Summary
Denne protokollen beskriver biaxial mekanisk karakterisering, polarisert romlig frekvens domene imaging-basert kollagen kvantifisering, og mikrodisseksjon av tricuspid ventil brosjyrer. Den medfølgende metoden belyser hvordan brosjyrelagene bidrar til den holistiske brosjyreoppførselen.
Abstract
Trikuspidalklaffen (TV) regulerer den ensrettede strømmen av uoksygenert blod fra høyre atrium til høyre ventrikel. TV-en består av tre brosjyrer, hver med unik mekanisk oppførsel. Disse variasjonene mellom de tre TV-brosjyrene kan forstås ytterligere ved å undersøke deres fire anatomiske lag, som er atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) og ventricularis (V). Selv om disse lagene er til stede i alle tre TV-brosjyrene, er det forskjeller i tykkelsen og mikrostrukturelle bestanddeler som ytterligere påvirker deres respektive mekaniske oppførsel.
Denne protokollen inneholder fire trinn for å belyse de lagspesifikke forskjellene: (i) karakterisere den mekaniske og kollagenfiber arkitektoniske oppførselen til den intakte TV-brosjyren, (ii) skille komposittlagene (A / S og F / V) i TV-brosjyren , (iii) utføre de samme karakteriseringene for komposittlagene, og (iv) utføre post hoc histologisk vurdering. Dette eksperimentelle rammeverket tillater unikt direkte sammenligning av det intakte TV-vevet til hvert av dets sammensatte lag. Som et resultat kan detaljert informasjon om mikrostruktur og biomekanisk funksjon av TV-brosjyrene samles inn med denne protokollen. Slik informasjon kan potensielt brukes til å utvikle TV-beregningsmodeller som søker å gi veiledning for klinisk behandling av TV-sykdom.
Introduction
TV-en er plassert mellom høyre atrium og høyre ventrikel i hjertet. Gjennom hele hjertesyklusen regulerer TV-en den ensrettede blodstrømmen via syklisk åpning og lukking av TV-anterior leaflet (TVAL), TV posterior leaflet (TVPL) og TV-septalbrosjyren (TVSL). Disse brosjyrene er komplekse og har fire forskjellige anatomiske lag - atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) og ventricularis (V) - med unike mikrostrukturelle bestanddeler. Elastinfibrene i atrialis og ventricularis bidrar til å gjenopprette vevet til sin uformede geometri etter mekanisk belastning1. I motsetning til dette inneholder fibrosa et tett nettverk av bølgede kollagenfibre som bidrar til bæreevnen til brosjyrene2. Spongiosa består hovedsakelig av glykosaminoglykaner, og har blitt antatt å muliggjøre skjæring mellom brosjyrelag under hjerteventilfunksjon3. Mens alle tre brosjyretyper har de samme anatomiske lagene, er det variasjoner i tykkelsen på lagene og bestanddelene som har implikasjoner for brosjyrespesifikk mekanisk oppførsel.
Forskere har utforsket egenskapene til TV-brosjyrene ved hjelp av plane mekaniske karakteriseringer, histomorfologiske vurderinger og optiske karakteriseringer av kollagenfiberarkitekturen. For eksempel søker plane biaxiale mekaniske karakteriseringer å etterligne fysiologisk belastning ved å påføre vinkelrette forskyvninger på vevet og registrere de tilknyttede kreftene. De resulterende kraftforskyvningsobservasjonene (eller spenningsstrekk) har vist at alle tre TV-brosjyrene utviser ikke-lineær, retningsspesifikk mekanisk oppførsel med mer åpenbare brosjyrespesifikke responser i radialvevsretningen 4,5,6. Disse brosjyrespesifikke atferdene antas å stamme fra forskjeller i de mikrostrukturelle egenskapene observert ved bruk av standard histologiske teknikker 6,7. Videre har andre harmoniskgenerasjons bildebehandling 6, småvinklet lysspredning8 og polarisert romlig frekvensdomeneavbildning7 (pSFDI) som mål å forstå disse mikrostrukturelle egenskapene og har vist brosjyrespesifikke forskjeller i kollagenfiberorientering og fiberkrymp som har implikasjoner for den observerte mekaniske oppførselen på vevsnivå. Disse studiene har betydelig avansert vår forståelse av vevsmikrostrukturen og dens rolle i vevsnivåadferd. Imidlertid gjenstår mye å bli adressert i eksperimentelt å koble vevsmekanikken og den underliggende mikrostrukturen.
Nylig utførte dette laboratoriet mekaniske karakteriseringer av TV-brosjyrelagene separert i to sammensatte lag (A / S og F / V) ved hjelp av en mikrodisseksjonsteknikk9. Det tidligere arbeidet fremhevet forskjeller i de mekaniske egenskapene til lagene og bidro til å gi innsikt i hvordan den lagdelte mikrostrukturen bidrar til vevsmekanisk oppførsel. Selv om denne undersøkelsen forbedret vår forståelse av mikrostrukturen i TV-brosjyren, hadde teknikken flere begrensninger. For det første ble egenskapene til komposittlagene ikke direkte sammenlignet med det intakte vevet, noe som førte til mangel på fullstendig forståelse av forholdet mellom mekanikk og mikrostruktur. For det andre ble kollagenfiberarkitekturen til komposittlagene ikke undersøkt. For det tredje ble bare lagene i TVAL undersøkt på grunn av vanskeligheter med å samle komposittlagene fra de to andre TV-brosjyrene. Metoden beskrevet her gir et helhetlig karakteriseringsrammeverk som overvinner disse begrensningene og gir komplette karakteriseringer av TV-brosjyrene og deres sammensatte lag.
Denne artikkelen beskriver mikrodisseksjonsteknikken som skiller de tre TV-brosjyrene i deres sammensatte lag (A / S og F / V) for biaxial mekaniske og mikrostrukturelle karakteriseringer 10,11,12. Denne iterative protokollen inkluderer (i) biaksial mekanisk testing og pSFDI-karakterisering av den intakte brosjyren, (ii) en ny og reproduserbar mikrodisseksjonsteknikk for pålitelig å oppnå kompositt-TV-lagene, og (iii) biaxial mekanisk testing og pSFDI-karakterisering av kompositt-TV-lagene. Vevet ble utsatt for biaxial strekkbelastning med ulike kraftforhold for mekanisk testing. Deretter ble pSFDI brukt til å bestemme kollagenfiberorientering og justering ved forskjellige lastede konfigurasjoner. pSFDI bevarer den opprinnelige kollagenfiberarkitekturen, tillater belastningsavhengig analyse og omgår det typiske behovet for å fikse eller fjerne vev for kollagenfiberarkitekturanalyse, for eksempel i andre harmonisk generasjons bildebehandling eller småvinklet lysspredning. Til slutt ble vevene forberedt ved hjelp av standard histologiske teknikker for å visualisere vevsmikrostrukturen. Dette iterative og helhetlige rammeverket muliggjør direkte sammenligning av de mekaniske og mikrostrukturelle egenskapene til TV-brosjyren til komposittlagene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma. Dyrevev ble kjøpt fra et USDA-godkjent slakteri.
1. Biaxial mekanisk karakterisering
- Forberedelse av vev
- Hent en TV-brosjyre fra fryseren, barberblad, en kirurgisk penn, tang, en pipette med avionisert (DI) vann og en skjærematte. Tin TV-brosjyren med 2-3 dråper romtemperert DI-vann.
MERK: DI-vann brukes i stedet for fosfatbufret saltvann (PBS) for å unngå PBS-induserte vanskeligheter for lagets mikrodisseksjon. - Legg prøven flatt på skjærematten med ventricularislaget (dvs. overflaten med chordae-innsettingene) vendt oppover. Plasser prøven slik at den radiale retningen justeres med Y-retningen og omkretsretningen justeres med X-retningen.
MERK: Omkretsretningen er orientert langs ventilens omkrets. - Undersøk chordae innsetting steder av vevet. Bestem et område, ideelt ~ 12 x 12 mm, med minst mulig store chordae-innsettinger, samtidig som du unngår ekstremt tynne (dvs. gjennomsiktige) områder (figur 1).
- Vend prøven slik at den atrieoverflaten (dvs. overflaten uten chordae-innsettinger) vender oppover. Sørg for at instruksjonene i den omkretsende og radiale brosjyren forblir på linje med henholdsvis X- og Y-aksene.
- Klipp en firkantet 12 x 12 mm prøve fra pakningsvedlegget som unngår de store chordae-innsettingene eller de tynne områdene som er identifisert i trinn 1.1.3. Fjern de trimmede delene av pakningsvedlegget med tangen og legg dem i en avfallsbeholder.
- Hvis det ikke er mulig å helt unngå store chordae-innsettinger, kutt vevet slik at de er langs kanten av den firkantede prøven. Å unngå chordae-innsettinger er viktig, da det bidrar til å forhindre problemer for senere mikrodisseksjon.
- Bruk en kirurgisk penn til å plassere en liten prikk øverst til høyre for å spore prøvens orientering. La blekket tørke i ca. 30 s.
- Vend prøven med ventrikulær overflate (dvs. overflaten med korale innsettinger) vendt oppover. Trim chordalfestene på baksiden av vevet ved å strekke chordaen fra brosjyren og bruk et barberblad for å kutte nær innsettingsstedet. Vend prøven igjen slik at den atrieoverflaten (dvs. den glatte overflaten) vender oppover.
- Hent en TV-brosjyre fra fryseren, barberblad, en kirurgisk penn, tang, en pipette med avionisert (DI) vann og en skjærematte. Tin TV-brosjyren med 2-3 dråper romtemperert DI-vann.
- Måling av tykkelse
- Hent en ikke-kontakt laserforskyvningssensor. Null forskyvningssensoren på en flat del av skjærematten nær det trimmede vevet.
FORSIKTIG: Ikke skinn laseren direkte inn i øynene. - Plasser laseren over det sentrale området av prøven. Fjern luft som er fanget under brosjyreoverflaten, da det kan forårsake målefeil. For å frigjøre fanget luft, bruk enten pinsett for å presse boblen til kanten av vevet eller løft det ene hjørnet av vevet.
- Registrer tykkelsen som vises på forskyvningssensorens display. Gjenta to målinger på andre steder i prøven.
- Beregn den gjennomsnittlige tykkelsen på brosjyren ved hjelp av de tre målingene som ble registrert i forrige trinn. Bruk denne verdien når du oppretter de biaksiale mekaniske karakteriseringsprotokollene.
- Hent en ikke-kontakt laserforskyvningssensor. Null forskyvningssensoren på en flat del av skjærematten nær det trimmede vevet.
- Biaxial tester oppsett og vev montering
- Forbered et DI vannbad ved 37 ° C, i henhold til testsystemets retningslinjer, for å sikre temperaturen under fysiologiske forhold in vivo .
- Hent tang, vevsprøven, monteringsutstyr, et finspisset verktøy, flytende cyanoakrylatlim og svartmalte glassperler (diameter: 300-500 μm).
MERK: Monteringsutstyr inkluderer tindene, monteringsbroen og monteringsgummien. - Monter vevsprøven til testsystemet. Sørg for at omkretsen av vevet stemmer overens med X-retningen, som kan assisteres av prikken som tidligere ble plassert i trinn 1.1.6.
MERK: Tindene som brukes her, skal være jevnt fordelt over hele vevskantlengden. Den effektive kantlengden er satt til å være 10 mm for det intakte vevet og >3,3 mm for komposittlagene.
- Fiducial markør plassering
- Identifiser den sentrale en tredjedel kvadratiske regionen av det monterte vevet. Bruk de omtrentlige hjørnene av dette området for plassering av fiducial markøren.
- Plasser glassperler i en veiebåt med åpen ansikt og lag et lite basseng med flytende cyanoakrylatlim i en separat veiebåt. Belegg toppen av det finspissede verktøyet med en liten mengde lim. Dab overflødig lim på siden av veiebåten.
- Lag ett hjørne av den sentrale en tredjedel firkantede matrisen ved å trykke forsiktig på den limbelagte spissen på vevet. Bruk tang, ta en glassperle og legg den forsiktig på toppen av limprikken. Bruk kameraet til den biaxiale testenheten for å få hjelp med dråpeplasseringen.
- Gjenta trinn 1.4.2 og 1.4.3 for ytterligere tre perler til den firkantede matrisen er fullført. Forsikre deg om at perlene er ordentlig festet, og at deres respektive limprikker ikke berører eller fester seg sammen. Tørk limet før du senker vevet i vannbadet.
- Hvis perlene sitter fast sammen, vent til limet tørker, bruk deretter tangen til å forsiktig ta tak i perlen eller limet og trekk det av vevet.
MERK: Limet og perlen(e) skal løsne, slik at dråpeplasseringen kan settes på nytt.
- Hvis perlene sitter fast sammen, vent til limet tørker, bruk deretter tangen til å forsiktig ta tak i perlen eller limet og trekk det av vevet.
- Forutsetninger
- Lag en kraftstyrt prekondisjoneringsprotokoll, der vevet med kantlengde og tykkelse vil gjennomgå seks repetisjoner av likeverdig belastning til en toppmembranspenning T-topp på 40 N / m med en forhåndsbelastning på 3% × T-topp10 og strekk- og gjenopprettingstider på 30 s hver.
- Konstruer en vilkårlig testkatalog som midlertidig lagrer dataene for fremtidige beregninger. Still inn lastehastigheten til 4,42 N/m.
- Konstruer et nytt testparametersett med navnet Preconditioning0. Angi kontrollmodusene X-aksen og Y-aksen til å tvinge, og angi at kontrollfunksjonene skal trinnes. Definer laststørrelsen til å være kraften knyttet til T-topp, dvs. ftopp = Ttopp · L. Definer forspenningsstørrelsen som 3 % av f-topp bare for den første repetisjonen, og definer både strekkvarigheten og restitusjonsvarigheten som 30 s. Definer antall repetisjoner som 10.
MERK: Den beregnede toppen første Piola-Kirchhoff stress, dvs. Ppeak = Tpeak / t, kan overstige 200 kPa for tynnere vev, noe som kan føre til vev rive under testing. I disse scenariene ble toppmembranspenningen justert til en maksimal første Piola-Kirchhoff-spenning på 200 kPa.
- Utfør forhåndskondisjoneringsprotokollen. Etter forhåndskondisjonering registrerer du de nåværende X- og Y-dimensjonene til prøven for bruk i de biaxiale testprotokollene.
- Lag en kraftstyrt prekondisjoneringsprotokoll, der vevet med kantlengde og tykkelse vil gjennomgå seks repetisjoner av likeverdig belastning til en toppmembranspenning T-topp på 40 N / m med en forhåndsbelastning på 3% × T-topp10 og strekk- og gjenopprettingstider på 30 s hver.
- Opprettelse og utførelse av biaxiale testprotokoller
- Bestem tiden som kreves for å oppnå den høyeste ekvibiaksiale konfigurasjonen fra den postforutbestemte konfigurasjonen med ønsket forskyvningshastighet. Med tanke på en konstant forskyvningshastighet, beregne lastetidene for de gjenværende lasteforholdene (dvs. TXX: TYY = 1: 0,5 og TXX: TYY = 0,5: 1).
- Jogg de lineære aktuatorene manuelt for å matche målkreftene for et gitt lasteforhold. Gjenta denne prosessen og registrer pakningsvedleggets dimensjoner for alle belastningsforhold.
- Forbered en forskyvningsstyrt testprotokoll som biaxialt forskyver vevet fra den postforutbestemte konfigurasjonen til konfigurasjonene registrert i trinn 1.6.2 (dvs. TXX: TYY = 1: 1, 1: 0.5, 0.5: 1) innenfor tidene som er bestemt i trinn 1.6.1. Forsikre deg om at hver protokoll har tre laste-/lossesykluser for repeterbarhet av den mekaniske oppførselen.
- Konstruer en testkatalog som lagrer dataene for fremtidige beregninger. Kontroller at katalognavnet samsvarer med gjeldende eksemplar.
- Konstruer et nytt testparametersett med navnet 1: 1, sett kontrollmodusene X-aksen og Y-aksen til forskyvning, og sett kontrollfunksjonene til rampe. Definer strekkstørrelsen som konfigurasjonen som ble registrert i trinn 1.6.1. Definer forspenningsstørrelsen som 3 % av f-topp for bare den første repetisjonen, og definer både strekkvarigheten og restitusjonsvarigheten som tiden som er registrert i trinn 1.6.1. Definer antall repetisjoner som 3.
- Gjenta trinn 1.6.3.2 for de gjenværende lasteforholdene (dvs. TXX:TYY = 1:0,5 og TXX:TYY = 0,5:1), bortsett fra definer forspenningsstørrelsen slik den ikke er brukt. Sørg for at strekkstørrelsen, strekkvarigheten og restitusjonsvarigheten samsvarer med de som er registrert i trinn 1.6.2.
MERK: Kun data fra den siste (tredje) syklusen vil bli brukt til stress- og tøyningsanalyser.
- Utfør de forskyvningsstyrte protokollene. Etter fullføring av biaxial testing, returner vevet til dets postforutbestemte dimensjoner.
MERK: Testen skal umiddelbart avbrytes hvis vevet begynner å rive.
- Ytterligere karakteriseringer
- La vevet være nedsenket i DI-vann og montert på det biaxiale testsystemet. Utfør pSFDI-avbildning som beskrevet i trinn 2.1-2.3.
- Demonter vevet. Hvis det er et intakt vev, fortsett til mikrodisseksjonen beskrevet i trinn 3.1-3.7. Hvis ikke, samle histologi etter trinn 3.7.
MERK: DI-vannbadet kan brukes til påfølgende karakteriseringer innen samme dag. - Gjenta trinn 1.2-1.7 med A/S- og F/V-lagene anskaffet etter mikrodisseksjonen (trinn 3.1-3.6).
MERK: Gjentakelsen av testprotokollen for lagene muliggjør direkte sammenligning av det intakte vevet med sine egne lag.
- Biaxial testing data etter behandling prosedyrer
- Utfør digital bildekorrelasjon av de oppkjøpte biaksiale testbildene for å bestemme de tidsavhengige markørposisjonene. Beregn de fiduciale markørforskyvningene via Eq (1). 5
(1)
Her er xi (t), Xi og di (t) den tidsavhengige plasseringen, den første (referanse) plasseringen og forskyvningen av markør i. - Beregne deformasjonsgradienten F ved å betrakte fiducialmarkørene som et firenodet bilinært element, som vist i Eq (2)5
(2)
Der BXi og BYi er derivater av formfunksjonene for node i i henholdsvis X- og Y-retningene, og ui(t) og vi(t) er komponentene i di(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T. - Beregn det anvendte første Piola-Kirchhoff-stresset P ved hjelp av de registrerte kreftene, som i Eq (3)5
(3)
PXX og PYY er X- og Y-komponentene til P; L og t er vevskantlengden og tykkelsen; fX og fY er kreftene som registreres i X- og Y-retningene. - Bestem andre tøynings- og spenningsmål etter behov,13 som inkluderer høyre Cauchy-Green deformasjon C = FT/F, Green-Lagrange-stammen E = (C - I)/2, Cauchy-spenningen σ = J-1PFT, og den andre Piola-Kirchhoff-spenningen S = F-1P.
MERK: Her er jeg en andreordens identitetstensor, og J = det (F) er jacobianeren av deformasjonsgradienten F.
- Utfør digital bildekorrelasjon av de oppkjøpte biaksiale testbildene for å bestemme de tidsavhengige markørposisjonene. Beregn de fiduciale markørforskyvningene via Eq (1). 5
(1)
(2)
(3)2. Polarisert romlig frekvensdomeneavbildning
- System forberedelse
MERK: Om ønskelig kan fiducialmarkørene fjernes fra vevet før følgende trinn.- Sentrer pSFDI-enheten over prøven (figur 2). Slå på projektoren og lys opp prøven med 490 nm (cyan) lys.
- Åpne kameraprogramvaren og inspiser kameraets synsfelt. Forsikre deg om at prøven er sentrert i rammen og er helt inneholdt i synsfeltet.
- Hvis den monterte prøven er en intakt brosjyre, juster lysstyrken på DLP-projektoren (Digital Light Processing) for å sikre at vevet er fullt opplyst uten blending på vevsoverflaten. Ikke juster lysstyrken hvis prøven er et av komposittlagene.
- Roter polarisatoren over hele bevegelsesområdet for å oppdage mulige gjenskinn eller smuss på polarisatorlinsen. Rengjør polarisatorlinsen forsiktig med en mikrofiberklut etter behov.
- Innsamling av data
MERK: Følgende datainnsamling kan automatiseres ved hjelp av programvare, for eksempel LabVIEW eller Python.- Flytt polarisatoren til hjemmeposisjonen – ideelt justert med en av de biaksiale testaksene. Ta ett gråtonebilde og lagre det på datamaskinen med polarisatorplasseringen (dvs. 0 °).
- Roter polarisatoren 5° og ta et nytt gråtonebilde. Gjenta denne prosessen for å hente 37 bilder som varierer fra 0° til 180° med en økning på 5°.
MERK: Bildene fra den første pSFDI-bildesekvensen kan foreløpig analyseres for å sikre ønsket optisk respons fra vevet. Se trinn 2.3 for instruksjoner. - Gjenta pSFDI-bildesekvensen for andre ønskede vevskonfigurasjoner, for eksempel toppkonfigurasjonene til belastningsprotokollene som vurderes for biaksial mekanisk testing.
- prosedyrer for etterbehandling av pSFDI-data
Merk: Følgende metode inkluderer trinn for MATLAB-programspråket. Imidlertid kan ethvert foretrukket språk (f.eks. Python, C ++) brukes i stedet.- Bruk MATLAB imread() -funksjonen til å konstruere matriser som inneholder de pikselvise intensitetene til de 37 anskaffede bildene. For enkelhets skyld, ordne disse som en n × m × 37 tredimensjonal matrise, hvor n og m er antall piksler langs de to aksene.
- Definer vevsområdet av interesse (ROI) ved hjelp av den brukerdefinerte grabit() -funksjonen.
- Tilpass intensitets- kontra polarisatorvinkeldataene for hver ROI-piksel ved hjelp av en 3-term Fourier-serie, som i Eq (4):
(4)
Heri er I(θ) pikselvis intensitet som en funksjon av polarisatorvinkelen, og bi er Fourier-konstantene. Bruk standard lineær minste kvadraters regresjon for å bestemme bi. - Bestem pikselvis fiberorientering som polarisatorvinkelen knyttet til maksimumsverdien av I (θ). Beregne graden av optisk anisotropi (DOA) via Eq (5).
(5) - Bruk plot() og histogram() til å visualisere de ervervede fiberretningene og DOA-verdiene. Lagre de behandlede resultatene for senere bruk.
(4)
(5)3. Mikrodisseksjon av trikuspidalklaffblad komposittlag
- Vevsfeste til voksbrett
- Samle de nødvendige materialene: voksbrett, DI-vann, pipette, skalpell, mikrosaks, tynne tang, buede tang, tykke tang og pinner.
MERK: Bruk bare pinsett uten tenner eller grep, da tang av denne typen veldig lett kan rive det tynne vevet i A/S-laget når du utfører disseksjonen. - Demonter vevet fra den biaksiale testeren og mål tykkelsen ved hjelp av laserforskyvningssensoren beskrevet i trinn 1.2. Plasser vevet på voksbrettet.
- Undersøk ventricularis-siden av vevet for store chordae-innsettinger. Legg merke til plasseringen av disse innsettingene for å unngå dem under disseksjonen (supplerende figur S1). Ta et bilde som referanse.
- Spred vevet flatt på voksbrettet med atrialis vendt opp. Fest vevet på brettet ved hjelp av pinnene:
- I hvert hjørne av vevet plasserer du en pinne som er vinklet bort fra vevet (for bedre visning) og trekker vevet litt stramt (figur 3A). Gjør dette i rekkefølge med eller mot klokken. Forsikre deg om at pinnene er utenfor hullene som er opprettet av tindene når du monterer vevet.
- Juster pinneplasseringen litt for å sikre at vevet er stramt og i en firkantet konfigurasjon (figur 3B) slik at vevet ligger flatt og ikke forskyves under lagmikrodisseksjonen.
- Plasser om nødvendig pinner langs siden av vevet under disseksjonen for å strekke vevet mer. Husk når du plasserer og vingler ekstra pinner at de må jobbes rundt under disseksjonen.
- Fjern glassperlens fiducial markører.
MERK: Følgende trinn er valgfritt. Det tilsatte DI-vannet bidrar til å opprettholde vevshydrering og forhindrer vevet i å feste seg til seg selv gjennom mikrodisseksjonen. - Bruk en pipette til å plassere DI-vann på overflaten av vevet slik at det helt dekker vevet på en boblelignende måte. Replenish DI vann etter behov gjennom disseksjonen.
- Samle de nødvendige materialene: voksbrett, DI-vann, pipette, skalpell, mikrosaks, tynne tang, buede tang, tykke tang og pinner.
- Lag det første hjørnet.
- Velg et hjørne av det festede eksemplaret for å starte disseksjonen. Unngå store chordae-innsettinger og ekstremt tynne områder.
- Gjør et kutt i A/S-laget ved å dra skalpellen lett over vevsoverflaten langs monteringshullene fra mekanisk testing (figur 3C). Sørg for at kuttet er minst 5 mm langt, og at kantene på kuttet begynner å trekke seg fra hverandre og avsløre F/V-laget under.
- Bruk de tynne tangene (uten skarp spiss) til å gni godt langs kuttet og dra kantene på kuttet fra hverandre (supplerende figur S2).
- Hvis kuttet i A/S-laget ikke begynner å trekke seg fra hverandre, kan du spore lett over det samme kuttet igjen med skalpellen til den begynner å gjøre dette. Vær forsiktig så du ikke skjærer for dypt inn i vevet (forbi A/S-komposittlaget), da det gjør det vanskeligere å skille lagene rent.
- Gjenta trinn 3.2 og 3.2.3 for å gjøre et nytt kutt vinkelrett på det første kuttet (figur 3D). Forsikre deg om at de to kuttene er koblet sammen og danner et hjørne.
- Hvis de to kuttene ikke er koblet sammen, kjør den tynne pinsetten under det lille vevsområdet som skiller de to kuttene (tilleggsfigur S3). Bruk deretter saksen forsiktig til å kutte vevet.
- Skrell vevet fra hjørnet.
- Gni langs kuttene ved hjelp av de tynne tangene til vevet begynner å skille seg fra F / V-laget. Så snart et lite stykke vev er skilt, ta tak i det med pinsetten og trekk det forsiktig for å skille komposittlagene ytterligere.
MERK: Plasser alltid tuppen av den tynne pinsetten forbi kanten av vevet når du griper. Ellers kan de ved et uhell stikke et hull inn i A/S komposittlaget. - Fortsett å skrelle vevet og gni sømmen til den når enden av de to kuttene som er laget for hjørnet. Gjennom denne prosessen bytter du til større pinsett for å ta tak i vevet for avskallingsprosessen for å forhindre uønsket ripping og riving av A/S komposittlaget.
- Hvis det første hjørnet som ble forsøkt har store problemer med separasjon, kan du prøve et annet hjørne som utgangspunkt (gå tilbake til trinn 3.2).
- Gni langs kuttene ved hjelp av de tynne tangene til vevet begynner å skille seg fra F / V-laget. Så snart et lite stykke vev er skilt, ta tak i det med pinsetten og trekk det forsiktig for å skille komposittlagene ytterligere.
- Forleng kutt, skrell vevet og lag et nytt hjørne.
- Forleng de to kuttene som er laget for det første hjørnet ved å plassere skalpellspissen nederst på hvert kutt og dra den lett langs vevsoverflaten (figur 4A). Sørg for at alle forlengelseskuttene er minst 5 mm, og kuttforlengelsene kobles til de originale kuttene og fortsetter å følge tinn- eller suturhullene.
MERK: Hvis forlengelseskuttet er for dypt, må den kommende peeling overvåkes nøye for å sikre at deler av fibrosa ikke skilles med A / S komposittlaget (figur 5A). - Fortsett å forlenge kuttene og skrell det øverste sammensatte A/S-laget tilbake mens du gnir sømmen til den ene siden er ferdig. Vær oppmerksom på at vevet vil bli separert helt langs ett kutt; sørg for at sømmen mellom komposittlagene A/S og F/V er rett (figur 4B).
- Gjenta instruksjonene i trinn 3.2 og trinn 3.3 for å lage et nytt hjørne vinkelrett på enden av den helt avskrellede siden (figur 4C).
- Forleng de to kuttene som er laget for det første hjørnet ved å plassere skalpellspissen nederst på hvert kutt og dra den lett langs vevsoverflaten (figur 4A). Sørg for at alle forlengelseskuttene er minst 5 mm, og kuttforlengelsene kobles til de originale kuttene og fortsetter å følge tinn- eller suturhullene.
- Skill A/S-laget helt.
- Forleng de resterende kuttene samtidig som du unngår store chordae-innsettinger. Fortsett å skille A/S- og F/V-lagene ved å bruke gnisse- og trekkteknikkene som brukes i det første hjørnet. Noter flere hensyn eller problemer som kan oppstå under denne prosessen:
- Ekskluder chordae-innsettingene fra A/S-separasjonsområdet (figur 5B) bare når denne utelukkelsen vil tillate et A/S-eksemplar som er stort nok for eksperimentelle karakteriseringer (>3,3 mm).
- Hvis vevet tårer eller et hull dannes, må du slutte å skille vevet umiddelbart. For å forhindre at pinsett blir fanget, plasser saksen i et hull som dannes og klipp vevet bort fra midten. Hvis defekten dannes langs separasjonssømmen, begynner du å skille vevet langs en annen kant for å forhindre ytterligere rive (figur 5C).
- Se etter mellomlagsforbindelser som kan oppstå mens du separerer vevet og forhindrer ytterligere separasjon av vevet uten høy risiko for ripping (figur 5D). Vær oppmerksom på at disse er tynne, men sterke tråder som må klippes forsiktig med saks. Unngå å lage et hull i A/S-laget eller skjære nedover i F/V-laget, da dette vil føre til ujevn separasjon.
- Fortsett denne prosessen til den største prøven som er mulig av A/S-laget er separert. Merk retningen på prøven med kirurgisk penn (figur 6A).
- Forleng de resterende kuttene samtidig som du unngår store chordae-innsettinger. Fortsett å skille A/S- og F/V-lagene ved å bruke gnisse- og trekkteknikkene som brukes i det første hjørnet. Noter flere hensyn eller problemer som kan oppstå under denne prosessen:
- Fullfør disseksjon.
- Bruk saksen til å klippe langs separasjonssømmen for den gjenværende vevskanten (figur 6B). Sørg for at dette kuttet er så nær separasjonssømmen som mulig.
- Plasser det separerte A/S komposittlaget flatt på skjærematten. Bruk om nødvendig skalpellen til å rette kantene på vevet og skape en firkantet vevsform som er egnet for biaxial mekanisk testing. Plasser A/S-laget i DI-vann til det er klart til å testes.
- Merk retningen på F/V-laget som er igjen på voksbrettet. Skjær den største firkanten som er mulig ut av området der A/S-laget ble fjernet (figur 6C), og plasser det deretter i DI-vann.
- Histologi
- Excise to strimler av vev-justert med omkrets og radiale retninger-for bruk i histologi. Bruk forskjellige protokoller for intakte og sammensatte lag (dvs. A / S og F / V).
- For det intakte laget, ta prøvene fra vevet som forblir festet til voksbrettet. Bruk vevet utenfor tinn-/suturhullene, da denne delen av vevet ikke er dissekert og vil representere det intakte pakningsvedlegget.
- For de sammensatte A/S- og F/V-lagene samler du kun histologiprøver etter at testingen og avbildningen er fullført. Demonter prøven fra det biaxiale testsystemet, legg vevet flatt på en skjærematte, og skjær omkrets- og radiale striper ved hjelp av et barberblad.
- Plasser de utskårne stripene i vevskassetter og senk kassettene i 10% formalin.
- Kast det gjenværende vevet. Rengjør disseksjonsverktøyene ved hjelp av rengjøringsforbindelse (se materialtabellen).
- Etter 24-48 timers fiksering, overfør kassettene til etanol, hvor de kan lagres på ubestemt tid til histologisk behandling og farging.
MERK: Denne histologiske analysen kan bekrefte at mikrodisseksjonen er vellykket. FORSIKTIG: 10% formalin forårsaker hudirritasjon og alvorlig øyeskade. Det kan også forårsake en allergisk reaksjon eller kreft gjennom innånding. Ved håndtering, bruk passende personlig verneutstyr, for eksempel hansker, vernebriller og laboratoriefrakk, og bruk bare i godt ventilerte rom, for eksempel i en avtrekksvifte. Når den ikke er i bruk, må du sørge for at oppbevaringsbeholderen er tett lukket.
- Excise to strimler av vev-justert med omkrets og radiale retninger-for bruk i histologi. Bruk forskjellige protokoller for intakte og sammensatte lag (dvs. A / S og F / V).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrodisseksjonen vil gi A/S- og F/V-prøver med relativt ensartede tykkelser som kan monteres på et (kommersielt) biaksialt testapparat. Histologisk analyse av det intakte pakningsvedlegget og de to dissekerte lagene vil verifisere om vevet var riktig separert langs grensen mellom spongiosa og fibrosa (figur 7). I tillegg kan histologimikrografiene brukes til å bestemme vevslagtykkelser og bestanddeler av massefraksjoner ved hjelp av ImageJ-programvare. En mislykket disseksjon oppstår når den produserer en A / S-prøve som er for liten for montering til biaxial tester. Dette skjer oftest når A/S under peeling, eller når det oppstår et hull i F/V-laget på grunn av tykk chordae.
Den forskyvningsstyrte mekaniske testingen og etterbehandlingen produserer spenningsdata som beskriver vevets ikke-lineære mekaniske oppførsel (figur 8). Prøvene er generelt anisotrope, der den cirkumferensielle vevsretningen har en stivere mekanisk respons enn radialvevsretningen (tab 1). Disse egenskapene med lav strekkfasthet og høy strekkfasthet kan bestemmes kvantitativt ved hjelp av ytterligere analyseteknikker 6,14. Samlet vurdering av rekkevidden av biaxiale kraftforhold gir ytterligere innsikt i vevets retningskobling (dvs. X-aksekraften avhenger av Y-aksekraften og omvendt). Det er viktig å merke seg at den mekaniske oppførselen til en vevsretning i disse forskjellige kraftforholdene kan vise komprimerende deformasjoner under ikke-nøyaktige deformasjoner. Denne unike oppførselen oppstår vanligvis på grunn av høyt justerte kollagenfibre langs trykkvevsretningen.
pSFDI-dataene gir fargekart over kollagenfiberorientering og DOA (figur 9). Spesielt gir disse fargekartene en omfattende forståelse av kollagenfiberarkitekturen over hele vevsprøven. En unik fordel med den ikke-destruktive pSFDI-teknikken er muligheten til å sammenligne resultatene på tvers av ulike lastekonfigurasjoner og forstå hvordan kollagenfibrene reorienterer og uncrimp / align for å støtte den påførte belastningen. Disse resultatene er suboptimale hvis det projiserte lyset er for lyst eller mørkt under avbildning, hvis det projiserte lyset ikke holdes konsistent over den intakte brosjyren og dens lag, hvis det er store bobler eller rusk på prøven, hvis det er for mye lim på vevet fra fiducial markørplassering, eller hvis nivået på vannbadet blir for lavt og skaper pinpoints av sterkt lys. Alle fører til unøyaktige representasjoner av den reflekterte intensiteten versus polarisatorvinkeldataene, noe som forstyrrer den bestemte fiberretningen og beregnet DOA.
Figur 1: Valg av mikrodisseksjonsområde. (A) Identifisering av problematiske områder som skal unngås og (B) målområde for lagets mikrodisseksjon. Skala bar = 10 mm (A, B). Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: pSFDI-systemet integrert med den biaxiale testenheten. Nøkkelkomponenter på begge enhetene er merket. Forkortelser: pSFDI = polarisert romlig frekvens domeneavbildning7; DLP = digital lysbehandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Initiering av pakningsvedleggets mikrodisseksjon. (A) Strekke vevet stramt mens du plasserer pinner, (B) det festede vevet klart for mikrodisseksjon, (C) gjøre det første kuttet i A/S komposittlaget, og (D) skape det første hjørnet av kutt i A/S komposittlaget. Skalastenger = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets; A/S = atrialis/spongiosa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Separasjon av A/S komposittlaget. (A) Forlengelse av kuttene i A/S komposittlaget, (B) separasjon av A/S komposittlaget via forsiktig peeling, og (C) opprettelse av det andre hjørnet. Skala bar = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets; A/S = atrialis/spongiosa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Potensielle problemer under mikrodisseksjonen i pakningsvedlegget. (A) Mislykket separasjon av komposittlagene A/S og F/V, (B) justering av mikrodisseksjonsområdet for å unngå chordae-innsettinger, (C) opprettelse av en ny separasjonssøm på grunn av uønsket hull, og (D) mellomlagstilkobling som forbinder komposittlagene A/S og F/V. Skala barer = 5 mm (A-C), 10 mm (D). Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets; A/S = atrialis/spongiosa; F / V = fibrosa / ventricularis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fullføring av mikrodisseksjonen. (A) Angivelse av øverste høyre hjørne for orientering, (B) separasjon av A/S ved hjelp av saks, og (C) gjenfinning av F/V komposittlaget med retning merket. Skala bar = 10 mm Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets; A/S = atrialis/spongiosa; F / V = fibrosa / ventricularis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Histologisk vurdering. Mikrografer som viser omkretstverrsnitt av (A) intakt pakningsvedlegg og (B) riktig separert A / S og F / V lag. Skala barer = 50 μm. Forkortelser: atrialis/spongiosa; F / V = fibrosa / ventricularis; VIC = valvulær interstitiell celle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Representative biaksiale mekaniske testresultater for ekvibiaksialt belastningsforhold. Membranspenning versus strekkdata for (A) trikuspidalklaffens fremre brosjyre, (B) trikuspidalklaffens bakre brosjyre og (C) trikuspidalklaffseptumbrosjyre. Forkortelser: atrialis/spongiosa; F / V = fibrosa / ventricularis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Representative pSFDI-resultater. (A) Råbilde av brosjyren under pSFDI-vurdering, (B) kvantifisert fiberorientering vist via fargekartet, og (C) kvantifisert grad av optisk anisotropi, vist via fargekartet, som indikerer fiberjusteringen. Pilene indikerer regioner med overflødig lim fra fiducialmarkørene. Den øverste raden viser gode bilder, mens den nedre raden viser dårlige bilder. Skala barer = 4 mm. Forkortelser: deg. = grader; DOA = grad av optisk anisotropi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sammensatt lag | λcirc | λrad |
| A/S | 1,26 ± 0,05 | 1,37 ± 0,05 |
| F/V | 1,17 ± 0,03 | 1,32 ± 0,08 |
Tabell 1: Gjennomsnittlige sammensatte lagstrekninger. De gjennomsnittlige toppstrekningene til de sammensatte lagene som viser de forventede variasjonene i den mekaniske oppførselen. Denne tabellen er hentet fra 9. Forkortelser: atrialis/spongiosa; F / V = fibrosa / ventricularis.
Supplerende figur S1: Identifisering av områder som skal unngås under mikrodisseksjon. (A) Undersøkelse av ventrikkelsiden av vevsprøven for chordae-innsettinger, (B) sporing av hvor vanskelige områder er når vev er plassert med atrialis vendt opp, og (C) planlegging for innledende kutt for å unngå identifiserte områder. Skala bar = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Demonstrasjon av gnidning langs kutt. (A) Kuttet før du gnir med stump pinsett og (B) kantene på kuttet skiller seg mer etter gnidning. Skala bar = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Ikke-sammenhengende kutt. Pinsett brukes til å identifisere det tynne området av vev som skiller de to kuttene før du forsiktig kutter vevet med saks. Skala bar = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkrets. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn for protokollen inkluderer: (i) lagets mikrodisseksjon, (ii) vevmonteringen, (iii) den fiduciale markørplasseringen og (iv) pSFDI-oppsettet. Passende lagmikrodisseksjon er det viktigste og vanskeligste aspektet ved metoden beskrevet her. Før en undersøkelse som bruker denne teknikken, bør dissectoren (e) ha langsiktig praksis med mikrodisseksjonsteknikken og alle tre TV-brosjyrene. Dissectoren skal sørge for at komposittlagsprøvene er tilstrekkelig store (>3,3 mm) og har en jevn tykkelse. Histologi bør brukes til å bekrefte at disseksjoner konsekvent har nøyaktig lagseparasjon.
For vevmontering må vevet festes til den biaxiale testeren slik at vevet er flatt uten kunstig strekk eller rynker. Disse feilene vil resultere i unøyaktige mekaniske data. Komposittlagene er mer utsatt for disse feilene på grunn av deres tynnere natur. Når du fester fiducialmarkørene, er det viktig at markørene plasseres innenfor det sentrale en tredjedelsområdet av vevet og ikke fester seg til hverandre. Uhensiktsmessig plassering av markør vil resultere i unøyaktig kvantifisering av vevsstrekningene. Til slutt må den pSFDI-projiserte lysstyrken velges nøye og forbli uendret for det intakte vevet og komposittlagene. Hvis lysstyrken endres, kan ikke pSFDI-resultatene sammenlignes mellom det intakte vevet og dets sammensatte lag.
Fleksibiliteten til metoden beskrevet her ligger først og fremst i den biaxiale mekaniske karakteriseringen, mens det meste av feilsøkingen oppstår under pSFDI-basert kollagenmikrostrukturell kvantifisering. De forskyvningsstyrte testprotokollene gir to viktige fordeler i forhold til alternative kraftstyrte testprotokoller: (i) spenningsstrekkkurvene er jevnere uten svingninger, og (ii) forskyvningshastigheten (mm / s) og belastningshastigheten (% / s) kan styres direkte i stedet for belastningshastigheten (N / m). Imidlertid er det fortsatt viktig å utføre kraftstyrt forkondisjonering før den mekaniske karakteriseringen for å skaffe repeterbare kraftforskyvningskurver og bestemme vevskonfigurasjonen som gir likeverdige spenninger. Når ekvibiaksialkonfigurasjonen er bestemt, kan de andre ønskede belastningsforholdene (f.eks. TXX: TYY = 1: 0,5 og TXX: TYY = 0,5: 1) bestemmes ved å jogge de lineære aktuatorene manuelt. Dette muliggjør svært nøyaktig replikering av målbiaxiale spenninger med de ekstra fordelene med et forskyvningsstyrt skjema. Videre kan denne allsidige mekaniske testprotokollen justeres for å vurdere flere belastningsforhold eller andre unike belastningsforhold, for eksempel ren skjær eller spenningsavslapping. Ytterligere pSFDI-kvantifisering kan inkluderes med disse nye protokollene eller på forskjellige punkter langs lastebanene. Før du utfører disse pSFDI-karakteriseringene, er det utrolig viktig å sikre at det ikke er blending, bobler eller rusk på vevet. Ofte må man teste forskjellige orienteringer av polarisatoren, væskehøyden til PBS-badet eller metoder for å forhindre / fjerne rusk og bobler for å sikre vellykket og nøyaktig pSFDI-kvantifisering.
Det er tre hovedbegrensninger i laget mikrodisseksjon. For det første kan det intakte vevet bare skilles i to sammensatte lag, noe som betyr at alle de fire anatomiske lagene ikke kan isoleres individuelt. Dette skyldes at vevet er for tynt til å forsøke å skille alle fire anatomiske lagene, og mangelen på strukturelle komponenter i spongiosa utelukker mikrodisseksjonen. For det andre bruker denne protokollen DI-vann i stedet for PBS. Mens PBS er nærmere det fysiologiske miljøet15, resulterte bruken av PBS under testing i konsistente, mislykkede disseksjoner på grunn av hyppig riving av det sammensatte A/S-laget. Bruken av DI-vann økte umiddelbart enkelheten og suksessen til disseksjoner ved å redusere sannsynligheten for hull og rifter i det sammensatte A/S-laget betydelig. For det tredje, selv om den eksperimentelle protokollen er utformet for å gi matchede data mellom intakte og sammensatte lag, er det merkbare prøve-til-prøve-variasjoner i de mekaniske og mikrostrukturelle egenskapene (tabell 1). Denne variasjonen kan noe forvirre dataanalysen; vår erfaring9 og omfattende studier fra litteraturen 4,5,16,17 viser imidlertid at den faller innenfor de typiske trikuspidalklaffens mekaniske karakteriseringsresultater.
Den presenterte protokollen har betydning av tre hovedgrunner. For det første er dette den eneste protokollen som klarer å skille lagene i alle tre TV-brosjyrene. For det andre tillater strukturen i denne protokollen direkte sammenligning av de mekaniske og kollagenfiber arkitektoniske egenskapene til en intakt TV-brosjyre med komposittlagene. For det tredje tillater dette unike pSFDI-systemet kvantifisering og visualisering av de lastavhengige endringene i kollagenfiberarkitekturen.
Denne lagdisseksjonsmetoden kan påføres ytterligere vev med lagdelt morfologi, for eksempel øyet eller huden. Det kombinerte mekanisk-strukturelle karakteriseringsrammeverket kan også brukes til vev med etablerte lagseparasjonsprosedyrer, for eksempel de resterende hjerteventilene, arteriene eller esophageal vev 18,19,20. Mens mekanisk testing har en etablert rolle i å forstå de mekaniske egenskapene til biologisk vev, er pSFDI en mye nyere utvikling som ennå ikke er fullt ut realisert i bløtvevsbiomekanikksamfunnet. Denne protokollen gir en ny metode for å syntetisere disse teknikkene for biologisk vev og gi ytterligere innsikt i vev-mikrostrukturforholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) og Presbyterian Health Foundation. KMC ble støttet delvis av University of Oklahoma (OU) Undergraduate Research Opportunity Program og Honors Research Apprenticeship Program. DWL ble støttet delvis av National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) og American Heart Association / Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award # 821298). All denne støtten er takknemlig anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps - Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps - Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps - Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
References
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
- Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
- Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
- Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
- Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
- Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
- Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
- Reddy, J. N. An Introduction to Continuum Mechanics. , Cambridge University Press. (2013).
- Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
- Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
- Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
- Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
- Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
