal aksoner i det optiske tectum neuropil observert etter øyefjerning. Ved to dager etter operasjonen viste RFP-merkede axoner kjennetegn på rask walleriansk degenerasjon28 som blebbing og fragmentering (figur 2A, B). Nyere arbeid har vist at mikroglia oppsluker mer myelinmateriale når nevroner blir stilnet29. I samsvar med mikroglia oppslukende biter av de degenererende RGC-axonene og migrere bort fra kilden til degenerasjon, ble lyse RFP-merkede puncta i og utenfor tectal neuropil notert (Figur 1B, piler). Ved fire dager etter operasjonen reduseres fragmenterte aksoner og RFP-merket axonalavfall betydelig i enten tektal lobe, noe som indikerer relativt rask klaring av døende og degenererende aksoner (figur 2C, D).

For å utføre fullkommen immunhiistokjemi og visualisere det optiske tectum av larval sebrafisk, ble hjernen utsatt ved å dissekere av øyet (e), kjeven, ørene og skallehetten i huden og bindevevet. Ideelt sett forblir hjernen intakt under denne prosedyren (f.eks. Imidlertid vil deler av forebrain, spesielt den olfaktoriske pæren, sannsynligvis bli skadet eller helt fjernet når skallehetten av hud eller kjeve fjernes (figur 2A, pilspiss). Videre kan noen ganger den laterale kanten av tectum kuttes når du piercing eller klemmer huden for å trekke den av hjernen (f.eks. figur 2A; rive på høyre tektal lobe).

Immunohistokjemi ble også brukt til å vurdere antall mititotiske celler i innerverte og ikke-innerverte lober i det optiske tectum ved å farge hele hjernen med et PH3-antistoff. Disse dataene viser betydelig færre mititotiske celler på den denerverte siden av enøyd larvalfisk (p = 0,00033, Welchs t-test; Figur 3).

Figure 2
Figur 2: Øyefjerning ved 5 dpf utløser degenerasjon av optiske nerveaksoner. (A-D) Representative maksimalintensitetsprojeksjoner som viser dorsale syn på ville hjerner fra intakte larver festet ved 7 dpf (A) eller 9 dpf (C), eller enøyde larver fra øyeutskillelsesoperasjoner ved 5 dpf, faste 2 dps (B) eller 4 dps (D). Alle kjerner er farget med DAPI (grønn), og optiske nerveaksoner som slutter i nevropilen til det optiske tectum er merket med atoh7: RFP-transgene (magenta). Stjerne indikerer innervated tectal neuropil i larver med bare høyre øye intakt. Piler indikerer eksempler på fragmenter av degenererte RGC-axoner som kommer fra det denerverte optiske tectumet. Pilspiss indikerer manglende deler av forebrain. Skalastang = 50 μm. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; dps = dager etter operasjonen; RGC = retinal ganglion celler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Antall mititotiske celler i det optiske tectumet øker med innervasjon. (A-B) Representative fremskrivninger med maksimal intensitet som viser dorsale syn på ville hjerner fra intakt (A) eller enøyd (B) 9 dpf larver immunostert med antistoffer for den mitotiske markøren PH3 (magenta) og nukleinert motangrep med DAPI (grønn). Stjerne indikerer innervated tectal neuropil fra det intakte høyre øyet. (C) Box plot med alle individuelle datapunkter lagt over som viser kvantasjon av forholdet mellom PH3 + celler i innervated (venstre) versus denervated (høyre) tectal lobe som et forskjellsforhold (venstre-høyre / total) for enøyde (n = 12) og toøyde (n = 8) 9 dpf larver. Midler til de to forholdene sammenlignet med Welchs t-test (***, p < 0,0005). Skalastang = 50 μm. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; dps = dager etter operasjonen; PH3 = fosforylatert histone H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil: Omriss og instruksjoner for plott vist i figur 3C. Denne filen inneholder alle data og kode slik at alle kan reprodusere boksen plott med alle datapunkter overlaid, som vist i figur 3C. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikkene beskrevet i denne artikkelen illustrerer en av mange tilnærminger for å studere virveldyr visuell systemutvikling i sebrafisk. Andre forskere har publisert metoder for å dissekere den embryonale netthinnen og utføre genuttrykksanalyser19 eller visualisere nevronaktivitet i det optiske tectum30. Dette dokumentet gir en tilnærming for å utforske hvordan differensial retinal input kan påvirke celleatferd i det optiske tectum.

For å sikre vellykket øyeutskillelse og larveoverlevelse etter operasjonen, er det viktig at larvene er sunne, tilstrekkelig bedøvet og immobilisert i 1% agarose. Det er også avgjørende at tang og wolfram nåler er veldig skarpe og rene. Larver overlever best når de ikke blir matet 24 timer før eller etter operasjonen, og oppdrettslarver i MMR supplert med antibiotika øker helbredelsesprosessen. Viktigst, den høyere ioniske styrken til MMR og spesielt den høyere konsentrasjonen av kalsium fremmer helbredelse14. Imidlertid kan lengre eksponering for høyere saltholdighet redusere overlevelsen, på samme måte som det som er dokumentert i embryonal sebrafisk31. Et mest kritisk trinn er fiksering for å sikre vellykkede hjerneavhandlinger, som er avgjørende for dataanalyse av bilder av immundempte prøver. Ved hjelp av nylaget 4% PFA supplert med 4% sukrose (kjærlig kalt søt løsning) har en tendens til å øke enkel hudfjerning og hjernevev bevaring. Som med operasjonene er skarpe og rene verktøy et must for dissekering av hjerner.

En av de største utfordringene med denne protokollen er å legge inn larver for øyeutskillelser. Det er viktig at hver person finner måten som fungerer best for dem, slik at de trygt og raskt kan fjerne larveøyet. Hvis larven ved et uhell blir stukket under operasjonen, dreper du den humant ved halshugging. En annen utfordring er å bestemme de mest effektive antistoffkonsentrasjonene for fullkomne immunstaining. Ved fastsettelse av passende antistoffkonsentrasjoner, bruk den publiserte litteraturen som utgangspunkt og optimaliser protokollen som bruk av publiserte reagenser på forskjellige vev (spesielt på større vev eller eldre dyr) kan kreve økte konsentrasjoner og / eller inkubasjonstider.

Den største begrensningen ved denne metoden er tiden et enkelt eksperiment tar fra start til slutt og antall fisk som kan studeres til enhver tid. For eksempel tok alle dataene som vises i figur 3 omtrent en måned fra den første sammenkoblingen av fisk til den endelige datainnsamlingen og analysen. Denne relativt lavgjennomstrømningsmetoden kan suppleres med heterologiske genetiske tilnærminger som enten selektivt knebler nevral aktivitet i det visuelle systemet32,33 eller av mutanter som mangler RGC-aksoner eller aktivitet34,35.

Betydningen av denne metoden er at den bringer en tradisjonell embryologisk teknikk å bære på moderne transgene fiskelinjer, noe som tillater direkte sammenligning av cellulære og genetiske mekanismer som opererer i hver av de tektale lober i samme individ. Videre er denne metoden moden for bruk på andre eksperimentelle systemer, inkludert Astyanax overflatefisk36 og / eller transgene sebrafisk larver med fluorescerende merket mikroglia 37,38,39 og astrocytter40 for å studere hvordan det utviklende fiskenervesystemet reagerer på en så dramatisk skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Støtten til dette arbeidet ble først og fremst støttet av oppstartsmidler fra Reed College til KLC, Helen Stafford Research Fellowship-midler til OLH, og et Reed College Science Research Fellowship til YK. Dette prosjektet begynte i Steve Wilsons laboratorium som et samarbeid med HR, som ble støttet av et Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Vi takker Máté Varga, Steve Wilson og andre medlemmer av Wilson-laboratoriet for innledende diskusjoner om dette prosjektet, og vi takker spesielt Florencia Cavodeassi og Kate Edwards, som var de første til å lære KLC hvordan man monterer embryoer i agarose og utfører sebrafisk hjerne disseksjoner. Vi takker også Greta Glover og Jay Ewing for hjelp med montering av vår wolfram nål-slipeenhet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes Aquaneering ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease Sigma or equivalent supplier Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL) For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5 Fine Science Tools (FST) 11252-20
Glass Pasteur pipettes DWK Lifescience 63A53 & 63A53WT For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy VWR or equivalent supplier 48311-703 Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders For making and storing solutions.
2-part epoxy resin ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent 0.85 oz syringe https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL) VWR or equivalent supplier 22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length) Fine Science Tools (FST) 26018-17 To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent Ali Express or equivalent For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 50-190-0267
Petri dishes 35 mm Fischer Scientific or equivalent supplier 08-757-100A
Pipette pump SP Bel-Art or equivalent F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 909122 For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage) For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit Dow Corning 3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter) World Precision Instruments (WPI) TGW0515 Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block The Lab Depot or equivalent supplier BSH1001 or BSH1002 Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar) For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended.
Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES Sigma H7006 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 1374248 For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate Sigma M7506 For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210 Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin Sigma P4333-20ML Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets Diagnostic BioSystems DMR E404-01 Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride Sigma P3911 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride Sigma S9888 For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide Sigma S5881 Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose Sigma S9378
Tricaine-S Pentair 100G #TRS1 Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG Invitrogen A-11011 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3 Invitrogen 1306 or T3605 Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418 A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH) Sigma 34860 Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum ThermoFisher Scientific 50-062Z A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3 Millipore 06-570 Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives) MBL International PM005 Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK) Sigma P2308-10MG Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100 Sigma T8787 Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji) Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains. Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028 (2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456 (2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667 (2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837 (2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14 (2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 180 sebrafisk visuelt system optisk tectum øyeekstirpasjon hjerneavhandling immunhiistokjemi spredning axonal degenerasjon
Øyefjerning i levende sebrafisk larver for å undersøke innervasjonsavhengig vekst og utvikling av det visuelle systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski,… More

Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski, E., Rouse, H., Cerveny, K. L. Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System. J. Vis. Exp. (180), e63509, doi:10.3791/63509 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter