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Neuroscience

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Abstract

La Drosophila G-proteina accoppiata fotopigmento rhodopsin (R) è composta da una proteina (opsina) e un cromoforo. Il processo di attivazione della rodopsina è avviato dall'isomerizzazione del cromoforo che induce l'assorbimento dei fotoni, promuovendo cambiamenti conformazionali dell'opsina e determinando un secondo stato di fotopigmento scuro-stabile (metarodopsina, M). Lo studio di questo fotopigmento bistabile utilizzando la mutagenesi casuale richiede metodi semplici e robusti per lo screening delle mosche mutanti. Pertanto, sono stati progettati diversi metodi per misurare le riduzioni dei livelli di fotopigmento funzionale. Uno di questi metodi sfrutta gli spostamenti di carica all'interno del fotopigmento successivi all'assorbimento dei fotoni e le enormi quantità di molecole di fotopigmento espresse nei fotorecettori. Questo segnale elettrico, chiamato potenziale del recettore precoce (o corrente del recettore precoce), è misurato da una varietà di metodi elettrofisiologici (ad esempio, elettroretinogramma e registrazioni di intere cellule) ed è linearmente proporzionale ai livelli di fotopigmento funzionale. I vantaggi di questo metodo sono l'elevato rapporto segnale-rumore, la misurazione lineare diretta dei livelli di fotopigmento e l'indipendenza dei meccanismi di fototrasduzione a valle dell'attivazione della rodopsina o della metarodopsina. Un ulteriore metodo elettrofisiologico chiamato postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) sfrutta la bi-stabilità del fotopigmento di Drosophila e le differenze spettrali di assorbimento degli stati pigmentati R e M della mosca. Il PDA è indotto da un'intensa luce blu, che converte quantità saturanti di rodopsina in metarodopsina, con conseguente fallimento della terminazione della risposta alla luce per un tempo prolungato nell'oscurità, ma può essere terminato dalla metarodopsina alla conversione della rodopsina usando un'intensa luce arancione. Poiché il PDA è un segnale robusto che richiede una massiccia conversione del fotopigmento, anche piccoli difetti nella biogenesi del fotopigmento portano a PDA anormali prontamente rilevati. In effetti, i mutanti PDA difettosi hanno portato all'identificazione di nuove proteine di segnalazione importanti per la fototrasduzione.

Introduction

La rodopsina (R) attivata dalla luce, che è un recettore accoppiato alla proteina G (GPCR), è composta da una proteina transmembrana 7 (opsina) e un cromoforo. In Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), l'assorbimento dei fotoni induce l'isomerizzazione del cromoforo 11-cis-3-OH-retinico a all-trans-3-OH-retinico1, promuovendo il cambiamento conformazionale della rodopsina in metarodossina (M, Figura 1A). A differenza della rodopsina vertebrata, la frazione predominante del cromoforo invertebrato non si dissocia dall'opsina, con conseguente stato pigmentato fisiologicamente attivo E stabile scuro M. A sua volta, l'ulteriore assorbimento di fotoni da parte del cromoforo all-trans-3-OH-retinico induce l'isomerizzazione del cromoforo 2,3, generando lo stato di pigmento R con il cromoforo 11-cis-3-OH-retinale. Lo stato R è un fotopigmento scuro, stabile e fisiologicamente non attivo. Oltre alla via di rigenerazione fotonica estremamente veloce del cromoforo4, proprio come i fotopigmenti dei vertebrati, esiste una via lenta enzimatica alternativa per la rigenerazione dei cromofori negli invertebrati, in cui alcuni degli stadi vengono eseguiti nelle cellule retiniche che circondano le cellule dei fotorecettori 5,6.

La drosophila comporta grandi vantaggi come organismo modello per lo studio dei fotorecettori degli invertebrati. In particolare, l'accessibilità della preparazione e la capacità di applicare la genetica molecolare hanno reso Drosophila un potente sistema modello7. Sono stati quindi stabiliti diversi metodi sperimentali in vivo ed ex vivo per lo studio della fototrasduzione in generale e dei livelli di fotopigmento, in particolare. Il metodo in vivo più semplice sfrutta la risposta di tensione registrata extracellulare relativamente grande alla luce dell'occhio di Drosophila. Di conseguenza, la stimolazione luminosa evoca una risposta di tensione elettrica in tutto l'occhio che può essere misurata utilizzando la registrazione dell'elettroretinogramma extracellulare (ERG), che è ~ 3 ordini di grandezza più grande della risposta ERG alla luce degli occhi dei vertebrati 8,9. La risposta di Drosophila ERG è robusta e facilmente ottenibile, il che lo rende un metodo conveniente per identificare anomalie nella risposta alla luce dovute a mutazioni. La risposta ERG alla luce deriva principalmente dai fotorecettori, dalle cellule pigmentate (glia) e dai neuroni secondari della lamina (vedi Figura 1B). I componenti principali dell'ERG sono (i) la risposta di tensione extracellulare dei fotorecettori, (ii) i transitori "on" e "off" all'inizio e alla fine dello stimolo luminoso che derivano dai neuroni della lamina (Figura 2A, inset, ON, OFF), (iii) la risposta lenta delle cellule gliali (Figura 2A, inserto, frecce) e (iv) la risposta breve e transitoria, derivante dallo spostamento di carica durante l'attivazione del fotopigmento che precede il transitorio ON10 (Figura 2C [inserto], D, E). Questa breve risposta è composta da due fasi (M1 e M2, Figura 2C [inserto]) e può essere indotta solo da una stimolazione luminosa estremamente forte, che attiva contemporaneamente milioni di molecole di fotopigmento. Non è osservato né sotto stimolazione blu (Figura 2D, traccia blu) né in mutanti con livelli di fotopigmento altamente ridotti (Figura 2E, traccia rossa), ma la sua ampiezza è leggermente migliorata in un mutante che abolisce l'attività del PLC (Figura 2E, traccia arancione). La fase M1 è un tipico ERP della mosca derivante dall'attivazione di M nei fotorecettori. La fase M1, che ha una polarità positiva (intracellulare), rilascia un neurotrasmettitore in modo normale in una sinapsi che inverte il segno e attiva i neuroni della lamina, che rispondono alla depolarizzazione del fotorecettore generando la fase M2 amplificata sinapticamente. Pertanto, entrambe le fasi M1 e M2 riflettono l'attivazione M10,11.

La depolarizzazione del fotorecettore genera il transitorio "on" corneale-positivo, derivante dalla sinapsi che inverte il segno tra l'assone fotorecettore e i neuroni monopolari della lamina10,11 (Figura 1B). La lenta ascesa e decadimento dell'ERG deriva dalla depolarizzazione delle cellule pigmentate (Figura 2A, inserto, frecce) principalmente a causa dell'efflusso K+ dalle cellule fotorecettrici12 attraverso il potenziale recettore transitorio (TRP) e i canali TRP-like (TRPL) 13,14,15. Questi componenti cinetici lenti mascherano e distorcono in gran parte la forma d'onda della risposta dei fotorecettori rispetto alle registrazioni intracellulari o intere cellule della risposta del fotorecettore alla luce 9,10. Inoltre, a illuminazioni molto forti, si può osservare un'ulteriore risposta transitoria, che precede e parzialmente si fonde con il transitorio "on" (Figura 2C [inserto],D,E). Questo segnale ha origine direttamente dalla massiccia attivazione del fotopigmento10.

Diversi protocolli di regime luminoso che utilizzano filtri a densità neutra (ND) e a colori, oltre a forti lampi illuminanti, sono stati sviluppati per studiare l'occhio in generale e la cascata di fototrasduzione in particolare. Questi protocolli sono stati utilizzati anche per studiare le proprietà del fotopigmento.

Il protocollo intensità-risposta misura l'ampiezza di picco della risposta di tensione ERG dell'intero occhio all'aumento delle intensità luminose (Figura 2A,B). Questo protocollo aiuta a rilevare i cambiamenti nella sensibilità delle cellule dei fotorecettori alla luce9.

Il protocollo di postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) sfrutta le differenze negli spettri di assorbimento di rodopsina e metarodopsina che consente, in Drosophila, una massiccia conversione fotopigmentale di R al suo stato M intermedio fisiologicamente attivo e dark-stabile2. Nella risposta di tensione ERG, viene dato un impulso relativamente breve di luce di saturazione e viene registrata la risposta di tensione risultante. In questa condizione, un tetto (potenziale di inversione) viene raggiunto dal segnale di depolarizzazione perché l'attivazione di una frazione di percentuale dell'enorme quantità di molecole di rodopsina (~ 1 x 108) è sufficiente per raggiungere il soffitto. La presenza dei componenti di fototrasduzione in grande abbondanza assicura che questo soffitto sarà raggiunto anche nei mutanti con una significativa riduzione della concentrazione o un sottile malfunzionamento dei componenti di fototrasduzione. Questa situazione preclude l'isolamento di questi mutanti. Pak et al. hanno introdotto lo screening PDA7 cercando un test affidabile e rivelatore per isolare i mutanti visivi. In Drosophila, la risposta PDA è causata dalla rimozione genetica del pigmento di screening rosso, che consente la conversione del fotopigmento, e l'applicazione della luce blu, che viene assorbita preferenzialmente dalla rodopsina (Figura 3A) e, quindi, si traduce in una grande conversione netta dello stato di fotopigmento R in M. La terminazione della fototrasduzione viene interrotta a livello del fotopigmento da una grande conversione netta di R in M, che, a sua volta, si traduce in un'eccitazione prolungata molto tempo dopo che la luce è spenta (Figura 2C, Figura 4A [in alto]). Durante il periodo PDA, i fotorecettori sono meno sensibili alle luci di prova successive e sono parzialmente desensibilizzati (inattivati). Il PDA rileva anche piccoli difetti nella biogenesi della rodopsina e verifica la capacità massima della cellula fotorecettore di mantenere l'eccitazione per un periodo prolungato. Poiché dipende strettamente dalla presenza di alte concentrazioni di rodopsina, segna facilmente per il rifornimento carente dei componenti di fototrasduzione. Sorprendentemente, lo schermo PDA ha prodotto molti nuovi e molto importanti mutanti visivi (recensiti in Pak et al.7). Pertanto, i mutanti PDA isolati da Pak et al.7 sono ancora estremamente utili per analizzare il sistema visivo Drosophila .

Il PDA è indotto in Drosophila saturando la luce blu, con conseguente depolarizzazione continua a lungo dopo l'offset della luce (Figura 4A [in alto]). Dopo aver saturato la luce blu che induce PDA, i fotorecettori periferici (R1-6) rimangono continuamente attivi al buio alla loro massima capacità, raggiungendo la saturazione. Ulteriori luci blu saturanti durante il PDA non producono alcuna risposta aggiuntiva nelle cellule R1-6 per molti secondi, ma inducono una risposta nelle cellule R7-8 che si sovrappone al PDA. Le risposte sovrapposte sono spiegate dai diversi spettri di assorbimento dei fotopigmenti espressi in queste cellule (R7-8)16. Il PDA può essere soppresso dalla fotoconversione di M in R con luce arancione saturante (Figura 4A [in alto]). La capacità del PDA di portare le cellule dei fotorecettori alla loro massima capacità attiva, una situazione che non può essere raggiunta con un'intensa luce bianca, spiega perché è stato uno strumento importante per lo screening dei mutanti visivi di Drosophila. Questo perché permette l'individuazione di difetti anche minori nelle proteine coinvolte nella biogenesi dei normali livelli di fotopigmento 17,18. Sono stati isolati due gruppi di mutanti difettosi PDA: mutanti né inattivazione né postpotenziale (nina) e inattivazione ma non mutanti postpotenziali (ina). Il fenotipo del primo è la mancanza di un PDA e l'inattivazione associata derivante da una grande riduzione dei livelli di fotopigmento (Figura 4A [centro]). Il fenotipo di quest'ultimo mostra inattivazione ma nessuna depolarizzazione scura dopo la luce blu a causa di un meccanismo ancora sconosciuto nel mutante con livelli normali di rodopsina ma privo di proteine che interagiscono con i canali TRP (Figura 4A [in basso]).

Il PDA nasce dalla differenza nella quantità di fotopigmento rispetto all'arrestina (ARR2), che lega e termina l'attività M 19,20,21 (Figura 1A). Nei fotorecettori di Drosophila, la quantità del fotopigmento è circa cinque volte maggiore della quantità di ARR219. Pertanto, i livelli di ARR2 sono insufficienti per inattivare tutte le molecole M generate da una grande fotoconversione netta di R a M, lasciando un eccesso di M costantemente attivo al buio 17,19,20,22,23. Questo meccanismo spiega l'eliminazione della risposta PDA da mutazioni o da deprivazione carotenoide24,25, causando una riduzione del livello di fotopigmento, ma non influisce sui livelli di arrestina. Inoltre, questa spiegazione spiega anche i fenotipi dell'allele mutante null ARR2 (arr23)21, in cui il PDA potrebbe essere raggiunto a intensità di luce blu ~ 10 volte più deboli19,20,21 (Figura 4B,C). Il PDA non è una caratteristica unica dei fotorecettori di mosca, e appare in ogni specie testata che ha M scuro stabile con uno spettro di assorbimento diverso da quello dello stato R, consentendo una sufficiente fotoconversione del fotopigmento dallo stato R allo stato M. Una specie accuratamente studiata in cui è stata scoperta la fenomenologia pda è il fotorecettore del cirripedicolo (Balanus), in cui lo spettro di assorbimento dello stato R è in una lunghezza d'onda più lunga dello stato M2 (Figura 3B). Di conseguenza, a differenza della situazione al volo, nel cirripedi, la luce rosso-arancio induce un PDA, mentre la luce blu sopprime il PDA2.

Il protocollo ERP (Early Receptor Potential) sfrutta lo spostamento di carica che si verifica durante l'attivazione di R o M. Il pigmento visivo è parte integrante della membrana superficiale del compartimento di segnalazione delle membrane sia dei vertebrati che degli invertebrati3. Di conseguenza, il processo di attivazione in cui le molecole di fotopigmento cambiano da uno stato intermedio a quello successivo è accompagnato da uno spostamento di carica 4,26. Poiché le molecole di fotopigmento sono allineate elettricamente in parallelo con la capacità di membrana4, un rapido cambiamento conformazionale sincronizzato genera un rapido cambiamento di polarizzazione della membrana superficiale, che, nelle mosche, si verifica nel compartimento di segnalazione composto da una pila di ~ 30.000-50.000 microvilli chiamati rabdomere. Questa polarizzazione si scarica quindi passivamente attraverso la capacità della membrana del corpo cellulare fino a quando la membrana cellulare è ugualmente polarizzata. L'ERP è la registrazione extracellulare dello spostamento di carica. L'ERP registrato intracellulare manifesta l'ERP extracellulare integrato dalla costante temporale della membrana cellulare 4,27,28. La corrente attivata dallo spostamento visivo della carica del pigmento potrebbe anche essere misurata nelle registrazioni a morsetto di tensione dell'intera cella29,30 (Figura 5A-D), con il vantaggio principale (nelle registrazioni della corrente del recettore precoce (ERC)) di ridurre al minimo l'effetto della capacità della membrana sulla cinetica del segnale.

La sezione del protocollo descrive come eseguire misurazioni ERG da Drosophila eye9 e misurazioni ERC mediante registrazioni di cellule intere da ommatidi isolati da Drosophila 31,32. Descriviamo anche protocolli specifici che vengono utilizzati per studiare la fototrasduzione in generale e i fotopigmenti in particolare.

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Protocol

1. Misurare la relazione di intensità di risposta, il postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) e il potenziale recettore precoce (ERP) utilizzando l'elettroretinogramma

  1. Condizioni di allevamento adeguate per la preparazione di D. melanogaster
    1. Raise D. melanogaster vola in bottiglie contenenti mais giallo standard contenente alimenti in un'incubatrice mantenuta ad una temperatura di 24 °C e in un ciclo buio/luce di 12 ore
    2. Tenere le bottiglie di mosca al buio almeno 24 ore prima dell'esperimento.
  2. Configurazione generale
    1. Preparare le pipette di registrazione tirando capillari di vetro borosilicato riempiti di fibra da 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) (Figura 6L, O). La resistenza delle pipette dovrebbe essere 5-10 MΩ; è possibile utilizzare qualsiasi estrattore adatto.
    2. Rivestire due fili d'argento con AgCl2, inserendo filo d'argento da 0,25 mm nella soluzione 3 M KCl collegata a un alimentatore a 5 V su misura.
    3. Inserire ogni filo d'argento rivestito nei supporti degli elettrodi (Figura 6N).
    4. Riempire il capillare di vetro con la soluzione filtrata di Ringer (vedere Tabella 1) utilizzando una siringa a punta allungata (Figura 6M).
    5. Inserire l'elettrodo a filo nel capillare di vetro. Assicurarsi che la soluzione all'interno del capillare sia a contatto con il filo d'argento.
    6. Inserire i portaelettrodi (Figura 7P, N) nei due micromanipolatori dell'elettrodo (Figura 7G).
  3. Procedura di preparazione della mosca per le registrazioni elettriche
    NOTA: per mantenere la mosca in condizioni di oscurità adattate, utilizzare solo l'illuminazione a luce rossa fioca durante i passaggi seguenti.
    1. Anestetizzare le mosche nella bottiglia con gas CO2 utilizzando il sistema fly sleeper (Figura 6A, B) e versarle nel contenitore del dormiente.
    2. Scegli una mosca e tienila con cura per la sua ala usando una pinzetta affilata. Coprire il resto delle mosche con una capsula di Petri.
    3. Posiziona la mosca sul supporto della mosca nell'orientamento corretto, sdraiato su un fianco, con la schiena verso la mano (Figura 6P).
    4. Accendere l'alimentatore del saldatore. Impostare la corrente su ~2,25 A. Questa corrente dovrebbe riscaldare il filamento di platino-iridio da 0,25 mm a ~55-56 °C (vedere File supplementare).
    5. Posizionare una goccia di cera con una bassa temperatura di fusione (~55-56 °C) sul saldatore (Figura 6F).
    6. Usando una pinzetta, sollevare la mosca dalle ali e fissare le ali al portamonete (Figura 6I) usando il saldatore.
    7. Utilizzando il saldatore, collegare la schiena della mosca alla superficie del supporto con cera (Figura 6P).
    8. Abbassare la punta del saldatore sul punto di unione delle gambe e sciogliere la cera per coprire tutte le gambe insieme (Figura 6P).
    9. Posizionare una piccola goccia di cera tra la testa e la schiena nella zona del collo (Figura 6P).
      NOTA: Prestare particolare attenzione per evitare il surriscaldamento della testa di mosca. Assicurarsi che la mosca sia correttamente fissata e non sia in grado di muoversi durante l'esperimento; movimenti minori possono creare artefatti nelle registrazioni. Assicurarsi che le aperture della trachea (prese di respirazione) nel torace e nell'addome non siano coperte di cera.
    10. Posizionare il supporto della mosca (Figura 7Q) in una gabbia di Faraday scura su un blocco magnetico (Figura 7I) e assicurarsi che la mosca si trovi a ~ 5 mm dall'estremità della guida luminosa (Figura 7L).
    11. Posizionare l'elettrodo di registrazione (Figura 7P) sopra l'occhio della mosca e l'elettrodo di terra (Figura 7N) sopra la parte superiore della schiena della mosca usando i micromanipolatori.
    12. Inserire l'elettrodo di terra nella parte posteriore della mosca utilizzando i micromanipolatori.
    13. Inserire l'elettrodo di registrazione nella periferia esterna dell'occhio della mosca, preferibilmente, utilizzando i micromanipolatori.
      NOTA: Dopo aver inserito l'elettrodo nell'occhio, si osserverà una piccola fossetta; tirare l'elettrodo verso l'alto senza rimuoverlo dall'occhio fino a quando la fossetta scompare. Gli elettrodi possono anche essere immersi in piccole goccioline di gelatina di elettrodi applicate al busto e all'occhio.
  4. Protocollo intensità-risposta
    1. Posizionare un filtro arancione (filtro bordo 590) davanti alla lampada allo xeno ad alta pressione. Utilizzare un filtro a densità neutra (ND) attenuante di grandi dimensioni (sei ordini di grandezza).
    2. Attendere 60 s al buio e dare un impulso luminoso di 5 s.
    3. Sostituire il filtro ND con un filtro ND meno attenuante con incrementi di un ordine di grandezza.
    4. Attendere 60 s al buio e dare un secondo impulso luminoso di 5 s.
    5. Ripetere i passaggi 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente l'intensità della luce utilizzando filtri ND meno attenuanti (l'ultimo impulso deve essere generato senza alcun filtro ND). Assicurarsi di utilizzare la serie di filtri ND nella giusta direzione, partendo da una grande attenuazione e raggiungendo una bassa attenuazione.
  5. Protocollo PDA (questo protocollo può essere eseguito solo su mosche dagli occhi bianchi)
    1. Dare un impulso luminoso di 5 s di massima intensità usando un filtro arancione (filtro a bordo 590, per convertire il fotopigmento massimo nello stato R).
    2. Sostituire il filtro arancione con un filtro blu a banda larga (BP450/40 nm) e dare tre impulsi luminosi da 5 s alla massima intensità.
      NOTA: è anche possibile dare un lungo impulso di luce blu continua di massima intensità fino a raggiungere una risposta di tensione allo stato stazionario.
    3. Attendere 60 s al buio, sostituire il filtro blu con il precedente filtro arancione e dare due impulsi luminosi da 5 s con intervalli di 60 s.
  6. Protocollo ERP/M-potenziale per la misurazione dello spettro di fotobilancio di M (questo protocollo può essere eseguito solo su mosche dagli occhi bianchi10,25)
    1. Dare un impulso luminoso blu continuo (passabanda (BP) 450/40 nm) fino a raggiungere una risposta di tensione allo stato stazionario, che converte la quantità massima di fotopigmento dallo stato R allo stato M delle celle R1-6.
    2. Dare un breve (<3 ms) lampo di luce intensa di una lunghezza d'onda compresa tra 350-700 nm (lo spettro di assorbimento noto del fotopigmento delle cellule R1-6) utilizzando filtri passa-banda stretti (~ 20 nm) e misurare l'ampiezza di picco della fase M della risposta potenziale M (che riflette l'assorbimento della metarodopsina a questa specifica lunghezza d'onda al fotobilancio10,25).
      NOTA: Per l'attivazione sincrona di un ampio pool di molecole di fotopigmento, è necessario un breve e intenso lampo di luce in modo che il contenuto di fotoni sia imballato in breve tempo. Il potenziale M è composto da due componenti: M1 (fase negativa corneale), che riflette lo spostamento di carica della metarodopsina nel fotorecettore, e M2 (fasecorneale positiva 11,33), che riflette la risposta M1 amplificata dei fotorecettori nella lamina 9,10,11 . Ognuno di questi componenti può essere identificato e misurato. Tuttavia, è preferibile misurare il potenziale M1 poiché è una manifestazione lineare diretta dei livelli M. Se si utilizza M2, assicurarsi che la sua ampiezza sia nell'intervallo lineare utilizzando una lieve deprivazione carotenoide24,25.
    3. Dare di nuovo un impulso luminoso blu continuo (BP450/40 nm), seguito da un breve (<1 ms) lampo di luce intensa di una lunghezza d'onda diversa.
    4. Ripetere questo protocollo fino a coprire l'intero spettro di assorbimento di M al fotoequilibrio.

2. Protocollo ERC per la misurazione dello spettro d'azione degli stati R e M delle celle R1-6 utilizzando registrazioni a morsetto di tensione a cella intera

NOTA: per un protocollo dettagliato per l'utilizzo di registrazioni a morsetto di tensione a cella intera, vedere Katz et al.34. Il potenziale M utilizza l'ERG per misurare l'attivazione dello stato M solo perché il contributo dello stato R è soppresso dalla capacità della membrana. Al contrario, l'ERC misura l'attivazione degli stati R (ERC positivo) e M (ERC negativo) perché le registrazioni a morsetto di tensione rimuovono l'effetto della capacità della membrana (vedi introduzione).

  1. Convertire il fotopigmento nello stato desiderato (R o M). Per la conversione da R a M, in primo luogo, adattare le mosche con un breve flash blu adattivo (<1 ms) (BP450/40 nm). Per la conversione da M a R, dare un breve flash arancione adattivo (filtro bordo OG590).
  2. Dare un breve lampo di luce (<1 ms) di una lunghezza d'onda compresa tra 350-700 nm e misurare l'ampiezza massima negativa o positiva della risposta ERC, che riflette l'assorbimento M / R a questa specifica lunghezza d'onda.
    NOTA: Per l'attivazione sincrona di un ampio pool di molecole di fotopigmento, è necessario un breve e intenso lampo di luce per impacchettare il contenuto di fotoni in una breve durata. La conversione massima del fotopigmento da R a M tramite flash blu può raggiungere circa l'80% delle molecole di fotopigmento totali a causa della sovrapposizione nello spettro di assorbimento di R e M (Figura 3A). Pertanto, a lunghezze d'onda inferiori a ~ 550 nm, l'ERC ha due componenti: una fase negativa che riflette la risposta della metarodopsina e una fase positiva che riflette la risposta della rodopsina rimanente. Il CER dipende linearmente dall'intensità della luce (Figura 5D). Di conseguenza, per derivare la sensibilità spettrale degli stati R e M, ogni fase dell'ERC deve essere normalizzata alle varie lunghezze d'onda per uguale energia29.
  3. Ripetere i passaggi 2.1.-2.2. utilizzando lampi di diverse lunghezze d'onda.
  4. Traccia l'ERC positivo e negativo normalizzato in funzione della lunghezza d'onda.
    NOTA: Il forte lampo di luce induce una corrente massiccia attraverso i canali sensibili alla luce che porta a stress metabolico sul fotorecettore, che, a sua volta, provoca l'apertura del canale indipendente dalla luce. Il CER si sovrappone a questa corrente costitutiva.

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Representative Results

La Figura 2 esemplifica la robustezza e la facilità di utilizzo della tecnica ERG. È robusto perché viene registrato nella mosca praticamente intatta con una semplice tecnica di registrazioni di tensione extracellulare che richiedono una semplice configurazione elettrofisiologica. La robustezza si manifesta ottenendo registrazioni di risposte luminose con ampiezze relativamente grandi (nell'intervallo millivolt) anche quando le mutazioni riducono o distorcono fortemente la risposta alla luce. Pertanto, anche uno sperimentatore inesperto può utilizzare la configurazione sperimentale altamente semplice e imparare come ottenere risultati significativi in pochi giorni. L'obiettivo principale della tecnica progettata per misurare i livelli di fotopigmento è raggiunto con metodi estremamente semplificati del PDA (Figura 2C) e dell'ERP (Figura 2C-E). L'alternativa, vale a dire la microspettrofotometria, richiede costose attrezzature ottiche e una notevole formazione e abilità (Figura 3B). L'ERC (Figura 5A-D), sebbene tecnicamente impegnativo, è meno sensibile alla conservazione cellulare; è caratterizzato da un elevato rapporto segnale-rumore e dall'eliminazione della capacità della membrana.

Figure 1
Figura 1: Il ciclo fotochimico: l'attivazione e la disattivazione del fotopigmento. (A) Saturazione dell'illuminazione blu (freccia blu ondulata) fotoconverte rodopsina (R) in metarodopsina (M). La fosforilazione multipla di M da parte della rodopsina chinasi e il successivo legame dell'arrestina 2 (ARR2) inattiva M. La luce arancione (freccia rossa ondulata) fotoconverte M non fosforilata in R. La M non fosforilata attiva la proteina G eterotrimerica (Gqαβγ), causando la dissociazione di Gqα da Gqβγ e lo scambio di GDP legato con GTP citoplasmatico. Gqα-GTP attiva quindi la fosfolipasi C (PLC), che idrolizza PIP2 in diacilglicerolo (DAG) e inositolo trisfosfato (IP3), attivando così i canali TRP/TRPL in modo ancora poco chiaro. La chinasi calmodulina-dipendente Ca2+ (CaMKII) fosforila il complesso Mpp-ARR2 e subisce endocitosi e degradazione clatrin-dipendenti. Illuminazione con luce arancione (freccia rossa ondulata) fotoconverte il complesso Mpp-ARR2 in R fosforilato (Rpp), rilasciando ARR2 al citosol. R fosforilato (Rpp) subisce la defosforilazione da parte della rodopsina fosfatasi (rdgC), producendo R pronto per un altro ciclo del fotopigmento. (B) Profilo di profondità dell'ERG della mosca dagli occhi bianchi a uno stimolo bianco di 1 s (colonna centrale) o a un flash stroboscopico bianco (colonna di destra). Gli stimoli sono indicati da barre o punti sotto le tracce. Le tracce sono disposte verticalmente in ordine di profondità, con la traccia superiore registrata ~ 10 μm sotto la cornea, con ogni registrazione successiva 25 μm più profonda dell'ultima. Sulla sinistra c'è una telecamera lucida che disegna una sezione corrispondente attraverso un altro occhio, che indica retina, membrana basale (BM), crosta laminare, cartucce laminari (sezionate obliquamente) e scorza midollare. Questa cifra è stata modificata da Stephenson e Pak11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Registrazioni elettroretinografiche (ERG) delle risposte luminose del tipo selvatico dagli occhi bianchi (w1118) e della Drosophila mutante che mostrano la relazione intensità-risposta, il postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) e il potenziale metarodossina (potenziale M). (A) Rapporto intensità-risposta di una mosca WT (w1118) ottenuta da una serie di luci arancioni (filtro bordo OG590, l'energia totale emessa dal bordo della guida luminosa utilizzando il filtro arancione era di 4 mW) con intensità luminosa crescente indicata in scala -log. L'inserto mostra la risposta indicata su una scala temporale più veloce. Inserto: I componenti principali dell'ERG sono la risposta di tensione extracellulare del fotorecettore (potenziale recettore), i transitori "on" e "off" (risposta ON, OFF) all'inizio e alla fine dello stimolo luminoso e la risposta lenta delle cellule gliali (frecce). (B) L'ampiezza media di picco delle risposte ERG è tracciata in funzione dell'intensità luminosa relativa. (C) L'ERP di una mosca WT (w1118) è stato ottenuto mediante l'applicazione della luce blu saturante (BP450/4 nm, l'energia totale emessa dal bordo della guida luminosa utilizzando il filtro blu era di 1 mW) che inizialmente induce un PDA. L'ERP (inserto) è stato ottenuto da un successivo intenso flash verde (~ 70 J, durata 2 ms) (freccia, filtro di interferenza a banda larga 550 nm), che ha soppresso il PDA. Inset: le varie componenti dell'ERP includono il potenziale M1 negativo corneale e il potenziale M2 positivo, come indicato. È inoltre indicato un residuo su transitorio (risposta "ON"). (D-E) La conversione del fotopigmento è necessaria per l'induzione del potenziale M: il potenziale (D) M è stato ottenuto da un flash verde (filtro di interferenza a banda larga da 550 nm) a seguito di adattamento blu ma non da un flash blu (BP450/4 nm) dopo l'adattamento blu in WT (w1118) volare. (E) Il protocollo di D è stato ripetuto in WT (w1118, traccia nera) e due mosche mutanti (PLC null mutant, norpAP24, traccia arancione e mutante ipomorfico rodopsina, ninaEP318, traccia rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Spettri di assorbimento dei fotopigmenti di mosca e cirripedi. (A) Spettri di assorbimento relativo della rodopsina (R) e della metarodopsina (M) della mosca calcolati da misurazioni fotometriche dello spettro di differenza e dello spettro di fotoequilibrio. Questa cifra è stata modificata da Selinger e Minke35. (B) Due nomogrammi di Dartnall con lunghezze d'onda di picco a 492 nm e 532 nm, con un rapporto di assorbimento di picco di 1,63:1, rispettivamente. La differenza tra queste curve dà la migliore misura allo spettro di differenza misurato dagli ocelli del cirripede Balanus eborneus, ottenuto da misurazioni di trasmissione nell'intervallo di 400-650 nm dopo saturazione dell'adattamento monocromatico blu (442 nm) e arancione (596 nm). Questa cifra è stata modificata da Minke e Kirschfeld36. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il fenotipo PDA dei mutanti nina, ina e Arr2 . (A) Il protocollo di induzione e soppressione del PDA in Drosophila. Il protocollo di induzione PDA è composto da un'illuminazione iniziale che utilizza l'impulso luminoso arancione di massima intensità (filtro a bordo 590, l'energia totale emessa dal bordo della guida luminosa utilizzando il filtro arancione era di 4 mW, barra arancione) seguita dall'applicazione di tre impulsi di luce blu di massima intensità (gli impulsi 2° e 3° sono per la verifica del raggiungimento del PDA massimo, Filtro BP450/40 nm, l'energia totale emessa dal bordo della guida luminosa utilizzando il filtro blu era di 1 mW, tre barre blu). La soppressione del PDA è stata ottenuta mediante l'applicazione dell'impulso luminoso arancione seguito dall'applicazione di una luce arancione aggiuntiva (due barre arancioni). Il protocollo di induzione e soppressione del PDA è stato ripetuto nel mutante dagli occhi bianchi del gene strutturale del fotopigmento R1-6, ninaEP318 7 (al centro). Il protocollo di induzione e soppressione del PDA è stato ripetuto anche nel mutante nullo dagli occhi bianchi della proteina chinasi C specifica per l'occhio (PKC32) inaCP209 (in basso). (B) Un confronto tra la quantità di luce blu richiesta per l'induzione di un PDA tra WT dagli occhi bianchi (W1118) e mutante Arr2 nullo (Arr23). Un treno di impulsi luminosi alternati arancioni (saturazione di 590 filtri edge) e blu (BP450/40 nm) di intensità luminosa crescente (ND in scala relativa -log). Alla luce blu di intensità -log 1, viene indotto un PDA (in alto). Il paradigma della traccia superiore è stato ripetuto nel mutante Arr23 mostrando che il PDA è stato indotto alla luce blu di ~ 10 volte l'intensità della luce più debole (-log 2) (in basso). (C) Un treno di deboli (-log 2) impulsi di luce blu di intensità costante non è riuscito a indurre un PDA in W1118 volare (a sinistra), mentre lo stesso treno di luci blu fioche ha indotto un PDA dal 1° impulso luminoso nel mutante Arr23 (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Registrazioni a cellule intere patch-clamp delle risposte alla luce di ommatidi isolati, registrate da WT dagli occhi bianchi (w1118), che mostrano la generazione di corrente recettoriale precoce (ERC) e la sua relazione intensità-risposta. (A) Registrazioni a vite intera patch-clamp da ommatidium isolato di WT fly (w1118) di risposta ERC bifasica con latenza inferiore al microsecondo. Lo stimolo luminoso è composto da un'intensa (~220 J, durata 0,8 ms) luce blu lampeggiante (filtro a banda larga con picco di assorbimento a 425 nm, freccia) stimolazione applicata dopo un forte adattamento al giallo-verde (filtro a banda larga con picco di assorbimento a 546 nm luce, traccia nera). All'inizio della luce, si osserva un artefatto elettrico fast-negative. La fase negativa deriva dall'attivazione di M e la fase positiva deriva dall'attivazione di R. L'attivazione della corrente indotta dalla luce (LIC) si manifesta con la fase negativa ritardata derivante dall'apertura dei canali sensibili alla luce. Il mutante nullo ninaEI17 ha mostrato una mancanza di risposta ERC allo stesso lampo di luce applicato all'ommatidium isolato (traccia rossa). (B) Misurazione ERC dei fotopigmenti Rh1 registrati dalla stessa cella di (A). La traccia nera mostra una risposta negativa monofasica (stato M) alla stimolazione flash arancione della mosca WT (w1118) dopo un forte adattamento alla luce blu. (C) Campione di tracce bifasiche di ERC misurate da una singola cellula fotorecettrice di Drosophila transgenica (opn4;ninaEI17) che esprime ectopicamente topi melanopsin photopigment (opn4) in fotorecettori a mosca R1-6 in risposta all'aumento delle intensità delle luci flash bianche (in una scala relativa -log I; ND indica filtri a densità neutra). L'inizio del flash è indicato dalla freccia. (D) L'aumento dell'intensità luminosa si è manifestato con un aumento lineare dell'ampiezza ERC di opn4;ninaEI17. Grafico dell'ampiezza media di picco della fase negativa delle risposte ERC (scala logaritmica) in funzione dell'intensità luminosa relativa (I/Imax, anche in scala logaritmica). La linea retta continua rappresenta una curva di regressione lineare che meglio si adatta ai punti sperimentali (R2 = 0,99, le barre di errore sono SEM, n = 5). Questa cifra è stata modificata da Yasin et al.29. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Strumenti e dispositivi necessari per la fissazione delle mosche e la registrazione della preparazione delle pipette. (A) Sistema di traversine Fly; (B) Pedale del sistema di sleeper Fly; C) sorgente luminosa fredda; D) microscopio stereoscopico; E) riscaldatore a filamento di cera; F) saldatore; G) Pedale riscaldante a filamento di cera; H) Pinzette ruvide; (I) Supporto magnetico per mosche; J) cera a bassa temperatura di fusione; (K) Salviette delicate; L) estrattore verticale per pipette; M) Siringa con punta allungata; N) portaelettrodi; O) capillari di vetro borosilicato; (P) Volo fisso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Panoramica della configurazione ERG. (A) Generatore di impulsi; (B) Computer; (C) convertitore A/D; (D) Amplificatore; e) microscopio stereoscopico; F) Micromanipolatore (fine meccanico); G) sistema di preamplificatori microelettrodi con stadio di testa; H) Tavola antivibrante; (I) Blocco magnetico On / Off; (J) Micromanipolatore (meccanico grossolano); K) gabbia di Faraday; (L) Guida luminosa dalla sorgente luminosa allo xeno; (M) Guida luminosa dal sistema di luce flash; (N) Portaelettrodi di massa; (O) Rilevatore di luce; (P) Portaelettrodo di registrazione; (Q) Supporto magnetico per mosche; (R) Alimentazione della lampada allo xeno; (S) Supporto per filtri a colori e ND; T) Banco ottico; (U) Sistema Flash Lamp; (V) Driver dell'otturatore; (W) Alimentazione della lampada; (X) Sistema di luce flash allo xeno Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La soluzione di Ringer
Reagente Concentrazione (mM)
NaCl 130
Kcl 2
MgCl2 5
CaCl2 · 2
HEPES · 10
Titolazione del pH a 7,15 utilizzando NaOH e HCl

Tabella 1: Composizione della soluzione di Ringer.

File supplementare 1: Schema elettrico del regolatore di fusione della cera. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il principale vantaggio dell'utilizzo della preparazione del fotorecettore Drosophila è la sua accessibilità, la facilità e l'accuratezza della stimolazione luminosa e, soprattutto, la capacità di applicare il potere della genetica molecolare7. Ampi studi genetici hanno stabilito Drosophila come un sistema modello estremamente utile per la dissezione genetica di processi biologici complessi7. La struttura relativamente semplice del genoma di Drosophila (costituito da soli quattro cromosomi, compresi i cromosomi sessuali X e Y, due elementi autosomici più grandi, i cromosomi 2 e 3 e il piccolo punto quarto cromosoma), la facilità di crescita e il rapido tempo di generazione (~ 2 settimane a 24 ° C) rendono Drosophila adatto per lo screening di un gran numero di singole mosche mutagenizzate. Inoltre, l'isolamento e il mantenimento di qualsiasi mutazione isolata diventano possibili grazie alla generazione di cromosomi equilibratori, contenenti marcatori dominanti e inversioni multiple, che impediscono la ricombinazione con i cromosomi nativi. Gli strumenti molecolari disponibili hanno permesso di studiare in vitro prodotti genici modificati nel loro ambiente cellulare nativo37. Questa potente metodologia ha prodotto una pletora di mosche mutanti con difetti in nuove proteine che altrimenti sarebbero state difficili da prevedere7.

Il principale vantaggio dell'utilizzo dell'ERG per le misurazioni dei livelli di fotopigmento e della sensibilità alla luce è la sua semplicità e facilità di applicazione e l'ampio rapporto segnale-rumore. Lo svantaggio dell'utilizzo dell'ERG è la sua origine cellulare eterogenica, distorcendo la forma d'onda della risposta luminosa derivante dai fotorecettori9. Il principale vantaggio delle registrazioni a cella intera a morsetto di tensione è la capacità di derivare la variazione della conduttanza misurando la relazione corrente-tensione (I-V). L'apertura e la chiusura dei canali TRP e TRPL durante e dopo l'illuminazione sono riflesse da questa misurazione13. Inoltre, si ottiene un elevato rapporto segnale-rumore grazie alla bassa resistenza della pipetta di registrazione (~10 MΩ) e alla misurazione delle correnti, consentendo misurazioni affidabili dei dossi quantistici (risposte a singolo fotone), utile per calibrare l'effettiva intensità luminosa38. Uno dei principali svantaggi delle registrazioni a cella intera patch-clamp è che, mentre le registrazioni ERG possono essere mantenute per ore anche sotto intensità di luce estreme, è difficile eseguire registrazioni affidabili patch-clamp intere per più di 15-30 minuti e la stimolazione della luce fioca è necessaria per registrazioni prolungate. Per ottenere registrazioni a cellule intere, è necessario il contatto diretto tra la pipetta di registrazione e la membrana del fotorecettore. Il contatto diretto si ottiene rimuovendo le cellule pigmentarie (gliali) che circondano l'ommatidi34 (Figura 1B). La rimozione delle cellule del pigmento provoca stress metabolico perché la cellula fotorecettore non può sintetizzare i metaboliti necessari per la produzione di adenosina trifosfato (ATP), interrompendo l'apporto metabolico39. Poiché i canali TRP e TRPL sono vulnerabili all'anossia e si aprono facilmente spontaneamente al buio a causa della deplezione di ATP, l'uso di ommatidi isolati impone una grande difficoltà40,12. L'intera procedura deve essere eseguita sotto una luce rossa fioca perché la risposta alla luce induce un grande consumo di ATP34.

La maggior parte delle mutazioni nella cascata di fototrasduzione inducono una diminuzione della sensibilità alla luce. Questa riduzione della sensibilità alla luce può essere facilmente rilevata da uno schermo basato sulla misurazione della relazione intensità-risposta. I paradigmi intensità-risposta sono ottenuti mediante ripetute stimolazioni luminose con intensità crescente su scala logaritmica. Aumentare (e non diminuire) le intensità della luce arancione sono necessarie per impedire l'adattamento alla luce. L'ERG (M-potenziale) e il PDA sono metodi molto semplici per misurare i livelli di fotopigmento. L'alternativa, vale a dire la microspettrofotometria36, richiede costose attrezzature ottiche e una notevole formazione e abilità.

Per concludere, l'ERG è uno strumento semplice da applicare ma relativamente impreciso. La registrazione a cella intera31 è accurata per misurare i livelli di fotopigmento utilizzando l'ERC ed è essenziale per compensare l'imprecisione e le limitazioni dell'ERG.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Israel Science Foundation (ISF) e della United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Ringraziamo il signor Anatoly Shapochnikov per la costruzione del riscaldatore a filamento di cera.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

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References

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Neuroscienze Numero 184
Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori <em>di Drosophila</em>
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Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

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