Summary
Dit werk beschrijft de ontwikkeling van flexibele interdigitated elektroden voor implementatie in 3D hersentumormodellen, namelijk in vitro cultuur, in ovo model en in vivo murine model. De voorgestelde methode kan worden gebruikt om de effecten van gepulseerde elektrische velden op tumoren op verschillende niveaus van complexiteit te evalueren.
Abstract
Glioblastoom is moeilijk uit te roeien met standaard oncologische therapieën vanwege de hoge mate van invasiviteit. Bio-elektrische behandelingen op basis van gepulseerde elektrische velden (PEF's) zijn veelbelovend voor de verbetering van de behandelingsefficiëntie. Ze vertrouwen echter op stijve elektroden die acute en chronische schade veroorzaken, vooral in zachte weefsels zoals de hersenen. In dit werk werd flexibele elektronica gebruikt om PEF's aan tumoren af te leveren en de biologische respons werd geëvalueerd met fluorescerende microscopie. Geinterdigiteerde gouden elektroden op een dun, transparant paryleen-C-substraat werden gecoat met het geleidende polymeer PEDOT:PSS, wat resulteerde in een conformeerbaar en biocompatibel apparaat. De effecten van PEF's op tumoren en hun micro-omgeving werden onderzocht met behulp van verschillende biologische modellen. Eerst werden monolagen van glioblastoomcellen bovenop de elektroden gekweekt om verschijnselen in vitro te onderzoeken. Als tussenstap werd een in ovo-model ontwikkeld waarbij gemanipuleerde tumorsferoïden werden geënt in het embryonale membraan van een kwartel. Door de afwezigheid van een immuunsysteem leidde dit tot sterk gevasculariseerde tumoren. In dit vroege stadium van ontwikkeling hebben embryo's geen immuunsysteem en worden tumoren niet herkend als vreemde lichamen. Zo kunnen ze zich snel ontwikkelen terwijl ze hun eigen bloedvaten ontwikkelen vanuit het bestaande embryovasculaire systeem, dat een waardevol 3D-kankermodel vertegenwoordigt. Ten slotte werd flexibele elektrodetoediening van PEF's geëvalueerd in een compleet organisme met een functioneel immuunsysteem, met behulp van een syngene, orthograft (intracraniaal) muismodel. Tumorsferoïden werden geënt in de hersenen van transgene multi-fluorescerende muizen voorafgaand aan de implantatie van flexibele organische elektrode-apparaten. Een afgesloten schedelvenster maakte multifotonenbeeldvorming van de tumor en zijn micro-omgeving mogelijk tijdens de behandeling met PEF's gedurende een periode van enkele weken.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) is een zeer invasieve tumor en daarom moeilijk uit te roeien met standaardbehandelingen zoals resectie, radiotherapie en chemotherapie. Ondanks multimodale behandelingen blijft de prognose zeer slecht en ervaren de meeste patiënten ziekteprogressie binnen 1 jaar na diagnose 1,2. Onlangs heeft de ontwikkeling van bio-elektrische behandelingen een groot potentieel getoond om bestaande therapieën te verbeteren. Deze therapieën maken gebruik van de levering van gepulseerde elektrische velden (PEF), meestal in een enkele behandelingssessie, om de integriteit van het cellulaire membraan en de micro-omgeving van tumoren te verstoren. Deze celmembraanverstoring, ook bekend als elektroporatie, kan omkeerbaar of onomkeerbaar zijn, afhankelijk van de intensiteit van het elektrische veld en het aantal pulsen. Irreversibele elektroporatie (IRE) wordt toegepast als een niet-thermische weefselablatietechniek waarbij elektrische pulsen fatale schade aan celmembranen veroorzaken, wat leidt tot celdood3. Reversibele elektroporatie wordt toegepast in elektrochemotherapie (ECT), een gevestigde techniek die bestaat uit de toediening van PEF's in combinatie met chemotherapiegeneesmiddelen om de opname van geneesmiddelen in kankercellen te verbeteren4. Bovendien toonden recente studies calciumelektroporatie aan als een alternatief voor ECT met een hoge efficiëntie voor de behandeling van kanker, wat ook goedkoop is en minder bijwerkingen veroorzaakt5. Ondanks deze veelbelovende vooruitgang worden PEF's over het algemeen toegepast met behulp van stijve, metalen elektroden waarvan bekend is dat ze schade aan zacht weefsel veroorzaken6. De hersenen zijn bijzonder gevoelig voor dergelijke invasieve apparaten waarbij de mechanische mismatch ontstekingen en astrogliale littekens veroorzaakt7.
In deze context wordt een flexibel PEF-toedieningssysteem in combinatie met 3D-modellen van glioblastoomtumoren gepresenteerd, van microfabricage tot een muizenmodel. Conformale elektroden worden gemaakt met standaard dunne-film microfabricageprocessen, inclusief het gebruik van zachte en biocompatibele materialen zoals paryleen-C, goud en PEDOT:PSS 8,9. Een geïndigiteerd elektrodeontwerp wordt gebruikt om een groot oppervlak te bedekken met behoud van voldoende transparantie voor beeldvorming tussen de elektrodevingers10. Voor het tumormodel worden 3D-sferoïden van glioblastoomcellen die een genetisch gecodeerde fluorescentiereporter tot expressie brengen, geproduceerd met behulp van een variatie van de vloeistof-overlay 96-well plaatmethode11. De sferoïden worden geënt in het chorioallantoïsche membraan van een kwartelembryo, wat resulteert in een in ovo-model dat uitgebreid is gebruikt om angiogenese of medicijntoxicologie te bestuderen12,13. Tumoren kunnen worden geënt en gevasculariseerd door de vasculatuur van het embryo bij afwezigheid van een immuunsysteem in dit stadium van de embryonale ontwikkeling12. Flexibele elektroden worden vervolgens bovenop de gevasculariseerde tumor geplaatst om het effect van PEF-toediening op de sferoïde en zijn vasculatuur te bestuderen. Ten slotte worden deze effecten onderzocht op een compleet levend organisme, inclusief tumormicro-omgeving en immuunsysteem, door gemanipuleerde sferoïden te implanteren in het hersenparenchym van muizenmodellen14. Flexibele elektroden worden bovenop de inbrengplaats geplaatst en de craniotomie wordt afgesloten met een glazen venster, waardoor herhaalde beeldvorming van twee fotonen gedurende meerdere weken mogelijk is.
Deze methoden zullen nuttig zijn voor mensen die geïnteresseerd zijn in verschillende domeinen, variërend van micro-elektronica engineering tot oncologische toepassingen. Het microfabricageprotocol kan worden gebruikt en aangepast voor elke toepassing waarvoor dunne-film metaalelektroden vereist die zijn gecoat met PEDOT: PSS. Verder zullen de biologische modellen die zijn ontwikkeld voor de evaluatie van antitumor elektrische behandelingen van algemeen belang zijn voor het onderzoek naar de differentiatie van cellulaire, vasculaire en immuunrespons op geïmplanteerde materialen.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse wetgeving en in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap van 24 november 1986 (86/609/EEG) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Het onderzoek op dieren werd goedgekeurd door de Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône en goedgekeurd door de ethische commissie van Provence Cote D'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. Microfabricage van flexibele apparaten (figuur 1)
- Reiniging van de glasplaten
- Soniceer glasglaasjes in 2% zeepoplossing gedurende 15 minuten. Spoel ze af met water.
- Soniceer opnieuw in een mengsel van 80% pure aceton en 20% pure isopropanol gedurende 15 minuten.
LET OP: Deze oplosmiddelen zijn schadelijk en ontvlambaar. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en hanteer ze onder een zuurkast. - Spoel de glaasjes af met isopropanol en droog ze af met een luchtpistool.
OPMERKING: Zorg ervoor dat aceton tijdens het hele proces niet op de substraten droogt.
- Gouden elektrodepatronen (Figuur 1A)
- Deponeer een laag van 3 μm paryleen-C (PaC) met een paryleendepositiesysteem (figuur 1Aa).
- Plaats de gereinigde glasplaten in de afzettingskamer. Spuit zeep op de koelmachine, laat deze drogen en steek deze in de daarvoor bestemde koudeval van het afzettingssysteem. Deze anti-kleefstof vergemakkelijkt de eenvoudige verwijdering van PaC uit de koelmachine na de afzetting.
LET OP: PaC is irriterend en vormt een gevaar voor de gezondheid. Draag handschoenen tijdens het hanteren. - Weeg 6 g PaC in een aluminium boot en plaats het in de oven. Evacueer de machine (P = 10 mTorr) en start de afzetting met de volgende parameters: TChiller = -100 °C, TFurnace = 690 °C, TVaporizer = 175 °C en TChamber = 135 °C.
- Wanneer de afzetting is voltooid en de temperatuur van de vaporizer lager is dan 40 °C, zet je de koelmachine, verdamper en oven uit. Ontlucht de machine en verzamel de monsters.
- Plaats de gereinigde glasplaten in de afzettingskamer. Spuit zeep op de koelmachine, laat deze drogen en steek deze in de daarvoor bestemde koudeval van het afzettingssysteem. Deze anti-kleefstof vergemakkelijkt de eenvoudige verwijdering van PaC uit de koelmachine na de afzetting.
- Activeer het oppervlak van de monsters door zuurstofplasmabehandeling gedurende 30 s (100 W, 50 sccm).
- Spin-coat de plasmabehandelde monsters met een negatieve fotoresist op 1.000 x g gedurende 40 s. Plaats de monsters gedurende 2 minuten op een hete plaat bij 110 °C (figuur 1Ab).
LET OP: De fotoresist-oplossing is ontvlambaar en veroorzaakt irritatie; draag PBM's en hanteer deze onder een zuurkast. - Plaats een i-line filter in de bundellijn van de UV-breedbandcontactuitlijner en stel de fotoresist bloot door een masker met het geïnterdigiteerde elektrodeontwerp (figuur 1Ac).
OPMERKING: Interdigitated elektroden met een opening van 50 of 250 μm werden ontworpen met behulp van een lay-outeditor en fotomaskers werden besteld bij een bedrijf dat polyester fotomaskers produceert door middel van laserfotoplotting. - Bak bovenstaande monsters bij 110 °C op een hete plaat gedurende 3 min en laat ze 5 min afkoelen tot kamertemperatuur. Dompel monsters gedurende 3 minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de niet-blootgestelde fotoresist te verwijderen. Spoel monsters af met water en droog ze af met een luchtpistool (figuur 1Ad).
LET OP: De ontwikkelaarsoplossing is irriterend; draag PBM's en handvat onder een zuurkast. - Activeer het oppervlak van de monsters door zuurstofplasmabehandeling gedurende 60 s (100 W, 50 sccm).
- Deponeer een 20 nm hechtingslaag chroom en een 300 nm laag goud met een thermische verdamper als volgt (figuur 1Ae).
- Ontlucht de verdampermachine en klem de monsters (naar beneden gericht) op de bovenste ronde plaat met metalen schroeven. Vul de speciale kroezen respectievelijk met chroom en goud. Sluit de machine af en evacueer deze om een druk onder 5·10-6 Torr te bereiken. Start de rotatie van de monsterhouder.
- Selecteer de kroes die chroom bevat en verhoog langzaam de stroom die er doorheen gaat totdat een afzettingssnelheid van 0,2 Å·s-1 is bereikt. Open de sluiter en wacht tot 20 nm chroom is afgezet. Sluit de sluiter en laat de stroom langzaam zakken tot 0 mA.
- Selecteer de kroes die goud bevat en verhoog langzaam de stroom die er doorheen gaat totdat een afzettingssnelheid van 0,2 Å·s-1 is bereikt. Open de sluiter om goud te verdampen, wacht tot 10 nm goud is afgezet en verhoog vervolgens de afzettingssnelheid tot 1,5 Å·s-1 totdat ongeveer 300 nm is afgezet. Sluit de sluiter en laat de stroom langzaam dalen tot 0 mA.
- Laat de monsters na afzetting 15 minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Stop de rotatie van de monsterhouder, ontlucht de machine en verzamel de monsters.
- Dompel de monsters onder in een bekerglas met aceton. Plaats het bekerglas gedurende 15 minuten op een schudplaat die is ingesteld op 110 tpm om de fotoresist op te tillen. Spoel de monsters af met isopropanol en droog ze met een luchtpistool (figuur 1Af).
- Activeer het oppervlak van de monsters door zuurstofplasmabehandeling gedurende 30 s (100 W, 50 sccm).
- Leg een 3 μm isolatielaag PaC af met een paryleendepositiesysteem (zie stap 1.2.1) (figuur 1Ag).
- Deponeer een laag van 3 μm paryleen-C (PaC) met een paryleendepositiesysteem (figuur 1Aa).
- Omtrekopening (figuur 1B)
- Spin-coat de monsters met een positieve fotoresist op 600 x g gedurende 35 s. Plaats het op een hete plaat bij 110 °C gedurende 2 minuten (figuur 1Ba).
LET OP: De fotoresist-oplossing is ontvlambaar en veroorzaakt irritatie; draag PBM's en handvat onder een zuurkast. - Zorg ervoor dat er geen i-line-filter in de bundellijn van de UV-breedbandcontactuitlijner zit en stel de fotoresist bloot via een masker met de omtrek van het apparaat met een UV-breedbandcontactaligner (figuur 1Bb).
- Dompel de monsters gedurende 4 minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de blootgestelde fotoresist te verwijderen. Spoel de monsters af met water en droog ze met een luchtpistool (figuur 1Bc).
- Ets de omtrek door de twee lagen PaC met een reactieve ionenetser (160 W, 22 min, Ø2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Figuur 1Bd).
- Verwijder de resterende fotoresist met aceton, spoel af met isopropanol en droog de monsters met een luchtpistool.
- Spin-coat de monsters met een positieve fotoresist op 600 x g gedurende 35 s. Plaats het op een hete plaat bij 110 °C gedurende 2 minuten (figuur 1Ba).
- PEDOT:PSS-coating (figuur 1C)
- Spincoat een zeepoplossing van 2% op 70 x g gedurende 35 s (figuur 1Ca).
- Deponeer een 3 μm opofferingslaag van PaC met een paryleendepositiesysteem (zie stap 1.2.1) (figuur 1Cb).
- Spin-coat positieve fotoresist bij 600 x g gedurende 35 s. Plaats de monsters gedurende 2 minuten op een hete plaat bij 110 °C (figuur 1cc).
- Zorg ervoor dat er geen i-line filter in de bundellijn van de UV-breedbandcontactuitlijner zit en stel de fotoresist bloot via een masker met het actieve oppervlak van de elektroden (figuur 1Cd).
- Dompel de monsters gedurende 4 minuten onder in een metaalionvrije ontwikkelaar om de blootgestelde fotoresist te verwijderen. Spoel de monsters af met water en droog ze af met een luchtpistool (figuur 1Ce).
- Ets de PaC met een reactieve ionenetser om het actieve oppervlak van de elektroden te openen (160 W, 24 min, Ø2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Controleer met een microscoop of er geen rest-Pac op het actieve oppervlak aanwezig is (figuur 1Cf).
- Verwijder de resterende fotoresist met aceton, spoel af met isopropanol en droog de monsters met een luchtpistool.
- Activeer het oppervlak van de monsters met behulp van zuurstofplasmabehandeling gedurende 90 s (100 W, 50 sccm).
- Meng een commerciële dispersie van chemisch gepolymeriseerd PEDOT:PSS met 5 vol% ethyleenglycol (EG) en 0,1 vol% dodecylbenzeensulfonzuur (DBSA). Sonicate gedurende 15 min. Voeg 1 wt% (3-glycydyloxypropyl) trimethylsiloxaan (GOPS) toe en soniceer gedurende 5 minuten. Filtreer de oplossing door een filter van 1,2 μm.
LET OP: EG is irriterend en vormt een gevaar voor de gezondheid. DBSA is irriterend en corrosief. GOPS is corrosief. Draag geschikte PBM's en hanteer deze chemicaliën onder een zuurkast.
OPMERKING: Het totale volume is afhankelijk van het aantal monsters. Bereid voor 10 standaard glasglaasjes ten minste 20 ml voor die overeenkomt met de volgende hoeveelheden: 18,78 ml PEDOT:PSS, 1 ml EG, 20 μL DBSA en 200 μL GOPS. - Spin-coat vier lagen PEDOT:PSS-oplossing op 150 x g gedurende 35 s. Bak na afzetting van elke laag de monsters bij 110 °C gedurende 60 s op een hete plaat en koel ze gedurende 5 minuten af tot kamertemperatuur voordat de volgende laag wordt gedraaid (figuur 1Cg).
- Verwijder de opofferende PaC-laag door de monsters onder te dompelen in water (figuur 1Ch).
- Bak de monsters gedurende 1 uur op 140 °C.
- Dompel de monsters gedurende 30 minuten onder in gedeïoniseerd water om de resterende zeep en verbindingen met een laag moleculair gewicht in de PEDOT:PSS-film te verwijderen en monsters los te maken van het glazen substraat (figuur 1Ci).
- Aansluitingen en verpakking (figuur 1D)
- Leg een dun laagje acrylverf neer op een polyimidefilm die is gecoat met koper (figuur 1Da). Gebruik een aerosol om een homogene verflaag te verkrijgen (figuur 1Db).
- Patroon de acrylverf met een laser (75 kHz, 7 W, 1 lasergang, 400 mm·s-1) om twee rechthoekige contactpads (5 mm x 15 mm; 1,5 mm opening) te verkrijgen (figuur 1Dc).
- Ets het koper nat met verzadigd 30% (w/v) ijzerchloride (FeCl3) in water gedurende 15 minuten bij 40 °C (figuur 1Dd).
LET OP: FeCl3 is irriterend en corrosief; Behandel het met handschoenen onder een zuurkast. - Strip de acrylverf met aceton door er lichtjes over te wrijven met een doek (figuur 1De).
- Snijd de polyimidefilm met patroon in rechthoekige vormen (15 mm x 30 mm) met een laser (15 kHz, 10 W, 30 laserpassen, 130 mm·s-1) (figuur 1Df).
- Doseer zilverpasta met een drieassige doseermachine bij een druk van drie bar met een naald met een diameter van 330 μm (5 m·min-1) (figuur 1Dg).
LET OP: Zilverpasta is irriterend; Handvat met handschoenen. - Lijn de PaC-sonde uit en bevestig deze met de polyimidefilm onder een binoculaire microscoop met behulp van een pincet (figuur 1Dh).
OPMERKING: In stap 1.5.2 kunnen uitlijningsmarkeringen worden gemodelleerd om de positionering van de sonde op de contactpads te vergemakkelijken. - Bak op 140 °C gedurende 2 uur in de oven.
- Plaats een 1 cm2 polyimide beschermingstape op de contactpads (figuur 1Di).
- Dompel de interface waar de PaC-sonde en polyimidefilm zijn aangesloten in PDMS (Figuur 1Dj).
- Bak het 2 uur op 50 °C.
- Verwijder de beschermingstape om de contactpads te openen (figuur 1Dk).
OPMERKING: Microfabricage van in vitro apparaten is vergelijkbaar, maar stappen 1.2.1, 1.3 en 1.5 moeten worden overgeslagen.
2. Generatie van Glioblastoma GCaMP6f stabiele cellijn
- Lentivirus productie
- Kweek in een kolf van 75 cm² een van HEK 293T afgeleide cellijn die is geoptimaliseerd voor lentivirusproductie in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 4,5 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat en aangevuld met 10% tetracyclinevrij foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine gedurende ten minste 3 dagen tot 80% samenvloeiing.
- Haal het medium uit de kolf. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C.
LET OP: Trypsine / EDTA-oplossing vormt een gevaar voor de gezondheid; draag PBM's en handvat onder een zuurkast. - Voeg 8 ml kweekmedium toe. Spoel de celsuspensie voorzichtig door.
- Tel de cellen en plaat 4 x 106 cellen in een petrischaaltje in 8 ml kweekmedium.
- Verdun de volgende dag 25 μg van het plasmide met het gen GCaMP6f en een selectiemarker die resistentie tegen puromycine verleent in een totaal volume van 600 μL water. Voeg het toe aan een buisje transfectiereagens. Vortex gedurende 10 s bij 3.000 tpm en incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de productie van nanodeeltjes mogelijk te maken.
- Voeg de inhoud van de buis druppelsgewijs toe aan de kweek van HEK 293 T-cellen en rock voorzichtig met de hand. Incubeer cellen bij 37 °C gedurende ten minste 4 uur.
- Vervang de media die nanodeeltjescomplexen bevatten door verse media en breng de cellen terug bij 37 °C.
- Verzamel drie dagen later het supernatant en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 x g om celafval te verwijderen. Verzamel de vloeibare fase met virale deeltjes.
OPMERKING: De virusproductie in het supernatant kan worden bevestigd met behulp van een kwantitatieve lentivirale titertest en kan gedurende ten minste 2 jaar bij -80 °C worden bewaard.
- Glioblastoom cellen transductie
- Kweek in een kolf van 75 cm² glioblastoomcellen in 10 ml DMEM met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat en aangevuld met 10% tetracyclinevrije FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine gedurende ten minste 4 dagen.
- Gooi het medium weg en voeg het in stap 2.1.9 verkregen supernatant toe aan de doelcellen.
- Voeg 5 μg·ml-1 hexadimethrinebromide toe aan het medium om de transductie te verbeteren. Incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C. Vervang het medium door 10 ml vers medium.
LET OP: Hexadimethrine Bromide is een irriterend middel. Pak het aan met handschoenen.
- Generatie van een stabiele cellijn
- Voeg twee tot drie dagen na transductie 10 ml DMEM toe met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, 10% FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline, 100 μg·ml-1 van streptomycine en aangevuld met puromycine om de niet-getransduceerde cellen te doden. Kweek cellen in dit medium gedurende ten minste 3 dagen.
LET OP: Puromycine is een irriterend middel; Pak het aan met handschoenen.
OPMERKING: De gevoeligheid van cellen voor puromycine moet vóór transductie worden getest door cellen te kweken in hun aanbevolen medium dat verschillende concentraties puromycine bevat. Controleer een dag later de cellen met een microscoop. Kies de juiste concentratie waarbij de meerderheid van de cellen dood is, maar weinigen nog in leven zijn, om ervoor te zorgen dat het antibioticum niet te giftig is en ook de getransfecteerde cellen kan doden. - Verwijder het medium en spoel de cellen af met 10 ml PBS.
- Voeg 1 ml 0,25% van een trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voeg 8 ml kweekmedium toe. Spoel de celsuspensie voorzichtig door.
- Verzamel 100 μL celsuspensie en meet de celconcentratie met een celteller. Zuig 50 μL celsuspensie op in een handheld geautomatiseerde celteller met een sensor van 60 μm.
- Zaad 1 cel/put in een 96-well plaat. Voeg bijvoorbeeld voor een concentratie van 1 x 10 3 cellen per ml 1 / (1 x 103) toe, d.w.z. 0,001 ml celsuspensie per put. Zaai elke put om de kans op succes te vergroten. Compleet met kweekmedium om een totaal volume van 200 μL per put te bereiken.
- Zoek een dag later elk putje met één cel en controleer de fluorescentie (λexc = 490 nm en λem = 530 nm). Markeer de putjes die slechts één getransfecteerde cel bevatten. Ga door met de groei gedurende een paar dagen totdat de put bijna samenvloeit.
- Gooi het medium weg en spoel de cellen af met 200 μL PBS. Voeg 100 μL 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de 96-well-plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voeg 100 μL medium toe en spoel de celsuspensie voorzichtig door. Breng de celsuspensie over in een petrischaaltje. Voeg 5 ml medium toe en laat de cellen een paar dagen groeien tot de petrischaal bijna samenvloeit.
- Gooi het medium weg en spoel de cellen af met 5 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de petrischaal gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voeg 6 ml medium toe en spoel de celsuspensie voorzichtig door. Breng de celsuspensie over in een T25-kolf. Ga door met de groei gedurende een paar dagen totdat de kolf bijna samenvloeit.
- Gooi het medium weg en spoel de cellen af met 5 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine/EDTA-oplossing toe en incubeer de T25-kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 7 ml DMEM toe met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine. Spoel de celsuspensie voorzichtig door.
- Splits de celsuspensie in vier T25-kolven (2 ml per kolf) en voeg 5 ml medium toe aan elke kolf. Laat de cellen een paar dagen groeien tot de kolven bijna samenvloeien.
- Herhaal stap 2.3.12 voor drie kolven en houd de laatste kolf voor stap 3.1.3. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 150 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celkorrel in 900 μL. Meng de cellen voorzichtig om een homogene celsuspensie te behouden.
- Breng de celsuspensie over in cryogene opslagflacons. Voeg 100 μL dimethylsulfoxide toe. Plaats de cryovialen een nacht op -80 °C. Breng bevroren cellen over naar vloeibare stikstof voor verdere experimenten.
OPMERKING: De efficiëntie van de transfectie kan worden beoordeeld door 5 μM ionomycinecalciumzout in het medium toe te voegen en de geïnduceerde toename van fluorescentie onder een fluorescentiemicroscoop te controleren (λexc = 490 nm en λem = 530 nm).
- Voeg twee tot drie dagen na transductie 10 ml DMEM toe met 1 g· L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, 10% FBS, 100 eenheden·ml-1 penicilline, 100 μg·ml-1 van streptomycine en aangevuld met puromycine om de niet-getransduceerde cellen te doden. Kweek cellen in dit medium gedurende ten minste 3 dagen.
3.3D modellen
- Sferoïde cultuur
- Bereid een oplossing van 1% (m/v) agarose in gedeïoniseerd (DI) water.
- Voeg 100 g agarosepoeder toe aan 100 ml DI-water en verwarm de oplossing in een magnetron tot al het poeder is opgelost. Roer de oplossing regelmatig om klonten te voorkomen. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten bij 120 °C.
- Eenmaal uit de autoclaaf gehaald, voeg je voorzichtig 75 μL agarose-oplossing per put toe in een plaat met 96 putten. Zet het aan de zijkant van de put om een meniscus te vormen, wat resulteert in een niet-hechtende ronde bodem. Laat het 15 minuten stollen bij kamertemperatuur.
- Maak de cellen (stap 2.3.12) los van de in stap 2.3.14 verkregen kolf.
- Voeg 10.000 cellen per put van glioblastoomcellen toe en voltooi om een totaal volume van 150 μL per put te bereiken met DMEM dat 1 g bevat · L-1 van glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden·ml-1 penicilline en 100 μg·ml-1 streptomycine.
- Incubeer cellen bij 37 °C zonder de plaat gedurende 3 dagen te verplaatsen. Vervang vervolgens de helft van de media door verse media om de 2 dagen met een meerkanaals pipet tot verdere experimenten. Houd de pipetpunt in het bovenste deel van de put om schade aan de agarose of de sferoïde zelf te voorkomen.
OPMERKING: De grootte van de sferoïden hangt af van het aantal gezaaide cellen en de cellijn, dus het moet worden aangepast afhankelijk van de experimenten.
- Bereid een oplossing van 1% (m/v) agarose in gedeïoniseerd (DI) water.
- Het in ovo model
- Plaats bevruchte eieren van Japanse kwartel (C. japonica) in een broedmachine (37 °C en 57% vochtigheid) op trays met een automatische rotator die eieren om de 2 uur draait. Deze dag wordt beschouwd als Embryonale Dag (ED) 0.
- Was plastic weegboten door ze in 70% (w/v) ethanol te plaatsen. Haal de weegboten eruit en droog ze onder een zuurkast.
OPMERKING: Vanaf dit punt worden experimenten niet uitgevoerd in steriele omstandigheden. Er zijn echter schone omstandigheden vereist om de ontwikkeling van schimmels op de embryo's te voorkomen. - Open op ED3 de eieren voorzichtig met een pincet met dunne uiteinden voorgewassen met 70% (w / v) ethanol. Giet het embryo in een plastic weegboot, bedek het met een andere weegboot en plaats het gedurende 3 dagen in een standaard bevochtigde couveuse bij 37 °C.
- Maak op ED6 een kleine incisie in het chorioallantoïsche membraan (CAM) met een naald van 23 G.
- Plaats met behulp van een pipet een 7-daagse sferoïde op de incisie en breng het embryo gedurende 3 dagen terug naar de couveuse, tot verdere experimenten.
OPMERKING: Een fluorescerende kleurstof kan in het oog van het embryo worden geïnjecteerd om bloedvaten te visualiseren. - Plaats op de dag van het experiment de flexibele sonde bovenop de gevasculariseerde tumor met behulp van een micromanipulator.
- De in vivo model
OPMERKING: Dit deel van het protocol is aangepast van het eerder gepubliceerde deel als referentie14. Volwassen meerkleurige fluorescerende AMU-Neuroinflam muizen (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) werden gebruikt; deze muizen presenteren labeling van een subpopulatie van Thy1+ neuronen door transgene expressie van ECFP, labeling van perifere LyzM+ ontstekingscellen door transgene expressie van EGFP en etikettering van een subtype van microglia dat EYFP tot expressie brengt onder controle van Cd11c+. Kortom, de dieren worden licht verdoofd met 1,5% isofluraan gedurende 2 minuten voor elke behandeling of injectie. Voor de operatie worden de dieren verdoofd met Ketamine (120 mg/kg; IP) en Xylazine (12 mg/kg; IP). Vervolgens wordt 3% Lidocaïne-gel lokaal aangebracht om eventuele pijn in de oren te verlichten die gepaard gaat met de fixatie van stereotactische ondersteuning. Vervolgens wordt 0,25% Bupivacaïne-oplossing toegediend aan de operatieplaats om eventuele pijn als gevolg van de craniotomie te verlichten. Nadat de muis was voorbereid op een operatie, werd een craniotomie van 4 mm diameter uitgevoerd volgens referentie14. Met een naald van 26 G werd een gat gemaakt in de dura-mater in het midden van de craniotomie en werd de tumorsferoïde geïnjecteerd met het in referentie beschreven injectiesysteem14. Bovendien, zoals hier beschreven, werd een flexibele elektrode op de GCamp6 of DsRed geplaatst die tumorsferoïde tot expressie bracht voordat de craniotomie met een glazen venster werd afgesloten.- Plaats een druppel Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS) zodat deze de craniotomie bedekt. Plaats de flexibele elektrode op de druppel DPBS en plaats de achterkant van de sonde met contactpads voorzichtig op de rug van de muis (figuur 4B).
OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen en een "tip only" techniek. Vervang de handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak. Zorg voor thermische ondersteuning tijdens deze procedure. - Raak de DPBS-druppel aan met een klein stukje papier om DPBS te absorberen totdat de sonde plat op de dura kan liggen en de kromming van de hersenen kan volgen. Zorg ervoor dat een kleine laag DPBS onder de elektroden blijft zonder uit de zijkant van de elektrode te ontsnappen. Dit zorgt voor een barrière tegen lijmoverloop tijdens de volgende stappen.
OPMERKING: Steriliseer alle apparatuur voor gebruik. - Plaats een kleine druppel siliconenlijm op de sonde en bedek deze met een rond dekglas van 5 mm. Duw het afdekglas naar beneden totdat de siliconen gelijkmatig zijn verdeeld en de afstand tussen het afdekglas en de sonde minimaal is. Duw het afdekglas nog eens 30 s naar beneden zodat siliconen kunnen stollen.
- Om het dekglas vast te zetten, brengt u snel secondelijm aan de zijkanten aan en duwt u het naar beneden totdat de lijm is uitgehard.
- Breng met behulp van een tandenstoker secondelijm aan op de nek van de sonde en zorg ervoor dat de secondelijm onder de nek wordt getrokken om er stabiele ondersteuning voor te bieden.
- Bedek de schedel met tandcement om een chronische dop te bouwen. Zorg er speciaal voor dat u alleen de randen van het afdekglas bedekt.
- Til de achterkant van de sonde op en breng cement aan onder de hals van de sonde. Laat de sonde op het cement rusten voordat deze uithardt. Duw de hals van de sonde voorzichtig naar beneden met een stompe tang, zodat het oppervlak zich op hetzelfde niveau bevindt als dat van het dekglas en niet in de weg staat van het microscoopobjectief tijdens het experiment.
- Bedek de bovenkant van de sondehals met niet meer dan 1,5 mm tandcementlaag om een stevige grip op de sonde te krijgen. Bouw een cementput met een nok van 1,5 mm op een afstand van 1-2 mm rond het dekglas om een bassin te creëren voor de onderdompelingsvloeistof voor de beeldvorming van twee fotonen (figuur 4C).
- Nadat het cement is uitgehard, breng buprenorfine postoperatieve analgetica aan (0,05 mg / kg, 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht subcutaan) en houd het dier in een warme atmosfeer totdat het wakker wordt. Dit omvat de nabijheid van een infraroodlamp en het inpakken van het dier in een papieren handdoek.
OPMERKING: Plaats een thermometer ter hoogte van de muis om de temperatuur te controleren. - Karakteriseer de impedantie in het bereik van 1-10 kHz met behulp van een potentiostaat.
- Laat het dier minstens 10 dagen herstellen van de operatie. Dien ontstekingsremmende geneesmiddelen onmiddellijk na de operatie toe en blijf de toestand van het dier controleren om de juiste postoperatieve analgesie te bieden.
- Plaats een druppel Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS) zodat deze de craniotomie bedekt. Plaats de flexibele elektrode op de druppel DPBS en plaats de achterkant van de sonde met contactpads voorzichtig op de rug van de muis (figuur 4B).
4. Pulsed Electric Field (PEF) levering en beeldvorming
- Plaats de monsters onder een fluorescentiemicroscoop. In het geval van 3D-modellen kunnen tumoren alleen van bovenaf worden waargenomen.
OPMERKING: Voor het in ovo-model werden experimenten uitgevoerd onder een epifluorescentiemicroscoop (maar is ook mogelijk met een microscoop met twee fotonen), terwijl experimenten met het in vivo-model werden uitgevoerd onder een microscoop met twee fotonen (figuur 6). - Sluit een pulsgenerator aan op de contactpads van de apparaten, met behulp van pogo-pinconnectoren (in vitro) of krokodillenklemmen (in ovo en in vivo) (figuur 4A). Stel de gewenste parameters in (aantal pulsen, spanning, pulsduur, frequentie) en pas PEF's toe door de generator te laten draaien (figuur 4A). Meet fluorescentie tegelijkertijd om de effecten van de PEF's in realtime te observeren.
Representative Results
Dit protocol maakt de toepassing mogelijk op twee glioblastoommodellen waarin een flexibel PEF-toedieningssysteem is geïntegreerd. Na microfabricage- en verpakkingsstappen worden flexibele elektroden gekarakteriseerd in zoutoplossing door elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) om hun prestaties te beoordelen en te valideren. De PEDOT:PSS-gecoate elektroden tonen de typische capacitieve en resistieve gedomineerde gebieden gescheiden door een afsnijfrequentie, terwijl de ongecoate elektroden alleen capacitief gedrag vertonen (figuur 2).
Een variatie op de vloeistof-overlay 96-well plaatmethode wordt gebruikt om 3D-tumoren te laten groeien die zijn gemaakt van getransfecteerde glioblastoomcellen die stabiel een fluorescerende intracellulaire calciumreporter tot expressie brengen. De groei van de sferoïden kan worden waargenomen met een helderveldmicroscoop (figuur 3; ED 0). Ten minste 2 of 3 dagen zijn nodig om bolvormige en dichte sferoïden te verkrijgen, afhankelijk van de cellijn en het aantal gezaaide cellen.
In het in ovo-model worden sferoïden geënt in het chorioallantoïsche membraan van een kwartelembryo (figuur 3; ED 6). Het succes van het transplantaat kan enkele dagen later worden beoordeeld met fluorescentiemicroscopie, omdat levende cellen intracellulair calcium hebben en dus fluorescerend zijn (figuur 3; ED 9). De vascularisatie van de tumor kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop door een fluorescerende kleurstof in de bloedvaten te injecteren (figuur 3; ED9). Het is echter niet altijd mogelijk om de bloedvaten in de tumor te visualiseren, omdat de sferoïde erg dicht is. De flexibele interdigitated elektroden worden bovenop de gevasculariseerde tumor geplaatst (figuur 3; ED 9) en aangesloten op een pulsgenerator. De sonde moet voorzichtig worden geplaatst om bloedingen van het embryo te voorkomen; Anders kan de fluorescerende kleurstof zich verspreiden, wat elke waarneming door beeldvorming belemmert. De juiste afgifte van de puls aan de biologische omgeving kan worden geverifieerd door de stroom te meten die door het circuit gaat. Beeldvorming hiervan in ovo-modellen maakt real-time monitoring mogelijk van het effect van PEF's op het intracellulaire calcium in een 3D-glioblastoomtumor, evenals de vasoconstrictie geïnduceerd op de vasculatuur van de tumor, waarbij elke invloed van andere celtypen, waaronder het immuunsysteem, wordt vermeden15.
De studie van het PEF-effect op glioblastoom kan ook worden uitgevoerd in een completer en voorspellender model. Het hierboven beschreven in vivo model14 bestaat inderdaad uit het enten van een 3D-glioblastoomtumor in het hersenparenchym van een muis (figuur 4). De injectieplaats van de tumor wordt afgesloten door een verknoopte dextran gel hemi-kraal, om de fysiologische biofysische beperkingen tijdens de groei van de tumor samen te vatten. Hoewel beschreven in referentie14, is het de moeite waard om nogmaals te benadrukken dat het van cruciaal belang is dat de dextran hemi-kraal precies op de dura mater wordt gelijmd; Anders kan de tumor ontsnappen door de open dura en de hersenen volledig bedekken, waardoor de beeldvorming onmogelijk wordt. Voor elke chronische beeldvorming vormt weefselingroei die plaatsvindt als het schedelvenster geneest een ernstige barrière, omdat het nieuwe weefsel niet-transparant is en beelden mistig of niet-bruikbaar maakt. Daarom moeten na het inbrengen en lijmen van de hemi-kraal de zijwanden van het geopende schedelvenster worden afgedicht met een dunne laag secondelijm die zorgvuldig rond de spouwmuur is geplaatst, zonder de secondelijm te laten glijden of op de dura te laten stromen. Wanneer de flexibele sonde bovenop de tumorinjectieplaats wordt geplaatst, kunnen er om twee redenen geen bellen onder de sonde blijven. Ten eerste kan beeldvorming niet doorgaan wanneer er bubbels aanwezig zijn. Ten tweede dienen bellen als isolatoren, waardoor de elektrische stimulatie-eigenschappen veranderen. Na het nemen van de hierboven beschreven voorzorgsmaatregelen, wordt de craniotomie verzegeld met een glazen venster dat aan de schedel is gecementeerd om chronische beeldvorming gedurende weken mogelijk te maken. Omdat de tumor bestaat uit GCaMP- of DsRed-expressiecellen, kan de injectie worden bevestigd met een fluorescentiemicroscoop. De elektrochemische impedantie van de elektroden moet worden gemeten om de prestaties na implantatie te valideren. Vergeleken met de impedantie in zoutoplossing wordt in vivo een toename van de impedantie verwacht bij frequenties boven 100 Hz als gevolg van de aanwezigheid van een biologische omgeving (figuur 5). Gevasculariseerd neuraal parenchym en tumorinfiltratie kunnen gedurende weken worden waargenomen en gekarakteriseerd door het transparante substraat door middel van tweefotonenmicroscopie (figuur 6). Het gebruik van transgene dieren die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cellen van belang (immuuncellen en neuronen) kan bijvoorbeeld het mogelijk maken om het minimale ontstekingsproces aan te tonen dat wordt geïnduceerd door elektrode-implantatie alleen (figuur 6A) of de aanwezigheid van microglia en monocyten aantonen 26 dagen na implantatie van een PEF-gestimuleerde elektrode geïmplanteerd bovenop een groeiende GBM-tumor (figuur 6B1 ). In het laatste geval werden zowel van perifere monocyten afgeleide cellen als van de hersenen residente microgliale cellen rond en in de tumor gevonden (figuur 6B2). Op de dag van PEF-levering kunnen contactpads van de flexibele elektroden worden aangesloten op de pulsgenerator, direct onder de tweefotonenmicroscoop. Over het algemeen kan dit model worden gebruikt om het effect van bio-elektrische behandelingen in de loop van de tijd te onderzoeken met behulp van verschillende soorten cellen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van hersentumoren, tot een diepte van ongeveer 500 μm.
Figuur 1: Microfabricage van flexibele elektroden . (A) Gouden elektrodepatronen en Paryleen C-substraat. (B) Omtrekopening. (C) PEDOT:PSS-coating. (D) Aansluitingen en verpakking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Elektrochemische impedantiespectroscopie van flexibele goudelektroden en PEDOT:PSS gecoate koude elektroden in een zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het in ovo model van glioblastoom. ED 0: Sferoïde waargenomen met een helderveldmicroscoop. ED 3: Schelp minder kweek van een kwartelembryo 3 dagen na opening. ED 6: Tumor geïmplanteerd in de CAM waargenomen met een helderveldmicroscoop. ED 9: Flexibel apparaat geplaatst op de gevasculariseerde tumor (tumor in groen en bloedvaten in rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De in vivo toepassing. (A) Schema voor in vivo experimenten. (B) Plaatsing van de sonde vóór het aanbrengen van afdekglas en acrylhars. (C) Voltooide implantatie van de sonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Elektrochemische impedantiespectroscopie van flexibele goudelektroden in een zoutoplossing in vergelijking met een geïmplanteerde sonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Intravitale multispectrale beeldvorming van twee fotonen door middel van elektroden . (A) Betegeld beeld van het gezonde hersenoppervlak in een controle multifluorescente AMU-Neuroinflam muis 3 dagen na elektrode-implantatie. Cyaan toont dendritische arborisatie van laag 5 piramidale neuronen, groen toont gerekruteerde granulocyten en monocyten, en geel toont geactiveerde microglia en dendritische cellen. Roze toont infrarooddiffusie als gevolg van warmteaccumulatie. (B1) Vergelijkbaar beeld als in A, maar 26 dagen na tumor sferoïde implantatie 200 μm diep in de cortex onmiddellijk gevolgd door elektrode-implantatie. Let op de accumulatie van groene en gele immuuncellen. (B2) Vergelijkbaar beeld als in B1 , maar 100 μm onder het oppervlak van de elektroden. Let op de aanwezigheid van blauwe neuronale dendritische arborisatie in de periferie van de rode tumormassa zelf geïnfiltreerd door gele microglia en dendritische cellen. Diepblauw toont een tweede harmonisch signaal van het peritumorale collageen. (B3) Ingezoomde weergave van B2 met de aanwezigheid van interneuron soma's (aangegeven met pijlen) in de buurt van de tumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De in dit werk beschreven aanpak stelt hersentumormodellen met een geïntegreerd PEF-toedieningssysteem in staat om het effect van PEF's op verschillende niveaus van biologische organisatie te bestuderen. Het microfabricageprotocol bestaat uit standaard dunnefilmprocessen, die een grote mate van vrijheid bieden in het elektrodeontwerp dat kan worden aangepast aan de specifieke toepassing. Soms kan een extra thermische gloeistap nuttig zijn aan het einde van de fabricage, om het buigen van de elektroden tijdens de productie te verminderen.
Het gebruik van een stabiele glioblastoomcellijn die een fluorescerende calciumindicator tot expressie brengt, vermijdt alle complicaties die verband houden met de afgifte en retentie van kleurstoffen, vooral in 3D-tumoren die zeer dicht zijn16. Inderdaad, een hoog expressieniveau wordt waargenomen over een lange periode in vergelijking met standaard chemische fluorescerende calciumindicatoren17. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende cellijnen, omdat het vaak wordt gebruikt voor het afbeelden van neurale activiteit11. Hier werden menselijke en muizencellijnen gebruikt (U87 en Gl261 voor implantatie in respectievelijk immunodeficiënte of immunocompetente muizen). Recente studies toonden inderdaad aan dat de U87-cellijn verschilt van die van de oorspronkelijke cellen, omdat veel mutaties werden verworven gedurende jaren van celkweek, waardoor experimentele reproduceerbaarheid18 werd beïnvloed. De methode die wordt gebruikt voor de bereiding van 3D-tumoren is met een hoge doorvoer, reproduceerbaar en maakt het mogelijk om sferoïden van een specifieke grootte te genereren, afhankelijk van de cellijn, het aantal cellen bij het zaaien en de tijd van groei19. Deze sferoïden zijn echter dicht, wat een nadeel oplevert bij het beeldvorming in de kern van de tumor.
Het in ovo-model is nuttig als eerste benadering om het effect van PEF op 3D-tumoren en hun vasculatuur te bestuderen, zonder interacties met andere celtypen die in de hersenen aanwezig zijn. Dit model is goedkoop, snel, high-throughput en roept minder ethische vragen op dan diermodellen. Het is belangrijk om de integriteit van het embryo gedurende het hele experiment te behouden, omdat dit de overleving en de kwaliteit van de beeldvorming kan beïnvloeden. Speciale zorg moet worden genomen bij het openen van het kwarteleit, om schade aan het embryonale membraan te voorkomen. Het transplantaat en de plaatsing van de flexibele elektroden moeten ook zorgvuldig worden uitgevoerd om bloedingen te voorkomen die het embryo zouden kunnen doden. Injectie van fluorescerende kleurstof in de bloedvaten maakt gelijktijdige visualisatie van de tumorcellen en vascularisatie met fluorescentiemicroscopie mogelijk. De intraoculaire injectie moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat kleurstof in de embryonale vloeistof lekt, wat een resterende fluorescentie op de achtergrond kan veroorzaken die de kwaliteit van de beeldvorming verslechtert. Dit model kan ook worden gebruikt voor het volgen van medicijnopname, omdat het toegang geeft tot de bloedsomloop. Experimenten worden echter beperkt door de 12-daagse overlevingstijd van het embryo, waardoor 7 dagen observatie mogelijk is, wat aanzienlijk korter is dan het in vivo model21.
Het in vivo hersentumormodel kan gedurende 4 tot 5 weken worden gevolgd voordat dieren een ethisch experimenteel eindpunt bereiken dat wordt bepaald door een plotseling gewichtsverlies van 20%. Het wordt goed verdragen en blijft op zijn plaats als de verbindingsstaart van de elektrode niet te lang is. Anders hebben dieren de neiging om de omdraaiende connector te krassen, die uiteindelijk kan worden gescheurd, waardoor een latere verbinding met de stimulator wordt voorkomen. Deze periode van 4 weken is niettemin waardevol om de verschillende stadia van de ontwikkeling van glioblastoom te dekken. Bij het vergelijken van de tumorceldichtheden in hetzelfde volume van belang op verschillende tijdsintervallen, kan de evolutie van de tumorgroeikinetiek worden waargenomen. In het bijzonder werd een verhoogde tumorgroei waargenomen op het moment van de immuunschakelaar22. Een soortgelijke studie in aanwezigheid van een stimulerende elektrode zou informatie verstrekken over het effect van PEF op de proliferatiesnelheid van tumoren en de gevoeligheid van de tumor voor immuun-eliminatie. In vergelijking met het in ovo-model kan het in vivo-model worden gezien als een waardevol preklinisch model om de impact van immuuncellen op tumorprogressie en hun bijdrage aan het therapeutische effect van PEF te bestuderen. Dit protocol is aangepast van een vorig artikel met de toevoeging van een flexibel elektrode-apparaat op de tumor voordat een schedelvenster wordt geplaatst14. Zowel de acute als chronische bio-elektrische behandelingen van tumoren kunnen worden gekenmerkt door directe en daaropvolgende observaties met twee-fotonenmicroscopie, aangezien initiële stimulatie naar verwachting celdood zal induceren en blijvende ontregeling van de immuunrespons zal veroorzaken.
De aansluitingen van de flexibele sonde zijn gemakkelijk toegankelijk onder de twee-foton microscoop. Elektrische stimulatieparameters kunnen dus in realtime worden aangepast op basis van het waargenomen effect op het neurale weefsel en / of de beoogde cellen, vergelijkbaar met hoe een arts interventionele procedures zou uitvoeren tijdens het observeren van MRI- of CT-beelden van zijn patiënt. Een laatste overweging is het belang van zorgvuldige afdichting van de elektrode op de hersenen met secondelijm en siliconenlijm om weefselhergroei te voorkomen.
Kortom, het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een innovatief model om het effect van PEF-therapie met flexibele organische polymeerelektroden voor glioblastoomtumormodellen te bestuderen. De twee modellen vertonen verschillende niveaus van complexiteit, zodat cellulaire, vasculaire of immuuneffecten kunnen worden gescheiden voor een beter begrip van de werkingsmechanismen. Conformale, oppervlakkige elektroden verminderen de iatrogene schade terwijl ze verstoring van de micro-omgeving van de tumor mogelijk maken, waardoor vasoconstrictie of ontregeling van intracellulair calcium15 wordt veroorzaakt.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Het hier gerapporteerde werk werd ondersteund door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-18-CE19-0029). De auteurs bedanken S.M. Bardet hartelijk voor haar bijdrage aan het genereren van een stabiele GCaMP6f cellijn en D. O'Connor voor haar hulp bij het in ovo model.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
- Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
- Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
- Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
- Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
- Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
- Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
- Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
- Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
- Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
- Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).
- Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
- Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).
- Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).
- Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
- Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
- Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301 (2021).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).
