Summary
Vi præsenterer en protokol til elektrofysiologisk at karakterisere bi-stabile fotopigmenter: (i) udnyttelse af ladningsforskydningerne i fotopigmentmolekylerne efter fotonabsorption og deres enorme mængde i fotoreceptorerne og (ii) udnyttelse af absorptionsspektreforskellene mellem rhodopsin og metarhodopsinfotopigmenttilstande. Disse protokoller er nyttige til at screene for mutationer, der påvirker bi-stabile fotopigmentsystemer.
Abstract
Drosophila G-proteinkoblet fotopigment rhodopsin (R) består af et protein (opsin) og en kromofor. Aktiveringsprocessen af rhodopsin initieres af fotonabsorptionsfremkaldende isomerisering af kromoforen, hvilket fremmer konformationsændringer af opsin og resulterer i en anden mørk stabil fotopigmenttilstand (metarhodopsin, M). Undersøgelse af denne bi-stabile fotopigment ved hjælp af tilfældig mutagenese kræver enkle og robuste metoder til screening af mutante fluer. Derfor er der designet flere metoder til måling af reduktioner i funktionelle fotopigmentniveauer. En sådan metode udnytter ladningsforskydningerne i fotopigmentet efter fotonabsorption og de enorme mængder fotopigmentmolekyler udtrykt i fotoreceptorerne. Dette elektriske signal, kaldet det tidlige receptorpotentiale (eller tidlig receptorstrøm), måles ved en række elektrofysiologiske metoder (f.eks. Elektroretinogram og helcelleoptagelser) og er lineært proportional med funktionelle fotopigmentniveauer. Fordelene ved denne metode er det høje signal-støj-forhold, direkte lineær måling af fotopigmentniveauer og uafhængighed af fototransduktionsmekanismer nedstrøms til rhodopsin- eller metarhodopsinaktivering. En yderligere elektrofysiologisk metode kaldet langvarig depolarisering efterpotentiel (PDA) udnytter bi-stabiliteten af Drosophila fotopigment og absorptionsspektrale forskelle mellem flue R og M pigmenttilstande. PDA'en induceres af intenst blåt lys, der omdanner mættede mængder rhodopsin til metarhodopsin, hvilket resulterer i svigt i lysresponsafslutning i længere tid i mørke, men det kan afsluttes ved metarhodopsin til rhodopsinkonvertering ved hjælp af intens orange lys. Da PDA'en er et robust signal, der kræver massiv fotopigmentkonvertering, fører selv små defekter i biogenesen af fotopigmentet til let detekteret unormal PDA. Faktisk førte defekte PDA-mutanter til identifikation af nye signalproteiner, der var vigtige for fototransduktion.
Introduction
Den lysaktiverede rhodopsin (R), som er en G-proteinkoblet receptor (GPCR), består af et 7 transmembranprotein (opsin) og en kromofor. I Drosophila melanogaster (frugtflue) inducerer fotonabsorption isomerisering af 11-cis-3-OH-retinal kromofor til all-trans-3-OH-retinal1, hvilket fremmer den konformationelle ændring af rhodopsin til metarhodopsin (M, figur 1A). I modsætning til hvirveldyr rhodopsin dissocieres den overvejende fraktion af invertebratchromophore ikke fra opsinen, hvilket resulterer i den fysiologisk aktive mørkstabile pigmenttilstand M. Til gengæld inducerer yderligere fotonabsorption af all-trans-3-OH-retinal kromofor isomerisering af kromoforen 2,3, hvilket genererer R-pigmenttilstanden med 11-cis-3-OH-retinal kromofor. R-tilstanden er en mørk, stabil og fysiologisk ikke-aktiv fotopigment. Ud over den ekstremt hurtige fotonregenereringsrute forkromoforen 4, ligesom hvirveldyrfotopigmenter, findes der en alternativ enzymatisk langsom rute til kromoforregenerering hos hvirvelløse dyr, hvor nogle af stadierne udføres i retinale celler omkring fotoreceptorcellerne 5,6.
Drosophila medfører store fordele som en modelorganisme til undersøgelse af hvirvelløse fotoreceptorer. Især præparatets tilgængelighed og evnen til at anvende molekylær genetik har gjort Drosophila til et kraftfuldt modelsystem7. Derfor er der etableret flere in vivo- og ex vivo-eksperimentelle metoder til undersøgelse af fototransduktion generelt og fotopigmentniveauer i særdeleshed. Den enkleste in-vivo-metode udnytter den relativt store ekstracellulært registrerede spændingsrespons på lyset i Drosophila-øjet. Følgelig fremkalder lysstimulering et elektrisk spændingsrespons i hele øjet, der kan måles ved hjælp af ekstracellulær elektroretinogram (ERG) optagelse, hvilket er ~ 3 størrelsesordener større end ERG-responsen på lys fra hvirveldyr øjne 8,9. Drosophila ERG-responsen er robust og let opnået, hvilket gør det til en bekvem metode til at identificere abnormiteter i lysrespons på grund af mutationer. ERG-responsen på lys stammer hovedsageligt fra fotoreceptorerne, pigmentcellerne (glia) og sekundære neuroner i laminaen (se figur 1B). Hovedkomponenterne i ERG er (i) fotoreceptorernes ekstracellulære spændingsrespons, (ii) "on" og "off" transienterne i begyndelsen og slutningen af lysstimuleringen, der opstår fra lamina neuronerne (figur 2A, indsat, ON, OFF), (iii) den langsomme respons af gliacellerne (figur 2A, indsats, pile) og (iv) den korte og forbigående respons, som følge af ladningsforskydning under fotopigmentaktivering, der går forud for ON transient10 (figur 2C [indsat], D, E). Dette korte respons består af to faser (M1 og M2, figur 2C [indsat]) og kan kun induceres ved ekstremt stærk lysstimulering, som samtidig aktiverer millioner af fotopigmentmolekyler. Det observeres hverken under blå stimulering (figur 2D, blåt spor) eller hos mutanter med stærkt reducerede fotopigmentniveauer (figur 2E, rødt spor), men dets amplitude er mildt forbedret i en mutant, der afskaffer PLC-aktivitet (figur 2E, orange spor). M1-fasen er en typisk ERP af fluen som følge af aktiveringen af M i fotoreceptorerne. M1-fasen, som har en positiv polaritet (intracellulært), frigiver en neurotransmitter på normal måde i en tegninverterende synapse og aktiverer lamina neuronerne, som reagerer på fotoreceptordepolariseringen ved at generere den synaptisk forstærkede M2-fase. Således afspejler både M1- og M2-faser M-aktivering10,11.
Depolariseringen af fotoreceptoren genererer den hornhinde-positive "on" forbigående, der stammer fra den tegninverterende synapse mellem fotoreceptor axon og de monopolære neuroner i lamina10,11 (figur 1B). Den langsomme stigning og henfald af ERG stammer fra depolariseringen af pigmentcellerne (figur 2A, indsat, pile) hovedsageligt på grund af K + -udstrømning fra fotoreceptorcellerne12 via det forbigående receptorpotentiale (TRP) og TRP-lignende (TRPL) kanaler 13,14,15. Disse langsomme kinetiske komponenter maskerer og forvrænger i vid udstrækning bølgeformen af fotoreceptorsponset sammenlignet med intracellulære eller helcelleoptagelser af fotoreceptorresponset på lys 9,10. Derudover kan der ved meget stærke belysninger observeres en yderligere forbigående respons, som går forud for og delvis smelter sammen med den "tændte" transient (figur 2C [indsat], D, E). Dette signal stammer direkte fra den massive aktivering af fotopigmentet10.
Flere lysregimeprotokoller ved hjælp af neutral densitet (ND) og farvefiltre samt stærke lysende blink er blevet udviklet til at undersøge øjet generelt og fototransduktionskaskaden i særdeleshed. Disse protokoller er også blevet brugt til at undersøge fotopigmentets egenskaber.
Intensitetsresponsprotokollen måler topamplituden af ERG-spændingsresponsen for hele øjet til stigende lysintensiteter (figur 2A, B). Denne protokol hjælper med at detektere ændringer i fotoreceptorcellernes følsomhed over for lys9.
Den langvarige depolariserende efterpotentielle (PDA) protokol udnytter forskellene i absorptionsspektrene af rhodopsin og metarhodopsin, der i Drosophila tillader en massiv fotopigmentkonvertering af R til dens fysiologisk aktive og mørkstabile mellemliggende M-tilstand2. I ERG-spændingsresponsen gives en relativt kort puls af mættet lys, og det resulterende spændingsrespons registreres. Under denne betingelse nås et loft (reverseringspotentiale) af depolariseringssignalet, fordi aktivering af en brøkdel af en procent af den enorme mængde rhodopsinmolekyler (~ 1 x 108) er tilstrækkelig til at nå loftet. Tilstedeværelsen af fototransduktionskomponenterne i stor overflod sikrer, at dette loft nås selv i mutanter med en betydelig reduktion i koncentration eller subtil funktionsfejl i fototransduktionskomponenterne. Denne situation udelukker isolering af disse mutanter. Pak et al. introducerede PDA-screening7 , der søgte en pålidelig og afslørende test for at isolere visuelle mutanter. I Drosophila tilvejebringes PDA-responset ved genetisk fjernelse af det røde screeningspigment, som muliggør fotopigmentkonvertering, og påføring af blåt lys, som fortrinsvis absorberes af rhodopsin (figur 3A) og dermed resulterer i en stor nettokonvertering af R til M-fotopigmenttilstanden. Fototransduktionsafslutning forstyrres på fotopigmentniveau ved en stor nettokonvertering af R til M, hvilket igen resulterer i vedvarende excitation længe efter, at lyset er slukket (figur 2C, figur 4A [øverst]). I PDA-perioden er fotoreceptorerne mindre følsomme over for efterfølgende testlys og er delvist desensibiliserede (inaktiverede). PDA'en detekterer selv mindre defekter i rhodopsin biogenese og tester fotoreceptorcellens maksimale kapacitet til at opretholde excitation i en længere periode. Da det strengt afhænger af tilstedeværelsen af høje koncentrationer af rhodopsin, scorer det let for mangelfuld genopfyldning af fototransduktionskomponenterne. Bemærkelsesværdigt har PDA-skærmen givet mange nye og meget vigtige visuelle mutanter (gennemgået i Pak et al.7). Således er PDA-mutanterne isoleret af Pak et al.7 stadig yderst nyttige til analyse af Drosophila visuelle system.
PDA'en induceres i Drosophila ved at mætte blåt lys, hvilket resulterer i kontinuerlig depolarisering længe efter lysforskydning (figur 4A [øverst]). Efter mætning af PDA-inducerende blåt lys forbliver de perifere fotoreceptorer (R1-6) kontinuerligt aktive i mørket ved deres maksimale kapacitet og når mætning. Yderligere mættende blå lys under PDA'en producerer ikke yderligere respons i R1-6-celler i mange sekunder, men inducerer et respons i R7-8-celler, der er overlejret på PDA'en. De overlejrede reaktioner forklares af de forskellige absorptionsspektre af fotopigmenterne udtrykt i disse celler (R7-8)16. PDA'en kan undertrykkes ved fotokonvertering af M tilbage til R med mættet orange lys (figur 4A [øverst]). PDA'ens evne til at bringe fotoreceptorcellerne til deres maksimale aktive kapacitet, en situation, der ikke kan opnås ved intenst hvidt lys, forklarer, hvorfor det har været et vigtigt værktøj til at screene for visuelle mutanter af Drosophila. Dette skyldes, at det tillader påvisning af selv mindre defekter i proteiner involveret i biogenesen af normale fotopigmentniveauer 17,18. To grupper af PDA defekte mutanter er blevet isoleret: hverken inaktivering eller efterpotentielle (nina) mutanter og inaktivering, men ikke efterpotentielle (ina) mutanter. Fænotypen af førstnævnte er mangel på en PDA og den tilhørende inaktivering som følge af en stor reduktion i fotopigmentniveauerne (figur 4A [midten]). Fænotypen af sidstnævnte viser inaktivering, men ingen mørk depolarisering efter blåt lys på grund af en stadig ukendt mekanisme i mutanten med normale rhodopsinniveauer, men mangler proteiner, der interagerer med TRP-kanalerne (figur 4A [bund]).
PDA'en stammer fra forskellen i mængden af fotopigment i forhold til arrestin (ARR2), som binder og afslutter M-aktivitet 19,20,21 (figur 1A). I Drosophila fotoreceptorer er mængden af fotopigment ca. fem gange større end mængden af ARR219. ARR2-niveauer er således utilstrækkelige til at inaktivere alle M-molekyler genereret af en stor nettofotokonvertering af R til M, hvilket efterlader et overskud af M konstant aktiv imørket 17,19,20,22,23. Denne mekanisme forklarer eliminering af PDA-responsen ved mutationer eller ved carotenoid deprivation24,25, hvilket forårsager en reduktion i fotopigmentniveauet, men påvirker ikke arrestinniveauerne. Desuden tegner denne forklaring sig også for fænotyperne af null ARR2 (arr23) mutant allel21, hvor PDA kunne opnås ved ~ 10 gange svagere blå lysintensiteter 19,20,21 (figur 4B, C). PDA'en er ikke et unikt træk ved fluefotoreceptorer, og den forekommer i alle testede arter, der har mørk stabil M med et absorptionsspektrum, der adskiller sig fra R-tilstanden, hvilket muliggør tilstrækkelig fotokonvertering af fotopigmentet fra R til M-tilstand. En grundigt undersøgt art, hvor PDA-fænomenologien blev opdaget, er barnacle (Balanus) fotoreceptoren, hvor absorptionsspektret for R-tilstanden er i en længere bølgelængde end M-tilstanden2 (figur 3B). I modsætning til situationen i fluen inducerer orangerødt lys i ruren derfor en PDA, mens blåt lys undertrykker PDA2.
Erp-protokollen (Early Receptor Potential) udnytter den ladningsforskydning, der forekommer under R- eller M-aktivering. Det visuelle pigment er en integreret del af overflademembranen i signalrummet i både hvirveldyr og hvirvelløse membraner3. Følgelig ledsages aktiveringsprocessen, hvor fotopigmentmolekylerne ændres fra en mellemtilstand til den næste, af en ladningsforskydning 4,26. Da fotopigmentmolekylerne er elektrisk justeret parallelt med membrankapacitansen4, genererer en hurtig synkroniseret konformationsændring en hurtig polarisationsændring af overflademembranen, som i fluer forekommer i signalrummet sammensat af en stak på ~ 30.000-50.000 mikrovilli kaldet rhabdomere. Denne polarisering udledes derefter passivt gennem cellelegemets membrankapacitans, indtil cellemembranen er lige polariseret. ERP er den ekstracellulære registrering af ladningsforskydningen. Den intracellulært registrerede ERP manifesterer den ekstracellulære ERP integreret af cellemembranens tidskonstant 4,27,28. Den strøm, der aktiveres af den visuelle pigmentladningsforskydning, kunne også måles i helcellespændingsklemmeoptagelser29,30 (figur 5A-D) med den største fordel (i tidlige receptorstrømoptagelser (ERC) ved at minimere effekten af membrankapacitans på signalets kinetik.
Protokolafsnittet beskriver, hvordan man udfører ERG-målinger fra Drosophila eye9 og ERC-målinger ved helcelleoptagelser fra Drosophila isoleret ommatidia31,32. Vi beskriver også specifikke protokoller, der bruges til at undersøge fototransduktion generelt og fotopigmenter i særdeleshed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Måling af intensitetsresponsforholdet, langvarig depolarisering efterpotentiel (PDA) og det tidlige receptorpotentiale (ERP) ved hjælp af elektroretinogrammet
- Egnede opdrætsbetingelser for forberedelse af D. melanogaster
- Raise D. melanogaster flyver i flasker indeholdende standard gul majs indeholdende mad i en inkubator, der holdes ved en temperatur på 24 ° C og i en 12 timers mørk / lys cyklus
- Hold flueflaskerne i mørke mindst 24 timer før eksperimentet.
- Generel opsætning
- Forbered optagelsespipetter ved at trække 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) fiberfyldte borosilikatglaskapillærer (figur 6L, O). Pipetternes modstand skal være 5-10 MΩ; enhver passende aftrækker kan bruges.
- Coat to sølvtråde med AgCl2, og indsæt 0,25 mm sølvtråd i 3 M KCl-opløsning, der er tilsluttet en specialfremstillet 5 V strømforsyning.
- Indsæt hver belagt sølvtråd i elektrodeholderne (figur 6N).
- Glaskapillæren fyldes med filtreret Ringer-opløsning (se tabel 1) med en aflang sprøjte med spids (figur 6M).
- Indsæt ledningselektroden i glaskapillæren. Sørg for, at opløsningen i kapillæren er i kontakt med sølvtråden.
- Indsæt elektrodeholderne (figur 7P, N) i de to elektrodemikromanipulatorer (figur 7G).
- Procedure for forberedelse af fluen til elektriske optagelser
BEMÆRK: For at holde fluen under mørke forhold skal du kun bruge svag rød lysbelysning under følgende trin.- Bedøv fluerne i flasken med CO2 -gas ved hjælp af fluesvellesystemet (figur 6A, B) og hæld dem i sovebeholderen.
- Vælg en flue og hold den forsigtigt ved vingen ved hjælp af en skarp pincet. Dæk resten af fluerne med en petriskål.
- Placer fluen på flueholderen i den rigtige retning - liggende på siden med ryggen mod hånden (figur 6P).
- Tænd for loddejernets strømforsyning. Indstil strømmen til ~ 2,25 A. Denne strøm skal opvarme 0,25 mm platin-iridiumfilamentet til ~ 55-56 ° C (se supplerende fil).
- Anbring en dråbe voks med en lav smeltetemperatur (~ 55-56 ° C) på loddejernet (figur 6F).
- Brug pincet til at løfte fluen fra vingerne og fastgør vingerne til flueholderen (figur 6I) ved hjælp af loddejernet.
- Brug loddejernet til at forbinde fluens ryg til stativoverfladen med voks (figur 6P).
- Sænk spidsen af loddejernet ned på benenes sammenføjningspunkt, og smelt voksen for at dække alle benene sammen (figur 6P).
- Placer en lille dråbe voks mellem hovedet og ryggen i nakkeområdet (figur 6P).
BEMÆRK: Vær særlig forsigtig for at undgå overophedning af fluehovedet. Sørg for, at fluen er korrekt fastgjort og ikke er i stand til at bevæge sig under eksperimentet; mindre bevægelser kan skabe artefakter i optagelserne. Sørg for, at luftrørsåbningerne (vejrtrækningsindløb) i thorax og mave ikke er dækket af voks. - Anbring flueholderen (figur 7Q) i et mørkt Faraday-bur på en magnetblok (figur 7I), og sørg for, at fluen er ~ 5 mm fra enden af lysstyringen (figur 7L).
- Anbring optageelektroden (figur 7P) over fluens øje og jordelektroden (figur 7N) over fluens øvre ryg ved hjælp af mikromanipulatorerne.
- Indsæt jordelektroden i fluens bagside ved hjælp af mikromanipulatorerne.
- Indsæt optageelektroden i den ydre periferi af fluens øje, helst ved hjælp af mikromanipulatorerne.
BEMÆRK: Efter indsættelse af elektroden i øjet observeres en lille fordybning; træk elektroden opad uden at fjerne den fra øjet, indtil fordybningen forsvinder. Elektroderne kan også nedsænkes i små dråber elektrodegelé påført torso og øje.
- Intensitet-respons protokol
- Placer et orange filter (590 kantfilter) foran højtryks Xenon-lampen. Brug et stort (seks størrelsesordener) dæmpende ND-filter (neutral densitet).
- Vent 60 s i mørket og giv en 5 s lyspuls.
- Udskift ND-filteret med et mindre dæmpende ND-filter i intervaller af en størrelsesorden.
- Vent 60 s i mørket og giv en anden 5 s lyspuls.
- Gentag trin 1.4.1.-1.4.4, og øg gradvist lysintensiteten ved hjælp af mindre dæmpende ND-filtre (den sidste puls skal genereres uden noget ND-filter overhovedet). Sørg for at bruge serien af ND-filtre i den rigtige retning, startende fra stor dæmpning og når lav dæmpning.
- PDA-protokol (denne protokol kan kun udføres på hvidøjede fluer)
- Giv en 5 s lyspuls med maksimal intensitet ved hjælp af et orange filter (590 kantfilter, for at konvertere maksimal fotopigment til R-tilstand).
- Udskift det orange filter med et bredbåndsblåt (BP450/40 nm) filter, og giv tre 5 s lysimpulser ved maksimal intensitet.
BEMÆRK: Det er også muligt at give en lang kontinuerlig maksimal intensitet blå lysimpuls, indtil en steady-state spændingsrespons er nået. - Vent 60 s i mørke, udskift det blå filter med det forrige orange filter, og giv to 5 s lysimpulser med 60 s intervaller.
- ERP/M-potentiel protokol til måling af foto-ligevægtsspektret for M (denne protokol kan kun udføres på hvidøjede fluer10,25)
- Giv en kontinuerlig blå (båndpas (BP) 450/40 nm) lyspuls, indtil den når et steady state spændingsrespons, som konverterer den maksimale mængde fotopigment fra R-tilstanden til M-tilstanden for R1-6-celler.
- Giv et kort (<3 ms) intenst lysglimt med en bølgelængde mellem 350-700 nm (det kendte absorptionsspektrum for R1-6-cellers fotopigment) ved hjælp af smalle (~ 20 nm) båndpasfiltre og mål topamplituden af M1-fasen af M-potentialresponsen (som afspejler metarhodopsinabsorptionen ved denne specifikke bølgelængde ved fotoligevægt10,25).
BEMÆRK: Til synkron aktivering af en stor pool af fotopigmentmolekyler kræves en kort, intens lysglimt, så fotonindholdet pakkes på kort tid. M-potentialet består af to komponenter: M1 (hornhinde negativ fase), som afspejler ladningsforskydningen af metarhodopsin i fotoreceptoren, og M2 (hornhindepositiv fase11,33), som afspejler fotoreceptorernes forstærkede M1-respons i lamina 9,10,11 . Hver af disse komponenter kan identificeres og måles. Det foretrækkes dog at måle M1-potentialet, da det er en direkte lineær manifestation af M-niveauerne. Hvis M2 anvendes, skal du sørge for, at dens amplitude er i det lineære område ved hjælp af mild carotenoid deprivation24,25. - Giv en kontinuerlig blå (BP450/40 nm) lyspuls igen efterfulgt af en kort (<1 ms) intens lysglimt med en anden bølgelængde.
- Gentag denne protokol, indtil hele absorptionsspektret for M ved fotoligevægt er dækket.
2. ERC-protokol til måling af handlingsspektret for R- og M-tilstande for R1-6-celler ved hjælp af helcellespændingsklemmeoptagelser
BEMÆRK: For en detaljeret protokol til brug af helcellespændingsklemmeoptagelser, se Katz et al.34. M-potentialet bruger kun ERG til at måle aktiveringen af M-tilstanden, fordi bidraget fra R-tilstanden undertrykkes af membrankapacitansen. I modsætning hertil måler ERC aktiveringen af både R (positiv ERC) og M (negativ ERC) tilstande, fordi spændingsklemmeoptagelser fjerner effekten af membrankapacitans (se introduktion).
- Konverter fotopigmentet til den ønskede tilstand (R eller M). For R til M-konvertering skal du først tilpasse fluerne med en kort (<1 ms) adaptiv blå (BP450/40 nm) flash. For M til R konvertering skal du give en kort adaptiv orange (OG590 kantfilter) flash.
- Giv et kort lysglimt (<1 ms) af en bølgelængde mellem 350-700 nm og mål den maksimale negative eller positive amplitude af ERC-responsen, som afspejler M / R-absorptionen ved denne specifikke bølgelængde.
BEMÆRK: Til synkron aktivering af en stor pool af fotopigmentmolekyler kræves en kort, intens lysglimt for at pakke fotonindholdet i en kort varighed. Den maksimale fotopigmentkonvertering fra R til M ved blå flash kan nå ~ 80% af de samlede fotopigmentmolekyler på grund af overlapningen i absorptionsspektret for R og M (figur 3A). Derfor har ERC ved bølgelængder under ~ 550 nm to komponenter: en negativ fase, der afspejler metarhodopsinens respons, og en positiv fase, der afspejler responsen fra det resterende rhodopsin. ERC afhænger lineært af lysintensiteten (figur 5D). For at udlede spektralfølsomheden af R- og M-tilstande skal hver fase af ERC derfor normaliseres ved de forskellige bølgelængder for lige energi29. - Gentag trin 2.1.-2.2. ved hjælp af blink med forskellige bølgelængder.
- Afbild den normaliserede positive og negative ERC som en funktion af bølgelængden.
BEMÆRK: Den stærke lysglimt inducerer en massiv strøm gennem de lysfølsomme kanaler, hvilket fører til metabolisk stress på fotoreceptoren, hvilket igen forårsager lysuafhængig kanalåbning. EFR er overlejret på denne konstituerende strøm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 eksemplificerer robustheden og letheden ved at bruge ERG-teknikken. Det er robust, fordi det registreres i den næsten intakte flue ved hjælp af en simpel teknik med ekstracellulære spændingsoptagelser, der kræver en simpel elektrofysiologisk opsætning. Robustheden manifesteres ved at opnå optagelser af lysresponser med relativt store amplituder (i millivoltområdet), selv når mutationer kraftigt reducerer eller forvrænger lysresponsen. Derfor kan selv en uerfaren eksperimentator bruge den meget enkle eksperimentelle opsætning og lære at opnå meningsfulde resultater på få dage. Hovedformålet med teknikken til måling af fotopigmentniveauer opnås ved ekstremt forenklede metoder for PDA (figur 2C) og ERP (figur 2C-E). Alternativet, nemlig mikrospektrofotometri, kræver dyrt optisk udstyr og betydelig uddannelse og dygtighed (figur 3B). ERC (figur 5A-D) er, selv om den er teknisk udfordrende, mindre følsom over for cellebevarelse; det er kendetegnet ved et højt signal-støj-forhold og eliminering af membrankapacitans.
Figur 1: Den fotokemiske cyklus: aktivering og deaktivering af fotopigmentet. (A) Mættende blå belysning (bølget blå pil) fotokonverterer rhodopsin (R) til metarhodopsin (M). Multipel phosphorylering af M med rhodopsinkinase og efterfølgende binding af arrestin 2 (ARR2) inaktiverer M. Orange lys (bølget rød pil) fotokonverterer ikke-phosphoryleret M tilbage til R. Det ikke-phosphorylerede M aktiverer heterotrimerisk G-protein (Gqαβγ), hvilket forårsager dissociation af Gqα fra Gqβγ og udveksling af bundet BNP med cytoplasmatisk GTP. Gqα-GTP aktiverer derefter phospholipase C (PLC), som hydrolyserer PIP2 til diacylglycerol (DAG) og inositoltrifosfat (IP3) og aktiverer dermed TRP / TRPL-kanalerne på en stadig uklar måde. Ca2+ calmodulinafhængig kinase (CaMKII) phosphorylerer M pp-ARR2-komplekset og gennemgår clathrinafhængig endocytose og nedbrydning. Belysning med orange lys (bølget rød pil) fotokonverterer M pp-ARR2-kompleks til phosphoryleret R (Rpp), hvilket frigiver ARR2 til cytosolen. Phosphoryleret R (Rpp) gennemgår dephosphorylation af rhodopsinphosphatasen (rdgC), hvilket producerer R klar til en anden cyklus af fotopigmentet. (B) Dybdeprofil af ERG af hvidøjet flue til en 1 s hvid stimulus (midtersøjle) eller en hvid stroboskopblink (højre kolonne). Stimuli er angivet med søjler eller prikker under sporene. Spor er arrangeret lodret i rækkefølge efter dybde, med det øverste spor registreret ~ 10 μm under hornhinden, med hver efterfølgende optagelse 25 μm dybere end den sidste. Til venstre er en camera lucida tegning af en tilsvarende sektion gennem et andet øje, der angiver nethinden, kældermembran (BM), laminær skorpe, laminære patroner (sektion skråt) og medullar skorpe. Denne figur er blevet ændret fra Stephenson og Pak11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Elektroretinogram (ERG) optagelser af lysresponser af hvidøjet vildtype (w1118) og mutant Drosophila, der viser forholdet mellem intensitet og respons, langvarig depolarisering efterpotentiel (PDA) og metarhodopsinpotentiale (M-potentiale). (A) Intensitet-responsforholdet mellem en WT-flue (w1118) opnået ved en række orange lys (OG590-kantfilter, den samlede energi, der udsendes fra kanten af lysstyringen ved hjælp af det orange filter, var 4 mW ) med stigende lysintensitet angivet i -logskala. Indsatsen viser det angivne svar på en hurtigere tidsskala. Indsat: Hovedkomponenterne i ERG er fotoreceptorens ekstracellulære spændingsrespons (receptorpotentiale), "on" og "off" transienterne (ON, OFF respons) i begyndelsen og slutningen af lysstimuleringen og den langsomme respons af gliacellerne (pile). (B) Den gennemsnitlige spidsamplitude af ERG-reaktionerne afbildes som en funktion af relativ lysintensitet. (C) ERP for en WT (w1118) flue blev opnået ved anvendelse af mættende blåt (BP450/4 nm, den samlede energi, der udsendes fra kanten af lysstyringen ved hjælp af det blå filter, var 1 mW) lys, der oprindeligt inducerer en PDA. ERP (indsat) blev opnået ved en følgende intens (~ 70 J, 2 ms varighed) grøn flash (pil, bredbånds 550 nm interferensfilter), som undertrykte PDA'en. Indsat: de forskellige komponenter i ERP inkluderer hornhinde negativt M1 potentiale og det positive M2 potentiale, som angivet. En residual på transient ("ON" respons) er også angivet. (D-E) Fotopigmentkonvertering er nødvendig for induktion af M-potentialet: (D) M-potentialet blev opnået ved et grønt (bredbånds 550 nm interferensfilter) blink efter blå tilpasning, men ikke ved et blåt (BP450/4 nm) blink efter blå tilpasning i WT (w1118) flue. (E) Protokollen for D blev gentaget i WT (w1118, sort spor) og to mutantfluer (PLC null mutant, norpAP24, orange spor og hypomorf rhodopsin mutant, ninaEP318, rød spor). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Absorptionsspektre af flue- og rurerfotopigmenter. (A) Relative absorptionsspektre af fluerodopsin (R) og metarhodopsin (M) beregnet ud fra fotometriske målinger af forskelsspektret og foto-ligevægtsspektret. Dette tal er ændret fra Selinger og Minke35. (B) To Dartnall-nomogrammer med maksimale bølgelængder ved henholdsvis 492 nm og 532 nm med et forhold mellem topabsorptionen på 1,63:1. Forskellen mellem disse kurver giver den bedste pasform til forskelsspektret målt fra ocelli af ruren Balanus eborneus, opnået ved transmissionsmålinger i området 400-650 nm efter mætning af monokromatisk blå (442 nm) og orange (596 nm) tilpasning. Dette tal er ændret fra Minke og Kirschfeld36. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: PDA-fænotypen af nina-, ina- og Arr2-mutanterne. (A) Protokollen for induktion og undertrykkelse af PDA'en i Drosophila. PDA-induktionsprotokollen består af en indledende belysning ved hjælp af maksimal intensitet orange lyspuls (590 kantfilter, den samlede energi, der udsendes fra kanten af lysstyringen ved hjælp af det orange filter, var 4 mW, orange bar) efterfulgt af påføring af tre impulser med maksimal intensitet blåt lys (2. og 3. puls er til verifikation af at nå den maksimale PDA, BP450/40 nm filter, den samlede energi, der udsendes fra kanten af lysstyringen ved hjælp af det blå filter, var 1 mW, tre blå bjælker). PDA-undertrykkelse blev opnået ved anvendelse af den orange lyspuls efterfulgt af påføring af et ekstra orange lys (to orange bjælker). PDA-induktions- og undertrykkelsesprotokollen blev gentaget i den hvidøjede mutant af det strukturelle gen af R1-6 fotopigment, ninaEP318 7 (i midten). PDA-induktions- og undertrykkelsesprotokollen blev også gentaget i den hvidøjede nullmutant af den øjenspecifikke proteinkinase C (PKC32) inaCP209 (nederst). (B) En sammenligning mellem den mængde blåt lys, der kræves til induktion af en PDA mellem hvidøjet WT (W1118) og null Arr2 mutant (Arr23). Et tog med skiftevis orange (mættende 590 kantfiltre) og blå (BP450/40 nm) lysimpulser med stigende lysintensiteter (ND i relativ -log skala). Ved blåt lys med -log 1 intensitet induceres en PDA (øverst). Paradigmet for det øverste spor blev gentaget i Arr2 3-mutanten, hvilket viser, at PDA'en blev induceret ved det blå lys af ~ 10 gange svagere lys (-log 2) intensitet (nederst). (C) Et tog med svage (-log 2) blå lysimpulser med konstant intensitet kunne ikke inducere en PDA i W1118 fly (venstre), mens det samme tog af svage blå lys inducerede en PDA ved 1st lyspulsen i Arr23 mutanten (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Patch-clamp helcelleoptagelser af lysresponser af isoleret ommatidia, registreret fra hvidøjet WT (w1118), der viser generering af tidlig receptorstrøm (ERC) og dens intensitet-respons-forhold. (A) Patch-clamp helcelleoptagelser fra isoleret ommatidium af WT flue (w1118) af bifasisk ERC-respons med submikrosekund latenstid. Lysstimuleringen består af en intens (~ 220 J, 0,8 ms varighed) blåt lysglimt (bredbåndsfilter med maksimal absorption ved 425 nm, pil) stimulering påført efter stærk tilpasning til gulgrøn (bredbåndsfilter med maksimal absorption ved 546 nm lys, sort spor). Ved lysbegyndelsen observeres en hurtig-negativ elektrisk artefakt. Den negative fase stammer fra aktiveringen af M, og den positive fase stammer fra aktiveringen af R. Aktiveringen af den lysinducerede strøm (LIC) manifesteres af den forsinkede negative fase som følge af åbningen af de lysfølsomme kanaler. NinaEI17 null mutant viste en mangel på ERC respons på den samme lys flash anvendt på isoleret ommatidium (rødt spor). (B) ERC-måling af Rh1-fotopigmenter registreret fra samme celle som (A). Det sorte spor viser monofasisk negativ respons (M-tilstand) på orange flashstimulering af WT (w1118) fluen efter stærk tilpasning til blåt lys. (C) Prøve af bifasiske ERC-spor målt fra en enkelt fotoreceptorcelle af transgene Drosophila (opn4; ninaEI17), der ektopisk udtrykker mus melanopsinfotopigment (opn4) i R1-6 fluefotoreceptorer som reaktion på stigende intensiteter af hvide blitzlys (i en relativ -log I-skala; ND angiver neutrale densitetsfiltre). Flashbegyndelsen er angivet med pilen. (D) Stigningen i lysintensitet blev manifesteret ved en lineær stigning i ERC-amplituden af opn4;ninaEI17. Et plot af den gennemsnitlige spidsamplitude af den negative fase af ERC-respons (logskala) som funktion af relativ lysintensitet (I / Imax, også i logskala). Den kontinuerlige lige linje repræsenterer en lineær regressionskurve, der passer bedst til de eksperimentelle punkter (R2 = 0,99, fejlbjælker er SEM, n = 5). Dette tal er blevet ændret fra Yasin et al.29. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Værktøj og udstyr, der kræves til flyfiksering og registrering af pipetteforberedelse. (A) Fly sleeper system; (B) Fluesv sovesystempedal; (C) kold lyskilde; (D) stereoskopisk mikroskop; E) varmeapparat til voksfilament f) loddekolbe (G) Voksfilamentvarmerpedal; (H) Grov pincet; (I) magnetisk fluestativ; (J) Voks med lav smeltetemperatur; (K) Sarte klude; (L) lodret pipetteudtræk; (M) Sprøjte med langstrakt spids; (N) Elektrodeholdere; O) Borosilikatglaskapillærer (P) Fast flue. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Oversigt over ERG-opsætningen. (A) Pulsgenerator; (B) Computer; C) A/D-konverter (D) forstærker; (E) stereoskopisk mikroskop; F) mikromanipulator (mekanisk bøde) G) Mikroelektrodeforforstærkersystem med hovedtrin (H) Antivibrationstabel; (I) Tænd / sluk magnetblok; J) Mikromanipulator (mekanisk grov) (K) Faraday bur; (L) Lysstyring fra Xenon lyskilde; (M) lysstyring fra blitzlyssystem; (N) jordelektrodeholder; (O) lysdetektor; (P) Optagelseselektrodeholder; (Q) Magnetisk fluestativ; (R) Xenon lampe strømforsyning; (S) Farve- og ND-filtre står; (T) optisk bænk; (U) Flash Lampe system; (V) Lukker driver; (W) Lygte strømforsyning; (X) Xenon blitzlyssystem Klik her for at se en større version af denne figur.
| Ringers løsning | |
| Reagens | Koncentration (mM) |
| NaCl | 130 |
| KCl | 2 |
| MgCl2 | 5 |
| CaCl2 | 2 |
| HEPES | 10 |
| pH-titrering til 7,15 ved hjælp af NaOH og HCI | |
Tabel 1: Sammensætning af Ringers opløsning.
Supplerende fil 1: Kredsløbsdiagram over vokssmelteregulatoren. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den største fordel ved at bruge Drosophila fotoreceptorpræparatet er dets tilgængelighed, lethed og nøjagtighed af lysstimulering og vigtigst af alt evnen til at anvende kraften i molekylær genetik7. Omfattende genetiske undersøgelser har etableret Drosophila som et yderst nyttigt modelsystem til genetisk dissektion af komplekse biologiske processer7. Den relativt enkle struktur af Drosophila-genomet (bestående af kun fire kromosomer, herunder X- og Y-kønskromosomer, to større autosomale elementer, kromosomer 2 og 3 og det lille prik fjerde kromosom), let vækst og hurtig generationstid (~ 2 uger ved 24 ° C) gør Drosophila egnet til screening af et stort antal mutageniserede individuelle fluer. Desuden bliver isolering og vedligeholdelse af enhver isoleret mutation mulig på grund af dannelsen af balancerkromosomer, der indeholder dominerende markører og flere inversioner, som forhindrer rekombination med de indfødte kromosomer. De tilgængelige molekylære værktøjer har gjort det muligt at studere in vitro-modificerede genprodukter i deres oprindelige cellulære miljø37. Denne kraftfulde metode har produceret en overflod af mutante fluer med defekter i nye proteiner, som ellers ville have været vanskelige at forudsige7.
Den største fordel ved at bruge ERG til målinger af fotopigmentniveauer og lysfølsomhed er dens enkelhed og brugervenlighed og store signal/støj-forhold. Ulempen ved at anvende ERG er dens heterogene cellulære oprindelse, der forvrænger bølgeformen af lysresponsen som følge af fotoreceptorerne9. Den største fordel ved spændingsklemme helcelleoptagelser er evnen til at udlede konduktansændring ved at måle forholdet mellem strøm og spænding (I-V). Åbningen og lukningen af TRP- og TRPL-kanalerne under og efter belysningen afspejles ved denne måling13. Derudover opnås et højt signal-støj-forhold på grund af optagepipetterens lave modstand (~ 10 MΩ) og måling af strømme, hvilket muliggør pålidelige målinger af kvantebump (enkeltfotonresponser), hvilket er nyttigt til kalibrering af den effektive lysintensitet38. En stor ulempe ved patch-clamp helcelleoptagelser er, at mens ERG-optagelser kan opretholdes i timevis selv under ekstreme lysintensiteter, er det vanskeligt at udføre pålidelige patch-clamp helcelleoptagelser i mere end 15-30 minutter, og svag lysstimulering er påkrævet ved langvarige optagelser. For at opnå helcelleoptagelser kræves direkte kontakt mellem optagepipetten og fotoreceptormembranen. Direkte kontakt opnås ved at fjerne pigmentcellerne (gliacellerne), der omgiver ommatidia34 (figur 1B). Fjernelse af pigmentceller forårsager metabolisk stress, fordi fotoreceptorcellen ikke kan syntetisere de metabolitter, der kræves til produktion af adenosintrifosfat (ATP), hvilket forstyrrer metabolisk forsyning39. Da TRP- og TRPL-kanaler er sårbare over for anoxi og let åbner spontant i mørke på grund af ATP-udtømning, pålægger brugen af isoleret ommatidia store vanskeligheder40,12. Hele proceduren skal udføres under svagt rødt lys, fordi lysresponsen inducerer et stort forbrug af ATP34.
De fleste mutationer i fototransduktionskaskaden inducerer et fald i lysfølsomheden. Denne reduktion i lysfølsomheden kan let detekteres af en skærm baseret på måling af forholdet mellem intensitet og respons. Intensitetsresponsparadigmer opnås ved gentagne lysstimuleringer med stigende intensitet på logaritmisk skala. Stigende (og ikke faldende) intensiteter af orange lys er påkrævet for at forhindre tilpasning til lys. ERG (M-potentiale) og PDA er meget enkle metoder til måling af fotopigmentniveauer. Alternativet, nemlig mikrospektrofotometri36, kræver dyrt optisk udstyr og betydelig uddannelse og dygtighed.
Afslutningsvis er ERG et simpelt at anvende, men relativt unøjagtigt værktøj. Helcelleoptagelse31 er nøjagtig til måling af fotopigmentniveauer ved hjælp af ERC, og det er vigtigt for at kompensere for ERG's unøjagtighed og begrænsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (ISF) og United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Vi takker Mr. Anatoly Shapochnikov for opførelsen af voksfilamentvarmeren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
References
- Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
- Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
- Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
- Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
- Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
- Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
- Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
- Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
- Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
- Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
- Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
- Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
- Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
- Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
- Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
- Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
- Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
- Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
- Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
- Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
- Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
- Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
- Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
- Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
- Cone, R. A., Cobbs, W. H.
- Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
- Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
- Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
- Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
- Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
- Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
- Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
- Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
- Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
- Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
- Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
- Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
- Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
- Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).
