Summary
Questo protocollo descrive la caratterizzazione meccanica biassiale, la quantificazione del collagene basata sull'imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata e la microdissezione dei lembi della valvola tricuspide. Il metodo fornito chiarisce come gli strati del volantino contribuiscono ai comportamenti olistici del volantino.
Abstract
La valvola tricuspide (TV) regola il flusso unidirezionale di sangue non ossidato dall'atrio destro al ventricolo destro. Il televisore è composto da tre volantini, ognuno con comportamenti meccanici unici. Queste variazioni tra i tre volantini TV possono essere ulteriormente comprese esaminando i loro quattro strati anatomici, che sono l'atriale (A), la spongiosa (S), la fibrosa (F) e la ventricolare (V). Mentre questi strati sono presenti in tutti e tre i volantini TV, ci sono differenze nei loro spessori e costituenti microstrutturali che influenzano ulteriormente i loro rispettivi comportamenti meccanici.
Questo protocollo include quattro passaggi per chiarire le differenze specifiche dello strato: (i) caratterizzare i comportamenti architettonici meccanici e delle fibre di collagene del foglietto TV intatto, (ii) separare gli strati compositi (A / S e F / V) del volantino TV, (iii) eseguire le stesse caratterizzazioni per gli strati compositi e (iv) eseguire post-hoc valutazione istologica. Questo quadro sperimentale consente in modo univoco il confronto diretto del tessuto TV intatto con ciascuno dei suoi strati compositi. Di conseguenza, con questo protocollo è possibile raccogliere informazioni dettagliate sulla microstruttura e sulla funzione biomeccanica dei foglietti illustrativi. Tali informazioni possono potenzialmente essere utilizzate per sviluppare modelli computazionali televisivi che cercano di fornire indicazioni per il trattamento clinico della malattia tv.
Introduction
La TV si trova tra l'atrio destro e il ventricolo destro del cuore. Durante tutto il ciclo cardiaco, il televisore regola il flusso sanguigno unidirezionale tramite l'apertura e la chiusura ciclica del volantino anteriore TV (TVAL), del volantino posteriore TV (TVPL) e del volantino settale TV (TVSL). Questi foglietti sono complessi e hanno quattro strati anatomici distinti - l'atriale (A), la spongiosa (S), la fibrosa (F) e la ventricolare (V) - con costituenti microstrutturali unici. Le fibre di elastina nell'atriale e nel ventricolare aiutano a ripristinare il tessuto alla sua geometria non deformata dopo il carico meccanico1. Al contrario, la fibrosa contiene una fitta rete di fibre di collagene ondulate che contribuiscono alla capacità portante delle foglioline2. Costituita principalmente da glicosaminoglicani, la spongiosa è stata ipotizzata per consentire la cesoiatura tra gli strati del foglietto durante la funzione della valvola cardiaca3. Mentre tutti e tre i tipi di volantini hanno gli stessi strati anatomici, ci sono variazioni negli spessori degli strati e nei rapporti costitutivi che hanno implicazioni per i comportamenti meccanici specifici del volantino.
I ricercatori hanno esplorato le proprietà dei volantini televisivi utilizzando caratterizzazioni meccaniche planari, valutazioni istomorfologiche e caratterizzazioni ottiche dell'architettura delle fibre di collagene. Ad esempio, le caratterizzazioni meccaniche biassiali planari cercano di emulare il carico fisiologico applicando spostamenti perpendicolari al tessuto e registrando le forze associate. Le osservazioni risultanti forza-spostamento (o stress-stretch) hanno rivelato che tutti e tre i volantini TV mostrano comportamenti meccanici non lineari, specifici della direzione con risposte più evidenti specifiche del volantino nella direzione del tessuto radiale 4,5,6. Si ritiene che questi comportamenti specifici del volantino derivino da differenze nelle proprietà microstrutturali osservate utilizzando tecniche istologiche standard 6,7. Inoltre, l'imaging di seconda generazione armonica6, lo scattering della luce a piccolo angolo8 e l'imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata7 (pSFDI) mirano a comprendere queste proprietà microstrutturali e hanno mostrato differenze specifiche del volantino nell'orientamento della fibra di collagene e nella crimpatura delle fibre che hanno implicazioni per i comportamenti meccanici osservati a livello tissutale. Questi studi hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione della microstruttura tissutale e del suo ruolo nei comportamenti a livello tissutale. Tuttavia, molto resta da affrontare nel collegare sperimentalmente la meccanica dei tessuti e la microstruttura sottostante.
Recentemente, questo laboratorio ha eseguito caratterizzazioni meccaniche degli strati di volantini TV separati in due strati compositi (A / S e F / V) utilizzando una tecnica di microdissezione9. Quel lavoro precedente ha evidenziato le differenze nelle proprietà meccaniche degli strati e ha contribuito a fornire informazioni su come la microstruttura stratificata contribuisce ai comportamenti meccanici dei tessuti. Sebbene questa indagine abbia migliorato la nostra comprensione della microstruttura del volantino TV, la tecnica aveva diverse limitazioni. In primo luogo, le proprietà degli strati compositi non sono state direttamente confrontate con il tessuto intatto, portando a una mancanza di comprensione completa della relazione meccanica-microstruttura. In secondo luogo, l'architettura delle fibre di collagene degli strati compositi non è stata esaminata. In terzo luogo, solo gli strati del TVAL sono stati studiati a causa delle difficoltà nel raccogliere gli strati compositi dagli altri due volantini TV. Il metodo qui descritto fornisce un quadro di caratterizzazione olistico che supera queste limitazioni e fornisce caratterizzazioni complete dei volantini TV e dei loro strati compositi.
Questo articolo descrive la tecnica di microdissezione che separa i tre foglietti TV nei loro strati compositi (A/S e F/V) per caratterizzazioni biassiali meccaniche e microstrutturali 10,11,12. Questo protocollo iterativo include (i) test meccanici biassiali e caratterizzazione pSFDI del foglietto intatto, (ii) una tecnica di microdissezione nuova e riproducibile per ottenere in modo affidabile gli strati TV compositi e (iii) test meccanici biassiali e caratterizzazione pSFDI degli strati TV compositi. Il tessuto è stato esposto a carico di trazione biassiale con vari rapporti di forza per prove meccaniche. Quindi, pSFDI è stato utilizzato per determinare l'orientamento e l'allineamento delle fibre di collagene in varie configurazioni caricate. pSFDI preserva l'architettura nativa delle fibre di collagene, consente l'analisi dipendente dal carico e aggira la tipica necessità di fissare o cancellare il tessuto per l'analisi dell'architettura delle fibre di collagene, come nell'imaging di seconda generazione armonica o nella diffusione della luce a piccolo angolo. Infine, i tessuti sono stati preparati utilizzando tecniche istologiche standard per visualizzare la microstruttura tissutale. Questo quadro iterativo e olistico consente il confronto diretto delle proprietà meccaniche e microstrutturali del foglietto TV con i suoi strati compositi.
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Protocol
Tutti i metodi descritti nel presente documento sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università dell'Oklahoma. I tessuti animali sono stati acquisiti da un macello approvato dall'USDA.
1. Caratterizzazione meccanica biassiale
- Preparazione dei tessuti
- Recupera un volantino TV dal congelatore, lame di rasoio, una penna chirurgica, una pinza, una pipetta con acqua deionizzata (DI) e un tappetino da taglio. Scongelare il volantino TV usando 2-3 gocce di acqua DI a temperatura ambiente.
NOTA: l'acqua DI viene utilizzata al posto della soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per evitare qualsiasi difficoltà indotta da PBS per la microdissezione dello strato. - Appoggiare il campione piatto sul tappetino da taglio con lo strato ventricolare (cioè la superficie con le inserzioni delle corde) rivolto verso l'alto. Posizionate il campione in modo che la direzione radiale si allinei con la direzione Y e la direzione circonferenziale si allinei con la direzione X.
NOTA: la direzione circonferenziale è orientata lungo la circonferenza della valvola. - Esaminare le posizioni di inserimento delle corde del tessuto. Determinare un'area, idealmente ~ 12 x 12 mm, con la minima quantità di grandi inserzioni di corde evitando aree estremamente sottili (cioè trasparenti) (Figura 1).
- Capovolgere il campione in modo che la superficie atriale (cioè la superficie senza inserzioni di corde) sia rivolta verso l'alto. Assicurarsi che le direzioni del volantino circonferenziale e radiale rimangano allineate rispettivamente con gli assi X e Y.
- Tagliare un campione quadrato di 12 x 12 mm dal tessuto del foglietto che eviti le grandi inserzioni di corde o le aree sottili identificate nel punto 1.1.3. Rimuovere le parti tagliate del tessuto del foglietto illustrativo con la pinza e metterle in un contenitore per i rifiuti.
- Se non è possibile evitare completamente le grandi inserzioni di corde, tagliare i tessuti in modo che siano lungo il bordo del campione quadrato. Evitare le inserzioni di corde è importante in quanto aiuta a prevenire problemi per la successiva microdissezione.
- Utilizzare una penna chirurgica per posizionare un piccolo punto nell'angolo in alto a destra per tracciare l'orientamento del campione. Lasciare asciugare l'inchiostro per circa 30 s.
- Capovolgere il campione con la superficie ventricolare (cioè la superficie con inserzioni cordali) rivolta verso l'alto. Tagliare gli attacchi cordali sul retro del tessuto allungando le corde dal foglietto e usando una lama di rasoio per tagliare vicino alla sua posizione di inserimento. Capovolgere nuovamente il campione in modo che la superficie atriale (cioè la superficie liscia) sia rivolta verso l'alto.
- Recupera un volantino TV dal congelatore, lame di rasoio, una penna chirurgica, una pinza, una pipetta con acqua deionizzata (DI) e un tappetino da taglio. Scongelare il volantino TV usando 2-3 gocce di acqua DI a temperatura ambiente.
- Misurazione dello spessore
- Recuperate un sensore di spostamento laser senza contatto. Azzerare il sensore di spostamento su una sezione piatta del tappetino di taglio vicino al tessuto tagliato.
ATTENZIONE: Non far brillare direttamente il laser negli occhi. - Posizionare il laser sulla regione centrale del campione. Rimuovere l'aria intrappolata sotto la superficie del foglietto in quanto può causare errori di misurazione. Per rilasciare l'aria intrappolata, utilizzare una pinzetta per spingere la bolla sul bordo del tessuto o sollevare un angolo del tessuto.
- Registrare lo spessore visualizzato sul display del sensore di spostamento. Ripetere altre due misurazioni in altre posizioni del campione.
- Calcola lo spessore medio del volantino utilizzando le tre misurazioni registrate nel passaggio precedente. Utilizzare questo valore quando si creano i protocolli di caratterizzazione meccanica biassiale.
- Recuperate un sensore di spostamento laser senza contatto. Azzerare il sensore di spostamento su una sezione piatta del tappetino di taglio vicino al tessuto tagliato.
- Configurazione del tester biassiale e montaggio su tessuto
- Preparare un bagno d'acqua DI a 37 °C, seguendo le linee guida del sistema di test, per garantire la temperatura in condizioni fisiologiche in vivo .
- Recuperare pinze, il campione di tessuto, l'hardware di montaggio, uno strumento a punta fine, colla cianoacrilica liquida e perle di vetro verniciato nero (diametro: 300-500 μm).
NOTA: l'hardware di montaggio include i denti, il ponte di montaggio e la gomma di montaggio. - Montare il campione di tessuto al sistema di test. Assicurarsi che la direzione circonferenziale del tessuto sia allineata con la direzione X, che può essere assistita dal punto precedentemente posizionato nel passaggio 1.1.6.
NOTA: i denti utilizzati qui devono essere distanziati uniformemente su tutta la lunghezza del bordo del tessuto. La lunghezza effettiva del bordo è impostata su 10 mm per il tessuto intatto e >3,3 mm per gli strati compositi.
- Posizionamento del marcatore fiduciale
- Identificare la regione centrale di un terzo quadrato del tessuto montato. Utilizzate gli angoli approssimativi di quest'area per il posizionamento del marcatore fiduciale.
- Posizionare le perle di vetro in una barca di pesatura a faccia aperta e creare una piccola piscina di colla liquida cianoacrilata in una barca di pesatura separata. Rivestire la parte superiore dello strumento a punta fine con una piccola quantità di colla. Tamponare la colla in eccesso sul lato della barca di pesatura.
- Creare un angolo della matrice centrale di un terzo quadrato premendo delicatamente la punta rivestita di colla sul tessuto. Usando una pinza, prendi una perla di vetro e posizionala con cura sopra il punto di colla. Utilizzare la fotocamera del dispositivo di test biassiale per assistenza con il posizionamento del tallone.
- Ripetere i passaggi 1.4.2 e 1.4.3 per tre perline aggiuntive fino al completamento della matrice quadrata. Assicurarsi che le perline siano saldamente attaccate e che i rispettivi punti di colla non si tocchino o si attacchino. Asciugare la colla prima di abbassare il tessuto nel bagno d'acqua.
- Se le perline sono attaccate insieme, attendere che la colla si asciughi, quindi utilizzare la pinza per afferrare delicatamente la perla o la colla e tirarla fuori dal tessuto.
NOTA: la colla e le perline dovrebbero staccarsi, consentendo di ritentare il posizionamento delle perline.
- Se le perline sono attaccate insieme, attendere che la colla si asciughi, quindi utilizzare la pinza per afferrare delicatamente la perla o la colla e tirarla fuori dal tessuto.
- Precondizionamento
- Creare un protocollo di precondizionamento controllato dalla forza, in cui il tessuto con lunghezza e spessore del bordo subirà sei ripetizioni di carico equibiassiale a un picco di tensione della membrana T di 40 N / m con un precarico del 3% × Tpicco10 e tempi di allungamento e recupero di 30 s ciascuno.
- Costruire una directory di test arbitraria che memorizzerà temporaneamente i dati per i calcoli futuri. Impostare la velocità di caricamento su 4,42 N/m.
- Costruire un nuovo set di parametri di test con il nome Preconditioning0. Impostare le modalità di controllo dell'asse X e dell'asse Y per forzare e impostare le funzioni di controllo su step. Definire la magnitudo del carico come la forza associata al picco T, cioè picco f = picco T · L. Definire la magnitudine del precarico come 3% del picco f solo per la prima ripetizione e definire sia la durata dell'allungamento che la durata del recupero come 30 s. Definite il numero di ripetizioni come 10.
NOTA: Il picco calcolato prima dello stress di Piola-Kirchhoff, cioè picco P = picco T/ t, può superare i 200 kPa per i tessuti più sottili, il che potrebbe causare lacerazione dei tessuti durante il test. In questi scenari, la tensione di picco della membrana è stata regolata a una prima sollecitazione massima di Piola-Kirchhoff di 200 kPa.
- Eseguire il protocollo di precondizionamento. Dopo il precondizionamento, registrare le attuali dimensioni X e Y del campione per l'uso nei protocolli di prova biassiale.
- Creare un protocollo di precondizionamento controllato dalla forza, in cui il tessuto con lunghezza e spessore del bordo subirà sei ripetizioni di carico equibiassiale a un picco di tensione della membrana T di 40 N / m con un precarico del 3% × Tpicco10 e tempi di allungamento e recupero di 30 s ciascuno.
- Creazione ed esecuzione di protocolli di test biassiali
- Determinare il tempo necessario per ottenere la configurazione equibiassale di picco dalla configurazione post-precondizionata con la velocità di spostamento desiderata. Considerando una velocità di spostamento costante, calcolare i tempi di caricamento per i rapporti di carico rimanenti (ad esempio, TXX: TYY = 1: 0,5 e TXX: TYY = 0,5: 1).
- Eseguire manualmente gli attuatori lineari in modo che corrispondano alle forze target per un determinato rapporto di carico. Ripetere questo processo e registrare le dimensioni del foglio illustrativo per tutti i rapporti di carico.
- Preparare un protocollo di prova a spostamento controllato che sposti biassialmente il tessuto dalla configurazione post-precondizionata alle configurazioni registrate nel passaggio 1.6.2 (ad esempio, TXX:TYY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) entro i tempi determinati nel passaggio 1.6.1. Assicurarsi che ogni protocollo abbia tre cicli di carico/scarico per la ripetibilità del comportamento meccanico.
- Costruire una directory di test che memorizzerà i dati per i calcoli futuri. Assicurarsi che il nome della directory corrisponda al campione corrente.
- Costruire un nuovo set di parametri di test con il nome 1:1, impostare le modalità di controllo dell'asse X e dell'asse Y sullo spostamento e impostare le funzioni di controllo su rampa. Definite la magnitudine dell'allungamento come configurazione registrata nel passaggio 1.6.1. Definire la magnitudo del precarico come 3% del picco f solo per la prima ripetizione e definire sia la durata del tratto che la durata del recupero come il tempo registrato nel passaggio 1.6.1. Definite il numero di ripetizioni come 3.
- Ripetere il passaggio 1.6.3.2 per i rapporti di carico rimanenti (ad esempio, TXX:TYY = 1:0.5 e TXX:TYY = 0,5:1), tranne definire la magnitudo del precarico come non applicata. Assicurarsi che l'entità dell'allungamento, la durata dell'allungamento e la durata del recupero corrispondano a quelle registrate nel passaggio 1.6.2.
NOTA: solo i dati del (terzo) ciclo finale saranno utilizzati per le analisi delle sollecitazioni e delle deformazioni.
- Eseguire i protocolli a spostamento controllato. Dopo il completamento del test biassiale, riportare il tessuto alle sue dimensioni post-precondizionate.
NOTA: Il test deve essere immediatamente interrotto se il tessuto inizia a lacerarsi.
- Ulteriori caratterizzazioni
- Lasciare il tessuto immerso in acqua DI e montato sul sistema di test biassiale. Eseguire l'imaging pSFDI come descritto nei passaggi 2.1-2.3.
- Smontare il tessuto. Se si tratta di un tessuto intatto, procedere alla microdissezione descritta nei passaggi 3.1-3.7. In caso contrario, raccogliere l'istologia seguendo il passaggio 3.7.
NOTA: Il bagno d'acqua DI può essere utilizzato per successive caratterizzazioni entro lo stesso giorno. - Ripetere i passaggi 1.2-1.7 con gli strati A/S e F/V acquisiti dopo la microdissezione (passi 3.1-3.6).
NOTA: La ripetizione del protocollo di test per gli strati consente il confronto diretto del tessuto intatto con i propri strati.
- Procedure di post-elaborazione dei dati di test biassiali
- Eseguire la correlazione delle immagini digitali delle immagini di test biassiali acquisite per determinare le posizioni dei marcatori dipendenti dal tempo. Calcolare gli spostamenti del marcatore fiduciale tramite Eq (1). 5
(1)
Qui, xi(t), Xi e di(t) sono la posizione dipendente dal tempo, la posizione iniziale (di riferimento) e lo spostamento del marcatore i. - Calcolare il gradiente di deformazione F considerando i marcatori fiduciali come un elemento finito bilineare a quattro nodi, come mostrato in Eq (2)5
(2)
Dove BXi e BYi sono le derivate delle funzioni di forma per il nodo i nelle direzioni X e Y, rispettivamente, e ui(t) e vi(t) sono le componenti di di(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T. - Calcolare la prima sollecitazione di Piola-Kirchhoff applicata P utilizzando le forze registrate, come in Eq (3)5
(3)
PXX e PYY sono le componenti X e Y di P; L e t sono la lunghezza e lo spessore del bordo del tessuto; fX e fY sono le forze registrate nelle direzioni X e Y. - Determinare altre misure di deformazione e sollecitazione secondo necessità,13 che includono la deformazione destra di Cauchy-Green C = FT /F, la deformazione di Green-Lagrange E = (C - I)/2, la σ di sollecitazione di Cauchy = J-1PFT e la seconda sollecitazione di Piola-Kirchhoff S = F-1P.
NOTA: Qui, I è un tensore di identità del secondo ordine, e J = det(F) è il jacobiano del gradiente di deformazione F.
- Eseguire la correlazione delle immagini digitali delle immagini di test biassiali acquisite per determinare le posizioni dei marcatori dipendenti dal tempo. Calcolare gli spostamenti del marcatore fiduciale tramite Eq (1). 5
(1)
(2)
(3)2. Imaging del dominio della frequenza spaziale polarizzata
- Preparazione del sistema
NOTA: Se lo si desidera, i marcatori fiduciali possono essere rimossi dal tessuto prima dei seguenti passaggi.- Centrare il dispositivo pSFDI sul campione (Figura 2). Accendere il proiettore e illuminare il campione con una luce a 490 nm (ciano).
- Aprire il software della fotocamera e ispezionare il campo visivo della telecamera. Assicurarsi che il campione sia centrato nel fotogramma e sia completamente contenuto nel campo visivo.
- Se il campione montato è un foglietto intatto, regolare la luminosità del proiettore DLP (Digital Light Processing) per garantire che il tessuto sia completamente illuminato senza riflessi sulla superficie del tessuto. Non regolare la luminosità se il campione è uno degli strati compositi.
- Ruota il polarizzatore sulla sua gamma completa di movimenti per rilevare possibili abbagliamenti o sporcizia sulla lente polarizzatore. Pulire accuratamente la lente polarizzata con un panno in microfibra, se necessario.
- Raccolta dei dati
NOTA: la seguente raccolta di dati può essere automatizzata utilizzando software, come LabVIEW o Python.- Spostare il polarizzatore nella posizione di partenza, idealmente allineato con uno degli assi di prova biassiali. Cattura un'immagine in scala di grigi e salvala sul computer con la posizione del polarizzatore (cioè 0°).
- Ruotare il polarizzatore di 5° e acquisire un'altra immagine in scala di grigi. Ripeti questo processo per acquisire 37 immagini che vanno da 0° a 180° con un incremento di 5°.
NOTA: Le immagini della prima sequenza di imaging pSFDI possono essere analizzate preliminarmente per garantire la risposta ottica desiderata dal tessuto. Fare riferimento al passaggio 2.3 per istruzioni. - Ripetere la sequenza di imaging pSFDI per altre configurazioni tissutali desiderate, ad esempio le configurazioni di picco dei protocolli di carico considerati per i test meccanici biassiali.
- Procedure di post-elaborazione dei dati pSFDI
NOTA: il seguente metodo include i passaggi per il linguaggio del programma MATLAB. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi linguaggio preferito (ad esempio, Python, C ++).- Utilizza la funzione MATLAB imread() per costruire array contenenti le intensità pixel-wise delle 37 immagini acquisite. Per comodità, disponeteli come un array tridimensionale n × m × 37, dove n e m sono i numeri di pixel lungo i due assi.
- Definire la regione di interesse del tessuto (ROI) utilizzando la funzione grabit() definita dall'utente.
- Adatta i dati sull'intensità rispetto all'angolo del polarizzatore per ciascun pixel ROI utilizzando una serie di Fourier a 3 termini, come in Eq (4):
(4)
Qui, I(θ) è l'intensità pixel-saggio in funzione dell'angolo del polarizzatore, e bi sono le costanti di Fourier. Utilizzare la regressione lineare standard dei minimi quadrati per determinare bi. - Determinare l'orientamento della fibra in pixel come angolo polarizzatore associato al valore massimo di I(θ). Calcolare il grado di anisotropia ottica (DOA) tramite Eq (5).
(5) - Utilizzare plot() e histogram() per visualizzare l'orientamento delle fibre acquisite e i valori DOA. Salvare i risultati elaborati per un uso successivo.
(4)
(5)3. Microdissezione di strati compositi di fogliettino valvolare tricuspide
- Attacco del tessuto alla tavola di cera
- Raccogli i materiali richiesti: tavola di cera, acqua DI, pipetta, bisturi, micro forbici, pinze sottili, pinze curve, pinze spesse e perni.
NOTA: Utilizzare solo pinzette senza denti o impugnature, poiché pinze di questo tipo possono facilmente strappare il tessuto sottile dello strato A / S durante l'esecuzione della dissezione. - Smontare il tessuto dal tester biassiale e misurarne lo spessore utilizzando il sensore di spostamento laser descritto al punto 1.2. Posizionare il tessuto sulla tavola di cera.
- Esaminare il lato ventricolare del tessuto per grandi inserzioni di corde. Si noti la posizione di queste inserzioni per evitarle durante la dissezione (Figura supplementare S1). Scatta una fotografia come riferimento.
- Stendere il tessuto piatto sulla tavola di cera con l'atriale rivolto verso l'alto. Apporre il tessuto alla scheda usando i perni:
- In ogni angolo del tessuto, posizionare un perno che è inclinato lontano dal tessuto (per una migliore visualizzazione) e tira leggermente il tessuto teso (Figura 3A). Esegui questa operazione in senso orario o antiorario. Assicurarsi che i perni siano all'esterno dei fori creati dai denti durante il montaggio del tessuto.
- Regolare leggermente il posizionamento del perno per assicurarsi che il tessuto sia teso e in una configurazione quadrata (Figura 3B) in modo che il tessuto rimanga piatto e non si sposti durante la micro-dissezione dello strato.
- Se necessario, posizionare i perni lungo il lato del tessuto durante la dissezione per allungare maggiormente il tessuto. Tieni presente quando posizioni e incingi perni aggiuntivi che devono essere lavorati durante la dissezione.
- Rimuovere i marcatori fiduciali di perline di vetro.
NOTA: il passaggio seguente è facoltativo. L'acqua DI aggiunta aiuta a mantenere l'idratazione dei tessuti e impedisce al tessuto di attaccarsi a se stesso durante la microdissezione. - Usando una pipetta, posizionare l'acqua DI sulla superficie del tessuto in modo che copra completamente il tessuto in modo simile a una bolla. Ricostituire l'acqua DI secondo necessità durante la dissezione.
- Raccogli i materiali richiesti: tavola di cera, acqua DI, pipetta, bisturi, micro forbici, pinze sottili, pinze curve, pinze spesse e perni.
- Fai l'angolo iniziale.
- Selezionate un angolo del campione bloccato per iniziare la dissezione. Evitare grandi inserzioni di corde e aree estremamente sottili.
- Effettuare un taglio nello strato A / S trascinando leggermente il bisturi sulla superficie del tessuto lungo i fori di montaggio dai test meccanici (Figura 3C). Assicurarsi che il taglio sia lungo almeno 5 mm e che i bordi del taglio inizino a staccarsi, rivelando lo strato F/V sottostante.
- Utilizzare la pinza sottile (senza punta affilata) per strofinare saldamente lungo il taglio e separare i bordi del taglio (Figura supplementare S2).
- Se il taglio nello strato A / S non inizia a staccarsi, tracciare leggermente lo stesso taglio di nuovo con il bisturi fino a quando non inizia a farlo. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità nel tessuto (oltre lo strato composito A / S) in quanto rende più difficile separare in modo pulito gli strati.
- Ripetete i passaggi 3.2 e 3.2.3 per effettuare un secondo taglio perpendicolare al primo taglio (Figura 3D). Assicurarsi che i due tagli siano collegati e formino un angolo.
- Se i due tagli non sono collegati, eseguire le pinzette sottili sotto la piccola area di tessuto che separa i due tagli (Figura supplementare S3). Quindi, utilizzare con attenzione le forbici per tagliare il tessuto.
- Sbucciare il tessuto dall'angolo.
- Strofinare lungo i tagli usando la pinza sottile fino a quando il tessuto inizia a separarsi dallo strato F / V. Non appena un piccolo pezzo di tessuto viene separato, afferrarlo con le pinzette e tirarlo delicatamente per separare ulteriormente gli strati compositi.
NOTA: Posizionare sempre la punta delle pinzette sottili oltre il bordo del tessuto durante la presa. Altrimenti, potrebbero accidentalmente praticare un foro nello strato composito A / S. - Continuare a sbucciare il tessuto e strofinare la cucitura fino a raggiungere la fine dei due tagli fatti per l'angolo. Durante questo processo, passare a pinzette più grandi per afferrare il tessuto per il processo di peeling per evitare strappi e strappi indesiderati dello strato composito A / S.
- Se la prima curva tentata presenta problemi importanti con la separazione, prova un'altra curva come punto di partenza (torna al passaggio 3.2).
- Strofinare lungo i tagli usando la pinza sottile fino a quando il tessuto inizia a separarsi dallo strato F / V. Non appena un piccolo pezzo di tessuto viene separato, afferrarlo con le pinzette e tirarlo delicatamente per separare ulteriormente gli strati compositi.
- Estendere i tagli, sbucciare il tessuto e fare un secondo angolo.
- Estendere i due tagli effettuati per il primo angolo posizionando la punta del bisturi nella parte inferiore di ogni taglio e trascinandola leggermente lungo la superficie del tessuto (Figura 4A). Assicurarsi che tutti i tagli di estensione siano di almeno 5 mm e che le prolunghe di taglio si colleghino ai tagli originali e continuino a seguire i fori di tina o di sutura.
NOTA: se il taglio dell'estensione è troppo profondo, il peeling imminente deve essere attentamente monitorato per garantire che le sezioni della fibrosa non siano separate con lo strato composito A / S (Figura 5A). - Continuare ad estendere i tagli e sbucciare lo strato A/S composito superiore mentre si strofina la cucitura fino a quando un lato non è finito. Osserva che il tessuto sarà separato completamente lungo un taglio; assicurarsi che la cucitura tra gli strati compositi A/S e F/V sia diritta (Figura 4B).
- Ripetere le istruzioni nei passaggi 3.2 e 3.3 per creare un secondo angolo perpendicolare all'estremità del lato completamente sbucciato (Figura 4C).
- Estendere i due tagli effettuati per il primo angolo posizionando la punta del bisturi nella parte inferiore di ogni taglio e trascinandola leggermente lungo la superficie del tessuto (Figura 4A). Assicurarsi che tutti i tagli di estensione siano di almeno 5 mm e che le prolunghe di taglio si colleghino ai tagli originali e continuino a seguire i fori di tina o di sutura.
- Separare completamente il livello A/S.
- Estendere i tagli rimanenti evitando grandi inserzioni di corde. Continuare a separare gli strati A/S e F/V utilizzando le tecniche di sfregamento e trazione utilizzate per la prima curva. Prendi nota di diverse considerazioni o problemi che possono sorgere durante questo processo:
- Escludere le inserzioni di corde dall'area di separazione A/S (Figura 5B) solo quando questa esclusione consentirà un campione A/S abbastanza grande per caratterizzazioni sperimentali (>3,3 mm).
- Se il tessuto si strappa o si forma un foro, smettere immediatamente di separare il tessuto. Per evitare che le pinzette vengano catturate, posizionare le forbici in qualsiasi foro che si forma e tagliare il tessuto lontano dal centro. Se il difetto si forma lungo la cucitura di separazione, iniziare a separare il tessuto lungo un altro bordo per evitare ulteriori strappi (Figura 5C).
- Cercare connessioni interstrato che possono apparire durante la separazione del tessuto e prevenire un'ulteriore separazione del tessuto senza un alto rischio di strappo (Figura 5D). Osserva che questi sono fili sottili ma forti che devono essere tagliati con cura usando le forbici. Evitare di creare un foro nello strato A/S o di tagliare verso il basso nello strato F/V, in quanto ciò causerebbe una separazione non uniforme.
- Continuare questo processo fino a quando il campione più grande possibile dello strato A/S non è stato separato. Contrassegnare l'orientamento del campione utilizzando la penna chirurgica (Figura 6A).
- Estendere i tagli rimanenti evitando grandi inserzioni di corde. Continuare a separare gli strati A/S e F/V utilizzando le tecniche di sfregamento e trazione utilizzate per la prima curva. Prendi nota di diverse considerazioni o problemi che possono sorgere durante questo processo:
- Termina la dissezione.
- Utilizzare le forbici per tagliare lungo la cucitura di separazione per il bordo del tessuto rimanente (Figura 6B). Assicurarsi che questo taglio sia il più vicino possibile alla cucitura di separazione.
- Posizionare lo strato composito A/S separato piatto sul tappetino di taglio. Se necessario, utilizzare il bisturi per raddrizzare i bordi del tessuto e creare una forma di tessuto quadrato adatta per i test meccanici biassiali. Posizionare lo strato A / S in acqua DI fino a quando non è pronto per essere testato.
- Contrassegnare l'orientamento dello strato F/V che rimane sulla tavola di cera. Tagliare il quadrato più grande possibile dall'area in cui è stato rimosso lo strato A/S (Figura 6C), quindi posizionarlo in acqua DI.
- Istologia
- Asportare due strisce di tessuto, allineate con le direzioni circonferenziale e radiale, per l'uso in istologia. Utilizzare protocolli diversi per gli strati intatti e compositi (ad esempio, A / S e F / V).
- Per lo strato intatto, prendi i campioni dal tessuto che rimane appuntato alla tavola di cera. Utilizzare il tessuto al di fuori dei fori di tino/sutura, poiché questa porzione del tessuto non è stata sezionata e rappresenterà il foglietto intatto.
- Per gli strati compositi A/S e F/V, raccogliere i campioni istologici solo dopo aver completato completamente il test e l'imaging. Smontare il campione dal sistema di prova biassiale, posare il tessuto piatto su un tappetino da taglio e asportare le strisce circonferenziali e radiali usando una lama di rasoio.
- Posizionare le strisce asportate in cassette di tessuto e immergere le cassette in formalina al 10%.
- Scartare il tessuto rimanente. Pulire gli strumenti di dissezione utilizzando il composto detergente (vedere la tabella dei materiali).
- Dopo 24-48 ore di fissazione, trasferire le cassette in etanolo, dove possono essere conservate indefinitamente fino all'elaborazione istologica e alla colorazione.
NOTA: Questa analisi istologica può confermare che la microdissezione ha esito positivo. ATTENZIONE: il 10% di formalina provoca irritazione cutanea e gravi danni agli occhi. Può anche causare una reazione allergica o cancro attraverso l'inalazione. Durante la manipolazione, indossare dispositivi di protezione individuale appropriati, come guanti, occhiali e un camice da laboratorio, e utilizzare solo in spazi ben ventilati, come in una cappa aspirante. Quando non è in uso, assicurarsi che il contenitore di stoccaggio sia ben chiuso.
- Asportare due strisce di tessuto, allineate con le direzioni circonferenziale e radiale, per l'uso in istologia. Utilizzare protocolli diversi per gli strati intatti e compositi (ad esempio, A / S e F / V).
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Representative Results
La microdissezione produrrà campioni A/S e F/V con spessori relativamente uniformi che possono essere montati su un dispositivo di prova biassiale (commerciale). L'analisi istologica del foglietto intatto e dei due strati sezionati verificherà se il tessuto è stato correttamente separato lungo il confine tra spongiosa e fibrosa (Figura 7). Inoltre, le micrografie istologiche possono essere utilizzate per determinare gli spessori degli strati di tessuto e le frazioni di massa costituenti utilizzando il software ImageJ. Una dissezione non riuscita si verifica quando produce un campione A / S troppo piccolo per il montaggio sul tester biassiale. Ciò si verifica più spesso quando l'A / S si strappa durante il peeling o quando si verifica un foro nello strato F / V a causa di spesse corde.
I test meccanici a spostamento controllato e il post-elaborazione producono dati stress-deformazione che descrivono il comportamento meccanico non lineare del tessuto (Figura 8). I campioni sono generalmente anisotropi, dove la direzione del tessuto circonferenziale ha una risposta meccanica più rigida rispetto alla direzione del tessuto radiale (Tabella 1). Queste proprietà a bassa e alta resistenza possono essere determinate quantitativamente utilizzando tecniche di analisi aggiuntive 6,14. La valutazione collettiva della gamma di rapporti di forza biassiale fornisce ulteriori informazioni sull'accoppiamento direzionale del tessuto (cioè, la forza dell'asse X dipende dalla forza dell'asse Y e viceversa). È importante notare che il comportamento meccanico di una direzione tissutale in questi vari rapporti di forza può mostrare deformazioni compressive durante deformazioni non equivalenti. Questo comportamento unico si verifica in genere a causa di fibre di collagene altamente allineate lungo la direzione del tessuto compressivo.
I dati pSFDI producono mappe a colori dell'orientamento delle fibre di collagene e DOA (Figura 9). In particolare, queste mappe a colori forniscono una comprensione completa dell'architettura della fibra di collagene attraverso l'intero campione di tessuto. Un vantaggio unico della tecnica pSFDI non distruttiva è la capacità di confrontare i risultati in varie configurazioni di carico e capire come le fibre di collagene si riorientano e si scrimpano / si allineano per supportare il carico applicato. Questi risultati non sono ottimali se la luce proiettata è troppo luminosa o scura durante l'imaging, se la luce proiettata non viene mantenuta coerente attraverso il foglietto intatto e i suoi strati, se ci sono grandi bolle o detriti sul campione, se c'è troppa colla sul tessuto dal posizionamento del marcatore fiduciale o se il livello del bagno d'acqua diventa troppo basso e crea puntini di luce intensa. Tutti portano a rappresentazioni imprecise dell'intensità riflessa rispetto ai dati dell'angolo del polarizzatore, che interferiscono con l'orientamento determinato della fibra e il DOA calcolato.
Figura 1: Selezione dell'area di microdissezione. (A) Identificazione delle aree problematiche da evitare e (B) area target per la microdissezione dello strato. Barra della scala = 10 mm (A, B). Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il sistema pSFDI integrato con il dispositivo di prova biassiale. I componenti chiave di entrambi i dispositivi sono etichettati. Abbreviazioni: pSFDI = polarized spatial frequency domain imaging7; DLP = elaborazione digitale della luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Avvio della microdissezione del foglietto illustrativo. (A) Allungamento del tessuto teso durante il posizionamento dei perni, (B) il tessuto appuntato pronto per la microdissezione, (C) effettuare il primo taglio nello strato composito A/S e (D) creare il primo angolo di tagli nello strato composito A/S. Barre di scala = 10 mm. Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale; A/S = atrialis/spongiosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Separazione dello strato composito A/S. (A) Estensione dei tagli nello strato composito A/S, (B) separazione dello strato composito A/S tramite peeling accurato e (C) creazione del secondo angolo. Barra della scala = 10 mm. Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale; A/S = atrialis/spongiosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Potenziali problemi durante la microdissezione del foglietto. (A) Separazione non riuscita degli strati compositi A/S e F/V, (B) regolazione dell'area di microdissezione per evitare l'inserimento di corde, (C) creazione di una nuova cucitura di separazione a causa di fori indesiderati e (D) connessione intercalare che collega gli strati compositi A/S e F/V. Barre di scala = 5 mm (A-C), 10 mm (D). Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale; A/S = atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Completamento della microdissezione. (A) Denotazione dell'angolo in alto a destra per l'orientamento, (B) separazione dell'A/S mediante forbici e (C) recupero dello strato composito F/V con orientamento marcato. Barra della scala = 10 mm Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale; A/S = atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Valutazione istologica. Micrografie che mostrano sezioni trasversali circonferenziali del foglietto (A) intatto e (B) strati A/S e F/V opportunamente separati. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricolare; VIC = cellula interstiziale valvolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Risultati rappresentativi dei test meccanici biassiali per il rapporto di carico equibiassiale. Tensione di membrana rispetto ai dati di allungamento del foglietto anteriore della valvola tricuspide (A), (B) del foglietto posteriore della valvola tricuspide e (C) del foglietto del setto della valvola tricuspide. Abbreviazioni: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Risultati rappresentativi di pSFDI. (A) Immagine grezza del foglietto illustrativo durante la valutazione pSFDI, (B) orientamento quantificato della fibra mostrato tramite la mappa a colori e (C) grado quantificato di anisotropia ottica, mostrato tramite la mappa a colori, che indica l'allineamento della fibra. Le frecce indicano le regioni con eccesso di colla dai marcatori fiduciali. La riga superiore mostra buone immagini, mentre la riga inferiore mostra immagini scadenti. Barre di scala = 4 mm. Abbreviazioni: deg. = gradi; DOA = grado di anisotropia ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Strato composito | λcirc | λrad |
| A/S | 1,26 ± 0,05 | 1,37 ± 0,05 |
| F/V | 1,17 ± 0,03 | 1,32 ± 0,08 |
Tabella 1: Allungamenti medi dello strato composito. I tratti medi di picco degli strati compositi che mostrano le variazioni previste nei comportamenti meccanici. Questa tabella è estratta da 9. Abbreviazioni: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricolari.
Figura supplementare S1: Identificazione delle aree da evitare durante la microdissezione. (A) Esame del lato ventricolare del campione di tessuto per le inserzioni di corde, (B) tracciamento dove si trovano aree difficili quando il tessuto viene posizionato con atriali rivolti verso l'alto e (C) pianificazione dei tagli iniziali per evitare aree identificate. Barra della scala = 10 mm. Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Dimostrazione di sfregamento lungo i tagli. (A) Il taglio prima dello sfregamento con pinzette smussate e (B) bordi del taglio che si separano maggiormente dopo lo sfregamento. Barra della scala = 10 mm. Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Tagli non di collegamento. Le pinzette vengono utilizzate per identificare l'area sottile del tessuto che separa i due tagli prima di tagliare accuratamente il tessuto con le forbici. Barra della scala = 10 mm. Abbreviazioni: Rad. = radiale; Circ. = circonferenziale. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
I passaggi critici per il protocollo includono: (i) la microdissezione dello strato, (ii) il montaggio del tessuto, (iii) il posizionamento del marcatore fiduciale e (iv) la configurazione pSFDI. La microdissezione a strati appropriata è l'aspetto più importante e difficile del metodo qui descritto. Prima di avviare un'indagine che utilizza questa tecnica, il dissettore (i) dovrebbe avere una pratica a lungo termine con la tecnica di microdissezione e tutti e tre i volantini TV. Il dissettore deve garantire che i campioni dello strato composito siano sufficientemente grandi (>3,3 mm) e abbiano uno spessore uniforme. L'istologia deve essere utilizzata per confermare che le dissezioni abbiano costantemente una separazione accurata degli strati.
Per il montaggio su tessuto, il tessuto deve essere fissato al tester biassiale in modo tale che il tessuto sia piatto senza alcun allungamento artificiale o rughe. Questi errori si tradurranno in dati meccanici imprecisi. Gli strati compositi sono più inclini a questi errori a causa della loro natura più sottile. Quando si appongono i marcatori fiduciali, è fondamentale che i marcatori siano posizionati all'interno dell'area centrale di un terzo del tessuto e non aderiscano l'uno all'altro. Il posizionamento inappropriato del marcatore comporterà una quantificazione imprecisa degli allungamenti tissutali. Infine, la luminosità della luce proiettata da pSFDI deve essere accuratamente selezionata e rimanere invariata per il tessuto intatto e gli strati compositi. Se la luminosità viene modificata, i risultati pSFDI non possono essere confrontati tra il tessuto intatto e i suoi strati compositi.
La flessibilità del metodo qui descritto risiede principalmente nella caratterizzazione meccanica biassiale, mentre la maggior parte della risoluzione dei problemi sorge durante la quantificazione microstrutturale del collagene basata su pSFDI. I protocolli di prova a spostamento controllato offrono due vantaggi chiave rispetto ai protocolli di prova alternativi a controllo di forza: (i) le curve di sollecitazione-allungamento sono più fluide senza oscillazioni e (ii) la velocità di spostamento (mm/s) e la velocità di deformazione (%/s) possono essere controllate direttamente piuttosto che la velocità di carico (N/m). Tuttavia, è ancora imperativo eseguire il precondizionamento controllato dalla forza prima della caratterizzazione meccanica per acquisire curve di forza-spostamento ripetibili e determinare la configurazione tissutale che fornisce tensioni equibiasiali. Una volta determinata la configurazione equibiassiale, gli altri rapporti di carico desiderati (ad esempio, TXX: TYY = 1: 0,5 e TXX: TYY = 0,5: 1) possono essere determinati facendo jogging manuale degli attuatori lineari. Ciò consente una replica altamente accurata delle tensioni biassiali bersaglio con i vantaggi aggiuntivi di uno schema controllato dallo spostamento. Inoltre, questo versatile protocollo di test meccanici può essere regolato per considerare più rapporti di carico o altre condizioni di carico uniche, come il taglio puro o il rilassamento da stress. Ulteriori quantificazioni pSFDI possono essere incluse con questi nuovi protocolli o in punti distinti lungo i percorsi di carico. Prima di eseguire queste caratterizzazioni pSFDI, è incredibilmente importante assicurarsi che non ci siano abbagliamenti, bolle o detriti sul tessuto. Spesso, è necessario testare diversi orientamenti del polarizzatore, altezza del fluido del bagno PBS o metodi per prevenire / rimuovere detriti e bolle per garantire una quantificazione pSFDI efficace e accurata.
Ci sono tre limitazioni principali della microdissezione dello strato. In primo luogo, il tessuto intatto può essere separato solo in due strati compositi, il che significa che tutti e quattro gli strati anatomici non possono essere isolati individualmente. Questo perché il tessuto è troppo sottile per tentare di separare tutti e quattro gli strati anatomici e la mancanza di componenti strutturali nella spongiosa preclude la sua microdissezione. In secondo luogo, questo protocollo utilizza acqua DI invece di PBS. Mentre PBS è più vicino all'ambiente fisiologico15, l'uso di PBS durante i test ha portato a dissezioni coerenti e fallite a causa della frequente lacerazione dello strato composito A / S. L'uso di acqua DI ha immediatamente aumentato la facilità e il successo delle dissezioni diminuendo significativamente la probabilità di fori e strappi nello strato composito A / S. In terzo luogo, sebbene il protocollo sperimentale sia progettato per fornire dati corrispondenti tra gli strati intatti e compositi, ci sono notevoli variabilità da campione a campione nelle proprietà meccaniche e microstrutturali (Tabella 1). Questa variabilità può in qualche modo confondere l'analisi dei dati; tuttavia, la nostra esperienza9 e studi approfonditi dalla letteratura 4,5,16,17 mostrano che rientra nei tipici risultati di caratterizzazione meccanica della valvola tricuspide.
Il protocollo presentato è significativo per tre motivi principali. Innanzitutto, questo è l'unico protocollo per separare con successo gli strati di tutti e tre i volantini TV. In secondo luogo, la struttura di questo protocollo consente il confronto diretto delle proprietà architettoniche meccaniche e delle fibre di collagene di un volantino TV intatto con i suoi strati compositi. In terzo luogo, questo esclusivo sistema pSFDI consente la quantificazione e la visualizzazione dei cambiamenti dipendenti dal carico nell'architettura delle fibre di collagene.
Questo metodo di dissezione dello strato può essere applicato a tessuti aggiuntivi con morfologia stratificata, come l'occhio o la pelle. Il quadro combinato di caratterizzazione meccanico-strutturale potrebbe essere utilizzato anche per tessuti con procedure di separazione degli strati stabilite, come le restanti valvole cardiache, arterie o tessuti esofagei 18,19,20. Mentre i test meccanici hanno un ruolo consolidato nella comprensione delle proprietà meccaniche dei tessuti biologici, pSFDI è uno sviluppo molto più recente che deve ancora essere pienamente realizzato all'interno della comunità biomeccanica dei tessuti molli. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per sintetizzare queste tecniche per i tessuti biologici e fornire ulteriori informazioni sulle relazioni tessuto-microstruttura.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) e dalla Presbyterian Health Foundation. KMC è stato supportato in parte dal programma di opportunità di ricerca universitaria dell'Università dell'Oklahoma (OU) e dal programma di apprendistato di ricerca Honors. DWL è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) e dall'American Heart Association / Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Premio #821298). Tutto questo sostegno è riconosciuto con gratitudine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps - Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps - Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps - Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
References
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
- Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
- Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
- Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
- Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
- Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
- Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
- Reddy, J. N. An Introduction to Continuum Mechanics. , Cambridge University Press. (2013).
- Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
- Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
- Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
- Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
- Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
