Summary
우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.
Abstract
초 파리 G-단백질-결합된 광색소 로돕신(등록상표)은 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 로돕신의 활성화 과정은 발색단의 광자 흡수 유도 이성체화에 의해 개시되고, 옵신의 형태적 변화를 촉진하고, 두 번째 어두운 안정한 광안료 상태(metarhodopsin, M)를 초래한다. 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 이러한 이중안정한 광안료를 조사하려면 돌연변이 파리를 스크리닝하기 위한 간단하고 강력한 방법이 필요하다. 따라서, 기능성 광안료 수준의 감소를 측정하기 위한 몇몇 방법들이 설계되었다. 그러한 방법 중 하나는 광자 흡수 및 광수용체에서 발현되는 엄청난 양의 광안료 분자에 따른 광안료 내의 전하 변위를 이용한다. 초기 수용체 전위(또는 초기 수용체 전류)로 명명된 이 전기 신호는 다양한 전기생리학적 방법(예를 들어, 일렉트로레티노그램 및 전체 세포 기록)에 의해 측정되며, 기능적 광안료 수준에 선형적으로 비례한다. 이 방법의 장점은 높은 신호 대 잡음비, 광안료 수준의 직접 선형 측정, 로돕신 또는 메타로돕신 활성화에 대한 하류의 광전달 메커니즘의 독립성이다. 장기간 탈분극 후전위(PDA)라고 불리는 추가적인 전기생리학적 방법은 초파리 광안료의 이중 안정성과 플라이 R 및 M 안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. PDA는 강렬한 청색광에 의해 유도되어 포화 된 양의 로돕신을 메타 로돕신으로 변환하여 어둠 속에서 오랜 시간 동안 광 반응 종료가 실패하지만 강렬한 오렌지 빛을 사용하여 메타 로돕신에서 로돕신 변환으로 종료 될 수 있습니다. PDA는 방대한 광안료 전환을 필요로 하는 강력한 신호이기 때문에, 광안료의 생물발생에 있어서 작은 결함이라도 비정상적 PDA를 쉽게 검출할 수 있다. 실제로, 결함 있는 PDA 돌연변이체는 광형질도입에 중요한 신규한 신호전달 단백질의 동정을 이끌었다.
Introduction
G-단백질 결합 수용체(GPCR)인 광활성화 로돕신(R)은 7개의 막횡단 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 초파리 멜라노가스터(fruit fly)에서, 광자 흡수는 11-시스-3-OH-망막 발색단의 모든 트랜스-3-OH-망막1에 대한 이성체화를 유도하여, 로돕신의 메타로돕신으로의 형태적 변화를 촉진한다(M, 도 1A). 척추동물 로돕신과는 달리, 무척추동물 발색단의 우세한 분획은 옵신으로부터 해리되지 않으며, 생리활성 암-안정한 색소 상태 M을 초래한다. 차례로, 모든 트랜스-3-OH-망막 발색단에 의한 추가적인 광자 흡수는 발색단2,3의 이성체화를 유도하여, 11-시스-3-OH-망막 발색단과 함께 R 안료 상태를 생성한다. R 상태는 어둡고, 안정하고, 생리학적으로 비활성 광안료이다. 척추동물 광색소와 마찬가지로 발색단4의 매우 빠른 광자 재생 경로 외에도, 발색단 재생을 위한 대안적인 효소적 느린 경로가 무척추동물에 존재하며, 이 경로에서 일부 단계는 광수용체 세포(5,6)를 둘러싸고 있는 망막 세포에서 수행된다.
초파리는 무척추 동물 광수용체를 연구하기위한 모델 유기체로서 큰 이점을 수반합니다. 특히, 제제의 접근성과 분자 유전학을 적용 할 수있는 능력은 초파리를 강력한 모델 시스템7로 만들었습니다. 따라서, 일반적으로 광형질도입 및 광안료 수준을 연구하기 위한 몇 가지 생체내 및 생체외 실험 방법, 특히 확립되었다. 가장 간단한 생체 내 방법은 초파리 눈의 빛에 대한 상대적으로 큰 세포 외 기록 된 전압 반응을 이용합니다. 따라서, 광 자극은 척추동물 눈의 빛에 대한 ERG 반응보다 ∼3배 더 큰 세포외 전기망막(ERG) 기록을 사용하여 측정될 수 있는 전체 눈에서 전기 전압 반응을 불러일으킨다(8,9). 초파리 ERG 반응은 견고하고 쉽게 얻을 수 있으므로 돌연변이로 인한 광 반응의 이상을 확인하는 편리한 방법입니다. 빛에 대한 ERG 반응은 주로 광수용체, 색소 (glia) 세포 및 라미나의 이차 뉴런에서 발생합니다 (그림 1B 참조). ERG의 주요 구성 요소는 (i) 광수용체의 세포외 전압 반응, (ii) 라미나 뉴런으로부터 발생하는 광 자극의 시작과 끝에서의 "on" 및 "off" 과도 상태 (도 2A, inset, ON, OFF), (iii) 신경교세포의 느린 반응 (도 2A, inset, arrows), 및 (iv) 짧고 일시적인 반응이고, ON 과도 상태10보다 앞선 광안료 활성화 동안의 전하 변위로 인한 결과(도 2C[inset], D, E). 이 짧은 반응은 2 단계 (M1 및 M2, 그림 2C [inset])로 구성되며 수백만 개의 광안료 분자를 동시에 활성화시키는 매우 강한 광 자극에 의해서만 유도 될 수 있습니다. 청색 자극 (그림 2D, 청색 흔적) 또는 광색소 수준이 고도로 감소 된 돌연변이 (그림 2E, 적색 흔적)에서는 관찰되지 않지만 PLC 활성을 폐지하는 돌연변이에서 진폭이 약간 향상됩니다 (그림 2E, 주황색 흔적). M1 상은 광수용체에서 M의 활성화로부터 발생하는 파리의 전형적인 ERP이다. 긍정적 인 극성 (세포 내)을 갖는 M1 단계는 신호 반전 시냅스에서 정상적인 방식으로 신경 전달 물질을 방출하고 시냅스 적으로 증폭 된 M2 상을 생성하여 광수용체 탈분극에 반응하는 라미나 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서, M1 및 M2 상 모두 M 활성화(10,11)를 반영한다.
광수용체의 탈분극은 각막 양성 "온" 과도기를 생성하며, 이는 라미나10,11의 광수용체 축색돌기와 단극성 뉴런 사이의 부호 반전 시냅스로부터 발생한다(도 1B). ERG의 느린 상승 및 붕괴는 주로 일시적인 수용체 전위 (TRP) 및 TRP 유사 (TRPL) 채널 13,14,15를 통한 광수용체 세포 (12)로부터의 K+ 유출로 인해 색소 세포의 탈분극 (도 2A, 인셋, 화살표)으로부터 발생한다. 이러한 느린 운동 성분은 광(9,10)에 대한 광수용체 반응의 세포내 또는 전체 세포 기록과 비교할 때 광수용체 반응의 파형을 크게 가릴 수 있고 왜곡시킨다. 또한, 매우 강한 조명에서, "온" 과도 상태와 선행하고 부분적으로 융합되는 추가적인 과도 응답이 관찰될 수 있다(그림 2C [inset],D,E). 이 신호는 광안료(10)의 거대한 활성화로부터 직접 기인한다.
중성 밀도 (ND) 및 컬러 필터뿐만 아니라 강력한 조명 플래시를 사용하는 여러 광 정권 프로토콜이 일반적으로 눈과 특히 광전달 캐스케이드를 조사하기 위해 개발되었습니다. 이들 프로토콜은 또한 광안료의 특성을 조사하기 위해 사용되었다.
강도-응답 프로토콜은 증가하는 광도에 대해 전체 눈의 ERG 전압 응답의 피크 진폭을 측정합니다(그림 2A,B). 이 프로토콜은 광수용체 9에대한 광수용체 세포의 민감도의 변화를 검출하는데 도움을 준다.
장기간의 탈분극 후전위(PDA) 프로토콜은 로돕신과 메타로돕신의 흡수 스펙트럼의 차이를 이용하여, 초파리에서 R의 광안료를 생리활성이고 암-안정한 중간체 M 상태2로 대량으로 전환시킬 수 있게 한다. ERG 전압 응답에서, 포화 광의 비교적 짧은 펄스가 주어지고, 그 결과 전압 응답이 기록된다. 이러한 조건 하에서, 천장(반전 전위)은 엄청난 양의 로돕신 분자(~1 x 10,8)의 퍼센트의 분율의 활성화가 천장에 도달하기에 충분하기 때문에 탈분극 신호에 의해 도달된다. 광전달 성분이 매우 풍부하게 존재하면 광전달 성분의 농도가 크게 감소하거나 미묘한 오작동이있는 돌연변이에서도 천장에 도달 할 수 있습니다. 이 상황은 이러한 돌연변이체의 분리를 배제한다. Pak et al.은 시각 돌연변이체를 분리하기 위한 신뢰성 있고 공개적인 시험을 추구하는 PDA 스크리닝7을 도입하였다. 초파리에서, PDA 반응은 광안료 전환을 허용하는 적색 스크리닝 안료를 유전적으로 제거하고, 로돕신에 의해 우선적으로 흡수되는 청색광의 적용에 의해 야기되고(도 3A), 따라서, R을 M 광안료 상태로 큰 순 전환을 초래한다. 광전달 종결은 R에서 M으로의 큰 순 변환에 의해 광안료의 수준에서 붕괴되고, 이는 차례로 광이 꺼진 후 오랫동안 지속적인 여기를 초래한다 (도 2C, 도 4A [상단]). PDA 기간 동안, 광수용체는 후속 테스트 라이트에 덜 민감하고 부분적으로 탈감작된다(불활성화). PDA는 로돕신 생물발생의 사소한 결함까지도 검출하고 장기간 흥분을 유지하기 위해 광수용체 세포의 최대 용량을 시험한다. 그것은 엄격하게 로돕신의 고농도의 존재에 의존하기 때문에, 그것은 쉽게 광전달 성분의 부족 보충에 대한 점수. 놀랍게도, PDA 스크린은 많은 새롭고 매우 중요한 시각적 돌연변이체를 산출하였다 (Pak et al.7에서 검토됨). 따라서, Pak et al.7에 의해 단리된 PDA 돌연변이체는 초파리 시각 시스템을 분석하는데 여전히 매우 유용하다.
PDA는 청색광을 포화시킴으로써 초파리에서 유도되어, 광 오프셋 후 오랫동안 지속적인 탈분극을 초래한다(그림 4A [상단]). PDA 유도 청색광을 포화시킨 후, 주변 광수용체(R1-6)는 최대 용량으로 어둠 속에서 지속적으로 활성 상태를 유지하여 포화에 도달한다. PDA 동안 추가적인 포화 청색광은 수초 동안 R1-6 세포에서 어떠한 추가적인 반응도 생성하지 않지만, PDA 상에 중첩되는 R7-8 세포에서 반응을 유도한다. 중첩된 반응은 이들 세포에서 발현된 광안료의 상이한 흡수 스펙트럼에 의해 설명된다(R7-8)16. PDA는 포화 오렌지 빛으로 M을 R로 다시 광변환함으로써 억제될 수 있다(그림 4A [상단]). 강렬한 백색광에 의해 달성 될 수없는 상황 인 광수용체 세포를 최대 활성 용량으로 가져 오는 PDA의 능력은 초파리의 시각적 돌연변이를 스크리닝하는 주요 도구 인 이유를 설명합니다. 이는 정상적인 광색소 수준17,18의 생물발생에 관여하는 단백질의 사소한 결함조차도 검출할 수 있기 때문이다. PDA 결함 돌연변이체의 두 그룹이 단리되었다: 불활성화 또는 사후전위(니나) 돌연변이체 및 불활성화는 아니지만 애프터포텐셜(ina) 돌연변이체는 아니다. 전자의 표현형은 광안료 수준의 큰 감소로부터 발생하는 PDA 및 연관된 불활성화의 결여이다(도 4A[중간]). 후자의 표현형은 정상적인 로돕신 수준을 가진 돌연변이체에서 아직 알려지지 않은 메커니즘으로 인해 불활성화를 나타내지 만 TRP 채널과 상호 작용하는 단백질이 부족하기 때문에 청색광 후 어두운 탈분극을 보이지 않습니다 (그림 4A [하단]).
PDA 는 M 활성19,20,21에 결합하고 종결시키는 레스틴(ARR2)에 비해 광안료의 양의 차이로부터 발생한다(도 1A). 초파리 광수용체에서, 광안료의 양은 ARR219의 양보다 약 5배 더 크다. 따라서, ARR2 수준은 R에서 M으로의 큰 순 광변환에 의해 생성된 모든 M 분자를 불활성화시키기에 불충분하고, 과량의 M이 어둠 속에서 지속적으로 활성화되도록 남겨둔다 17,19,20,22,23. 이 메카니즘은 돌연변이 또는 카로티노이드 박탈24,25에 의한 PDA 반응의 제거를 설명하고, 광안료 수준의 감소를 야기하지만, arrestin 수준에는 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 이러한 설명은 또한 널 ARR2 (arr23) 돌연변이 대립유전자21의 표현형을 설명하는데, 여기서 PDA는 ~10배 조광기 청색 광 강도19,20,21에서 달성될 수 있었다(도 4B,C). PDA는 파리 광수용체의 독특한 특징이 아니며, R 상태와 다른 흡수 스펙트럼을 가진 어두운 안정한 M을 갖는 모든 테스트 된 종에서 나타나므로 R에서 M 상태로 광안료의 충분한 광변환이 가능합니다. PDA 현상학이 발견된 철저하게 조사된 종은 바나클(Balanus) 광수용체이며, 여기서 R 상태의 흡수 스펙트럼은 M 상태2보다 더 긴 파장에 있다(도 3B). 따라서, 파리의 상황과는 달리, 바나클에서는 주황색-적색광이 PDA를 유도하고, 청색광은PDA2를 억제한다.
초기 수용체 전위(ERP) 프로토콜은 R 또는 M 활성화 동안 발생하는 전하 변위를 이용한다. 시각 안료는 척추동물 및 무척추동물 막(3) 둘 다의 신호전달 구획의 표면막의 필수적인 부분이다. 따라서, 광안료 분자가 하나의 중간 상태에서 다음 상태로 변하는 활성화 과정은 전하 변위(4,26)를 수반한다. 광안료 분자가 막 커패시턴스(4)와 병렬로 전기적으로 정렬됨에 따라, 급격하게 동기화된 형태 변화는 표면 막의 빠른 분극 변화를 발생시키며, 파리에서는 횡문재라고 불리는 ~30,000-50,000 마이크로빌리의 스택으로 구성된 신호전달 구획에서 발생한다. 이 분극은 세포막이 똑같이 분극 될 때까지 세포체의 막 커패시턴스를 통해 수동적으로 방전됩니다. ERP는 전하 변위의 세포외 기록이다. 세포내 기록된 ERP는 세포막 4,27,28의 시간 상수에 의해 통합된 세포외 ERP를 나타낸다. 시각적 안료 전하 변위에 의해 활성화된 전류는 또한 전체 세포 전압 클램프 기록(29,30)(도 5A-D)에서 측정될 수 있었고, 신호의 동역학에 대한 막 커패시턴스의 영향을 최소화하는 주요 이점(초기 수용체 전류(ERC) 기록에서)을 갖는다.
프로토콜 섹션은 초파리 눈9에서 ERG 측정을 수행하는 방법 및 초파리 분리 옴마티디아31,32로부터의 전체 세포 기록에 의한 ERC 측정을 기술한다. 우리는 또한 일반적으로 광형질도입과 특히 광안료를 조사하는 데 사용되는 특정 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 일렉트로레티노그램을 사용하여 강도 반응 관계, 장기간의 탈분극 후전위(PDA) 및 초기 수용체 전위(ERP) 측정
- D. 멜라노가스터 준비에 적합한 양육 조건
- D. melanogaster 는 24 °C의 온도와 12 시간의 어두운/밝은 주기로 유지되는 인큐베이터에서 음식이 들어있는 표준 노란색 옥수수가 들어있는 병에서 날아갑니다.
- 실험 전에 적어도 24 시간 전에 비행 병을 어둠 속에 보관하십시오.
- 일반 설정
- 1mm x 0.58mm(O.D x I.D) 섬유로 채워진 보로실리케이트 유리 모세혈관을 잡아당겨 기록 피펫을 준비합니다(그림 6L, O). 피펫의 저항은 5-10 MΩ이어야합니다. 임의의 적합한 풀러가 사용될 수 있다.
- 두 개의 은선을AgCl2로 코팅하고 맞춤형 5V 전원 공급 장치에 연결된 3M KCl 솔루션에 0.25mm 은선을 삽입합니다.
- 코팅된 각 은선을 전극 홀더에 삽입합니다(그림 6N).
- 길쭉한 팁 주사기를 사용하여 여과된 링거 용액( 표 1 참조)으로 유리 모세관을 채웁니다(그림 6M).
- 와이어 전극을 유리 모세관에 삽입합니다. 모세관 내의 용액이 은선과 접촉하고 있는지 확인하십시오.
- 전극 홀더(그림 7P, N)를 두 개의 전극 미세 조작기에 삽입합니다(그림 7G).
- 전기 기록을 위해 파리를 준비하는 절차
참고: 파리를 어두운 조건에서 유지하려면 다음 단계 중에 희미한 빨간색 조명 조명만 사용하십시오.- 플라이 슬리퍼 시스템(그림 6A, B)을 사용하여CO2 가스로 병에 있는 파리를 마취시키고 침목 용기에 부어 넣습니다.
- 하나의 파리를 선택하고 날카로운 트위저를 사용하여 조심스럽게 날개로 잡으십시오. 나머지 파리를 페트리 접시로 덮으십시오.
- 플라이 홀더에 플라이를 적절한 방향으로 놓고 등을 손을 향해 눕히십시오(그림 6P).
- 납땜 인두의 전원 공급 장치를 켭니다. 전류를 ~2.25A로 설정합니다. 이 전류는 0.25mm 백금-이리듐 필라멘트를 ~55-56°C로 가열해야 합니다( 보충 파일 참조).
- 납땜 인두에 낮은 용융 온도(~55-56°C)의 왁스 한 방울을 놓습니다(그림 6F).
- 핀셋을 사용하여 날개에서 플라이를 들어 올리고 납땜 인두를 사용하여 날개를 플라이 홀더(그림 6I)에 고정합니다.
- 납땜 인두를 사용하여 왁스로 플라이의 뒷면을 스탠드 표면에 연결합니다(그림 6P).
- 납땜 인두의 끝을 다리의 결합 지점으로 내리고 왁스를 녹여 모든 다리를 함께 덮습니다(그림 6P).
- 목 부위의 머리와 등 사이에 작은 왁스 한 방울을 놓습니다(그림 6P).
참고 : 비행 헤드가 과열되지 않도록 특별한주의를 기울이십시오. 파리가 제대로 고정되어 있고 실험 중에 움직일 수 없는지 확인하십시오. 사소한 움직임으로 인해 녹음에 아티팩트가 생성될 수 있습니다. 흉부와 복부의 기관 개구부 (호흡 입구)가 왁스로 덮여 있지 않은지 확인하십시오. - 플라이 홀더(그림 7Q)를 자석 블록(그림 7I)의 어두운 패러데이 케이지에 놓고 플라이가 도광체 끝에서 ~5mm가 되도록 합니다(그림 7L).
- 마이크로 조작기를 사용하여 기록 전극(그림 7P)을 파리의 눈 위에 놓고 접지 전극(그림 7N)을 파리의 위쪽 뒤쪽 위에 놓습니다.
- 미세 조작기를 사용하여 접지 전극을 플라이 뒤쪽에 삽입하십시오.
- 기록 전극을 파리의 눈의 외부 주변부에 삽입하고, 바람직하게는 미세 조작기를 사용한다.
참고 : 전극을 눈에 삽입 한 후 작은 보조개가 관찰됩니다. 딤플이 사라질 때까지 눈에서 전극을 제거하지 않고 전극을 위쪽으로 당깁니다. 전극은 또한 몸통과 눈에 적용된 전극 젤리의 작은 물방울에 침지될 수 있다.
- 강도-응답 프로토콜
- 주황색 필터(590 에지 필터)를 고압 제논 램프 앞에 놓습니다. 중성 밀도(ND) 필터를 감쇠시키는 큰(여섯 차수의 크기) 필터를 사용합니다.
- 어둠 속에서 60 초를 기다렸다가 5 초의 가벼운 펄스를주십시오.
- ND 필터를 한 단계 씩 씩 감쇠가 덜 감쇠되는 ND 필터로 교체합니다.
- 어둠 속에서 60 초를 기다렸다가 두 번째 5 초 빛 펄스를주십시오.
- 1.4.1.-1.4.4단계를 반복하여 덜 감쇠하는 ND 필터를 사용하여 점차적으로 광도를 높입니다(ND 필터 없이 마지막 펄스를 생성해야 함). 일련의 ND 필터를 큰 감쇠에서 시작하여 낮은 감쇠에 도달하여 적절한 방향으로 사용하십시오.
- PDA 프로토콜 (이 프로토콜은 흰 눈동자 파리에서만 수행 할 수 있음)
- 주황색 필터 (최대 광안료를 R 상태로 변환하기 위해 590 에지 필터)를 사용하여 최대 강도의 5 초 광 펄스를 제공하십시오.
- 주황색 필터를 광대역 청색(BP450/40nm) 필터로 교체하고 최대 강도에서 세 개의 5s 광 펄스를 제공합니다.
참고: 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 긴 연속 최대 강도 청색광 펄스를 제공할 수도 있습니다. - 어둠 속에서 60초 동안 기다렸다가 파란색 필터를 이전 주황색 필터로 교체한 다음 60초 간격으로 두 개의 5초 빛 펄스를 제공합니다.
- M의 광평형 스펙트럼을 측정하기위한 ERP / M 전위 프로토콜 (이 프로토콜은 흰 눈의 파리10,25에서만 수행 할 수 있음)
- 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 연속 청색(대역통과(BP) 450/40nm) 광 펄스를 주고, 이는 최대 광안료를 R 상태에서 R1-6 셀의 M 상태로 변환시킨다.
- 좁은 (~ 20nm) 대역 통과 필터를 사용하여 350-700 nm 사이의 파장 (R1-6 세포 광안료의 알려진 흡수 스펙트럼)의 간략한 (<3ms) 강렬한 광 플래시를 제공하고 M 전위 반응의 M1 단계의 피크 진폭을 측정합니다 (이는 광평형10,25에서이 특정 파장에서의 메타 로돕신 흡수를 반영합니다).
참고: 광안료 분자의 큰 풀을 동기적으로 활성화하려면 광자 함량이 짧은 시간 내에 포장될 수 있도록 짧고 강렬한 빛의 플래시가 필요합니다. M 전위는 두 가지 성분으로 구성됩니다 : 광수용체에서 메타 로돕신의 전하 변위를 반영하는 M1 (각막 음성 상)과 라미나9,10,11에서 광수용체의 증폭 된 M1 반응을 반영하는 M2 (각막 양성 상 11,33) . 이들 성분들 각각은 식별되고 측정될 수 있다. 그러나, M1 전위는 M 레벨의 직접적인 선형 발현이기 때문에 측정하는 것이 바람직하다. M2를 사용하는 경우 온화한 카로티노이드 박탈24,25를 사용하여 진폭이 선형 범위에 있는지 확인하십시오. - 연속 청색(BP450/40nm) 광 펄스를 다시 주고 다른 파장의 짧은(<1ms) 강렬한 광 플래시를 제공합니다.
- 사진 평형에서 M의 전체 흡수 스펙트럼이 커버 될 때까지이 프로토콜을 반복하십시오.
2. 전체 셀 전압 클램프 기록을 사용하여 R의 작용 스펙트럼과 R1-6 셀의 M 상태를 측정하기위한 ERC 프로토콜
참고: 전체 셀 전압 클램프 레코딩을 사용하기 위한 자세한 프로토콜은 Katz et al.34를 참조하십시오. M-포텐셜은 ERG를 사용하여 M 상태의 활성화를 측정하는데, 이는 R 상태의 기여가 막 커패시턴스에 의해 억제되기 때문이다. 대조적으로, ERC는 전압 클램프 기록이 멤브레인 커패시턴스의 효과를 제거하기 때문에 R (포지티브 ERC) 및 M (네거티브 ERC) 상태의 활성화를 측정합니다 (소개 참조).
- 광안료를 원하는 상태(R 또는 M)로 변환합니다. R에서 M으로 변환하려면 먼저 짧은 (<1ms) 적응 형 파란색 (BP450 / 40nm) 플래시로 파리를 조정하십시오. M에서 R로 변환하려면 짧은 적응형 주황색(OG590 에지 필터) 플래시를 제공합니다.
- 350-700nm 사이의 파장의 짧은 광 플래시(<1ms)를 제공하고 이 특정 파장에서 M/R 흡수를 반영하는 ERC 응답의 최대 음의 또는 포지티브 진폭을 측정합니다.
참고: 광안료 분자의 큰 풀을 동기적으로 활성화하기 위해서는 짧은 시간 내에 광자 함량을 포장하기 위해 짧고 강렬한 빛의 섬광이 필요합니다. 청색 플래시에 의한 R에서 M으로의 최대 광안료 변환은 R 및 M의 흡수 스펙트럼에서 겹치기 때문에 전체 광안료 분자의 ~ 80%에 도달할 수 있다(그림 3A). 따라서 ~ 550nm 이하의 파장에서 ERC는 메타 로돕신의 반응을 반영하는 음성 상과 나머지 로돕신의 반응을 반영하는 양성 단계의 두 가지 구성 요소를 가지고 있습니다. ERC는 광도에 선형적으로 의존합니다(그림 5D). 따라서, R 및 M 상태의 스펙트럼 감도를 도출하기 위해, ERC의 각 위상은 동일한 에너지(29)에 대해 다양한 파장에서 정규화될 필요가 있다. - 2.1.-2.2단계를 반복합니다. 다른 파장의 플래시를 사용합니다.
- 정규화된 포지티브 및 네거티브 ERC를 파장의 함수로 플로팅한다.
참고: 빛의 강한 섬광은 빛에 민감한 채널을 통해 엄청난 전류를 유도하여 광수용체에 대사 스트레스를 유발하며, 이는 차례로 빛에 독립적인 채널 개방을 일으킨다. ERC는 이 구성 전류에 겹쳐집니다.
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Representative Results
도 2는 ERG 기술을 사용하는 견고성 및 용이성을 예시한다. 그것은 간단한 전기 생리학 적 설정을 필요로하는 세포 외 전압 기록의 간단한 기술에 의해 사실상 손상되지 않은 파리에 기록되기 때문에 견고합니다. 견고성은 돌연변이가 광 반응을 강하게 감소시키거나 왜곡하는 경우에도 상대적으로 큰 진폭 (밀리볼트 범위)을 갖는 광 반응의 기록을 얻음으로써 나타납니다. 따라서 경험이 부족한 실험자조차도 매우 간단한 실험 설정을 사용하여 며칠 내에 의미있는 결과를 얻는 방법을 배울 수 있습니다. 광안료 수준을 측정하도록 설계된 기술의 주요 목표는 PDA(그림 2C) 및 ERP(그림 2C-E)의 매우 단순화된 방법에 의해 달성됩니다. 대안, 즉 미세분광광도측정법은 값비싼 광학 장비와 상당한 훈련과 기술이 필요합니다(그림 3B). ERC (그림 5A-D)는 기술적으로 어렵지만 세포 보존에 덜 민감합니다. 그것은 높은 신호 대 잡음비와 멤브레인 커패시턴스의 제거를 특징으로합니다.
그림 1 : 광화학 사이클 : 광안료의 활성화 및 비활성화. (A) 포화 청색 조명 (물결 모양의 파란색 화살표) 광은 로돕신 (R)을 메타 로돕신 (M)으로 변환합니다. 로돕신 키나제에 의한 M의 다중 인산화와 페레딘 2(ARR2)의 후속 결합은 M. 오렌지광(물결 모양의 적색 화살표)을 불활성화시켜 인산화되지 않은 M을 다시 R로 변환시킨다. 비인산화된 M은 헤테로삼량체 G-단백질(Gqαβγ)을 활성화시켜 Gqβγ로부터 Gqα의 해리 및 결합된 GDP를 세포질 GTP와 교환시킨다. 그런 다음 Gqα-GTP는 PIP2를 디아실글리세롤 (DAG) 및 이노시톨 트리스 포스페이트 (IP3)로 가수분해하는 포스포리파아제 C (PLC)를 활성화시켜 TRP / TRPL 채널을 여전히 불분명 한 방식으로 활성화시킵니다. Ca2+ 칼모듈린-의존성 키나아제 (CaMKII)는Mpp-ARR2 복합체를 인산화하고, 클라트린-의존성 엔도사이토시스 및 분해를 겪는다. 주황색 광(물결 모양의 빨간색 화살표)을 사용한 조명은 Mpp-ARR2 복합체를 인산화된 R(Rpp)로 변환하여 ARR2를 시토졸로 방출합니다. 인산화된 R(Rpp)은 로돕신 포스파타제(rdgC)에 의한 탈인산화를 겪고, 광안료의 또 다른 사이클을 위해 준비된 R을 생산한다. (B) 1 s 백색 자극 (중앙 열) 또는 흰색 스트로브 플래시 (오른쪽 열)에 대한 흰 눈의 파리의 ERG의 깊이 프로파일. 자극은 흔적 아래의 막대 또는 점으로 표시됩니다. 흔적은 깊이 순서대로 수직으로 배열되며, 상단 트레이스는 각막 아래에 ~ 10 μm를 기록하고 각 후속 기록은 마지막보다 25 μm 더 깊습니다. 왼쪽에는 망막, 기저막 (BM), 층상 껍질, 층상 카트리지 (비스듬히 단면화) 및 수질 껍질을 나타내는 다른 눈을 통해 해당 섹션의 카메라 루시다 그림이 있습니다. 이 그림은 Stephenson과 Pak11에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 백눈동 야생형(w1118)과 돌연변이 초파리의 광반응에 대한 전기망막(ERG) 기록은 강도-반응 관계, 장기간의 탈분극 후전위(PDA) 및 메타로돕신 전위(M-potential)를 보여준다. (a) WT(w1118)의 강도-반응 관계는 일련의 오렌지 라이트(OG590 에지 필터)에 의해 수득된 플라이-오렌지 필터, 오렌지색 필터를 사용한 도광체의 에지로부터 방출되는 총 에너지는 4 mW였다)-log scale로 표시된 증가된 광 강도와 함께. 인셋은 표시된 응답을 더 빠른 시간 척도로 표시합니다. 삽입: ERG의 주요 구성 요소는 광수용체의 세포외 전압 반응(수용체 전위), 광 자극의 시작과 끝에서의 "on" 및 "off" 과도 상태(ON, OFF 응답), 및 신경교세포의 느린 반응(화살표)이다. (b) ERG 반응의 평균 피크 진폭은 상대 광 강도의 함수로서 플롯팅된다. (c) WT(w1118)의 ERP는 초기에 PDA를 유도하는 포화 청색(BP450/4 nm, 청색 필터를 사용한 도광의 가장자리로부터 방출된 총 에너지는 1 mW)의 적용에 의해 얻어졌다. ERP(인셋)는 PDA를 억제한 다음의 강렬한(∼70 J, 2 ms 지속) 그린 플래시(화살표, 광대역 550 nm 간섭 필터)에 의해 얻어졌다. 삽입: ERP의 다양한 성분은 각막 음성 M1 전위 및 양성 M2 전위를 포함한다. 과도 상태("ON" 응답)에 대한 잔류도 표시됩니다. (D-E) 광안료 변환은 M 전위의 유도에 필요하다: (D) M 전위는 WT(w1118)에서의 청색 적응 후에 청색 적응에 뒤따르는 녹색(광대역 550 nm 간섭 필터) 플래시에 의해 얻어졌으나 청색(BP450/4 nm) 플래시에 의해서는 그렇지 않았다. (e) D의 프로토콜을 WT (w1118, 검정 트레이스) 및 두 개의 돌연변이 파리 (PLC 귀무 돌연변이체, norpAP24, 오렌지 트레이스, 및 저형성 로돕신 돌연변이체, ninaEP318, 적색 추적)에서 반복하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 플라이 및 바나클 광안료의 흡수 스펙트럼. (A) 차이 스펙트럼과 광평형 스펙트럼의 광도 측정으로부터 계산된 플라이 로돕신(R) 및 메타로돕신(M)의 상대적 흡수 스펙트럼. 이 수치는 Selinger와 Minke35에서 수정되었습니다. (B) 492nm 및 532nm에서 피크 파장을 갖는 두 개의 Dartnall 노모그램(각각 1.63:1의 피크 흡수 비율. 이 곡선의 차이는 단색 청색 (442 nm) 및 오렌지색 (596 nm) 적응 후 400-650 nm 범위의 투과 측정에 의해 얻은 바나클 Balanus eborneus의 오켈리에서 측정 된 차이 스펙트럼에 가장 적합합니다. 이 그림은 Minke와 Kirschfeld36에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 니나, ina, 및 Arr2 돌연변이체의 PDA 표현형. (A) 초파리에서 PDA의 유도 및 억제의 프로토콜. PDA 유도 프로토콜은 최대 강도 오렌지 광 펄스 (590 에지 필터, 오렌지 필터를 사용하여 도광체의 가장자리에서 방출되는 총 에너지는 4 mW, 오렌지 바)를 사용하여 초기 조명으로 구성되며 최대 강도의 3 펄스를 적용한 후 최대 강도의 청색광 (2 번째 및 3번째 펄스는 최대 PDA에 도달하는 것을 검증하기위한 것입니다. BP450/40 nm 필터, 청색 필터를 사용한 도광체의 가장자리에서 방출된 총 에너지는 1 mW, 3개의 청색 막대)이었다. PDA 억제는 오렌지색 광 펄스의 적용에 이어 추가적인 오렌지 라이트(두 개의 오렌지색 막대)의 적용에 의해 얻어졌다. PDA 유도 및 억제 프로토콜은 R1-6 광색소의 구조 유전자인 ninaEP318 7(중간)의 백눈 돌연변이체에서 반복되었다. PDA 유도 및 억제 프로토콜은 또한 안구 특이적 단백질 키나아제 C(PKC32) inaCP209(하단)의 백안구 널 돌연변이체에서 반복되었다. (b) 백목 WT(W1118)와 널 Arr2 돌연변이체(Arr23) 사이의 PDA의 유도에 필요한 청색광의 양 사이의 비교. 주황색(포화 590개의 에지 필터)과 파란색(BP450/40nm)을 번갈아 가며 광도를 높이는 광선 펄스(상대 -로그 스케일의 ND)의 열차입니다. -log 1 강도의 청색광에서, PDA가 유도된다(상단). 상부 트레이스의 패러다임은 PDA가 ∼10배 이량광(-log 2) 강도(하단)의 청색광에서 유도되었음을 보여주는 Arr23 돌연변이체에서 반복되었다. (c) 일정한 강도의 희미한(-log 2) 청색광 펄스의 트레인이 W1118 플라이(왼쪽)에서 PDA를 유도하지 못한 반면, 동일한 희미한 청색광 열차는 Arr23 돌연변이체에서1st 광 펄스에 의해 PDA를 유도하였다(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 백선(w1118)으로부터 기록된 단리된 옴마티디아의 광 반응에 대한 패치-클램프 전체 세포 기록으로, 초기 수용체 전류(ERC)의 생성과 그 강도-반응 관계를 보여준다. (a) 서브마이크로초 레이턴시를 갖는 이phasic ERC 반응의 WT 플라이(w1118)의 단리된 옴마티듐으로부터의 패치-클램프 전체 세포 기록. 광 자극은 황록색 (546 nm에서 피크 흡수가있는 광대역 필터, 검은 색 흔적)에 강한 적응 후에 적용된 강렬한 (~ 220 J, 0.8 ms 지속 시간) 청색광 플래시 (425 nm에서 피크 흡수가있는 광대역 필터, 검은 색 흔적)로 구성됩니다. 빛이 시작될 때, 빠른 음의 전기 아티팩트가 관찰됩니다. 음의 단계는 M의 활성화로부터 발생하고, 양성 단계는 R의 활성화로부터 발생한다. 광유도 전류(LIC)의 활성화는 광-감지 채널의 개방으로부터 발생하는 지연된 네거티브 위상에 의해 나타난다. ninaEI17null 돌연변이체는 단리된 옴마티듐(적색 트레이스)에 적용된 동일한 광 플래시에 대한 ERC 반응의 결여를 나타냈다. (b) (A)와 동일한 세포로부터 기록된 Rh1 광안료의 ERC 측정. 흑색 트레이스는 청색광에 강한 적응 후 WT(w1118) 플라이의 오렌지색 플래시 자극에 대한 모노-phasic 음성 반응(M 상태)을 보여준다. (c) R1-6 플라이 광수용체에서 외래 발현 마우스 멜라놉신 광색소 (opn4)를 트랜스제닉 초파리 (opn4; ninaEI17)의 단일 광수용체 세포로부터 측정된 이phasic ERC 트레이스의 샘플은 백색 플래쉬 라이트의 강도 증가에 반응하여 (상대적으로-log I 스케일로; ND는 중성 밀도 필터를 나타냅니다). 플래시 시작은 화살표로 표시됩니다. (D) 광도의 증가는 opn4;ninaEI17의 ERC 진폭의 선형 증가에 의해 나타난다. 상대 광도(I/Imax, 로그 스케일)의 함수로서 ERC 응답의 음의 위상(로그 스케일)의 평균 피크 진폭의 플롯입니다. 연속 직선은 실험 지점에 가장 잘 맞는 선형 회귀 곡선을 나타낸다(R2=0.99, 오차 막대는 SEM, n=5). 이 수치는 Yasin et al.29에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 비행 고정 및 기록 피펫 준비에 필요한 도구 및 장치. (A) 플라이 슬리퍼 시스템; (b) 플라이 슬리퍼 시스템 페달; (c) 차가운 광원; (d) 스테레오스코픽 현미경; (e) 왁스 필라멘트 히터; (f) 납땜 인두; (g) 왁스 필라멘트 히터 페달; (h) 거친 핀셋; (i) 마그네틱 플라이 스탠드; (J) 낮은 용융 온도 왁스; (K) 섬세한 물티슈; (l) 수직 피펫 풀러; (M) 길쭉한 팁이있는 주사기; (N) 전극 홀더; (o) 보로실리케이트 유리 모세관; (P) 고정 플라이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: ERG 설정 개요. (A) 펄스 발생기; (B) 컴퓨터; (C) A/D 변환기; (d) 증폭기; (e) 입체 현미경; (f) 미세 조작기 (기계적 미세); (g) 헤드 스테이지를 갖는 마이크로전극 전치 증폭기 시스템; (H) 진동 방지 테이블; (i) 온/오프 자석 블록; (J) 미세 조작기 (기계적 조대); (K) 패러데이 케이지; (l) 제논 광원으로부터의 도광체; (M) 플래시 라이트 시스템으로부터의 도광체; (N) 접지 전극 홀더; (o) 광 검출기; (p) 기록 전극 홀더; (Q) 마그네틱 플라이 스탠드; (R) 제논 램프 전원 공급 장치; (S) 컬러 및 ND 필터 스탠드; (T) 광학 벤치; (U) 플래시 램프 시스템; (V) 셔터 드라이버; (W) 램프 전원 공급 장치; (X) 제논 플래시 라이트 시스템 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 링거의 해결책 | |
| 시약 | 농도 (mM) |
| 나클 | 130 |
| 증권 시세 표시기 | 2 |
| MgCl2 | 5 |
| CaCl2 | 2 |
| 헤페스 | 10 |
| NaOH 및 HCl을 사용하여 pH 적정 7.15 | |
표 1: 링거 용액의 조성.
보충 파일 1 : 왁스 용융 조절기의 회로도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
초파리 광수용체 제제를 사용하는 가장 큰 장점은 접근성, 광 자극의 용이성 및 정확성, 그리고 가장 중요한 것은 분자 유전학의 힘을 적용 할 수있는 능력입니다 7. 광범위한 유전 연구는 초파리를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 모델 시스템으로 확립했습니다7. 초파리 게놈의 비교적 간단한 구조 (X 및 Y 성 염색체, 2 개의 큰 상염색체 요소, 염색체 2 및 3 및 작은 점 네 번째 염색체를 포함한 4 개의 염색체로 구성됨), 성장의 용이성 및 빠른 생성 시간 (24 °C에서 ~ 2 주)은 Drosophila를 돌연변이 생성 된 개별 파리의 방대한 수의 스크리닝에 적합하게 만듭니다. 더욱이, 임의의 단리된 돌연변이의 분리 및 유지는 천연 염색체와의 재조합을 방지하는 우세한 마커 및 다중 역전을 포함하는 밸런서 염색체의 생성으로 인해 가능해진다. 이용 가능한 분자 도구는 그들의 토착 세포 환경37에서 시험관 내 변형 유전자 산물을 연구 할 수있게 해주었습니다. 이 강력한 방법론은 예측하기 어려웠을 새로운 단백질의 결함이있는 수많은 돌연변이 파리를 생산했습니다7.
광안료 수준과 빛에 대한 민감도를 측정하기 위해 ERG를 사용하는 가장 큰 장점은 단순성과 적용 용이성 및 큰 신호 대 잡음비입니다. ERG를 사용하는 것의 단점은 그의 헤테로제닉 세포 기원이며, 광수용체9로부터 발생하는 광 반응의 파형을 왜곡시킨다. 전압 클램프 전체 셀 기록의 가장 큰 장점은 전류-전압(I-V) 관계를 측정하여 컨덕턴스 변화를 유도할 수 있다는 것입니다. 조명 동안 및 후속되는 조명의 TRP 및 TRPL 채널의 개폐는 이러한 측정(13)에 의해 반영된다. 또한, 기록 피펫의 낮은 저항(~10MΩ)과 전류의 측정으로 인해 높은 신호 대 잡음비가 얻어지고, 양자 범프(단일 광자 응답)의 신뢰할 수 있는 측정이 가능하며, 이는 효과적인 광 강도(38)를 교정하는데 유용하다. 패치 클램프 전체 세포 기록의 주요 단점은 ERG 기록이 극한의 광 강도에서도 몇 시간 동안 유지 될 수 있지만 15-30 분 이상 신뢰할 수있는 패치 클램프 전체 세포 기록을 수행하기가 어렵고 장시간 녹음을 위해서는 희미한 광 자극이 필요하다는 것입니다. 전체 세포 기록을 얻기 위해서는 기록 피펫과 광수용체 막 사이의 직접적인 접촉이 필요합니다. 직접적인 접촉은 옴마티디아(34)를 둘러싸고 있는 색소(glial) 세포를 제거함으로써 달성된다(도 1B). 색소 세포 제거는 광수용체 세포가 아데노신 삼인산염(ATP) 생산에 필요한 대사산물을 합성할 수 없기 때문에 대사 스트레스를 유발하여 대사 공급을 방해한다(39). TRP 및 TRPL 채널은 식욕 부진에 취약하고 ATP 고갈로 인해 어둠 속에서 자발적으로 쉽게 열리기 때문에 격리 된 ommatidia의 사용은 큰 어려움을 부과합니다40,12. 전체 절차는 광 응답이 ATP(34)의 큰 소비를 유도하기 때문에 희미한 적색광 하에서 수행되어야 한다.
광전달 캐스케이드에서의 대부분의 돌연변이는 빛에 대한 민감성의 감소를 유도한다. 빛에 대한 민감도의 이러한 감소는 강도-반응 관계를 측정하는 것에 기초한 스크린에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 강도-반응 패러다임은 대수 척도에서 강도가 증가하는 반복된 광 자극에 의해 달성된다. 빛에 대한 적응을 방지하기 위해 주황색 빛의 강도를 증가 (감소시키지 않음)해야합니다. ERG (M-potential) 및 PDA는 광안료 수준을 측정하는 매우 간단한 방법입니다. 대안, 즉 미세분광광도계(microspectrophotometry)(36)는 값비싼 광학 장비와 상당한 훈련과 기술을 필요로 한다.
결론적으로, ERG는 적용하기 쉽지만 상대적으로 부정확 한 도구입니다. 전체 세포 기록(31 )은 ERC를 이용하여 광안료 수준을 측정하는데 정확하며, ERG의 부정확성 및 한계를 보상하는데 필수적이다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF)과 미국 - 이스라엘 이중 국가 과학 재단 (BSF)의 보조금으로 지원되었습니다. 왁스 필라멘트 히터 건설에 대해 Anatoly Shapochnikov 씨에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
References
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