Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מיקרו-דיסקציה של שכבה של עלוני שסתומים טריקוספידיים לאפיון מכני דו-אקסיאלי וכימות מיקרו-סטרוקטורלי

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63522
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Biomechanics and Biomaterials Design Laboratory (BBDL), School of Aerospace and Mechanical Engineering, The University of Oklahoma, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (IBEST), The University of Oklahoma

Summary

פרוטוקול זה מתאר את האפיון המכני הדו-אקסיאלי, כימות קולגן מבוסס הדמיה של תחום תדרים מרחביים מקוטבים, ומיקרו-הבחנה של עלוני מסתמים טריקוספידיים. השיטה שסופקה מבהירה כיצד שכבות העלון תורמות להתנהגויות העלון ההוליסטיות.

Abstract

המסתם הטריקוספידי (טלוויזיה) מווסת את הזרימה החד-כיוונית של דם לא מחומצן מהאטריום הימני לחדר הימני. הטלוויזיה מורכבת משלושה עלונים, כל אחד עם התנהגויות מכניות ייחודיות. ניתן להבין עוד יותר את הווריאציות הללו בין שלושת עלוני הטלוויזיה על ידי בחינת ארבע השכבות האנטומיות שלהם, שהן האטריאליס (A), ספונגיוסה (S), פיברוסה (F) וחדרים (V). בעוד ששכבות אלה נמצאות בכל שלושת עלוני הטלוויזיה, ישנם הבדלים בעוביים שלהם ובמרכיבים המיקרו-סטרוקטורליים שלהם המשפיעים עוד יותר על ההתנהגויות המכניות שלהם.

פרוטוקול זה כולל ארבעה שלבים כדי להבהיר את ההבדלים הספציפיים לשכבה: (i) לאפיין את ההתנהגויות האדריכליות המכניות וסיבי הקולגן של עלון הטלוויזיה השלם, (ii) להפריד את השכבות המורכבות (A/S ו-F/V) של עלון הטלוויזיה, (iii) לבצע את אותם אפיונים עבור השכבות המורכבות, ו-(iv) לבצע פוסט-הוק הערכה היסטולוגית. מסגרת ניסיונית זו מאפשרת באופן ייחודי השוואה ישירה של רקמת הטלוויזיה השלמה לכל אחת מהשכבות המורכבות שלה. כתוצאה מכך, ניתן לאסוף מידע מפורט לגבי המיקרו-מבנה והתפקוד הביו-מכני של עלוני הטלוויזיה באמצעות פרוטוקול זה. מידע כזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי לפיתוח מודלים חישוביים טלוויזיוניים המבקשים לספק הדרכה לטיפול הקליני במחלת הטלוויזיה.

Introduction

הטלוויזיה ממוקמת בין האטריום הימני לחדר הימני של הלב. לאורך כל מחזור הלב, הטלוויזיה מווסתת את זרימת הדם החד-כיוונית באמצעות פתיחה וסגירה מחזורית של העלון הקדמי של הטלוויזיה (TVAL), העלון האחורי של הטלוויזיה (TVPL) ועלון המחיצה של הטלוויזיה (TVSL). עלונים אלה מורכבים וכוללים ארבע שכבות אנטומיות נפרדות – האטריאליס (A), הספונגיוסה (S), הפיברוסה (F) והחדר (V) – עם מרכיבים מיקרו-סטרוקטורליים ייחודיים. סיבי האלסטין באטריאליס ובחדרים מסייעים להחזיר את הרקמה לגיאומטריה הלא מעוותת שלה לאחר העמסה מכנית1. לעומת זאת, הפיברוסה מכילה רשת צפופה של סיבי קולגן גליים התורמים ליכולת נשיאת העומס של העלונים2. הספונטיוסה, המורכבת בעיקר מגליקוזאמינוגליקנים, הושער כי היא מאפשרת גזירה בין שכבות העלון במהלך תפקוד מסתם הלב3. בעוד שלכל שלושת סוגי העלונים יש את אותן שכבות אנטומיות, ישנן וריאציות בעובי השכבות וביחסים המרכיבים שיש להן השלכות על התנהגויות מכניות ספציפיות לעלון.

חוקרים חקרו את התכונות של עלוני הטלוויזיה באמצעות אפיונים מכניים מישוריים, הערכות היסטומורפיולוגיות ואפיונים אופטיים של ארכיטקטורת סיבי הקולגן. לדוגמה, אפיונים מכניים דו-אקסיאליים מישוריים מבקשים לחקות את ההעמסה הפיזיולוגית על ידי החלת תזוזות ניצבות על הרקמה ורישום הכוחות הקשורים. התצפיות שהתקבלו על תזוזת כוח (או מתח-מתיחה) גילו כי כל שלושת עלוני הטלוויזיה מפגינים התנהגויות מכניות לא ליניאריות וספציפיות לכיוון עם תגובות ספציפיות יותר לעלון בכיוון הרקמה הרדיאלית 4,5,6. מאמינים כי התנהגויות ספציפיות לכרוזים אלה נובעות מהבדלים בתכונות המיקרו-סטרוקטורליות שנצפו באמצעות טכניקות היסטולוגיות סטנדרטיות 6,7. יתר על כן, הדמיית דור הרמוני שני6, פיזור אור בזווית קטנה8, והדמיית תחום תדרים מרחבייםמקוטבים 7 (pSFDI) שואפים להבין את התכונות המיקרו-סטרוקטורליות הללו והראו הבדלים ספציפיים לעלון בכיוון סיבי הקולגן ובקימפ הסיבים שיש להם השלכות על ההתנהגויות המכניות שנצפו ברמת הרקמה. מחקרים אלה קידמו באופן משמעותי את הבנתנו את המיקרו-מבנה של הרקמות ואת תפקידו בהתנהגויות ברמת הרקמה. עם זאת, הרבה נותר לטפל בחיבור ניסיוני בין מכניקת הרקמות לבין המיקרו-מבנה הבסיסי.

לאחרונה, מעבדה זו ביצעה אפיונים מכניים של שכבות עלון הטלוויזיה המופרדות לשתי שכבות מרוכבות (A/S ו-F/V) באמצעות טכניקת מיקרו-דיסקציה9. עבודה קודמת זו הדגישה הבדלים בתכונות המכניות של השכבות ועזרה לספק תובנה כיצד המיקרו-מבנה השכבתי תורם להתנהגויות המכניות של הרקמה. למרות שחקירה זו שיפרה את הבנתנו את המיקרו-מבנה של עלון הטלוויזיה, לטכניקה היו מספר מגבלות. ראשית, התכונות של השכבות המורכבות לא הושוו ישירות לרקמה השלמה, מה שהוביל לחוסר הבנה מלאה של יחסי המכניקה-מיקרו-מבנה. שנית, ארכיטקטורת סיבי הקולגן של השכבות המורכבות לא נבדקה. שלישית, רק השכבות של ה-TVAL נחקרו בשל קשיים באיסוף השכבות המורכבות משני עלוני הטלוויזיה האחרים. השיטה המתוארת כאן מספקת מסגרת אפיון הוליסטית המתגברת על מגבלות אלה ומספקת אפיונים מלאים של עלוני הטלוויזיה והשכבות המורכבות שלהם.

מאמר זה מתאר את טכניקת המיקרו-דיסקציה המפרידה בין שלושת עלוני הטלוויזיה לשכבות המורכבות שלהם (A/S ו-F/V) עבור אפיונים מכניים דו-אקסיאליים ומיקרו-סטרוקטורליים 10,11,12. פרוטוקול איטרטיבי זה כולל (i) בדיקה מכנית דו-אקסיאלית ואפיון pSFDI של העלון השלם, (ii) טכניקת מיקרו-דיסקציה חדשנית וניתנת לשחזור כדי להשיג באופן אמין את שכבות הטלוויזיה המורכבות, ו-(iii) בדיקה מכנית דו-אקסיאלית ואפיון pSFDI של שכבות הטלוויזיה המורכבות. הרקמה נחשפה להעמסה דו-אקסיאלית של מתיחה עם יחסי כוח שונים לבדיקה מכנית. לאחר מכן, pSFDI שימש לקביעת הכיוון והיישור של סיבי הקולגן בתצורות טעונות שונות. pSFDI משמר את ארכיטקטורת סיבי הקולגן המקומית, מאפשר ניתוח תלוי עומס, ועוקף את הצורך האופייני לתקן או לנקות רקמה לניתוח ארכיטקטורת סיבי קולגן, כגון בהדמיית דור הרמוני שני או פיזור אור בזווית קטנה. לבסוף, הרקמות הוכנו באמצעות טכניקות היסטולוגיה סטנדרטיות כדי לדמיין את המיקרו-מבנה של הרקמה. מסגרת איטרטיבית והוליסטית זו מאפשרת השוואה ישירה של התכונות המכניות והמיקרו-סטרוקטורליות של עלון הטלוויזיה לשכבות המורכבות שלו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוקלהומה. רקמות בעלי חיים נרכשו מבית מטבחיים שאושר על ידי USDA.

1. אפיון מכני דו-אקסיאלי

  1. הכנת רקמות
    1. שלפו עלון טלוויזיה מהמקפיא, סכיני גילוח, עט כירורגי, מלקחיים, פיפטה עם מים שעברו דה-יוניזציה (DI) ומשטח חיתוך. להפשיר את עלון הטלוויזיה באמצעות 2-3 טיפות של מי DI בטמפרטורת החדר.
      הערה: נעשה שימוש במי DI במקום במי מלח עם חיץ פוספט (PBS) כדי למנוע קשיים הנגרמים על-ידי PBS עבור המיקרו-דיסקציה של השכבה.
    2. הניחו את הדגימה שטוחה על משטח החיתוך כאשר שכבת החדר (כלומר, המשטח עם תוספות הכורדה) פונה כלפי מעלה. מקם את הדגימה כך שהכיוון הרדיאלי יתיישר עם כיוון ה-Y והכיוון ההיקפי יתיישר עם כיוון ה-X.
      הערה: כיוון ההיקף מכוון לאורך היקף השסתום.
    3. בחנו את מיקומי ההחדרה של הכורדה של הרקמה. קבעו שטח, באופן אידיאלי בגודל של כ-12 על 12 מ"מ, עם הכמות הנמוכה ביותר של תוספות צ'ורדה גדולות תוך הימנעות מאזורים דקים במיוחד (כלומר שקופים) (איור 1).
    4. הפוך את הדגימה כך שמשטח הפרוזדורים (כלומר, המשטח ללא תוספות של צ'ורדה) פונה כלפי מעלה. ודא שכיווני העלון ההיקפיים והרדיאליים נשארים מיושרים עם צירי X ו-Y, בהתאמה.
    5. חותכים דגימה מרובעת של 12 x 12 מ"מ מרקמת העלון, כדי למנוע את ההחדרות הגדולות של הכורדה או את האזורים הדקים שזוהו בשלב 1.1.3. מוציאים את החלקים הגזומים של רקמת העלון עם המלקחיים ומניחים אותם במיכל פסולת.
      1. אם לא ניתן להימנע לחלוטין מהכנסות צ'ורדה גדולות, חותכים את הרקמות כך שהן נמצאות לאורך קצה הדגימה המרובעת. חשוב להימנע מהכנסות של צ'ורדה מכיוון שהוא מסייע במניעת בעיות עבור המיקרו-דיסקציה המאוחרת יותר.
    6. השתמש בעט כירורגי כדי למקם נקודה קטנה בפינה הימנית העליונה כדי לעקוב אחר כיוון הדגימה. אפשרו לדיו להתייבש במשך כ-30 שניות.
    7. הפוך את הדגימה כאשר המשטח החדרי (כלומר, המשטח עם תוספות אקורדים) פונה כלפי מעלה. חותכים את חיבורי האקורדים בגב הרקמה על ידי מתיחת המיתר מהעלון ושימוש בסכין גילוח כדי לחתוך סמוך למיקום ההחדרה שלו. הפוך שוב את הדגימה כך שמשטח הפרוזדורים (כלומר, המשטח החלק) פונה כלפי מעלה.
  2. מדידת עובי
    1. שלף חיישן תזוזת לייזר לא תואם. אפס את חיישן התזוזה על קטע שטוח של מחצלת החיתוך ליד הרקמה הגזומה.
      אזהרה: אין להאיר את הלייזר ישירות לתוך העיניים.
    2. מקם את הלייזר מעל האזור המרכזי של הדגימה. הסר את האוויר הכלוא מתחת למשטח העלון מכיוון שהוא עלול לגרום לשגיאות מדידה. כדי לשחרר אוויר כלוא, השתמשו בפינצטה כדי לדחוף את הבועה לקצה הרקמה או הרימו פינה אחת של הרקמה.
    3. תעד את העובי המוצג בתצוגת חיישן התזוזה. חזור על שתי מדידות נוספות במיקומים אחרים של הדגימה.
    4. חישבו את עובי העלון הממוצע באמצעות שלוש המדידות שנרשמו בשלב הקודם. השתמש בערך זה בעת יצירת פרוטוקולי האפיון המכני הדו-אקסיאליים.
  3. הגדרת בודק דו-אקסיאלי והרכבת רקמות
    1. הכינו אמבט מים DI בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להנחיות מערכת הבדיקה, כדי להבטיח את הטמפרטורה בתנאים פיזיולוגיים in vivo .
    2. מלקח מלקחיים, דגימת הרקמה, חומרת הרכבה, כלי בעל קצה דק, דבק ציאנואקרילט נוזלי וחרוזי זכוכית צבועים בשחור (קוטר: 300-500 מיקרומטר).
      הערה: חומרת ההרכבה כוללת את הטינים, את גשר ההרכבה ואת גומי ההרכבה.
    3. הר את דגימת הרקמה למערכת הבדיקה. ודא שהכיוון ההיקפי של הרקמה מתיישר עם כיוון ה-X, שניתן להיעזר בנקודה שהונחה קודם לכן בשלב 1.1.6.
      הערה: הטינים המשמשים כאן צריכים להיות מרווחים באופן שווה על פני כל אורך קצה הרקמה. אורך הקצה האפקטיבי מוגדר להיות 10 מ"מ עבור הרקמה השלמה ו->3.3 מ"מ עבור השכבות המורכבות.
  4. מיקום סמן פידוקיאלי
    1. זהה את האזור הריבועי המרכזי של שליש מהרקמה המותקנת. השתמש בפינות המשוערות של אזור זה למיקום הסמן הפידוקיאלי.
    2. מניחים חרוזי זכוכית בסירת שקילה פתוחה ויוצרים בריכה קטנה של דבק ציאנואקרילט נוזלי בסירת שקילה נפרדת. מצפים את החלק העליון של הכלי בעל הקצה העדין בכמות קטנה של דבק. דאב עודף דבק בצד סירת השקילה.
    3. צרו פינה אחת של המערך המרכזי של שליש ריבועים על ידי לחיצה עדינה על הקצה המצופה בדבק על הרקמה. בעזרת מלקחיים, קחו חרוז זכוכית והניחו אותו בזהירות על גבי נקודת הדבק. השתמש במצלמה של מכשיר הבדיקה הדו-אקסיאלי לקבלת עזרה במיקום החרוזים.
    4. חזור על שלבים 1.4.2 ו- 1.4.3 עבור שלושה חרוזים נוספים עד להשלמת המערך המרובע. ודאו שהחרוזים מחוברים היטב, ונקודות הדבק המתאימות שלהם אינן נוגעות זו בזו או נדבקות זו לזו. מייבשים את הדבק לפני הורדת הרקמה לאמבטיית המים.
      1. אם החרוזים דבוקים זה לזה, המתן עד שהדבק יתייבש, ואז השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החרוז או הדבק ולמשוך אותו מהרקמה.
        הערה: הדבק והחרוזים צריכים לרדת, ולאפשר למקם מחדש את מיקום החרוזים.
  5. תנאים מוקדמים
    1. צור פרוטוקול תנאים מוקדמים מבוקר כוח, שבו הרקמה עם אורך ועובי הקצה תעבור שש חזרות של העמסה שווה-צלעות לשיא מתח ממברנה T של 40 N/m עם מטען מקדים של 3% × Tשיא10 וזמני מתיחה והתאוששות של 30 שניות כל אחד.
      1. בנה ספריית בדיקות שרירותית שתאחסן באופן זמני את הנתונים לחישובים עתידיים. הגדר את קצב הטעינה להיות 4.42 N/m.
      2. בנה קבוצת פרמטרים חדשה לבדיקה עם השם Precondiditioning0. הגדר את מצבי הבקרה של ציר X וציר Y כדי לכפות והגדר את פונקציות הבקרה לצעד. הגדר את גודל העומס ככוח המשויך לשיא T, כלומר, שיא f = שיא T · L. הגדר את גודל הטעינה מראש כ- 3% משיא f עבור החזרה הראשונה בלבד והגדר הן את משך המתיחה והן את משך ההתאוששות כ- 30 שניות. הגדר את מספר החזרות כ- 10.
        הערה: השיא המחושב הראשון של מתח פיולה-קירכהוף, כלומר שיא P= Tpeak/t, עשוי לעלות על 200 kPa עבור רקמות דקות יותר, מה שעלול לגרום לקריעת רקמות במהלך הבדיקה. בתרחישים אלה, שיא מתח הממברנה הותאם ללחץ פיולה-קירכהוף ראשון מקסימלי של 200 kPa.
    2. הפעל את פרוטוקול התנאים המוקדמים. לאחר תנאים מוקדמים, רשמו את ממדי ה-X וה-Y הנוכחיים של הדגימה לשימוש בפרוטוקולי הבדיקה הדו-אקסיאליים.
  6. יצירה וביצוע של פרוטוקולי בדיקה דו-אקסיאליים
    1. קבע את הזמן הדרוש כדי להשיג את תצורת השיא השווה-שוויון מהתצורה שלאחר התנאים המוקדמים עם קצב התזוזה הרצוי. בהתחשב בקצב תזוזה קבוע, חישב את זמני הטעינה עבור יחסי הטעינה הנותרים (כלומר, TXX:TYY = 1:0.5 ו - TXX:TYY = 0.5:1).
    2. הפעל ידנית את המפעילים הליניאריים כדי להתאים את כוחות המטרה ליחס טעינה נתון. חזור על תהליך זה ותעד את מידות העלון עבור כל יחסי הטעינה.
    3. הכן פרוטוקול בדיקה מבוקר תזוזה המעביר באופן ביאלי את הרקמה מהתצורה שלאחר התנאים המוקדמים לתצורות שנרשמו בשלב 1.6.2 (כלומר, TXX:TYY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) בתוך הזמנים שנקבעו בשלב 1.6.1. ודא שלכל פרוטוקול יש שלושה מחזורי טעינה/פריקה כדי לחזור על ההתנהגות המכנית.
      1. בנה ספריית בדיקה שתאחסן את הנתונים לחישובים עתידיים. ודא ששם הספרייה תואם לדגימה הנוכחית.
      2. בנה פרמטר בדיקה חדש עם השם 1:1, הגדר את מצבי הבקרה של ציר X וציר Y לתזוזה והגדר את פונקציות הבקרה לרמפה. הגדר את גודל המתיחה כתצורה שנרשמה בשלב 1.6.1. הגדר את גודל הטעינה מראש כ- 3% משיא f עבור החזרה הראשונה בלבד, והגדר הן את משך המתיחה והן את משך ההתאוששות כזמן שנרשם בשלב 1.6.1. הגדר את מספר החזרות כ- 3.
      3. חזור על שלב 1.6.3.2 עבור יחסי הטעינה הנותרים (כלומר, TXX:TYY = 1:0.5 ו - TXX:TYY = 0.5:1), למעט הגדרת גודל הטעינה מראש כלא מוחל. ודא שגודל המתיחה, משך המתיחה ומשך ההתאוששות תואמים לאלה שנרשמו בשלב 1.6.2.
        הערה: רק נתונים מהמחזור הסופי (השלישי) ישמשו לניתוחי מתח ומתח.
    4. בצע את הפרוטוקולים הנשלטים על-ידי תזוזה. לאחר השלמת הבדיקה הדו-אקסיאלית, החזירו את הרקמה לממדיה שלאחר תנאים מוקדמים.
      הערה: יש לבטל את הבדיקה באופן מיידי אם הרקמה מתחילה להיקרע.
  7. אפיונים נוספים
    1. השאירו את הרקמה שקועה במי DI והורכבה על מערכת הבדיקה הדו-אקסיאלית. בצע הדמיית pSFDI כמתואר בשלבים 2.1-2.3.
    2. שחררו את הרקמה. אם זוהי רקמה שלמה, המשך למיקרו-דיסקציה המתוארת בשלבים 3.1-3.7. אם לא, לאסוף היסטולוגיה בעקבות שלב 3.7.
      הערה: אמבט המים DI יכול לשמש לאפיונים הבאים באותו יום.
    3. חזור על שלבים 1.2-1.7 עם שכבות ה-A/S וה-F/V שנרכשו לאחר המיקרו-דיסקציה (שלבים 3.1-3.6).
      הערה: החזרה על פרוטוקול הבדיקה של השכבות מאפשרת השוואה ישירה של הרקמה השלמה לשכבות שלה.
  8. בדיקה דו-אקסיאלית של נהלי עיבוד נתונים לאחר עיבוד
    1. בצע מתאם תמונה דיגיטלי של תמונות הבדיקה הדו-אקסיאליות שנרכשו כדי לקבוע את מיקומי הסמן התלויים בזמן. חישוב תזוזות הסמן הפידוקיאלי באמצעות Eq (1). 5
      Equation 6 (1)
      כאן, xi(t), Xi ו- di(t) הם המיקום התלוי בזמן, המיקום הראשוני (הפניה) והתזוזה של הסמן i.
    2. חישוב גרדיאנט העיוות F על ידי התחשבות בסמנים הפידוקיאליים כאלמנט סופי דו-ליניארי בעל ארבעה צמתים, כפי שמוצג ב- Eq (2)5
      Equation 1 (2)
      כאשר BXi ו-BYi הם הנגזרות של פונקציות הצורה עבור צומת i בכיווני X ו-Y, בהתאמה, ו-ui(t) ו-vi(t) הם הרכיבים של di(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T.
    3. חישוב הלחץ הראשון של פיולה-קירכהוף P באמצעות הכוחות שנרשמו, כמו ב- Eq (3)5
      Equation 3 (3)
      PXX ו-PYY הם רכיבי X ו-Y של P; L ו-t הם אורך ועובי קצה הרקמה; fX ו-fY הם הכוחות שנרשמו בכיווני X ו-Y.
    4. קבע מדדי מאמץ ומתח אחרים לפי הצורך,13 הכוללים את העיוות הנכון של קאוצ'י-גרין C = FT/F, זן גרין-לגראנז' E = (C - I)/2, σ הלחץ הקאוצ'י = J-1PFT, ואת הלחץ השני של פיולה-קירכהוף S = F-1P.
      הערה: כאן, I הוא טנזור זהות מסדר שני, ו- J = det(F) הוא היעקוביאן של גרדיאנט העיוות F.

2. הדמיית תחום תדרים מרחביים מקוטבים

  1. הכנת מערכת
    הערה: אם תרצה, ניתן להסיר את הסמנים הפידוציאליים מהרקמה לפני השלבים הבאים.
    1. מרכז את התקן ה-pSFDI מעל הדגימה (איור 2). הפעל את המקרן והאיר את הדגימה באור של 490 ננומטר (ציאן).
    2. פתח את תוכנת המצלמה ובדוק את שדה הראייה של המצלמה. ודא שהדגימה ממורכזת במסגרת ומוכלת לחלוטין בתוך שדה הראייה.
    3. אם הדגימה המותקנת היא עלון שלם, התאימו את בהירות המקרן של עיבוד האור הדיגיטלי (DLP) כדי להבטיח שהרקמה מוארת במלואה ללא בוהק על פני הרקמה. אין להתאים את הבהירות אם הדגימה היא אחת השכבות המורכבות.
    4. סובבו את המקטב על פני טווח התנועה המלא שלו כדי לזהות בוהקים או לכלוך אפשריים בעדשת המקטב. יש לנקות בזהירות את עדשת המקטב באמצעות מטלית מיקרופייבר לפי הצורך.
  2. איסוף נתונים
    הערה: ניתן להפוך את איסוף הנתונים הבא לאוטומטי באמצעות תוכנה, כגון LabVIEW או Python.
    1. הזיזו את המקטב למיקום הביתי שלו – מיושר באופן אידיאלי עם אחד מצירי הבדיקה הדו-אקסיאליים. צלם תמונה אחת בגווני אפור ושמור אותה במחשב עם מיקום המקטב (כלומר, 0°).
    2. סובב את המקטב ב- 5° וצלם תמונה נוספת בגווני אפור. חזור על תהליך זה כדי לרכוש 37 תמונות הנעות בין 0° ל- 180° עם תוספת של 5°.
      הערה: ניתן לנתח באופן ראשוני את התמונות מרצף ההדמיה הראשון של pSFDI כדי להבטיח את התגובה האופטית הרצויה מהרקמה. עיין בשלב 2.3 לקבלת הוראות.
    3. חזור על רצף ההדמיה של pSFDI עבור תצורות רקמה רצויות אחרות, לדוגמה, תצורות השיא של פרוטוקולי הטעינה הנחשבים לבדיקה מכנית דו-אקסיאלית.
  3. pSFDI נתונים לאחר עיבוד נהלים
    הערה: השיטה הבאה כוללת שלבים עבור שפת התוכנית MATLAB. עם זאת, ניתן להשתמש בכל שפה מועדפת (לדוגמה, Python, C++) במקום זאת.
    1. השתמש בפונקציה MATLAB imread() כדי לבנות מערכים המכילים את העוצמות מבחינת פיקסלים של 37 התמונות שנרכשו. מטעמי נוחות, סדרו אותם כ-n × m × 37 מערך תלת-ממדי, כאשר n ו-m הם מספרי הפיקסלים לאורך שני הצירים.
    2. הגדר את אזור העניין של הרקמה (ROI) באמצעות פונקציית grabit() המוגדרת על-ידי המשתמש.
    3. התאם את נתוני העוצמה לעומת זווית המקטב עבור כל פיקסל ROI באמצעות סדרת פורייה בת 3 מונחים, כמו ב- Eq (4):
      Equation 4 (4)
      כאן, I(θ) היא העוצמה מבחינת פיקסלים כפונקציה של זווית המקטב, ו-bi הם קבועי פורייה. השתמש ברגרסיה סטנדרטית של ריבועים ליניאריים לפחות כדי לקבוע bi.
    4. קבע את כיוון הסיבים מבחינת פיקסלים כזווית המקטב המשויכת לערך המרבי של I(θ). חישוב מידת האניזוטרופיה האופטית (DOA) באמצעות Eq (5).
      Equation 5 (5)
    5. השתמש ב-plot() וב-histogram() כדי להמחיש את כיוון הסיבים הנרכש ואת ערכי ה-DOA. שמור את התוצאות המעובדות לשימוש מאוחר יותר.

3. מיקרו-דיסקציה של שכבות מרוכבות עלון שסתום טריקוספידיות

  1. חיבור רקמות ללוח שעווה
    1. לאסוף את החומרים הנדרשים: לוח שעווה, מים DI, פיפטה, אזמל, מיקרו מספריים, מלקחיים דקים, מלקחיים מעוקלים, מלקחיים עבים וסיכות.
      הערה: השתמש רק בפינצטה ללא שיניים או אחיזות, שכן מלקחיים מסוג זה יכולים בקלות רבה לקרוע את הרקמה הדקה של שכבת ה- A/S בעת ביצוע הנתיחה.
    2. שחררו את הרקמה מהבודק הדו-אקסיאלי ומדדו את עוביה באמצעות חיישן תזוזת הלייזר המתואר בשלב 1.2. מניחים את הרקמה על לוח השעווה.
    3. יש לבחון את הצד החדרי של הרקמה לאיתור תוספות גדולות של כורדה. שים לב למיקום של תוספות אלה כדי להימנע מהן במהלך הניתוח (איור משלים S1). צלם תמונה לעיון.
    4. מורחים את הרקמה שטוחה על לוח השעווה כאשר האטריאליס פונה כלפי מעלה. הצמד את הרקמה ללוח באמצעות הפינים:
      1. בכל פינה של הרקמה, הניחו סיכה אחת שנמצאת בזווית הרחק מהרקמה (לצפייה טובה יותר) ומשכה מעט את הרקמה מתוחה (איור 3A). עשו זאת בסדר כיוון השעון או נגד כיוון השעון. יש לוודא כי הפינים נמצאים מחוץ לחורים שנוצרו על ידי הטינים בעת הרכבת הרקמה.
      2. התאימו מעט את מיקום הפינים כדי לוודא שהרקמה מתוחה ובתצורה מרובעת (איור 3B) כך שהרקמה תהיה שטוחה ולא תזוז במהלך המיקרו-דיסקציה של השכבה.
      3. במידת הצורך, מניחים סיכות לאורך צד הרקמה במהלך הנתיחה כדי למתוח את הרקמה יותר. יש לזכור בעת הצבתם וסיכות נוספות שיש לעקוף אותן במהלך הנתיחה.
      4. הסר את סמני חרוזי הזכוכית.
        הערה: השלב הבא הוא אופציונלי. מי ה-DI המוספים מסייעים בשמירה על הידרציה של הרקמות ומונעים מהרקמה להיצמד לעצמה לאורך כל המיקרו-דיסקציה.
      5. באמצעות פיפטה, מניחים מי DI על פני הרקמה כך שהם מכסים לחלוטין את הרקמה באופן דמוי בועה. מלאו את מי ה-DI לפי הצורך לאורך כל הנתיחה.
  2. הפוך את הפינה הראשונית.
    1. בחר פינה של הדגימה המוצמדת כדי להתחיל את הנתיחה. הימנעו מתוספות צ'ורדה גדולות ואזורים דקים במיוחד.
    2. בצעו חתך בשכבת ה-A/S על-ידי גרירה קלה של האזמל מעל משטח הרקמה לאורך חורי ההרכבה מבדיקה מכנית (איור 3C). ודאו שאורכו של החתך הוא לפחות 5 מ"מ, ושולי החתך מתחילים להתפרק, וחושפים את שכבת ה-F/V שמתחת.
    3. השתמשו במלקחיים הדקים (ללא קצה חד) כדי לשפשף בחוזקה לאורך החתך ולמשוך את קצוות החתך זה מזה (איור משלים S2).
      1. אם החתך בשכבת ה-A/S לא מתחיל להתפרק, יש לעקוב קלות אחר אותו חתך שוב עם האזמל עד שהוא מתחיל לעשות זאת. היזהרו שלא לחתוך עמוק מדי לתוך הרקמה (מעבר לשכבת ה-A/S המורכבת) מכיוון שזה מקשה על הפרדת השכבות בצורה נקייה.
    4. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.2.3 כדי ליצור חתך שני בניצב לחיתוך הראשון (איור 3D). ודא ששני החיתוכים מחוברים ויוצרים פינה.
      1. אם שני החתכים אינם מחוברים, הפעילו את הפינצטה הדקה מתחת לשטח הקטן של הרקמה המפריד בין שני החתכים (איור משלים S3). לאחר מכן, בזהירות להשתמש במספריים כדי לחתוך את הרקמה.
  3. מקלפים את הרקמה מהפינה.
    1. משפשפים לאורך החתכים באמצעות המלקחיים הדקים עד שהרקמה מתחילה להיפרד משכבת ה-F/V. ברגע שפיסת רקמה קטנה מופרדת, תפסו אותה בפינצטה ומשכו אותה בעדינות כדי להפריד עוד יותר את השכבות המורכבות.
      הערה: הנח תמיד את קצה הפינצטה הדקה מעבר לקצה הרקמה בעת האחיזה. אחרת, הם עלולים בטעות לתקוע חור בשכבה המורכבת A/S.
    2. ממשיכים לקלף את הרקמה ולשפשף את התפר עד שהיא מגיעה לקצה שני החתכים שנעשו עבור הפינה. לאורך כל התהליך הזה, עברו לפינצטה גדולה יותר כדי לתפוס את הרקמה של תהליך הקילוף כדי למנוע קריעה לא רצויה וקריעה של השכבה המורכבת A/S.
      1. אם בפינה הראשונה שנוסתה יש בעיות משמעותיות בהפרדה, נסה פינה אחרת כנקודת התחלה (חזור לשלב 3.2).
  4. להאריך חתכים, לקלף את הרקמה, ולעשות פינה שנייה.
    1. הרחיבו את שני החיתוכים שנעשו עבור הפינה הראשונה על ידי הצבת קצה האזמל בתחתית כל חתך וגרירה קלה שלו לאורך משטח הרקמה (איור 4A). ודא שכל חתכי ההארכה הם לפחות 5 מ"מ ושלוחות החתך מתחברות לחיתוכים המקוריים וממשיכות לעקוב אחר חורי הטין או התפר.
      הערה: אם חתך ההרחבה עמוק מדי, יש לעקוב מקרוב אחר הפילינג הקרוב כדי לוודא שחלקים של הפיברוסה אינם מופרדים בשכבת A/S המורכבת (איור 5A).
    2. המשיכו להאריך את החתכים ולקלף את שכבת ה-A/S המורכבת העליונה בחזרה תוך כדי שפשוף התפר עד לסיום צד אחד. שימו לב שהרקמה תופרד לחלוטין לאורך חתך אחד; ודא שהתפר בין השכבות המורכבות A/S ו-F/V יהיה ישר (איור 4B).
    3. חזור על ההוראות בשלב 3.2 ובשלב 3.3 כדי ליצור פינה שנייה בניצב לקצה הצד המקולף במלואו (איור 4C).
  5. הפרד לחלוטין את שכבת ה-A/S.
    1. הרחיבו את החתכים הנותרים תוך הימנעות מהכנסות גדולות של צ'ורדה. המשך להפריד בין שכבות ה-A/S וה-F/V באמצעות טכניקות השפשוף והמשיכה שבהן נעשה שימוש עבור הפינה הראשונה. שים לב למספר שיקולים או בעיות שעלולים להתעורר במהלך תהליך זה:
      1. אל תכלול את התוספות של הכורדה מאזור ההפרדה A/S (איור 5B) רק כאשר החרגה זו תאפשר דגימת A/S גדולה מספיק לאפיונים ניסיוניים (>3.3 מ"מ).
      2. אם הרקמה נקרעת או נוצר חור, יש להפסיק להפריד את הרקמה באופן מיידי. כדי למנוע לכידת פינצטה, הניחו את המספריים בכל חור שנוצר וחתכו את הרקמה מהמרכז. אם הפגם נוצר לאורך תפר ההפרדה, התחילו להפריד את הרקמה לאורך קצה אחר כדי למנוע קרע נוסף (איור 5C).
      3. חפשו קשרים בין-שכבתיים שעשויים להופיע בעת הפרדת הרקמה ולמנוע הפרדה נוספת של הרקמה ללא סיכון גבוה לקריעה (איור 5D). שימו לב שאלו גדילים דקים אך חזקים שיש לחתוך בזהירות באמצעות מספריים. הימנעו מיצירת חור בשכבת ה-A/S או חיתוך כלפי מטה לשכבת ה-F/V, מכיוון שהדבר יגרום להפרדה לא אחידה.
      4. המשך בתהליך זה עד להפרדת הדגימה הגדולה ביותר האפשרית של שכבת ה- A/S. סמן את כיוון הדגימה באמצעות העט הכירורגי (איור 6A).
  6. סיים את הנתיחה.
    1. השתמשו במספריים כדי לחתוך לאורך תפר ההפרדה עבור קצה הרקמה הנותר (איור 6B). ודא שחתך זה קרוב ככל האפשר לתפר ההפרדה.
    2. מניחים את השכבה המורכבת המופרדת A/S שטוחה על משטח החיתוך. במידת הצורך, השתמש באזמל כדי ליישר את קצוות הרקמה וליצור צורת רקמה מרובעת המתאימה לבדיקה מכנית דו-אקסיאלית. מניחים את שכבת ה-A/S במי DI עד שהיא מוכנה לבדיקה.
    3. סמן את הכיוון של שכבת ה-F/V שנותרה על לוח השעווה. חותכים את הריבוע הגדול ביותר האפשרי מחוץ לשטח שבו הוסרה שכבת ה-A/S (איור 6C), ואז מניחים אותה במי DI.
  7. היסטולוגיה
    1. לבלות שתי רצועות של רקמה – מיושרות עם הכיוונים ההיקפיים והרדיאליים – לשימוש בהיסטולוגיה. השתמש בפרוטוקולים שונים עבור השכבות השלמות והשכבות המורכבות (כלומר, A/S ו- F/V).
      1. עבור השכבה השלמה, קח את הדגימות מהרקמה שנותרה מוצמדת ללוח השעווה. השתמשו ברקמה מחוץ לחורי הטין/תפר, שכן חלק זה של הרקמה לא נותח וייצג את העלון השלם.
      2. עבור השכבות המורכבות A/S ו-F/V, אספו דגימות היסטולוגיה רק לאחר השלמת הבדיקה וההדמיה במלואן. שחררו את הדגימה ממערכת הבדיקה הדו-אקסיאלית, הניחו את הרקמה שטוחה על משטח חיתוך, וכרתו את הרצועות ההיקפיות והרדיאליות באמצעות סכין גילוח.
    2. מניחים את הרצועות שנכרתו בקלטות רקמות ומטביעים את הקסטות ב-10% פורמלין.
    3. השליכו את הרקמה הנותרת. נקו את כלי הנתיחה באמצעות תרכובת ניקוי (ראו טבלת החומרים).
    4. לאחר 24-48 שעות של קיבוע, העבר את הקלטות לאתנול, שם ניתן לאחסן אותן ללא הגבלת זמן עד לעיבוד היסטולוגיה וצביעה.
      הערה: ניתוח היסטולוגי זה יכול לאשר כי המיקרו-דיסקציה מוצלחת. אזהרה: 10% פורמלין גורם לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. זה עלול גם לגרום לתגובה אלרגית או לסרטן באמצעות שאיפה. בעת הטיפול, לבשו ציוד הגנה אישי מתאים, כגון כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה, והשתמשו רק בחללים מאווררים היטב, כגון במכסה אדים. כאשר אינו בשימוש, ודא שמיכל האחסון סגור היטב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המיקרו-דיסקציה תניב דגימות A/S ו-F/V בעוביים אחידים יחסית שניתן להרכיב על מכשיר בדיקה דו-אקסיאלי (מסחרי). ניתוח היסטולוגי של העלון השלם ושתי השכבות המנותחות יוודא אם הרקמה הופרדה כהלכה לאורך הגבול בין הספונטיוסה לפיברוסה (איור 7). בנוסף, ניתן להשתמש במיקרוגרפים ההיסטולוגיים כדי לקבוע את עובי שכבת הרקמה ואת שברי המסה המרכיבים באמצעות תוכנת ImageJ. דיסקציה כושלת מתרחשת כאשר היא מייצרת דגימת A/S קטנה מדי להרכבה לבוחן הדו-אקסיאלי. זה קורה לרוב כאשר ה-A/S נקרע במהלך הקילוף, או כאשר נוצר חור בשכבת ה-F/V עקב כורדה עבה.

הבדיקות המכניות הנשלטות על ידי תזוזה והעיבוד שלאחר העיבוד מייצרות נתוני מתח-מאמץ המתארים את ההתנהגות המכנית הלא-ליניארית של הרקמה (איור 8). הדגימות הן בדרך כלל אניזוטרופיות, כאשר לכיוון הרקמה ההיקפית יש תגובה מכנית נוקשה יותר מאשר לכיוון הרקמה הרדיאלית (טבלה 1). ניתן לקבוע באופן כמותי תכונות אלה של מתיחה נמוכה ומתיחה גבוהה באמצעות טכניקות ניתוח נוספות 6,14. הערכה קולקטיבית של טווח יחסי הכוח הדו-אקסיאליים מספקת תובנה נוספת לגבי הצימוד הכיווני של הרקמה (כלומר, כוח ציר ה-X תלוי בכוח ציר ה-Y ולהיפך). חשוב לציין שההתנהגות המכנית של כיוון רקמה אחת ביחסי הכוח השונים הללו עשויה להראות דפורמציות דחיסה במהלך דפורמציות לא-יציבותיות. התנהגות ייחודית זו נובעת בדרך כלל מסיבי קולגן מיושרים מאוד לאורך כיוון הרקמה הדוחסת.

נתוני pSFDI מניבים מפות צבע של כיוון סיבי הקולגן ו-DOA (איור 9). באופן ספציפי, מפות צבע אלה מספקות הבנה מקיפה של ארכיטקטורת סיבי הקולגן בכל דגימת הרקמה. אחד היתרונות הייחודיים של טכניקת ה-pSFDI הלא-דיסטרוקטיבית הוא היכולת להשוות את התוצאות בין תצורות טעינה שונות ולהבין כיצד סיבי הקולגן מכוונים מחדש ו-uncrimp/align כדי לתמוך בהעמסה המיושמת. תוצאות אלה אינן אופטימליות אם האור המוקרן בהיר או כהה מדי במהלך ההדמיה, אם האור המוקרן אינו נשמר עקבי על פני העלון השלם ושכבותיו, אם יש בועות גדולות או פסולת על הדגימה, אם יש יותר מדי דבק על הרקמה ממיקום הסמן הפידוקיאלי, או אם מפלס אמבט המים נמוך מדי ויוצר נקודות של אור בהיר. כל אלה מובילים לייצוגים לא מדויקים של נתוני העוצמה המוחזרת לעומת זווית המקטב, מה שמפריע לכיוון הסיבים שנקבע ול-DOA המחושב.

Figure 1
איור 1: בחירת אזור המיקרו-דיסקציה. (A) זיהוי אזורים בעייתיים שיש להימנע מהם ו-(B) אזור המטרה עבור המיקרו-דיסקציה של השכבה. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ (A, B). קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מערכת ה-pSFDI משולבת עם התקן הבדיקה הדו-אקסיאלי. רכיבים מרכזיים של שני המכשירים מסומנים. קיצורים: pSFDI = הדמיית תחום תדרים מרחביים מקוטבים7; DLP = עיבוד אור דיגיטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: התחלת המיקרו-דיסקציה של העלון. (A) מתיחת הרקמה מתוחה תוך הנחת סיכות, (B) הרקמה המוצמדת המוכנה למיקרו-דיסקציה, (C) ביצוע החיתוך הראשון לשכבה המורכבת A/S, ו-(D) יצירת הפינה הראשונה של החיתוכים בשכבה המורכבת A/S. סרגלי קנה מידה = 10 מ"מ. קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף; A/S = אטריאליס/ספונגיוסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הפרדת השכבה המורכבת A/S. (A) הרחבת החיתוכים לשכבה המורכבת A/S, (B) הפרדת השכבה המורכבת A/S באמצעות קילוף זהיר, ו-(C) יצירת הפינה השנייה. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף; A/S = אטריאליס/ספונגיוסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: בעיות פוטנציאליות במהלך המיקרו-דיסקציה של העלון. (A) הפרדה לא מוצלחת של השכבות המורכבות A/S ו-F/V, (B) התאמה של אזור המיקרו-דיסקציה כדי למנוע הכנסת מיתרים, (C) יצירת תפר הפרדה חדש עקב חור לא רצוי, ו-(D) חיבור שזירה המחבר בין השכבות המרוכבות A/S ו-F/V. סרגלי קנה מידה = 5 מ"מ (A-C), 10 מ"מ (D). קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף; A/S = אטריאליס/ספונגיוסה; F/V = פיברוסה/חדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: השלמת המיקרו-דיסקציה. (A) דנוטציה של הפינה הימנית העליונה לכיוון, (B) הפרדת ה-A/S באמצעות מספריים, ו-(C) אחזור השכבה המורכבת F/V עם כיוון מסומן. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף; A/S = אטריאליס/ספונגיוסה; F/V = פיברוסה/חדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: הערכה היסטולוגית. מיקרוגרפים המציגים חתכים היקפיים של העלון (A) השלם ו-(B) הפרידו כראוי בין שכבות A/S ו-F/V. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: אטריאליס/ספונגיוסה; F/V = פיברוסה/חדרים; VIC = תא אינטרסטיציאלי וולוולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: תוצאות בדיקה מכניות דו-אקסיאליות מייצגות עבור יחס ההעמסה השווה-צלעות. מתח הממברנה לעומת נתוני המתיחה של עלון השסתום הקדמי (A) הטריקוספידי, (B) העלון האחורי של המסתם הטריקוספידי, ו-(C) עלון המחיצה של המסתם הטריקוספידי. קיצורים: אטריאליס/ספונגיוסה; F/V = פיברוסה/חדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: תוצאות pSFDI מייצגות. (A) תמונה גולמית של העלון במהלך הערכת pSFDI, (B) כיוון סיבים מכמת המוצג באמצעות מפת הצבעים, ו-(C) דרגה מכמתת של אניזוטרופיה אופטית, המוצגת באמצעות מפת הצבעים, המציינת את יישור הסיבים. החצים מציינים אזורים עם עודף דבק מהסמנים הפידוקיאליים. השורה העליונה מדגימה תמונות טובות, ואילו השורה התחתונה מדגימה תמונות גרועות. סרגלי קנה מידה = 4 מ"מ. קיצורים: deg. = מעלות; DOA = דרגת האניזוטרופיה האופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שכבה מורכבת λcirc λrad
A/S 1.26 ± 0.05 1.37 ± 0.05
F/V 1.17 ± 0.03 1.32 ± 0.08

טבלה 1: שכבה מורכבת ממוצעת נמתחת. מקטעי השיא הממוצעים של השכבות המורכבות מראים את השונות הצפויה בהתנהגויות המכניות. טבלה זו מופקת מ-9. קיצורים: אטריאליס/ספונגיוסה; F/V = פיברוסה/חדר.

איור S1 משלים: זיהוי אזורים שיש להימנע מהם במהלך מיקרו-דיסקציה. (A) בחינת הצד החדרי של דגימת הרקמה לאיתור החדרות של כורדה, (B) מעקב אחר האזורים הקשים שבהם ממוקמים הרקמה כאשר הרקמה ממוקמת עם אטריאליס הפונה כלפי מעלה, ו-(ג) תכנון חתכים ראשוניים כדי להימנע מאזורים מזוהים. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S2 משלים: הדגמה של שפשוף לאורך חתכים. (A) החתך לפני השפשוף בפינצטה קהה ו-(ב) קצוות החתך מפרידים יותר לאחר השפשוף. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: חתכים שאינם מקשרים. פינצטה משמשת לזיהוי האזור הדק של הרקמה המפריד בין שני החתכים לפני חיתוך קפדני של הרקמה עם מספריים. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. קיצורים: Rad. = רדיאלי; היקף = היקף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים עבור הפרוטוקול כוללים: (i) המיקרו-דיסקציה של השכבה, (ii) הרכבת הרקמה, (iii) מיקום הסמן הפידוקיאלי, ו-(iv) הגדרת pSFDI. מיקרו-דיסקציה מתאימה של השכבה היא ההיבט החשוב והקשה ביותר של השיטה המתוארת כאן. לפני פתיחת חקירה תוך שימוש בטכניקה זו, הדיסקטור(ים) צריכים לתרגל לטווח ארוך עם טכניקת המיקרו-דיסקציה וכל שלושת עלוני הטלוויזיה. הדיסקטור צריך לוודא שדגימות השכבה המורכבת גדולות מספיק (>3.3 מ"מ) ובעלות עובי אחיד. יש להשתמש בהיסטולוגיה כדי לאשר כי לנתחים יש באופן עקבי הפרדת שכבות מדויקת.

עבור הרכבה רקמה, הרקמה חייבת להיות מחוברת לבוחן הדו-אקסיאלי כך שהרקמה שטוחה ללא כל מתיחה מלאכותית או קימוט. שגיאות אלה יגרמו לנתונים מכניים לא מדויקים. השכבות המורכבות נוטות יותר לשגיאות אלה בשל אופיים הדק יותר. כאשר מדביקים את הסמנים הפידוקיאליים, חשוב ביותר שהסמנים ממוקמים בתוך האזור המרכזי של שליש מהרקמה ואינם נדבקים זה לזה. מיקום סמן לא הולם יגרום לכימות לא מדויק של מתיחות הרקמה. לבסוף, יש לבחור בקפידה את בהירות האור המוקרנת על ידי pSFDI ולהישאר ללא שינוי עבור הרקמה השלמה והשכבות המורכבות. אם הבהירות משתנה, לא ניתן להשוות את תוצאות ה-pSFDI בין הרקמה השלמה לבין השכבות המורכבות שלה.

הגמישות של השיטה המתוארת כאן טמונה בעיקר באפיון המכני הדו-אקסיאלי, בעוד שרוב פתרון הבעיות מתעורר במהלך הכימות המיקרו-סטרוקטורלי של קולגן מבוסס pSFDI. פרוטוקולי הבדיקה הנשלטים על ידי תזוזה מספקים שני יתרונות מרכזיים על פני פרוטוקולי בדיקה חלופיים הנשלטים על ידי כוח: (i) עקומות הלחץ-מתיחה חלקות יותר ללא תנודות, ו-(ii) קצב התזוזה (mm/s) ושיעור המאמץ (%/s) ניתנים לשליטה ישירה במקום קצב הטעינה (N/m). עם זאת, עדיין חובה לבצע תנאים מוקדמים מבוקרי כוח לפני האפיון המכני כדי לרכוש עקומות תזוזת כוח הניתנות לחזרה ולקבוע את תצורת הרקמה המספקת מתחים שווה-צלעות. לאחר שנקבעה תצורת השוויון, ניתן לקבוע את יחסי הטעינה הרצויים האחרים (לדוגמה, T XX: TYY = 1 : 0.5 ו- TXX: TYY = 0.5: 1) על ידי ריצה ידנית של המפעילים הליניאריים. זה מאפשר שכפול מדויק ביותר של המתחים הדו-אקסיאליים של המטרה עם היתרונות הנוספים של סכימה מבוקרת תזוזה. יתר על כן, ניתן להתאים את פרוטוקול הבדיקה המכנית הרב-תכליתי הזה כדי לשקול יותר יחסי טעינה או תנאי טעינה ייחודיים אחרים, כגון גזירה טהורה או הרפיית מתח. ניתן לכלול כימות pSFDI נוסף בפרוטוקולים חדשים אלה או בנקודות נפרדות לאורך נתיבי הטעינה. לפני ביצוע אפיוני pSFDI אלה, חשוב מאוד לוודא שאין בוהק, בועות או פסולת על הרקמה. לעתים קרובות, יש לבדוק כיוונים שונים של המקטב, גובה הנוזל של אמבט PBS, או שיטות למניעה/הסרה של פסולת ובועות כדי להבטיח כימות pSFDI מוצלח ומדויק.

ישנן שלוש מגבלות עיקריות של המיקרו-דיסקציה של השכבה. ראשית, ניתן להפריד את הרקמה השלמה לשתי שכבות מרוכבות בלבד, כלומר לא ניתן לבודד בנפרד את כל ארבע השכבות האנטומיות. הסיבה לכך היא שהרקמה דקה מכדי לנסות להפריד בין כל ארבע השכבות האנטומיות, והיעדר מרכיבים מבניים בספונטיוסה מונע את המיקרו-דיסקציה שלה. שנית, פרוטוקול זה משתמש במי DI במקום PBS. בעוד ש-PBS קרוב יותר לסביבה הפיזיולוגית15, השימוש ב-PBS במהלך הבדיקה הביא לניתוחים עקביים וכושלים עקב קריעה תכופה של שכבת ה-A/S המורכבת. השימוש במי DI הגביר באופן מיידי את הקלות וההצלחה של ניתוחים על ידי הפחתה משמעותית של הסבירות לחורים וקרעים בשכבת ה-A/S המורכבת. שלישית, למרות שהפרוטוקול הניסיוני נועד לספק נתונים מותאמים בין השכבות השלמות והמרוכבות, יש שונות ניכרת בין דגימה לדגימה בתכונות המכניות והמיקרו-סטרוקטורליות (טבלה 1). שונות זו עשויה לבלבל במידה מסוימת את ניתוח הנתונים; עם זאת, הניסיון שלנו9 ומחקרים נרחבים מהספרות 4,5,16,17 מראים כי הוא נופל בתוך תוצאות האפיון המכני האופייניות של שסתום טריקוספיד.

הפרוטוקול המוצג משמעותי משלוש סיבות עיקריות. ראשית, זהו הפרוטוקול היחיד שהפריד בהצלחה בין השכבות של כל שלושת עלוני הטלוויזיה. שנית, המבנה של פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה של התכונות האדריכליות המכניות וסיבי הקולגן של עלון טלוויזיה שלם עם השכבות המורכבות שלו. שלישית, מערכת pSFDI ייחודית זו מאפשרת כימות והדמיה של השינויים התלויים בעומס בארכיטקטורת סיבי הקולגן.

שיטת כריתת שכבה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות נוספות עם מורפולוגיה שכבתית, כגון העין או העור. מסגרת האפיון המכנית-מבנית המשולבת יכולה לשמש גם לרקמות עם הליכי הפרדת שכבות מבוססים, כגון שאר מסתמי הלב, העורקים או רקמות הוושט 18,19,20. בעוד שלבדיקות מכניות יש תפקיד מבוסס בהבנת התכונות המכניות של רקמות ביולוגיות, pSFDI הוא פיתוח חדש בהרבה שעדיין לא מומש במלואו בקהילת הביומכניקה של הרקמות הרכות. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לסינתזה של טכניקות אלה עבור רקמות ביולוגיות ולספק תובנה נוספת לגבי יחסי רקמה-מיקרו-מבנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפיתוח של איגוד הלב האמריקאי (16SDG27760143) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית. KMC נתמך בחלקו על ידי תוכנית הזדמנויות המחקר לתואר ראשון של אוניברסיטת אוקלהומה (OU) ותוכנית החניכות למחקר בהצטיינות. DWL נתמך בחלקו על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (GRF 2019254233) ואיגוד הלב האמריקאי / מלגת קדם-דוקטורט של קרן הלב לילדים (פרס #821298). כל התמיכה הזו זוכה להכרת תודה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered Sigma-Aldrich HT501128-4L
Alconox Detergent Alconox cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester CellScale Biomaterials Testing 1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat Dahle B0027RS8DU
Deionized Water N/A
Fine-Tipped Tool HTI INSTRUMENTS NSPLS-12
Forceps - Curved Scientific Labwares 16122
Forceps - Thick Scientific Labwares 161001078
Forceps - Thin Scientific Labwares 16127
LabJoy CellScale Biomaterials Testing Version 10.66
Laser Displacement Sensor Keyence IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue Loctite 2436365
MATLAB MathWorks Version 2020a
Micro Scissors HTI Instruments CAS55C
Pipette Belmaks 360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device N/A Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera.
See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel THINKPRICE TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) VWR International H3515541105024
Surgical Pen LabAider LAB-Skin-6
T-Pins Business Source BSN32351
Wax Board N/A Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat Pure Ponta mdo-azoc-1030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
  2. Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
  3. Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
  4. Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
  5. Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
  6. Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
  7. Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
  8. Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
  9. Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
  10. Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
  11. Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
  12. Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
  13. Reddy, J. N. An Introduction to Continuum Mechanics. , Cambridge University Press. (2013).
  14. Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
  15. Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
  16. Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
  17. Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
  18. Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
  19. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
  20. Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 180
מיקרו-דיסקציה של שכבה של עלוני שסתומים טריקוספידיים לאפיון מכני דו-אקסיאלי וכימות מיקרו-סטרוקטורלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, … More

Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, M., Lee, C. H. Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification. J. Vis. Exp. (180), e63522, doi:10.3791/63522 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter