Summary
Dit protocol beschrijft de biaxiale mechanische karakterisering, gepolariseerde spatial frequency domain imaging-based collageenkwantificering en microdissectie van tricuspidalisklepfolders. De meegeleverde methode verheldert hoe de folderlagen bijdragen aan het holistische foldergedrag.
Abstract
De tricuspidalisklep (TV) regelt de unidirectionele stroom van ongeoxygeneerd bloed van het rechter atrium naar de rechter ventrikel. De tv bestaat uit drie folders, elk met uniek mechanisch gedrag. Deze variaties tussen de drie tv-folders kunnen verder worden begrepen door hun vier anatomische lagen te onderzoeken, namelijk de atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) en ventriculaireis (V). Hoewel deze lagen aanwezig zijn in alle drie de tv-folders, zijn er verschillen in hun diktes en microstructurele bestanddelen die hun respectieve mechanische gedrag verder beïnvloeden.
Dit protocol bevat vier stappen om de laagspecifieke verschillen op te helderen: (i) het mechanische en collageenvezelarchitectuurgedrag van de intacte tv-folder karakteriseren, (ii) de samengestelde lagen (A / S en F / V) van de tv-folder scheiden, (iii) dezelfde karakteriseringen uitvoeren voor de samengestelde lagen en (iv) post-hoc uitvoeren histologische beoordeling. Dit experimentele raamwerk maakt op unieke wijze de directe vergelijking van het intacte tv-weefsel met elk van de samengestelde lagen mogelijk. Hierdoor kan met dit protocol gedetailleerde informatie over de microstructuur en biomechanische functie van de tv-folders worden verzameld. Dergelijke informatie kan mogelijk worden gebruikt om tv-computationele modellen te ontwikkelen die richtlijnen proberen te bieden voor de klinische behandeling van tv-ziekten.
Introduction
De tv bevindt zich tussen het rechter atrium en de rechter ventrikel van het hart. Gedurende de hele hartcyclus reguleert de tv de unidirectionele bloedstroom via het cyclisch openen en sluiten van de tv-anterieure folder (TVAL), de tv-posteriorfolder (TVPL) en de tv-septumfolder (TVSL). Deze blaadjes zijn complex en hebben vier verschillende anatomische lagen - de atrialis (A), de spongiosa (S), de fibrosa (F) en de ventriculaireis (V) - met unieke microstructurele bestanddelen. De elastinevezels in de atrialis en ventriculaireis helpen het weefsel te herstellen naar zijn ongevormde geometrie na mechanische belasting1. De fibrosa bevat daarentegen een dicht netwerk van golvende collageenvezels die bijdragen aan het draagvermogen van de bijsluiters2. Voornamelijk bestaande uit glycosaminoglycanen, is de spongiosa verondersteld om scheren tussen folderlagen mogelijk te maken tijdens hartklepfunctie3. Hoewel alle drie de foldertypen dezelfde anatomische lagen hebben, zijn er variaties in de diktes van de lagen en de samenstellingsverhoudingen die implicaties hebben voor folderspecifiek mechanisch gedrag.
Onderzoekers hebben de eigenschappen van de tv-folders onderzocht met behulp van vlakke mechanische karakteriseringen, histomorfologische beoordelingen en optische karakteriseringen van de collageenvezelarchitectuur. Planaire biaxiale mechanische karakteriseringen proberen bijvoorbeeld fysiologische belasting na te bootsen door loodrechte verplaatsingen op het weefsel toe te passen en de bijbehorende krachten te registreren. De resulterende krachtverplaatsing (of stress-stretch) observaties hebben aangetoond dat alle drie de tv-folders niet-lineair, richtingspecifiek mechanisch gedrag vertonen met meer duidelijke folderspecifieke reacties in de radiale weefselrichting 4,5,6. Aangenomen wordt dat dit folderspecifieke gedrag voortkomt uit verschillen in de microstructurele eigenschappen die worden waargenomen met behulp van standaard histologische technieken 6,7. Verder zijn de tweede harmonische generatie beeldvorming6, small-angle light scattering8 en polarized spatial frequency domain imaging7 (pSFDI) gericht op het begrijpen van deze microstructurele eigenschappen en hebben ze folderspecifieke verschillen aangetoond in de collageenvezeloriëntatie en vezelkrimp die implicaties hebben voor het waargenomen mechanische gedrag op weefselniveau. Deze studies hebben ons begrip van de weefselmicrostructuur en zijn rol in gedrag op weefselniveau aanzienlijk verbeterd. Er moet echter nog veel worden aangepakt bij het experimenteel verbinden van de weefselmechanica en de onderliggende microstructuur.
Onlangs heeft dit laboratorium mechanische karakteriseringen uitgevoerd van de tv-folderlagen gescheiden in twee composietlagen (A / S en F / V) met behulp van een microdissectietechniek9. Dat eerdere werk benadrukte verschillen in de mechanische eigenschappen van de lagen en hielp inzicht te geven in hoe de gelaagde microstructuur bijdraagt aan het mechanische gedrag van het weefsel. Hoewel dit onderzoek ons begrip van de microstructuur van de tv-folder verbeterde, had de techniek verschillende beperkingen. Ten eerste werden de eigenschappen van de samengestelde lagen niet direct vergeleken met het intacte weefsel, wat leidde tot een gebrek aan volledig begrip van de relatie tussen mechanica en microstructuur. Ten tweede werd de collageenvezelarchitectuur van de samengestelde lagen niet onderzocht. Ten derde werden alleen de lagen van de TVAL onderzocht vanwege problemen met het verzamelen van de samengestelde lagen uit de andere twee tv-folders. De hierin beschreven methode biedt een holistisch karakteriseringskader dat deze beperkingen overwint en volledige karakteriseringen van de tv-folders en hun samengestelde lagen biedt.
Dit artikel beschrijft de microdissectietechniek die de drie tv-folders scheidt in hun samengestelde lagen (A / S en F / V) voor biaxiale mechanische en microstructurele karakteriseringen 10,11,12. Dit iteratieve protocol omvat (i) biaxiale mechanische testen en pSFDI-karakterisering van de intacte folder, (ii) een nieuwe en reproduceerbare microdissectietechniek om op betrouwbare wijze de samengestelde tv-lagen te verkrijgen, en (iii) biaxiaal mechanisch testen en pSFDI-karakterisering van de samengestelde tv-lagen. Het weefsel werd blootgesteld aan biaxiale trekbelasting met verschillende krachtverhoudingen voor mechanisch testen. Vervolgens werd pSFDI gebruikt om de oriëntatie en uitlijning van collageenvezels bij verschillende geladen configuraties te bepalen. pSFDI behoudt de native collageenvezelarchitectuur, maakt belastingsafhankelijke analyse mogelijk en omzeilt de typische noodzaak om weefsel te fixeren of te verwijderen voor collageenvezelarchitectuuranalyse, zoals bij beeldvorming van de tweede harmonische generatie of lichtverstrooiing onder een kleine hoek. Ten slotte werden de weefsels bereid met behulp van standaard histologische technieken om de weefselmicrostructuur te visualiseren. Dit iteratieve en holistische raamwerk maakt de directe vergelijking mogelijk van de mechanische en microstructurele eigenschappen van de tv-folder met de samengestelde lagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hierin beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Oklahoma. Dierlijke weefsels werden verkregen van een usda-goedgekeurd slachthuis.
1. Biaxiale mechanische karakterisering
- Weefselvoorbereiding
- Haal een tv-folder uit de vriezer, scheermesjes, een chirurgische pen, een tang, een pipet met gedeïoniseerd (DI) water en een snijmat. Ontdooi de tv-folder met 2-3 druppels DI-water op kamertemperatuur.
OPMERKING: DI-water wordt gebruikt in plaats van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om PBS-geïnduceerde problemen voor de laagmicrodissectie te voorkomen. - Leg het monster plat op de snijmat met de ventriculaireislaag (d.w.z. het oppervlak met de chordae-inbrengingen) naar boven gericht. Plaats het monster zo dat de radiale richting uitlijnt met de Y-richting en de omtrekrichting uitlijnt met de X-richting.
OPMERKING: De omtrekrichting is gericht langs de omtrek van de klep. - Onderzoek de chordae inbrenglocaties van het weefsel. Bepaal een gebied, idealiter ~ 12 x 12 mm, met de minste hoeveelheid grote chordae-inserties terwijl extreem dunne (d.w.z. transparante) gebieden worden vermeden (figuur 1).
- Draai het monster om zodat het atriale oppervlak (d.w.z. het oppervlak zonder chordae-inserties) naar boven is gericht. Zorg ervoor dat de circumferentiële en radiale deelrichtingen uitgelijnd blijven met respectievelijk de X- en Y-as.
- Snijd een vierkant monster van 12 x 12 mm uit het deeldeelweefsel dat de grote chordae-inbrengingen of dunne gebieden vermijdt die in stap 1.1.3 zijn geïdentificeerd. Verwijder de bijgesneden delen van het deelblaadjespapier met de tang en plaats ze in een afvalcontainer.
- Als het niet mogelijk is om grote chordae-inserties volledig te vermijden, snijdt u de weefsels zo dat ze langs de rand van het vierkante exemplaar liggen. Het vermijden van chordae-inserties is belangrijk omdat het problemen voor de latere microdissectie helpt voorkomen.
- Gebruik een chirurgische pen om een kleine stip in de rechterbovenhoek te plaatsen om de oriëntatie van het monster te volgen. Laat de inkt ongeveer 30 s drogen.
- Draai het monster om met het ventriculaire oppervlak (d.w.z. het oppervlak met chordale inserties) naar boven gericht. Snijd de koraalaanhechtingen op de achterkant van het weefsel door de chordae uit de bijsluiter te rekken en een scheermesje te gebruiken om in de buurt van de inbrenglocatie te snijden. Draai het monster opnieuw om zodat het atriale oppervlak (d.w.z. het gladde oppervlak) naar boven is gericht.
- Haal een tv-folder uit de vriezer, scheermesjes, een chirurgische pen, een tang, een pipet met gedeïoniseerd (DI) water en een snijmat. Ontdooi de tv-folder met 2-3 druppels DI-water op kamertemperatuur.
- Diktemeting
- Haal een contactloze laserverplaatsingssensor op. Nul de verplaatsingssensor op een plat gedeelte van de snijmat in de buurt van het bijgesneden weefsel.
LET OP: Laat de laser niet direct in de ogen schijnen. - Plaats de laser over het centrale gebied van het monster. Verwijder lucht die vastzit onder het oppervlak van de folder, omdat dit meetfouten kan veroorzaken. Om opgesloten lucht vrij te maken, gebruikt u een pincet om de bel naar de rand van het weefsel te duwen of tilt u een hoek van het weefsel op.
- Noteer de dikte die wordt weergegeven op het display van de verplaatsingssensor. Herhaal nog twee metingen op andere locaties van het monster.
- Bereken de gemiddelde bladdikte met behulp van de drie metingen die in de vorige stap zijn geregistreerd. Gebruik deze waarde bij het maken van de biaxiale mechanische karakteriseringsprotocollen.
- Haal een contactloze laserverplaatsingssensor op. Nul de verplaatsingssensor op een plat gedeelte van de snijmat in de buurt van het bijgesneden weefsel.
- Biaxiale testeropstelling en weefselmontage
- Bereid een DI-waterbad bij 37 °C voor, volgens de richtlijnen van het testsysteem, om de temperatuur onder in vivo fysiologische omstandigheden te garanderen.
- Haal een tang, het weefselmonster, bevestigingsmateriaal, een gereedschap met fijne punt, vloeibare cyanoacrylaatlijm en zwartgeverfde glaskralen (diameter: 300-500 μm) op.
OPMERKING: Bevestigingsmateriaal omvat de tanden, de montagebrug en het montagerubber. - Monteer het weefselmonster op het testsysteem. Zorg ervoor dat de omtrekrichting van het weefsel overeenkomt met de X-richting, die kan worden bijgestaan door de stip die eerder in stap 1.1.6 is geplaatst.
OPMERKING: De tanden die hier worden gebruikt, moeten gelijkmatig over de gehele lengte van de weefselrand worden verdeeld. De effectieve randlengte is ingesteld op 10 mm voor het intacte weefsel en >3,3 mm voor de composietlagen.
- Fiduciale marker plaatsing
- Identificeer het centrale een derde vierkante gebied van het gemonteerde weefsel. Gebruik de geschatte hoeken van dit gebied voor de plaatsing van de fiduciale markering.
- Plaats glazen kralen in een open weegboot en maak een kleine plas vloeibare cyanoacrylaatlijm in een aparte weegboot. Bedek de bovenkant van het gereedschap met fijne punt met een kleine hoeveelheid lijm. Dep overtollige lijm aan de zijkant van de weegboot.
- Maak een hoek van de centrale vierkante array van een derde door de met lijm bedekte punt voorzichtig op het weefsel te drukken. Pak met een tang een glazen kraal en plaats deze voorzichtig op de lijmpunt. Gebruik de camera van het biaxiale testapparaat voor hulp bij het plaatsen van de kraal.
- Herhaal stap 1.4.2 en 1.4.3 voor drie extra kralen totdat de vierkante array is voltooid. Zorg ervoor dat de kralen stevig zijn bevestigd en dat hun respectieve lijmpunten elkaar niet raken of aan elkaar plakken. Droog de lijm voordat je het weefsel in het waterbad laat zakken.
- Als de kralen aan elkaar zijn geplakt, wacht dan tot de lijm is opgedroogd en gebruik vervolgens de tang om de kraal of lijm voorzichtig vast te pakken en van het weefsel te trekken.
OPMERKING: De lijm en kraal(s) moeten loskomen, zodat de kraalplaatsing opnieuw kan worden geattempt.
- Als de kralen aan elkaar zijn geplakt, wacht dan tot de lijm is opgedroogd en gebruik vervolgens de tang om de kraal of lijm voorzichtig vast te pakken en van het weefsel te trekken.
- Voorconditionering
- Maak een krachtgestuurd voorconditioneringsprotocol, waarbij het weefsel met randlengte en -dikte zes herhalingen van equibiaxiale belasting ondergaat tot een piekmembraanspanning T-piek van 40 N / m met een voorspanning van 3% × T-piek10 en rek- en hersteltijden van elk 30 s.
- Stel een willekeurige testmap samen waarin de gegevens tijdelijk worden opgeslagen voor toekomstige berekeningen. Stel de laadsnelheid in op 4,42 N/m.
- Maak een nieuwe testparameterset met de naam Preconditioning0. Stel de besturingsmodi X-as en Y-as in op forceren en stel de besturingsfuncties in op stap. Definieer de belastingsomvang als de kracht geassocieerd met T-piek, d.w.z. fpeak = Tpeak · L. Definieer de voorspanningsgrootheid als 3% van def-piek alleen voor de eerste herhaling en definieer zowel de rekduur als de herstelduur als 30 s. Definieer het aantal herhalingen als 10.
OPMERKING: De berekende piek eerste Piola-Kirchhoff stress, d.w.z. Ppiek = Tpiek / t, kan hoger zijn dan 200 kPa voor dunnere weefsels, wat kan resulteren in weefselscheuren tijdens het testen. In deze scenario's werd de piekmembraanspanning aangepast naar een maximale eerste Piola-Kirchhoff-spanning van 200 kPa.
- Voer het preconditioningprotocol uit. Noteer na de voorconditionering de huidige X- en Y-afmetingen van het monster voor gebruik in de biaxiale testprotocollen.
- Maak een krachtgestuurd voorconditioneringsprotocol, waarbij het weefsel met randlengte en -dikte zes herhalingen van equibiaxiale belasting ondergaat tot een piekmembraanspanning T-piek van 40 N / m met een voorspanning van 3% × T-piek10 en rek- en hersteltijden van elk 30 s.
- Creatie en uitvoering van biaxiale testprotocollen
- Bepaal de tijd die nodig is om de piek equibiaxiale configuratie te bereiken van de post-preconditioned configuratie met de gewenste verplaatsingssnelheid. Uitgaande van een constante verplaatsingssnelheid, berekent u de laadtijden voor de resterende laadverhoudingen (d.w.z. TXX: TYY = 1: 0,5 en TXX: TYY = 0,5: 1).
- Jog de lineaire actuatoren handmatig om de doelkrachten voor een bepaalde belastingsverhouding aan te passen. Herhaal dit proces en noteer de folderafmetingen voor alle laadverhoudingen.
- Bereid een verplaatsingsgestuurd testprotocol voor dat het weefsel biaxiaal verplaatst van de post-geconditioneerde configuratie naar de configuraties die zijn vastgelegd in stap 1.6.2 (d.w.z. TXX: TYY = 1: 1, 1: 0.5, 0.5: 1) binnen de tijden bepaald in stap 1.6.1. Zorg ervoor dat elk protocol drie laad- en loscycli heeft voor herhaalbaarheid van het mechanische gedrag.
- Stel een testmap samen waarin de gegevens worden opgeslagen voor toekomstige berekeningen. Zorg ervoor dat de mapnaam overeenkomt met het huidige exemplaar.
- Stel een nieuwe testparameterset samen met de naam 1:1, stel de besturingsmodi X-as en Y-as in op verplaatsing en stel de besturingsfuncties in op helling. Definieer de rekgrootte als de configuratie die is vastgelegd in stap 1.6.1. Definieer de preload magnitude als 3% van fpiek voor alleen de eerste herhaling, en definieer zowel de duur van de rek als de herstelduur als de tijd die is vastgelegd in stap 1.6.1. Definieer het aantal herhalingen als 3.
- Herhaal stap 1.6.3.2 voor de resterende belastingsverhoudingen (d.w.z. TXX:TYY = 1:0.5 en TXX:TYY = 0,5:1), behalve het definiëren van de voorspanningsgrootheid als niet toegepast. Zorg ervoor dat de omvang van de rek, de duur van de rek en de herstelduur overeenkomen met die welke zijn vastgelegd in stap 1.6.2.
OPMERKING: Alleen gegevens van de laatste (derde) cyclus worden gebruikt voor stress- en spanningsanalyses.
- Voer de verplaatsingsgestuurde protocollen uit. Na voltooiing van biaxiaal testen, keert u het weefsel terug naar zijn vooraf geconditioneerde afmetingen.
OPMERKING: De test moet onmiddellijk worden afgebroken als het weefsel begint te scheuren.
- Verdere karakteriseringen
- Laat het weefsel ondergedompeld in DI-water en gemonteerd op het biaxiale testsysteem. Voer pSFDI-beeldvorming uit zoals beschreven in stap 2.1-2.3.
- Monteer het weefsel. Als het een intact weefsel is, ga dan verder met de microdissectie beschreven in stap 3.1-3.7. Zo niet, verzamel dan histologie volgens stap 3.7.
OPMERKING: Het DI-waterbad kan binnen dezelfde dag worden gebruikt voor volgende karakteriseringen. - Herhaal stap 1.2-1.7 met de A/S- en F/V-lagen die zijn verkregen na de microdissectie (stappen 3.1-3.6).
OPMERKING: De herhaling van het testprotocol voor de lagen maakt een directe vergelijking van het intacte weefsel met zijn eigen lagen mogelijk.
- Biaxiale testgegevens na verwerkingsprocedures
- Voer digitale beeldcorrelatie uit van de verkregen biaxiale testbeelden om de tijdsafhankelijke markeringsposities te bepalen. Bereken de fiduciale markerverplaatsingen via Eq (1). 5
(1)
Hierin zijn xi(t), Xi en di(t) de tijdsafhankelijke locatie, de initiële (referentie)locatie en de verplaatsing van marker i. - Bereken de vervormingsgradiënt F door de fiduciale markers te beschouwen als een bilineair eindig element met vier knooppunten, zoals weergegeven in Eq (2)5
(2)
Waarbij BXi en BYi de afgeleiden zijn van de vormfuncties voor knooppunt i in respectievelijk de X- en Y-richting, en ui(t) en vi(t) de componenten van di(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T. - Bereken de toegepaste eerste Piola-Kirchhoff spanning P met behulp van de opgenomen krachten, zoals in Eq (3)5
(3)
PXX en PYY zijn de X- en Y-componenten van P; L en t zijn de lengte en dikte van de weefselrand; fX en fY zijn de krachten die in de X- en Y-richting zijn geregistreerd. - Bepaal indien nodig andere spannings- en stressmaatregelen,13 waaronder de juiste Cauchy-Green vervorming C = FT/F, de Green-Lagrange stam E = (C - I)/2, de Cauchy stress σ = J-1PFT en de tweede Piola-Kirchhoff spanning S = F-1P.
OPMERKING: Hierin is I een tweede-orde identiteitstensor en J = det(F) is de Jacobiaan van de vervormingsgradiënt F.
- Voer digitale beeldcorrelatie uit van de verkregen biaxiale testbeelden om de tijdsafhankelijke markeringsposities te bepalen. Bereken de fiduciale markerverplaatsingen via Eq (1). 5
(1)
(2)
(3)2. Gepolariseerde ruimtelijke frequentie domein beeldvorming
- Systeemvoorbereiding
OPMERKING: Indien gewenst kunnen de fiduciale markers voorafgaand aan de volgende stappen uit het weefsel worden verwijderd.- Centreer het pSFDI-apparaat over het monster (figuur 2). Schakel de projector in en verlicht het monster met 490 nm (cyaan) licht.
- Open de camerasoftware en inspecteer het gezichtsveld van de camera. Zorg ervoor dat het monster gecentreerd is in het frame en volledig in het gezichtsveld is opgenomen.
- Als het gemonteerde monster een intacte folder is, past u de helderheid van de DLP-projector (Digital Light Processing) aan om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig wordt verlicht zonder verblinding op het weefseloppervlak. Pas de helderheid niet aan als het monster een van de samengestelde lagen is.
- Draai de polarisator over het volledige bewegingsbereik om mogelijke schitteringen of vuil op de polarisatorlens te detecteren. Reinig de polarisatorlens indien nodig zorgvuldig met een microvezeldoek.
- Dataverzameling
OPMERKING: De volgende gegevensverzameling kan worden geautomatiseerd met behulp van software, zoals LabVIEW of Python.- Verplaats de polarisator naar zijn thuispositie - ideaal uitgelijnd met een van de biaxiale testassen. Leg één grijswaardenafbeelding vast en sla deze op de computer op met de polarisatorlocatie (d.w.z. 0°).
- Draai de polarisator 5° en leg een ander grijswaardenbeeld vast. Herhaal dit proces om 37 beelden te verkrijgen die variëren van 0° tot 180° met een toename van 5°.
OPMERKING: De beelden van de eerste pSFDI-beeldvormingssequentie kunnen voorlopig worden geanalyseerd om de gewenste optische respons van het weefsel te garanderen. Raadpleeg stap 2.3 voor instructies. - Herhaal de pSFDI-beeldvormingssequentie voor andere gewenste weefselconfiguraties, bijvoorbeeld de piekconfiguraties van de belastingsprotocollen die worden overwogen voor biaxiaal mechanisch testen.
- Procedures voor de naverwerking van pSFDI-gegevens
OPMERKING: De volgende methode bevat stappen voor de MATLAB-programmataal. In plaats daarvan kan echter elke voorkeurstaal (bijv. Python, C ++) worden gebruikt.- Gebruik de functie MATLAB imread() om arrays samen te stellen die de pixelgewijze intensiteiten van de 37 verkregen afbeeldingen bevatten. Rangschik deze voor het gemak als een n × m × 37 driedimensionale array, waarbij n en m de aantallen pixels langs de twee assen zijn.
- Definieer het gewenste weefselgebied (ROI) met behulp van de door de gebruiker gedefinieerde grabit() -functie.
- Pas de intensiteit versus polarisatorhoekgegevens voor elke ROI-pixel aan met behulp van een Fourier-reeks van 3 termijnen, zoals in Eq (4):
(4)
Hierin is I(θ) de pixelgewijze intensiteit als functie van de polarisatiehoek, en bi zijn de Fourierconstanten. Gebruik standaard lineaire kleinste-kwadraten regressie om bi te bepalen. - Bepaal de pixelgewijze vezeloriëntatie als de polarisatiehoek die wordt geassocieerd met de maximale waarde van I(θ). Bereken de mate van optische anisotropie (DOA) via Eq (5).
(5) - Gebruik plot() en histogram() om de verworven vezeloriëntatie en DOA-waarden te visualiseren. Sla de verwerkte resultaten op voor later gebruik.
(4)
(5)3. Microdissectie van tricuspidalisklepfolder composietlagen
- Weefselaanhechting aan wasbord
- Verzamel de benodigde materialen: wasbord, DI-water, pipet, scalpel, microschaar, dunne tang, gebogen tang, dikke tang en pinnen.
OPMERKING: Gebruik alleen een pincet zonder tanden of grepen, omdat een tang van dit type heel gemakkelijk het dunne weefsel van de A / S-laag kan scheuren bij het uitvoeren van de dissectie. - Ontkoppel het weefsel van de biaxiale tester en meet de dikte met behulp van de laserverplaatsingssensor die in stap 1.2 wordt beschreven. Leg het doekje op de wasplank.
- Onderzoek de ventriculaire kant van het weefsel op grote chordae inserties. Noteer de positie van deze inserties om ze tijdens de dissectie te vermijden (aanvullende figuur S1). Maak een foto ter referentie.
- Spreid het weefsel plat op de wasplank met de atrialis naar boven gericht. Bevestig het weefsel op het bord met behulp van de pinnen:
- Plaats in elke hoek van het weefsel een pin die schuin van het weefsel af staat (voor een beter zicht) en het weefsel iets strak trekt (figuur 3A). Doe dit met de klok mee of tegen de klok in. Zorg ervoor dat de pinnen zich buiten de gaten bevinden die door de tanden zijn gemaakt bij het monteren van het weefsel.
- Pas de plaatsing van de pin iets aan om ervoor te zorgen dat het weefsel strak en in een vierkante configuratie is (figuur 3B) zodat het weefsel plat ligt en niet verschuift tijdens de microdissectie van de laag.
- Plaats indien nodig pinnen langs de zijkant van het weefsel tijdens de dissectie om het weefsel meer uit te rekken. Houd er bij het plaatsen en hengelen van extra pinnen rekening mee dat deze tijdens de dissectie moeten worden bewerkt.
- Verwijder de fiduciale markers van de glaskraal.
OPMERKING: De volgende stap is optioneel. Het toegevoegde DI-water helpt de weefselhydratatie te behouden en voorkomt dat het weefsel tijdens de microdissectie aan zichzelf kleeft. - Plaats met behulp van een pipet DI-water op het oppervlak van het weefsel, zodat het het weefsel op een belachtige manier volledig bedekt. Vul het DI-water indien nodig aan tijdens de dissectie.
- Verzamel de benodigde materialen: wasbord, DI-water, pipet, scalpel, microschaar, dunne tang, gebogen tang, dikke tang en pinnen.
- Maak de eerste hoek.
- Selecteer een hoek van het vastgemaakte exemplaar om de dissectie te starten. Vermijd grote chordae inserties en extreem dunne gebieden.
- Maak een snede in de A/S-laag door het scalpel lichtjes over het weefseloppervlak langs de montagegaten van mechanische tests te slepen (figuur 3C). Zorg ervoor dat de snede minstens 5 mm lang is en dat de randen van de snede uit elkaar beginnen te trekken, waardoor de F/V-laag eronder zichtbaar wordt.
- Gebruik de dunne tang (zonder scherpe punt) om stevig langs de snede te wrijven en de randen van de snede uit elkaar te trekken (Supplemental Figure S2).
- Als de snee in de A/S-laag niet uit elkaar begint te trekken, trek dan met het scalpel lichtjes over dezelfde snede totdat deze dit begint te doen. Zorg ervoor dat u niet te diep in het weefsel snijdt (voorbij de A / S-composietlaag), omdat dit het moeilijker maakt om de lagen schoon te scheiden.
- Herhaal stap 3.2 en 3.2.3 om een tweede snede loodrecht op de eerste snede te maken (figuur 3D). Zorg ervoor dat de twee sneden met elkaar verbonden zijn en een hoek vormen.
- Als de twee sneden niet met elkaar verbonden zijn, laat u het dunne pincet onder het kleine gebied van weefsel dat de twee sneden scheidt (aanvullende figuur S3). Gebruik vervolgens voorzichtig de schaar om het weefsel te knippen.
- Haal het weefsel uit de hoek.
- Wrijf langs de sneden met behulp van de dunne tang totdat het weefsel begint te scheiden van de F / V-laag. Zodra een klein stukje weefsel is gescheiden, pak je het vast met het pincet en trek je het voorzichtig om de samengestelde lagen verder te scheiden.
OPMERKING: Plaats de punt van het dunne pincet altijd langs de rand van het weefsel tijdens het vastpakken. Anders zouden ze per ongeluk een gat in de A / S-composietlaag kunnen prikken. - Blijf het weefsel afpellen en wrijf over de naad totdat deze het einde van de twee sneden voor de hoek bereikt. Schakel tijdens dit proces over op een groter pincet om het weefsel vast te pakken voor het peelingproces om ongewenst scheuren en scheuren van de A / S-composietlaag te voorkomen.
- Als de eerste poging tot bocht grote problemen heeft met de scheiding, probeer dan een andere hoek als uitgangspunt (ga terug naar stap 3.2).
- Wrijf langs de sneden met behulp van de dunne tang totdat het weefsel begint te scheiden van de F / V-laag. Zodra een klein stukje weefsel is gescheiden, pak je het vast met het pincet en trek je het voorzichtig om de samengestelde lagen verder te scheiden.
- Strek sneden uit, pel het weefsel en maak een tweede hoek.
- Verleng de twee sneden die voor de eerste hoek zijn gemaakt door de scalpelpunt aan de onderkant van elke snede te plaatsen en deze lichtjes langs het weefseloppervlak te slepen (figuur 4A). Zorg ervoor dat alle verlengstukken ten minste 5 mm zijn en dat de gesneden verlengstukken aansluiten op de originele sneden en de tand- of hechtgaten blijven volgen.
OPMERKING: Als de extensiesnede te diep is, moet de komende peeling nauwlettend worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat delen van de fibrosa niet worden gescheiden met de A / S-composietlaag (figuur 5A). - Blijf de sneden verlengen en pel de bovenste composiet A / S-laag terug terwijl u over de naad wrijft totdat één kant klaar is. Merk op dat het weefsel volledig wordt gescheiden langs één snede; ervoor zorgen dat de naad tussen de A/S- en F/V-composietlagen recht is (figuur 4B).
- Herhaal de instructies in stap 3.2 en stap 3.3 om een tweede hoek loodrecht op het einde van de volledig geschilde zijde te maken (figuur 4C).
- Verleng de twee sneden die voor de eerste hoek zijn gemaakt door de scalpelpunt aan de onderkant van elke snede te plaatsen en deze lichtjes langs het weefseloppervlak te slepen (figuur 4A). Zorg ervoor dat alle verlengstukken ten minste 5 mm zijn en dat de gesneden verlengstukken aansluiten op de originele sneden en de tand- of hechtgaten blijven volgen.
- Scheid de A/S-laag volledig.
- Verleng de resterende sneden terwijl u grote chordae-inbrengingen vermijdt. Ga door met het scheiden van de A/S- en F/V-lagen door gebruik te maken van de wrijf- en trektechnieken die voor de eerste bocht worden gebruikt. Noteer verschillende overwegingen of problemen die zich tijdens dit proces kunnen voordoen:
- Sluit de chordae-inserties van het A/S-scheidingsgebied (figuur 5B) alleen uit wanneer deze uitsluiting een A/S-monster mogelijk maakt dat groot genoeg is voor experimentele karakteriseringen (>3,3 mm).
- Als het weefsel scheurt of een gat vormt, stop dan onmiddellijk met het scheiden van het weefsel. Om te voorkomen dat een pincet wordt gevangen, plaatst u de schaar in een gat dat zich vormt en snijdt u het weefsel weg van het midden. Als het defect zich vormt langs de scheidingsnaad, begin dan met het scheiden van het weefsel langs een andere rand om verder scheuren te voorkomen (figuur 5C).
- Zoek naar verbindingen tussen de lagen die kunnen verschijnen tijdens het scheiden van het weefsel en voorkom verdere scheiding van het weefsel zonder een hoog risico op scheuren (figuur 5D). Let op: dit zijn dunne maar sterke strengen die zorgvuldig met een schaar moeten worden geknipt. Vermijd het maken van een gat in de A/S-laag of het naar beneden snijden in de F/V-laag, omdat dit een ongelijke scheiding zou veroorzaken.
- Ga door met dit proces totdat het grootst mogelijke monster van de A/S-laag is gescheiden. Markeer de oriëntatie van het monster met de chirurgische pen (figuur 6A).
- Verleng de resterende sneden terwijl u grote chordae-inbrengingen vermijdt. Ga door met het scheiden van de A/S- en F/V-lagen door gebruik te maken van de wrijf- en trektechnieken die voor de eerste bocht worden gebruikt. Noteer verschillende overwegingen of problemen die zich tijdens dit proces kunnen voordoen:
- Maak de dissectie af.
- Gebruik de schaar om langs de scheidingsnaad voor de resterende weefselrand te knippen (figuur 6B). Zorg ervoor dat deze snede zo dicht mogelijk bij de scheidingsnaad zit.
- Leg de gescheiden A/S composietlaag plat op de snijmat. Gebruik indien nodig het scalpel om de randen van het weefsel recht te trekken en een vierkante weefselvorm te creëren die geschikt is voor biaxiaal mechanisch testen. Plaats de A/S-laag in DI-water totdat deze klaar is om te worden getest.
- Markeer de oriëntatie van de F/V-laag die op het wasbord achterblijft. Snijd het grootst mogelijke vierkant uit het gebied waar de A/S-laag is verwijderd (figuur 6C) en plaats het vervolgens in DI-water.
- Histologie
- Snijd twee stroken weefsel weg - uitgelijnd met de omtrek- en radiale richtingen - voor gebruik in de histologie. Gebruik verschillende protocollen voor de intacte en de samengestelde lagen (d.w.z. A / S en F / V).
- Voor de intacte laag, neem de exemplaren van het weefsel dat op het wasbord blijft vastgepind. Gebruik het weefsel buiten de tand-/hechtgaten, omdat dit deel van het weefsel niet is ontleed en de intacte folder vertegenwoordigt.
- Verzamel voor de A/S- en F/V-composietlagen alleen histologiemonsters nadat ze volledig zijn getest en gebeeldhouwd. Maak het monster los van het biaxiale testsysteem, leg het weefsel plat op een snijmat en snijd de omtrek- en radiale strips weg met een scheermesje.
- Plaats de weggesneden strips in weefselcassettes en dompel de cassettes onder in 10% formaline.
- Gooi het resterende weefsel weg. Reinig de snijgereedschappen met reinigingsmiddel (zie de tabel met materialen).
- Breng na 24-48 uur fixatie de cassettes over naar ethanol, waar ze voor onbepaalde tijd kunnen worden bewaard tot histologieverwerking en kleuring.
OPMERKING: Deze histologische analyse kan bevestigen dat de microdissectie succesvol is. LET OP: 10% formaline veroorzaakt huidirritatie en ernstig oogletsel. Het kan ook een allergische reactie of kanker veroorzaken door inademing. Draag bij het hanteren geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, een bril en een laboratoriumjas, en gebruik deze alleen in goed geventileerde ruimtes, zoals in een zuurkast. Wanneer de opslagcontainer niet in gebruik is, zorg er dan voor dat deze goed gesloten is.
- Snijd twee stroken weefsel weg - uitgelijnd met de omtrek- en radiale richtingen - voor gebruik in de histologie. Gebruik verschillende protocollen voor de intacte en de samengestelde lagen (d.w.z. A / S en F / V).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De microdissectie levert A/S- en F/V-monsters op met relatief uniforme diktes die op een (commercieel) biaxiaal testapparaat kunnen worden gemonteerd. Histologische analyse van de intacte folder en de twee ontleedde lagen zal controleren of het weefsel correct werd gescheiden langs de grens tussen de spongiosa en fibrosa (figuur 7). Bovendien kunnen de histologiemicrografieën worden gebruikt om de weefsellaagdiktes en samenstellende massafracties te bepalen met behulp van ImageJ-software. Een mislukte dissectie treedt op wanneer het een A/S-monster produceert dat te klein is voor montage op de biaxiale tester. Dit gebeurt meestal wanneer de A / S scheurt tijdens het pellen, of wanneer er een gat ontstaat in de F / V-laag als gevolg van dikke chordae.
De verplaatsingsgecontroleerde mechanische tests en nabewerkingen produceren stress-rekgegevens die het niet-lineaire mechanische gedrag van het weefsel beschrijven (figuur 8). De monsters zijn over het algemeen anisotroop, waarbij de richting van het omtrekweefsel een stijvere mechanische respons heeft dan de radiale weefselrichting (tabel 1). Deze eigenschappen met een lage treksterkte en hoge treksterkte kunnen kwantitatief worden bepaald met behulp van aanvullende analysetechnieken 6,14. Het collectief beoordelen van het bereik van biaxiale krachtverhoudingen geeft extra inzicht in de directionele koppeling van het weefsel (d.w.z. de X-askracht is afhankelijk van de Y-askracht en vice versa). Het is belangrijk op te merken dat het mechanische gedrag van één weefselrichting in deze verschillende krachtverhoudingen drukvervormingen kan vertonen tijdens niet-klinische vervormingen. Dit unieke gedrag ontstaat meestal als gevolg van sterk uitgelijnde collageenvezels langs de richting van het drukweefsel.
De pSFDI-gegevens leveren kleurenkaarten op van de collageenvezeloriëntatie en DOA (figuur 9). In het bijzonder bieden deze kleurenkaarten een uitgebreid inzicht in de collageenvezelarchitectuur in het hele weefselmonster. Een uniek voordeel van de niet-destructieve pSFDI-techniek is de mogelijkheid om de resultaten over verschillende belastingsconfiguraties te vergelijken en te begrijpen hoe de collageenvezels zich heroriënteren en uitzetten / uitlijnen om de toegepaste belasting te ondersteunen. Deze resultaten zijn suboptimaal als het geprojecteerde licht te helder of donker is tijdens de beeldvorming, als het geprojecteerde licht niet consistent wordt gehouden over de intacte folder en de lagen ervan, als er grote bellen of puin op het monster zijn, als er te veel lijm op het weefsel zit van fiduciale markerplaatsing, of als het niveau van het waterbad te laag wordt en precieze punten van fel licht creëert. Ze leiden allemaal tot onnauwkeurige weergaven van de gereflecteerde intensiteit versus polarisatorhoekgegevens, die interfereren met de bepaalde vezeloriëntatie en berekende DOA.
Figuur 1: Selectie van het microdissectiegebied. (A) Identificatie van te vermijden probleemgebieden en (B) doelgebied voor de laagmicrodissectie. Schaalbalk = 10 mm (A, B). Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het pSFDI-systeem is geïntegreerd met het biaxiale testapparaat. De belangrijkste onderdelen van beide apparaten zijn gelabeld. Afkortingen: pSFDI = polarized spatial frequency domain imaging7; DLP = digitale lichtverwerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Initiatie van de foldermicrodissectie. (A) Het weefsel strak uitrekken tijdens het plaatsen van pennen, (B) het vastgepinde weefsel klaar voor microdissectie, (C) het maken van de eerste snede in de A/S-composietlaag en (D) het creëren van de eerste hoek van sneden in de A/S-composietlaag. Schaalstaven = 10 mm. Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek; A/S = atrialis/spongiosa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Scheiding van de A/S composietlaag. (A) Uitbreiding van de sneden in de A/S composietlaag, (B) scheiding van de A/S composietlaag door zorgvuldig afbladderen, en (C) creatie van de tweede hoek. Schaalbalk = 10 mm. Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek; A/S = atrialis/spongiosa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Mogelijke problemen tijdens de foldermicrodissectie. (A) Mislukte scheiding van de A/S- en F/V-composietlagen, (B) aanpassing van het microdissectiegebied om chordae-inbrengingen te voorkomen, (C) het creëren van een nieuwe scheidingsnaad als gevolg van ongewenst gat, en (D) tussenlaagverbinding die de A/S- en F/V-composietlagen verbindt. Schaalstaven = 5 mm (A-C), 10 mm (D). Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek; A/S = atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventriculaireis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voltooiing van de microdissectie. (A) Aantekening van de rechterbovenhoek voor oriëntatie, (B) scheiding van de A/S met behulp van een schaar en (C) ophalen van de F/V-composietlaag met oriëntatie gemarkeerd. Schaalbalk = 10 mm Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek; A/S = atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventriculaireis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Histologische beoordeling. Microfoto's met omtrekdoorsneden van de (A) intacte deelblaadjes en (B) goed gescheiden A/S- en F/V-lagen. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventriculaireis; VIC = valvulaire interstitiële cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Representatieve biaxiale mechanische testresultaten voor de equibiaxiale belastingsverhouding. Membraanspanning versus rekgegevens van de (A) tricuspidalisklep anterieure folder, (B) tricuspidalisklep achterste folder en (C) tricuspidalisklepseptumfolder. Afkortingen: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventriculaireis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Representatieve pSFDI-resultaten. (A) Onbewerkt beeld van de folder tijdens pSFDI-beoordeling, (B) gekwantificeerde vezeloriëntatie weergegeven via de kleurenkaart en (C) gekwantificeerde mate van optische anisotropie, weergegeven via de kleurenkaart, die de vezeluitlijning aangeeft. De pijlen geven gebieden aan met overtollige lijm van de fiduciale markers. De bovenste rij toont goede afbeeldingen, terwijl de onderste rij slechte afbeeldingen laat zien. Schaalstaven = 4 mm. Afkortingen: deg. = graden; DOA = mate van optische anisotropie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Samengestelde laag | λcirkel | λrad |
| A/S | 1,26 ± 0,05 | 1,37 ± 0,05 |
| F/V | 1,17 ± 0,03 | 1,32 ± 0,08 |
Tabel 1: Gemiddelde samengestelde laag strekt zich uit. De gemiddelde piekstroken van de samengestelde lagen tonen de verwachte variaties in het mechanische gedrag. Deze tabel is samengesteld uit 9. Afkortingen: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventriculaireis.
Aanvullende figuur S1: Identificatie van gebieden die moeten worden vermeden tijdens microdissectie. (A) Het onderzoeken van de ventriculaire kant van het weefselmonster op chordae-inserties, (B) het volgen van moeilijke gebieden wanneer weefsel wordt geplaatst met atrialis naar boven gericht, en (C) het plannen van initiële sneden om geïdentificeerde gebieden te vermijden. Schaalbalk = 10 mm. Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Demonstratie van het wrijven langs sneden. (A) De snede voor het wrijven met een stomp pincet en (B) randen van de snede die meer scheiden na het wrijven. Schaalbalk = 10 mm. Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Niet-verbindende sneden. Pincetten worden gebruikt om het dunne gebied van weefsel te identificeren dat de twee sneden scheidt voordat het weefsel zorgvuldig met een schaar wordt gesneden. Schaalbalk = 10 mm. Afkortingen: Rad. = radiaal; Circ. = omtrek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen voor het protocol zijn: (i) de laagmicrodissectie, (ii) de weefselmontage, (iii) de fiduciale markerplaatsing en (iv) de pSFDI-opstelling. Passende laagmicrodissectie is het belangrijkste en moeilijkste aspect van de hierin beschreven methode. Voordat een onderzoek met behulp van deze techniek wordt gestart, moeten de dissector (en) langdurig oefenen met de microdissectietechniek en alle drie de tv-folders. De dissector moet ervoor zorgen dat de samengestelde laagmonsters voldoende groot zijn (>3,3 mm) en een uniforme dikte hebben. Histologie moet worden gebruikt om te bevestigen dat dissecties consequent een nauwkeurige laagscheiding hebben.
Voor weefselmontage moet het weefsel aan de biaxiale tester worden bevestigd, zodat het weefsel plat is zonder kunstmatige rek of rimpels. Deze fouten zullen resulteren in onnauwkeurige mechanische gegevens. De samengestelde lagen zijn gevoeliger voor deze fouten vanwege hun dunnere aard. Bij het aanbrengen van de fiduciale markers is het van het grootste belang dat de markers in het centrale een derde gebied van het weefsel worden geplaatst en niet aan elkaar hechten. Ongepaste plaatsing van de marker zal resulteren in onnauwkeurige kwantificering van de weefselrekken. Ten slotte moet de door pSFDI geprojecteerde lichthelderheid zorgvuldig worden geselecteerd en ongewijzigd blijven voor het intacte weefsel en de samengestelde lagen. Als de helderheid wordt gewijzigd, kunnen de pSFDI-resultaten niet worden vergeleken tussen het intacte weefsel en de samengestelde lagen.
De flexibiliteit van de hierin beschreven methode ligt voornamelijk in de biaxiale mechanische karakterisering, terwijl het grootste deel van de probleemoplossing ontstaat tijdens de op pSFDI gebaseerde collageenmicrostructurele kwantificering. De verplaatsingsgestuurde testprotocollen bieden twee belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve krachtgestuurde testprotocollen: (i) de spanningsrekcurven zijn vloeiender zonder oscillaties, en (ii) de verplaatsingssnelheid (mm / s) en reksnelheid (% / s) kunnen direct worden geregeld in plaats van de belastingssnelheid (N / m). Het is echter nog steeds noodzakelijk om krachtgestuurde conditionering uit te voeren voorafgaand aan de mechanische karakterisering om herhaalbare krachtverplaatsingscurven te verkrijgen en de weefselconfiguratie te bepalen die equibiaxiale spanningen biedt. Zodra de equibiaxiale configuratie is bepaald, kunnen de andere gewenste belastingsverhoudingen (bijv. TXX: TYY = 1: 0,5 en TXX: TYY = 0,5: 1) worden bepaald door de lineaire actuatoren handmatig te joggen. Dit maakt een zeer nauwkeurige replicatie van de biaxiale spanningen van het doel mogelijk met de extra voordelen van een verplaatsingsgestuurd schema. Bovendien kan dit veelzijdige mechanische testprotocol worden aangepast om rekening te houden met meer belastingsverhoudingen of andere unieke belastingsomstandigheden, zoals pure afschuiving of spanningsontspanning. Aanvullende pSFDI-kwantificering kan worden opgenomen in deze nieuwe protocollen of op verschillende punten langs de laadpaden. Voorafgaand aan het uitvoeren van deze pSFDI-karakteriseringen, is het ongelooflijk belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen schitteringen, bellen of puin op het weefsel zijn. Vaak moet men verschillende oriëntaties van de polarisator, vloeistofhoogte van het PBS-bad of methoden om vuil en bubbels te voorkomen / verwijderen testen om een succesvolle en nauwkeurige pSFDI-kwantificering te garanderen.
Er zijn drie belangrijke beperkingen van de laagmicrodissectie. Ten eerste kan het intacte weefsel alleen worden gescheiden in twee samengestelde lagen, wat betekent dat alle vier de anatomische lagen niet afzonderlijk kunnen worden geïsoleerd. Dit komt omdat het weefsel te dun is om te proberen alle vier de anatomische lagen te scheiden, en het ontbreken van structurele componenten in de spongiosa verhindert de microdissectie ervan. Ten tweede gebruikt dit protocol DI-water in plaats van PBS. Hoewel PBS dichter bij de fysiologische omgevingligt 15, resulteerde het gebruik van PBS tijdens het testen in consistente, mislukte dissecties als gevolg van frequent scheuren van de samengestelde A / S-laag. Het gebruik van DI-water verhoogde onmiddellijk het gemak en het succes van dissecties door de kans op gaten en scheuren in de composiet A / S-laag aanzienlijk te verminderen. Ten derde, hoewel het experimentele protocol is ontworpen om overeenkomende gegevens te leveren tussen de intacte en samengestelde lagen, zijn er merkbare specimen-tot-specimen variabiliteiten in de mechanische en microstructurele eigenschappen (tabel 1). Deze variabiliteit kan de data-analyse enigszins verstoren; onze ervaring9 en uitgebreide studies uit de literatuur 4,5,16,17 tonen echter aan dat het binnen de typische tricuspidalisklep mechanische karakteriseringsresultaten valt.
Het gepresenteerde protocol is om drie belangrijke redenen belangrijk. Ten eerste is dit het enige protocol om de lagen van alle drie de tv-folders met succes te scheiden. Ten tweede maakt de structuur van dit protocol de directe vergelijking mogelijk van de mechanische en collageenvezel architecturale eigenschappen van een intacte tv-folder met zijn samengestelde lagen. Ten derde maakt dit unieke pSFDI-systeem de kwantificering en visualisatie van de belastingsafhankelijke veranderingen in de collageenvezelarchitectuur mogelijk.
Deze laagdissectiemethode kan worden toegepast op extra weefsels met gelaagde morfologie, zoals het oog of de huid. Het gecombineerde mechanisch-structurele karakteriseringskader kan ook worden gebruikt voor weefsels met gevestigde laagscheidingsprocedures, zoals de resterende hartkleppen, slagaders of slokdarmweefsels 18,19,20. Hoewel mechanisch testen een gevestigde rol speelt bij het begrijpen van de mechanische eigenschappen van biologische weefsels, is pSFDI een veel nieuwere ontwikkeling die nog niet volledig is gerealiseerd binnen de biomechanicagemeenschap van zacht weefsel. Dit protocol biedt een nieuwe methode om deze technieken voor biologische weefsels te synthetiseren en meer inzicht te geven in de weefsel-microstructuur relaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) en de Presbyterian Health Foundation. KMC werd gedeeltelijk ondersteund door het Undergraduate Research Opportunity Program van de University of Oklahoma (OU) en het Honors Research Apprenticeship Program. DWL werd gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) en de American Heart Association / Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award # 821298). Al deze steun wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps - Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps - Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps - Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
References
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
- Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
- Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
- Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
- Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
- Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
- Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
- Reddy, J. N. An Introduction to Continuum Mechanics. , Cambridge University Press. (2013).
- Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
- Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
- Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
- Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
- Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
