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Cancer Research

ग्लियोब्लास्टोमा के स्पंदित इलेक्ट्रिक फील्ड थेरेपी के लिए लचीले कार्बनिक इलेक्ट्रॉनिक उपकरण

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/63527
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 2, 2, 2, 1, 3,4,5, 1
1Centre CMP, Bioelectronics Department, Mines Saint-Etienne, 2Panaxium SAS, 3Institut Universitaire de France, 4Institut des Neurosciences de la Timone (UMR7289), CNRS, Aix-Marseille Université, 5Centre Européen de Recherche en Imagerie Médicale, Aix-Marseille Université

Summary

यह काम 3 डी ब्रेन ट्यूमर मॉडल में कार्यान्वयन के लिए लचीले इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड के विकास का वर्णन करता है, अर्थात्, इन विट्रो कल्चर, ओवो मॉडल में , और विवो म्यूरिन मॉडल में । प्रस्तावित विधि का उपयोग जटिलता के विभिन्न स्तरों पर ट्यूमर पर स्पंदित विद्युत क्षेत्रों के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा को इसकी उच्च स्तर की आक्रामकता के कारण मानक ऑन्कोलॉजी उपचारों के साथ मिटाना मुश्किल है। स्पंदित विद्युत क्षेत्रों (पीईएफ) पर आधारित बायोइलेक्ट्रिक उपचार उपचार दक्षता में सुधार के लिए आशाजनक हैं। हालांकि, वे कठोर इलेक्ट्रोड पर भरोसा करते हैं जो तीव्र और पुरानी क्षति का कारण बनते हैं, खासकर मस्तिष्क जैसे नरम ऊतकों में। इस काम में, लचीले इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग ट्यूमर को पीईएफ देने के लिए किया गया था और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ जैविक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन किया गया था। एक पतली, पारदर्शी पैरिलीन-सी सब्सट्रेट पर इंटरडिजिटेटेड गोल्ड इलेक्ट्रोड को कंडक्टिंग पॉलिमर पेडोट: पीएसएस के साथ लेपित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक अनुरूप और बायोकम्पैटिबल डिवाइस था। ट्यूमर और उनके माइक्रोएन्वायरमेंट पर पीईएफ के प्रभावों की जांच विभिन्न जैविक मॉडल का उपयोग करके की गई थी। सबसे पहले, ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के मोनोलेयर को विट्रो में घटनाओं की जांच के लिए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर सुसंस्कृत किया गया था। एक मध्यवर्ती चरण के रूप में, एक इनओवो मॉडल विकसित किया गया था जहां एक बटेर के भ्रूण झिल्ली में इंजीनियर ट्यूमर स्फेरॉइड को ग्राफ्ट किया गया था। प्रतिरक्षा प्रणाली की अनुपस्थिति के कारण, इससे अत्यधिक संवहनी ट्यूमर हो गए। विकास के इस प्रारंभिक चरण में, भ्रूण में कोई प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं होती है, और ट्यूमर को विदेशी निकायों के रूप में मान्यता नहीं दी जाती है। इस प्रकार, वे मौजूदा भ्रूण संवहनी प्रणाली से अपने स्वयं के वाहिकाओं को विकसित करते हुए तेजी से विकसित हो सकते हैं, जो एक मूल्यवान 3 डी कैंसर मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। अंत में, पीईएफ के लचीले इलेक्ट्रोड वितरण का मूल्यांकन एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक पूर्ण जीव में किया गया था, जिसमें एक सिंजेनिक, ऑर्थोग्राफ्ट (इंट्राक्रैनील) माउस मॉडल का उपयोग किया गया था। लचीले कार्बनिक इलेक्ट्रोड उपकरणों के आरोपण से पहले ट्रांसजेनिक मल्टी-फ्लोरोसेंट चूहों के मस्तिष्क में ट्यूमर स्फेरॉइड को ग्राफ्ट किया गया था। एक सील कपाल खिड़की ने कई हफ्तों की अवधि में पीईएफ के साथ उपचार के दौरान ट्यूमर और इसके माइक्रोएन्वायरमेंट की मल्टीफोटॉन इमेजिंग को सक्षम किया।

Introduction

ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम) एक अत्यधिक आक्रामक ट्यूमर है और इसलिए रिसेक्शन, रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी जैसे मानक उपचारों के साथ उन्मूलन करना मुश्किल है। मल्टीमॉडल उपचार के बावजूद, रोग का निदान बहुत खराब रहता है और अधिकांश रोगी निदान 1,2 के 1 वर्ष के भीतर रोग की प्रगति का अनुभव करते हैं। हाल ही में, बायोइलेक्ट्रिक उपचार के विकास ने मौजूदा उपचारों में सुधार करने की बड़ी क्षमता दिखाई है। ये उपचार स्पंदित विद्युत क्षेत्रों (पीईएफ) के वितरण का उपयोग करते हैं, आमतौर पर एक ही उपचार सत्र में, सेलुलर झिल्ली अखंडता और ट्यूमर के माइक्रोएन्वायरमेंट को बाधित करने के लिए। यह कोशिका झिल्ली व्यवधान, जिसे इलेक्ट्रोपोरेशन के रूप में भी जाना जाता है, विद्युत क्षेत्र की तीव्रता और दालों की संख्या के आधार पर प्रतिवर्ती या अपरिवर्तनीय हो सकता है। अपरिवर्तनीय इलेक्ट्रोपोरेशन (आईआरई) को एक गैर-थर्मल ऊतक पृथक्करण तकनीक के रूप में लागू किया जाता है जिसमें विद्युत दालें सेलुलर झिल्ली को घातक नुकसान पहुंचाती हैं जिससे कोशिका मृत्युहो जाती है। प्रतिवर्ती इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोकीमोथेरेपी (ईसीटी) में लागू किया जाता है, एक स्थापित तकनीक जिसमेंकैंसर कोशिकाओं में दवा अपटेक को बढ़ाने के लिए कीमोथेरेपी दवाओं के साथ संयोजन में पीईएफ का वितरण शामिल है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों ने कैंसर के उपचार के लिए उच्च दक्षता के साथ ईसीटी के विकल्प के रूप में कैल्शियम इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रदर्शन किया, जो सस्ती भी है औरकम दुष्प्रभावों को प्रेरित करता है। इन आशाजनक प्रगति के बावजूद, पीईएफ को आम तौर पर कठोर, धातु इलेक्ट्रोड का उपयोग करके लागू किया जाता है जो नरम ऊतक 6 को नुकसान पहुंचाने के लिए जानेजाते हैं। मस्तिष्क विशेष रूप से ऐसे आक्रामक उपकरणों के प्रति संवेदनशील होता है जहां यांत्रिक बेमेल सूजन और एस्ट्रोग्लियल स्कारिंग 7 को प्रेरित करताहै।

इस संदर्भ में, ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर के 3 डी मॉडल के साथ संयोजन में एक लचीली पीईएफ वितरण प्रणाली प्रस्तुत की जाती है, माइक्रोफैब्रिकेशन से एक मुराइन मॉडल तक। अनुरूप इलेक्ट्रोड मानक पतली-फिल्म माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रियाओं के साथ बनाए जाते हैं, जिसमें पैरिलीन-सी, गोल्ड और पेडोट: पीएसएस 8,9 जैसे नरम और जैव-संगत सामग्री का उपयोग शामिल है। इलेक्ट्रोड उंगलियों10 के बीच इमेजिंग के लिए पर्याप्त पारदर्शिता बनाए रखते हुए एक बड़े सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए एक इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड डिज़ाइन का उपयोग किया जाता है। ट्यूमर मॉडल के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरेसेंस रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के 3 डी स्फेरॉइड का उत्पादन तरल-ओवरले 96-वेल प्लेट विधि11 की भिन्नता का उपयोग करके किया जाता है। स्फेरॉइड को एक बटेर भ्रूण के कोरियोलैंटोइक झिल्ली में ग्राफ्ट किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक इनवो मॉडल होता है जिसका उपयोग एंजियोजेनेसिस या ड्रग टॉक्सिकोलॉजी12,13 का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया जाता है। भ्रूण के विकास के इस चरण में प्रतिरक्षा प्रणाली की अनुपस्थिति में भ्रूण के वाहिका द्वारा ट्यूमर को ग्राफ्ट और संवहनी किया जा सकताहै। लचीले इलेक्ट्रोड को तब गोलाकार और इसके वाहिका पर पीईएफ वितरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संवहनी ट्यूमर के शीर्ष पर रखा जाता है। अंत में, इन प्रभावों की जांच ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट और प्रतिरक्षा प्रणाली सहित एक पूर्ण जीवित जीव पर की जाती है, जो मुराइन मॉडल14 के मस्तिष्क पैरेन्काइमा में इंजीनियर स्फेरॉइड को प्रत्यारोपित करके होती है। लचीले इलेक्ट्रोड को सम्मिलन स्थल के शीर्ष पर रखा जाता है और क्रैनियोटॉमी को ग्लास विंडो के साथ सील कर दिया जाता है, जिससे कई हफ्तों में बार-बार दो-फोटॉन इमेजिंग की अनुमति मिलती है।

ये विधियां माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक इंजीनियरिंग से लेकर ऑन्कोलॉजी अनुप्रयोगों तक विभिन्न डोमेन में रुचि रखने वाले लोगों के लिए उपयोगी होंगी। माइक्रोफैब्रिकेशन प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी एप्लिकेशन के लिए किया जा सकता है और पीईडीओटी: पीएसएस के साथ लेपित पतली-फिल्म धातु इलेक्ट्रोड की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एंटीट्यूमर विद्युत उपचार के मूल्यांकन के लिए विकसित जैविक मॉडल प्रत्यारोपित सामग्री के लिए सेलुलर, संवहनी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के भेदभाव की जांच के लिए सामान्य रुचि के होंगे।

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को फ्रांसीसी कानून के अनुसार और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए 24 नवंबर, 1986 (86/609 / ईईसी) के यूरोपीय सामुदायिक परिषद के निर्देश के अनुपालन में किया गया था। जानवरों पर शोध को दिशा डेपार्टेमेंटेल डेस सर्विसेज वेटेरिनेयर्स डेस बोचेस-डु-रोने द्वारा अधिकृत किया गया था और प्रोवेंस कोटे डी'अज़ूर की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (अपाफिस # 22689-2019100414103054)।

1. लचीला डिवाइस माइक्रोफैब्रिकेशन (चित्रा 1)

  1. कांच की स्लाइड्स की सफाई
    1. 15 मिनट के लिए 2% साबुन के घोल में सोनिकेट ग्लास स्लाइड। इन्हें पानी से धो लें।
    2. 15 मिनट के लिए शुद्ध एसीटोन के 80% और शुद्ध आइसोप्रोपेनोल के 20% के मिश्रण में फिर से सोनिकेट करें।
      चेतावनी: ये सॉल्वैंट्स हानिकारक और ज्वलनशील हैं। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें और उन्हें एक फ्यूमहुड के नीचे संभालें।
    3. स्लाइड्स को आइसोप्रोपेनॉल से धोएं और एयर गन से सुखाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि एसीटोन पूरी प्रक्रिया के दौरान सब्सट्रेट्स पर सूखता नहीं है।
  2. गोल्ड इलेक्ट्रोड पैटर्निंग (चित्र 1A)
    1. पैरिलीन निक्षेपण प्रणाली (चित्रा 1एए) के साथ पैरिलीन-सी (पीएसी) की 3 μm परत जमा करें।
      1. साफ किए गए ग्लास स्लाइड को जमाव कक्ष में रखें। चिलर पर साबुन स्प्रे करें, इसे सूखने दें, और इसे जमाव प्रणाली के नामित ठंडे जाल में डालें। यह एंटी-चिपकने वाला जमाव के बाद चिलर से पीएसी को आसानी से हटाने की सुविधा प्रदान करता है।
        सावधानी: पीएसी एक अड़चन है और स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा करता है। इसे संभालते समय दस्ताने पहनें।
      2. एल्यूमीनियम नाव में 6 ग्राम पीएसी का वजन करें और इसे भट्ठी में रखें। मशीन (पी = 10 मीटर टॉर) को खाली करें और निम्नलिखित मापदंडों के साथ जमाव शुरू करें: टीचिलर = -100 डिग्री सेल्सियस, टीफर्नेस = 690 डिग्री सेल्सियस, टीवेपोराइज़र = 175 डिग्री सेल्सियस, और टीचैंबर = 135 डिग्री सेल्सियस।
      3. जब जमाव समाप्त हो जाता है और वेपोराइज़र का तापमान 40 डिग्री सेल्सियस से नीचे होता है, तो चिलर, वेपोराइज़र और भट्ठी बंद कर दें। मशीन को बाहर निकालें और नमूने एकत्र करें।
    2. 30 एस (100 डब्ल्यू, 50 एससीसीएम) के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा नमूनों की सतह को सक्रिय करें।
    3. प्लाज्मा-उपचारित नमूनों को 40 सेकंड के लिए 1,000 x g पर नकारात्मक फोटोरेसिस्ट के साथ स्पिन-कोट करें। नमूने को 2 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर रखें (चित्रा 1 एबी)।
      सावधानी: फोटोरेसिस्ट समाधान ज्वलनशील है और जलन का कारण बनता है; पीपीई पहनें और इसे एक फ्यूम हुड के नीचे संभालें।
    4. यूवी ब्रॉडबैंड संपर्क संरेखक की बीमलाइन में एक आई-लाइन फ़िल्टर रखें और एक मास्क के माध्यम से फोटोरेसिस्ट को उजागर करें जिसमें इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड डिज़ाइन (चित्रा 1 एसी) है।
      नोट: 50 या 250 μm के अंतर के साथ इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड को लेआउट संपादक का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया था और फोटोमास्क को एक कंपनी से ऑर्डर किया गया था जो लेजर फोटोप्लॉटिंग द्वारा पॉलिएस्टर फोटोमास्क का उत्पादन करता है।
    5. उपरोक्त नमूनों को 3 मिनट के लिए गर्म प्लेट पर 110 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें और उन्हें 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। गैर-उजागर फोटोरेसिस्ट को हटाने के लिए 3 मिनट के लिए धातु-आयन-मुक्त डेवलपर में नमूने डुबोएं। नमूनों को पानी से धोएं और उन्हें एयर गन से सुखाएं (चित्रा 1 एडी)।
      चेतावनी: डेवलपर समाधान एक अड़चन है; पीपीई पहनें और फ्यूम हुड के नीचे हैंडल करें।
    6. 60 एस (100 डब्ल्यू, 50 एससीसीएम) के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा नमूनों की सतह को सक्रिय करें।
    7. क्रोमियम की 20 एनएम आसंजन परत और थर्मल बाष्पीकरणकर्ता के साथ सोने की 300 एनएम परत निम्नानुसार जमा करें (चित्रा 1 ए)।
    8. बाष्पीकरण मशीन को बाहर निकालें और धातु स्क्रू के साथ ऊपरी गोल प्लेट पर नमूने (नीचे की ओर) क्लिप करें। क्रोमियम और सोने के साथ क्रमशः समर्पित क्रूसिबल भरें। 5.10-6 टॉर से नीचे के दबाव तक पहुंचने के लिए मशीन को सील करें और खाली करें। नमूना धारक का रोटेशन शुरू करें।
    9. क्रोमियम युक्त क्रूसिबल का चयन करें और धीरे-धीरे इसके माध्यम से जाने वाली धारा को बढ़ाएं जब तक कि 0.2 A's-1 की जमाव दर तक नहीं पहुंच जाती। शटर खोलें और क्रोमियम के 20 एनएम जमा होने तक प्रतीक्षा करें। शटर बंद करें और धीरे-धीरे 0 एमए तक करंट को नीचे उतारें।
    10. सोने वाले क्रूसिबल का चयन करें और धीरे-धीरे इसके माध्यम से धारा बढ़ाएं जब तक कि 0.2 A's-1 की जमाव दर तक नहीं पहुंच जाती। सोने को वाष्पित करने के लिए शटर खोलें, 10 एनएम सोना जमा होने तक प्रतीक्षा करें, और फिर लगभग 300 एनएम जमा होने तक जमाव दर को 1.5 एएस -1 तक बढ़ाएं। शटर बंद करें और धीरे-धीरे करंट को 0 एमएएच तक कम करें।
    11. जमाव के बाद नमूने को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। नमूना धारक के रोटेशन को रोकें, मशीन को बाहर निकालें, और नमूने एकत्र करें।
    12. एसीटोन के साथ एक बीकर में नमूने डुबोएं। फोटोरेसिस्ट को उठाने के लिए बीकर को 15 मिनट के लिए 110 आरपीएम पर सेट एक हिलने वाली प्लेट पर रखें। नमूनों को आइसोप्रोपेनोल से धोएं और उन्हें एयर गन से सुखाएं (चित्रा 1एएफ)।
    13. 30 एस (100 डब्ल्यू, 50 एससीसीएम) के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा नमूनों की सतह को सक्रिय करें।
    14. एक पैरिलीन निक्षेपण प्रणाली के साथ पीएसी की 3 μm इन्सुलेशन परत जमा करें (चरण 1.2.1 देखें) (चित्रा 1Ag)।
  3. रूपरेखा खोलने (चित्रा 1 बी)
    1. 35 सेकंड के लिए 600 x g पर सकारात्मक फोटोरेसिस्ट के साथ नमूने को स्पिन-कोट करें। इसे 2 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर रखें (चित्रा 1बीए)।
      सावधानी: फोटोरेसिस्ट समाधान ज्वलनशील है और जलन का कारण बनता है; पीपीई पहनें और फ्यूम हुड के नीचे हैंडल करें।
    2. सुनिश्चित करें कि यूवी ब्रॉडबैंड संपर्क संरेखक की बीमलाइन में कोई आई-लाइन फ़िल्टर नहीं है और एक मास्क के माध्यम से फोटोरेसिस्ट को उजागर करें जिसमें यूवी ब्रॉडबैंड संपर्क संरेखक (चित्रा 1 बीबी) के साथ डिवाइस की रूपरेखा है।
    3. उजागर फोटोरेसिस्ट को हटाने के लिए 4 मिनट के लिए धातु-आयन-मुक्त डेवलपर में नमूने डुबोएं। नमूनों को पानी से धोएं और उन्हें एयर गन से सुखाएं (चित्रा 1 बीसी)।
    4. एक प्रतिक्रियाशील आयन एटचर (160 डब्ल्यू, 22 मिनट, ओ 2: 50 एससीसीएम, सीएफ4: 10 एससीसीएम) के साथ पीएसी की दो परतों के माध्यम से रूपरेखा तैयार करें (चित्रा 1बीडी)।
    5. एसीटोन के साथ शेष फोटोरेसिस्ट को हटा दें, आइसोप्रोपेनॉल से कुल्ला करें, और नमूने को एयर गन से सुखाएं।
  4. PEDOT: पीएसएस कोटिंग (चित्रा 1 सी)
    1. 35 सेकंड के लिए 70 x g पर 2% साबुन समाधान स्पिन-कोट करें (चित्रा 1Ca)।
    2. एक पैरिलीन निक्षेपण प्रणाली के साथ पीएसी की 3 μm बलिदान परत जमा करें (चरण 1.2.1 देखें) (चित्रा 1Cb)।
    3. 35 सेकंड के लिए 600 x g पर स्पिन-कोट पॉजिटिव फोटोरेसिस्ट। नमूने को 2 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर रखें (चित्रा 1 सीसी)।
    4. सुनिश्चित करें कि यूवी ब्रॉडबैंड संपर्क संरेखक की बीमलाइन में कोई आई-लाइन फ़िल्टर नहीं है और एक मास्क के माध्यम से फोटोरेसिस्ट को उजागर करें जिसमें इलेक्ट्रोड की सक्रिय सतह होती है (चित्रा 1 सीडी)।
    5. उजागर फोटोरेसिस्ट को हटाने के लिए 4 मिनट के लिए धातु-आयन-मुक्त डेवलपर में नमूने डुबोएं। नमूनों को पानी से धोएं और उन्हें एयर गन से सुखाएं (चित्रा 1 सी)।
    6. इलेक्ट्रोड की सक्रिय सतह (160 डब्ल्यू, 24 मिनट, ओ 2: 50 एससीसीएम, सीएफ4: 10 एससीसीएम) को खोलने के लिए एक प्रतिक्रियाशील आयन एटचर के साथ पीएसी को लें। माइक्रोस्कोप से जांचें कि सक्रिय सतह पर कोई अवशिष्ट पीएसी नहीं है (चित्रा 1सीएफ)।
    7. एसीटोन के साथ शेष फोटोरेसिस्ट को हटा दें, आइसोप्रोपेनॉल से कुल्ला करें और नमूने को एयर गन से सुखाएं।
    8. 90 एस (100 डब्ल्यू, 50 एससीसीएम) के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार का उपयोग करके नमूनों की सतह को सक्रिय करें।
    9. रासायनिक रूप से पॉलीमराइज्ड पेडोट: पीएसएस के 5 वॉल्यूम% एथिलीन ग्लाइकोल (ईजी) के साथ मिलाएं, और डोडेसिलबेंजीन सल्फोनिक एसिड (डीबीएसए) के 0.1 वॉल्यूम% के साथ। 15 मिनट के लिए सोनिकेट करें। 1 डब्ल्यूटी% (3-ग्लाइसीडिलऑक्सीप्रोपिल) ट्राइमिथाइलसिलोक्सेन (जीओपीएस) जोड़ें और 5 मिनट के लिए सोनिकेट करें। समाधान को 1.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
      चेतावनी: ईजी एक अड़चन है और स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा करता है। डीबीएसए एक अड़चन और संक्षारक है। जीओपीएस संक्षारक है। उपयुक्त पीपीई पहनें और इन रसायनों को फ्यूम हुड के नीचे संभालें।
      नोट: कुल मात्रा नमूने की संख्या पर निर्भर करती है। 10 मानक ग्लास स्लाइड के लिए, कम से कम 20 एमएल तैयार करें जो निम्नलिखित मात्राओं के अनुरूप होगा: 18.78 एमएल पीईडीओटी: पीएसएस, 1 एमएल ईजी, 20 μL DBSA, और 200 μL GOPS।
    10. पेडोट की चार परतों को स्पिन-कोट करें: 35 सेकंड के लिए 150 x g पर पीएसएस समाधान। प्रत्येक परत के जमाव के बाद, नमूनों को गर्म प्लेट पर 60 सेकंड के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें और अगली परत को घुमाने से पहले उन्हें 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें (चित्रा 1सीजी)।
    11. नमूनों को पानी में डुबोकर बलिदान पीएसी परत को हटा दें (चित्रा 1सीएच)।
    12. नमूने को 1 घंटे के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    13. पेडोट: पीएसएस फिल्म में शेष साबुन और कम आणविक भार वाले यौगिकों को हटाने और ग्लास सब्सट्रेट (चित्रा 1 सीआई) से नमूनों को अलग करने के लिए 30 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में नमूने डुबोएं।
  5. कनेक्शन और पैकेजिंग (चित्रा 1 डी)
    1. पॉलीमाइड फिल्म पर ऐक्रेलिक पेंट की एक पतली परत जमा करें जिसे तांबे के साथ लेपित किया जाता है (चित्रा 1 डीए)। पेंट की एक सजातीय परत प्राप्त करने के लिए एक एरोसोल का उपयोग करें (चित्रा 1 डीबी)।
    2. दो आयताकार संपर्क पैड (5 मिमी x 15 मिमी; 1.5 मिमी अंतराल) प्राप्त करने के लिए एक लेजर (75 kHz, 7 W, 1 लेजर पास, 400 mm/s-1) के साथ ऐक्रेलिक पेंट को पैटर्न करें (चित्रा 1Dc)।
    3. तांबे को संतृप्त 30% (w/v) फेरिक क्लोराइड (FeCl3) के साथ 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस (चित्र 1DD) पर पानी में गीला करें।
      सावधानी: FeCl3 एक अड़चन और संक्षारक है; इसे एक फ्यूम हुड के नीचे दस्ताने के साथ संभालें।
    4. ऐक्रेलिक पेंट को एसीटोन के साथ कपड़े से थोड़ा रगड़कर पट्टी करें (चित्रा 1 डीई)।
    5. पैटर्न पॉलीमाइड फिल्म को लेजर (15 kHz, 10 W, 30 लेजर पास, 130 mm-s-1) के साथ आयताकार आकार (15 मिमी x 30 मिमी) में काटें (चित्रा 1डीएफ)।
    6. 330 μm व्यास की सुई (5 m.min-1) के साथ तीन बार के दबाव पर तीन-अक्ष डिस्पेंसिंग मशीन के साथ चांदी का पेस्ट वितरित करें (चित्रा 1Dg)।
      सावधानी: चांदी का पेस्ट एक अड़चन है; दस्ताने के साथ संभालें।
    7. चिमटी (चित्रा 1 डीएच) का उपयोग करके दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत पॉलीमाइड फिल्म के साथ पीएसी जांच को संरेखित और संलग्न करें।
      नोट: संपर्क पैड पर जांच की स्थिति को सुविधाजनक बनाने के लिए संरेखण चिह्नों को चरण 1.5.2 में पैटर्न किया जा सकता है।
    8. ओवन में 2 घंटे के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    9. संपर्क पैड पर 1 सेमी2 पॉलीमाइड सुरक्षा टेप रखें (चित्रा 1 डीआई)।
    10. इंटरफ़ेस को डुबोएं जहां पीएसी जांच और पॉलीमाइड फिल्म पीडीएमएस (चित्रा 1 डीजे) में जुड़े हुए हैं।
    11. इसे 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए बेक करें।
    12. संपर्क पैड खोलने के लिए सुरक्षा टेप निकालें (चित्रा 1Dk).
      नोट: इन विट्रो उपकरणों का माइक्रोफैब्रिकेशन समान है लेकिन चरण 1.2.1, 1.3 और 1.5 को छोड़ दिया जाना चाहिए।

2. ग्लियोब्लास्टोमा जीसीएएमपी 6 एफ स्थिर सेल लाइन की पीढ़ी

  1. लेंटीवायरस उत्पादन
    1. 75 सेमी² फ्लास्क में, 4.5 ग्राम युक्त डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 10 एमएल में लेंटीवायरस उत्पादन के लिए अनुकूलित एचईके 293 टी-व्युत्पन्न सेल लाइन को कल्चर करें। ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन, सोडियम पाइरूवेट और सोडियम बाइकार्बोनेट के एल -1 और 10% टेट्रासाइक्लिन-मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), पेनिसिलिन के 100 यूनिट-एमएल -1 और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg.mL-1 के साथ कम से कम 3 दिनों के लिए 80% संगम तक पूरक।
    2. फ्लास्क से माध्यम को हटा दें। धीरे से फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    3. ईडीटीए समाधान का 1 एमएल जोड़ें और फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान एक स्वास्थ्य खतरा पैदा करता है; पीपीई पहनें और फ्यूम हुड के नीचे हैंडल करें।
    4. संस्कृति माध्यम के 8 एमएल जोड़ें। धीरे से सेल निलंबन को फ्लश करें।
    5. 8 एमएल कल्चर माध्यम में पेट्री डिश में कोशिकाओं और प्लेट 4 x 106 कोशिकाओं की गणना करें।
    6. अगले दिन, जीन जीसीएएमपी 6 एफ युक्त प्लास्मिड के 25 μg को पतला करें और एक चयन मार्कर जो 600 μL पानी की कुल मात्रा में प्यूरोमाइसिन के प्रतिरोध को प्रदान करता है। इसे अभिकर्मक अभिकर्मक की एक ट्यूब में जोड़ें। 3,000 आरपीएम पर 10 सेकंड के लिए भंवर और नैनोकणों के उत्पादन की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    7. एचईके 293 टी कोशिकाओं की संस्कृति पर ट्यूब ड्रॉपवाइज की सामग्री जोड़ें और हाथ से धीरे से चट्टान करें। कम से कम 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    8. नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स युक्त मीडिया को ताजा मीडिया के साथ बदलें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस करें।
    9. तीन दिन बाद, सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 500 x g पर सतह पर तैरने वाला और सेंट्रीफ्यूज एकत्र करें। वायरल कणों वाले तरल चरण को इकट्ठा करें।
      नोट: सुपरनैटेंट में वायरस उत्पादन की पुष्टि मात्रात्मक लेंटिवायरल टिटर परीक्षण का उपयोग करके की जा सकती है और इसे कम से कम 2 वर्षों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का पारगमन
    1. 75 सेमी² फ्लास्क में, डीएमईएम के 10 एमएल में ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को कल्चर करें जिसमें 1 ग्राम होता है। ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन , सोडियम पाइरूवेट और सोडियम बाइकार्बोनेट के एल -1 और कम से कम 4 दिनों के लिए 10% टेट्रासाइक्लिन-मुक्त एफबीएस, पेनिसिलिन के 100 यूनिट एमएल -1 और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg.mL-1 के साथ पूरक।
    2. माध्यम को छोड़ दें और लक्ष्य कोशिकाओं पर चरण 2.1.9 में प्राप्त सतह पर तैरने वाला जोड़ें।
    3. पारगमन में सुधार के लिए माध्यम में हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड के 5 μg.mL-1 जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। माध्यम को 10 एमएल ताजा माध्यम से बदलें।
      चेतावनी: हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड एक अड़चन है। इसे दस्ताने से संभालें।
  3. एक स्थिर सेल लाइन का उत्पादन
    1. पारगमन के दो से तीन दिन बाद, 1 ग्राम युक्त डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें। ग्लूकोज का एल -1 , एल-ग्लूटामाइन, सोडियम पाइरूवेट, और सोडियम बाइकार्बोनेट, 10% एफबीएस, पेनिसिलिन का 100 यूनिट एमएल -1 , स्ट्रेप्टोमाइसिन का 100 μg.mL-1 और गैर-ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को मारने के लिए प्यूरोमाइसिन के साथ पूरक। कम से कम 3 दिनों के लिए इस मीडिया में संस्कृति कोशिकाएं।
      सावधानी: प्यूरोमाइसिन एक अड़चन है; इसे दस्ताने से संभालें।
      नोट: प्यूरोमाइसिन के लिए कोशिकाओं की संवेदनशीलता को उनके अनुशंसित माध्यम में कोशिकाओं को संवर्धन करके पारगमन से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए जिसमें प्यूरोमाइसिन की विभिन्न सांद्रता होती है। एक दिन बाद, माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की जांच करें। पर्याप्त एकाग्रता चुनें जिस पर अधिकांश कोशिकाएं मृत हैं लेकिन कुछ अभी भी जीवित हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि एंटीबायोटिक बहुत विषाक्त नहीं है और संक्रमित कोशिकाओं को भी मार सकता है।
    2. माध्यम को हटा दें और पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    3. ईडीटीए समाधान के 0.25% का 1 एमएल जोड़ें और फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. संस्कृति माध्यम के 8 एमएल जोड़ें। धीरे से सेल निलंबन को फ्लश करें।
    5. सेल निलंबन के 100 μL एकत्र करें और सेल काउंटर के साथ सेल एकाग्रता को मापें। 60 μm सेंसर के साथ हैंडहेल्ड ऑटोमेटेड सेल काउंटर में Aspirate 50 μL सेल सस्पेंशन।
    6. 96-वेल प्लेट में बीज 1 सेल / उदाहरण के लिए, प्रति एमएल 1 x 103 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए, 1 / (1 x 103) जोड़ें, यानी, प्रति अच्छी तरह से 0.001 एमएल सेल निलंबन। सफलता की संभावना बढ़ाने के लिए हर कुएं को बीज दें। प्रति कुएं 200 μL की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए संस्कृति माध्यम के साथ पूरा करें।
    7. एक दिन बाद, प्रत्येक कुएं में एक कोशिका पाई जाए और इसकी प्रतिदीप्ति की जांच करें (xexc = 490 nm और530 nm)। केवल एक संक्रमित कोशिका वाले कुओं को चिह्नित करें। कुछ दिनों के लिए विकास जारी रखें जब तक कि कुआं लगभग स्थिर न हो जाए।
    8. माध्यम को त्याग दें और कोशिकाओं को पीबीएस के 200 μL के साथ कुल्ला करें। ईडीटीए समाधान का 100 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    9. मध्यम के 100 μL जोड़ें और धीरे से सेल निलंबन को फ्लश करें। एक पेट्री डिश में सेल निलंबन स्थानांतरित करें। 5 एमएल माध्यम जोड़ें और कोशिकाओं को कुछ दिनों तक बढ़ने दें जब तक कि पेट्री डिश लगभग स्थिर न हो जाए।
    10. माध्यम को त्याग दें और 5 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। ईडीटीए समाधान का 1 एमएल जोड़ें और पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    11. 6 एमएल मध्यम जोड़ें और धीरे से सेल निलंबन को फ्लश करें। सेल निलंबन को टी 25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। कुछ दिनों के लिए विकास जारी रखें जब तक कि फ्लास्क लगभग स्थिर न हो जाए।
    12. माध्यम को त्याग दें और 5 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए समाधान का 1 एमएल जोड़ें और टी 25 फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 7 एमएल डीएमईएम जोड़ें जिसमें 1 ग्राम · ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन, सोडियम पाइरूवेट और सोडियम बाइकार्बोनेट के एल -1, और 10% एफबीएस, पेनिसिलिन के 100 यूनिट एमएल -1 और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg.mL-1 के साथ पूरक। धीरे से सेल निलंबन को फ्लश करें।
    13. सेल निलंबन को चार टी 25 फ्लास्क (2 एमएल प्रति फ्लास्क) में विभाजित करें और प्रत्येक फ्लास्क में 5 एमएल माध्यम जोड़ें। कोशिकाओं को कुछ दिनों तक बढ़ने दें जब तक कि फ्लास्क लगभग स्थिर न हो जाएं।
    14. तीन फ्लास्क के लिए चरण 2.3.12 दोहराएं और चरण 3.1.3 के लिए अंतिम फ्लास्क रखें। सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 150 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और सेल पेलेट को 900 μL में पुन: निलंबित करें। धीरे से एक सजातीय सेल निलंबन बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को मिलाएं।
    15. सेल निलंबन को क्रायोजेनिक स्टोरेज शीशियों में स्थानांतरित करें। डाइमिथाइल सल्फोक्साइड के 100 μL जोड़ें। क्रायोवियल्स को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। आगे के प्रयोगों के लिए जमे हुए कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
      नोट: अभिकर्मक की दक्षता का मूल्यांकन माध्यम में 5 μM आयनमाइसिन कैल्शियम नमक जोड़कर और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति की प्रेरित वृद्धि की जांच करके किया जा सकता है (λexc = 490 nm औरλ em = 530 nm)।

3.3D मॉडल

  1. स्फेरॉइड संस्कृति
    1. विआयनीकृत (डीआई) पानी में 1% (डब्ल्यू / वी) अगारोस का एक घोल तैयार करें।
      1. 100 एमएल डीआई पानी में 100 ग्राम अगारोस पाउडर जोड़ें और घोल को माइक्रोवेव ओवन में तब तक गर्म करें जब तक कि सभी पाउडर घुल न जाएं। झुरमुट से बचने के लिए घोल को नियमित रूप से हिलाएं। 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए घोल को ऑटोक्लेव करें।
    2. एक बार आटोक्लेव से पुनर्प्राप्त होने के बाद, 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं 75 μL Agarose घोल सावधानी से जोड़ें। मेनिस्कस बनाने के लिए इसे कुएं के किनारे जमा करें, जिसके परिणामस्वरूप एक गैर-अनुयायी गोल तल होता है। इसे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए जमने दें।
    3. चरण 2.3.14 में प्राप्त फ्लास्क से कोशिकाओं (चरण 2.3.12) को अलग करें।
    4. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के प्रति कुएं में 10,000 कोशिकाएं जोड़ें और 1 ग्राम युक्त डीएमईएम के साथ प्रति कुएं 150 μL की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए पूरा करें। ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन , सोडियम पाइरूवेट और सोडियम बाइकार्बोनेट का एल -1, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), पेनिसिलिन के 100 यूनिट एमएल -1 और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg.mL-1 के साथ पूरक।
    5. 3 दिनों के लिए प्लेट को हिलाए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर, आगे के प्रयोगों तक मल्टी-चैनल पिपेट के साथ हर 2 दिनों में आधे मीडिया को ताजा मीडिया के साथ बदलें। अगारोस या स्फेरॉइड को नुकसान से बचाने के लिए पिपेट टिप को कुएं के ऊपरी हिस्से में रखें।
      नोट: स्फेरॉइड का आकार बीजित कोशिकाओं की संख्या और सेल लाइन पर निर्भर करता है, इसलिए इसे प्रयोगों के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. in ovo मॉडल
    1. जापानी बटेर (सी. जैपोनिका) के निषेचित अंडों को एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 57% आर्द्रता) में ट्रे पर एक स्वचालित घूर्णन के साथ रखें जो हर 2 घंटे में अंडे को घुमाता है। इस दिन को भ्रूण दिवस (ईडी) 0 माना जाता है।
    2. प्लास्टिक वजन वाली नौकाओं को 70% (डब्ल्यू / वी) इथेनॉल में रखकर धोएं। वजन वाली नौकाओं को बाहर निकालें और उन्हें एक फ्यूम हुड के नीचे सुखाएं।
      नोट: इस बिंदु से, बाँझ स्थितियों में प्रयोग नहीं किए जाते हैं। हालांकि, भ्रूण पर मोल्ड के विकास से बचने के लिए साफ परिस्थितियों की आवश्यकता होती है।
    3. ईडी 3 पर, 70% (डब्ल्यू / वी) इथेनॉल के साथ पहले से धोए गए पतले सुझावों के साथ चिमटी का उपयोग करके अंडे को धीरे से खोलें। भ्रूण को प्लास्टिक वजन वाली नाव में डालें, इसे एक अन्य वजन वाली नाव के साथ कवर करें और इसे 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में रखें।
    4. ईडी 6 पर, 23 जी सुई के साथ कोरिओलैंटोइक झिल्ली (सीएएम) में एक छोटा सा चीरा लगाएं।
    5. पिपेट का उपयोग करके, चीरे पर 7-दिवसीय स्फेरॉइड रखें, और भ्रूण को 3 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में वापस कर दें, जब तक कि आगे के प्रयोग न हों।
      नोट: रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने के लिए भ्रूण की आंख में एक फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्ट किया जा सकता है।
    6. प्रयोग के दिन, माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके संवहनी ट्यूमर के शीर्ष पर लचीली जांच रखें।
  3. वही in vivo नमूना
    नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा संदर्भ में पहले प्रकाशित एक से अनुकूलित है14. वयस्क मल्टीकलर फ्लोरोसेंट एएमयू-न्यूरोइन्फ्लेम चूहों (B6.Cg-टीजी (थाई 1-सीएफपी) 23 जेआरएस (एलवाई 6 ए-ईजीएफपी) जी 5 डीजेडके (इटगैक्स-ईवाईएफपी) 1 एमएनजेड / एफडी) का उपयोग किया गया था; ये चूहे Thy1 की एक उप-जनसंख्या का लेबलिंग प्रस्तुत करते हैं+ ईसीएफपी की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा न्यूरॉन्स, परिधीय LyzM की लेबलिंग+ ईजीएफपी की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा भड़काऊ कोशिकाएं और सीडी 11 सी के नियंत्रण में ईवाईएफपी को व्यक्त करने वाले माइक्रोग्लिया के एक उपप्रकार की लेबलिंग+. संक्षेप में, जानवरों को किसी भी उपचार या इंजेक्शन से पहले 2 मिनट के लिए 1.5% आइसोफ्लुरेन के साथ हल्के से बेहोश किया जाता है। सर्जरी से पहले, जानवरों को केटामाइन (120 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एनेस्थेटाइज किया जाता है; आईपी) और ज़ाइलज़िन (12 मिलीग्राम / आईपी)। फिर, स्टीरियोटैक्टिक समर्थन के निर्धारण से जुड़े कानों में किसी भी दर्द को कम करने के लिए स्थानीय रूप से 3% लिडोकेन जेल लागू किया जाता है। फिर, क्रैनियोटॉमी के कारण किसी भी दर्द को कम करने के लिए सर्जिकल साइट पर 0.25% बुपिवैकेन समाधान प्रशासित किया जाता है। एक बार जब माउस को सर्जरी के लिए तैयार किया गया था, तो संदर्भ के अनुसार 4 मिमी व्यास का क्रैनियोटॉमी किया गया था14. 26 जी सुई के साथ, क्रानियोटॉमी के बीच में ड्यूरा-मैटर में एक छेद बनाया गया था और ट्यूमर स्फेरॉइड को संदर्भ में वर्णित इंजेक्शन प्रणाली के साथ इंजेक्ट किया गया था14. इसके अतिरिक्त, जैसा कि यहां वर्णित है, ग्लास विंडो के साथ क्रैनियोटॉमी को सील करने से पहले ट्यूमर स्फेरॉइड को व्यक्त करने वाले जीकैम्प 6 या डीएसरेड पर एक लचीला इलेक्ट्रोड रखा गया था।
    1. डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (डीपीबीएस) की एक बूंद रखें ताकि यह क्रैनियोटॉमी को कवर करे। लचीले इलेक्ट्रोड को डीपीबीएस की बूंद पर रखें, और धीरे से माउस की पीठ पर संपर्क पैड के साथ जांच के पीछे रखें (चित्रा 4 बी)।
      नोट: बाँझ दस्ताने और "टिप ओनली" तकनीक का उपयोग करें। यदि एक गैर-बाँझ सतह से संपर्क किया जाता है तो दस्ताने बदलें। इस प्रक्रिया के दौरान थर्मल सहायता प्रदान करें।
    2. डीपीबीएस को अवशोषित करने के लिए कागज के एक छोटे से टुकड़े के साथ डीपीबीएस ड्रॉप को स्पर्श करें जब तक कि जांच ड्यूरा पर सपाट न हो जाए और मस्तिष्क की वक्रता का पालन न कर सके। सुनिश्चित करें कि डीपीबीएस की एक छोटी परत इलेक्ट्रोड के किनारे से भागने के बिना इलेक्ट्रोड के नीचे रहती है। यह अगले चरणों के दौरान गोंद स्पिलओवर के खिलाफ एक बाधा सुनिश्चित करता है।
      नोट: उपयोग से पहले सभी उपकरणों को निष्फल करें।
    3. जांच पर सिलिकॉन चिपकने वाला की एक छोटी बूंद रखें और इसे 5 मिमी गोल कवर ग्लास के साथ कवर करें। कवर ग्लास को तब तक नीचे धकेलें जब तक कि सिलिकॉन समान रूप से वितरित न हो जाए और कवर ग्लास और जांच के बीच की दूरी कम से कम हो। कवर ग्लास को एक और 30 सेकंड के लिए नीचे धकेलें ताकि सिलिकॉन जम सके।
    4. कवर ग्लास को सुरक्षित करने के लिए, जल्दी से इसके किनारों पर सुपरग्लू लागू करें और इसे तब तक नीचे धकेलें जब तक गोंद ठोस न हो जाए।
    5. टूथपिक का उपयोग करके, प्रोब की गर्दन पर सुपरग्लू लागू करें ताकि इसके लिए स्थिर समर्थन प्रदान करने के लिए सुपरग्लू गर्दन के नीचे खींचा जा सके।
    6. पुरानी टोपी बनाने के लिए खोपड़ी को दंत सीमेंट से कवर करें। कवर ग्लास के किनारों को ही कवर करने का विशेष ध्यान रखें।
    7. जांच के पिछले हिस्से को उठाएं और जांच की गर्दन के नीचे सीमेंट लगाएं। ठीक होने से पहले जांच को सीमेंट पर रखें। जांच की गर्दन को कुंद बल के साथ धीरे से नीचे धकेलें ताकि इसकी सतह कवर ग्लास के समान स्तर पर हो और प्रयोग के दौरान माइक्रोस्कोप उद्देश्य के रास्ते में न हो।
    8. जांच पर एक मजबूत पकड़ हासिल करने के लिए 1.5 मिमी से अधिक दंत सीमेंट परत के साथ जांच गर्दन के शीर्ष को कवर करें। दो-फोटॉन इमेजिंग (चित्रा 4 सी) के लिए विसर्जन तरल पदार्थ के लिए एक बेसिन बनाने के लिए कवर ग्लास के चारों ओर 1-2 मिमी की दूरी पर 1.5 मिमी रिज पेश करने वाले एक सीमेंट वेल का निर्माण करें।
    9. सीमेंट के ठीक होने के बाद, ब्यूप्रेनोर्फिन पोस्ट-सर्जिकल एनाल्जेसिक (0.05 मिलीग्राम / किग्रा, 0.1 एमएल प्रति 10 ग्राम शरीर के वजन को चमड़े के नीचे) लागू करें और जानवर को गर्म वातावरण में तब तक बनाए रखें जब तक कि वह जाग न जाए। इसमें इन्फ्रारेड लाइट बल्ब के साथ-साथ जानवर को पेपर टॉवल में लपेटना शामिल है।
      नोट: तापमान की निगरानी के लिए माउस के स्तर पर एक थर्मामीटर रखें।
    10. पोटेंशियोस्टेट का उपयोग करके 1-10 kHz रेंज में प्रतिबाधा को चिह्नित करें।
    11. जानवर को कम से कम 10 दिनों के लिए सर्जरी से ठीक होने दें। सर्जरी के तुरंत बाद विरोधी भड़काऊ दवाओं का प्रशासन करें और उचित पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए जानवर की स्थिति की निगरानी जारी रखें।

4. स्पंदित इलेक्ट्रिक फील्ड (पीईएफ) वितरण और इमेजिंग

  1. नमूनों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत रखें। 3 डी मॉडल के मामले में, ट्यूमर केवल शीर्ष से देखा जा सकता है।
    नोट: इन ओवो मॉडल के लिए, प्रयोगों को एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत किया गया था (लेकिन दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ भी संभव है), जबकि विवो मॉडल पर प्रयोग दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप (चित्रा 6) के तहत किए गए थे।
  2. पोगो पिन कनेक्टर्स (इन विट्रो) या मगरमच्छ क्लिप (ओवो और विवो में) का उपयोग करके एक पल्स जनरेटर को उपकरणों के संपर्क पैड से कनेक्ट करें (चित्रा 4 ए)। वांछित पैरामीटर (दालों की संख्या, वोल्टेज, पल्स अवधि, आवृत्ति) सेट करें और जनरेटर चलाकर पीईएफ लागू करें (चित्रा 4 ए)। वास्तविक समय में पीईएफ के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए एक साथ प्रतिदीप्ति को मापें।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल दो ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल के आवेदन की अनुमति देता है जिसमें एक लचीली पीईएफ वितरण प्रणाली एकीकृत होती है। माइक्रोफैब्रिकेशन और पैकेजिंग चरणों के बाद, लचीले इलेक्ट्रोड को उनके प्रदर्शन का आकलन और सत्यापन करने के लिए इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईआईएस) द्वारा खारा समाधान में विशेषता दी जाती है। पीईडीओटी: पीएसएस-लेपित इलेक्ट्रोड एक कट-ऑफ आवृत्ति द्वारा अलग किए गए विशिष्ट कैपेसिटिव और प्रतिरोधक प्रभुत्व वाले क्षेत्रों को दिखाते हैं, जबकि अनकोटेड इलेक्ट्रोड केवल कैपेसिटिव व्यवहार प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 2)।

तरल-ओवरले 96-वेल प्लेट विधि की एक भिन्नता का उपयोग ट्रांसक्रिप्टेड ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं से बने 3 डी ट्यूमर को विकसित करने के लिए किया जाता है जो एक फ्लोरोसेंट इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिपोर्टर को स्थिर रूप से व्यक्त करता है। स्फेरॉइड की वृद्धि को उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है (चित्रा 3; चित्र 3)। ईडी 0)। सेल लाइन और बीजित कोशिकाओं की संख्या के आधार पर गोलाकार और घने स्फेरॉइड प्राप्त करने के लिए कम से कम 2 या 3 दिनों की आवश्यकता होती है।

इन ओवो मॉडल में, स्फेरॉइड को बटेर भ्रूण के कोरिओलैंटोइक झिल्ली में ग्राफ्ट किया जाता है (चित्र 3; चित्र 3)। ईडी 6)। ग्राफ्ट की सफलता का मूल्यांकन कुछ दिनों बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है, क्योंकि जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम होता है, और इस प्रकार फ्लोरोसेंट होता है (चित्रा 3; चित्र 3)। ईडी 9)। ट्यूमर के वैस्कुलराइजेशन को रक्त वाहिकाओं में एक फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्ट करके एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है (चित्रा 3; चित्र 3)। ईडी 9)। हालांकि, ट्यूमर के अंदर रक्त वाहिकाओं की कल्पना करना हमेशा संभव नहीं हो सकता है क्योंकि स्फेरॉइड बहुत घना है। लचीले इंटरडिजिटेटेड इलेक्ट्रोड को संवहनी ट्यूमर के शीर्ष पर रखा जाता है (चित्रा 3; चित्र 3)। ईडी 9) और एक पल्स जनरेटर से जुड़ा हुआ है। भ्रूण के रक्तस्राव से बचने के लिए जांच को धीरे से रखा जाना चाहिए; अन्यथा, फ्लोरोसेंट डाई फैल सकती है, जो इमेजिंग द्वारा किसी भी अवलोकन को बाधित करती है। जैविक वातावरण में नाड़ी के सही वितरण को सर्किट के माध्यम से जाने वाली धारा को मापकर सत्यापित किया जा सकता है। ओवो मॉडल में इनकी इमेजिंग 3 डी ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम पर पीईएफ के प्रभाव की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देती है, साथ ही ट्यूमर के वाहिका पर प्रेरित वाहिकासंकीर्णन, प्रतिरक्षा प्रणाली सहित अन्य सेल प्रकारों के किसी भी प्रभाव से बचतीहै।

ग्लियोब्लास्टोमा पर पीईएफ प्रभाव का अध्ययन अधिक पूर्ण और पूर्वानुमानित मॉडल में भी किया जा सकता है। दरअसल,14 से ऊपर वर्णित विवो मॉडल में माउस के मस्तिष्क पैरेन्काइमा में 3 डी ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर ग्राफ्टिंग शामिल है (चित्रा 4)। ट्यूमर के विकास के दौरान शारीरिक बायोफिज़िकल बाधाओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए ट्यूमर की इंजेक्शन साइट को क्रॉस-लिंक्ड डेक्सट्रान जेल हेमी-बीड द्वारा प्लग किया जाता है। यद्यपि संदर्भ14 में वर्णित है, यह फिर से जोर देने योग्य है कि यह गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि डेक्सट्रान हेमी-बीड को ड्यूरा मेटर से ठीक से जोड़ा जाए; अन्यथा, ट्यूमर खुले ड्यूरा के माध्यम से बच सकता है और मस्तिष्क को पूरी तरह से कवर कर सकता है, जिससे इमेजिंग असंभव हो जाती है। किसी भी पुरानी इमेजिंग के लिए, कपाल खिड़की के ठीक होने के रूप में होने वाली ऊतक वृद्धि एक गंभीर बाधा पैदा करती है, क्योंकि नया ऊतक गैर-पारदर्शी होता है और छवियों को धुंधला या गैर-उपयोग करने योग्य बनाता है। इसलिए, हेमी-बीड डालने और चिपकाने के बाद, खुली कपाल खिड़की की साइडवॉल को सुपरग्लू की एक पतली परत के साथ सील करने की आवश्यकता होती है, जिसे सुपरग्लू को फिसलने या ड्यूरा पर बहने के बिना गुहा की दीवार के चारों ओर सावधानीपूर्वक रखा जाता है। जब लचीली जांच को ट्यूमर इंजेक्शन साइट के शीर्ष पर रखा जाता है, तो दो कारणों से कोई बुलबुले जांच के तहत नहीं रह सकते हैं। सबसे पहले, बुलबुले मौजूद होने पर इमेजिंग आगे नहीं बढ़ सकती है। दूसरे, बुलबुले इन्सुलेटर के रूप में काम करते हैं, इस प्रकार विद्युत उत्तेजना गुणों को बदलते हैं। ऊपर वर्णित सावधानी बरतने के बाद, क्रैनियोटॉमी को खोपड़ी पर सीमेंट की गई कांच की खिड़की के साथ सील कर दिया जाता है ताकि हफ्तों में पुरानी इमेजिंग की अनुमति मिल सके। चूंकि ट्यूमर में जीसीएएमपी या डीएसरेड व्यक्त करने वाली कोशिकाएं होती हैं, इंजेक्शन की पुष्टि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ की जा सकती है। प्रत्यारोपण के बाद प्रदर्शन को मान्य करने के लिए इलेक्ट्रोड के इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा को मापा जाना चाहिए। खारा घोल में प्रतिबाधा की तुलना में, जैविक वातावरण की उपस्थिति के कारण 100 हर्ट्ज से ऊपर की आवृत्तियों पर विवो में प्रतिबाधा की वृद्धि की उम्मीद है (चित्रा 5)। संवहनी तंत्रिका पैरेन्काइमा और ट्यूमर घुसपैठ को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6) द्वारा हफ्तों में पारदर्शी सब्सट्रेट के माध्यम से देखा और विशेषता दी जा सकती है। उदाहरण के लिए, रुचि की कोशिकाओं (प्रतिरक्षा कोशिकाओं और न्यूरॉन्स) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग, अकेले इलेक्ट्रोड आरोपण (चित्रा 6 ए) द्वारा प्रेरित न्यूनतम भड़काऊ प्रक्रिया के प्रदर्शन की अनुमति दे सकता है या बढ़ते जीबीएम ट्यूमर के शीर्ष पर प्रत्यारोपित पीईएफ उत्तेजित इलेक्ट्रोड के प्रत्यारोपण के 26 दिन बाद माइक्रोग्लिया और मोनोसाइट्स की उपस्थिति दिखा सकता है (चित्रा 6 बी 1)। ). बाद के मामले में, परिधीय-मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाएं और मस्तिष्क-निवासी माइक्रोग्लियल कोशिकाएं दोनों ट्यूमर के आसपास और अंदर पाई गईं (चित्रा 6 बी 2)। पीईएफ डिलीवरी के दिन, लचीले इलेक्ट्रोड के संपर्क पैड को पल्स जनरेटर से जोड़ा जा सकता है, सीधे दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत। कुल मिलाकर, इस मॉडल का उपयोग मस्तिष्क ट्यूमर के विकास में शामिल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग करके समय के साथ बायोइलेक्ट्रिक उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है, लगभग 500 μm की गहराई तक।

Figure 1
चित्र 1: लचीले इलेक्ट्रोड का माइक्रोफैब्रिकेशन। (ए) गोल्ड इलेक्ट्रोड पैटर्निंग और पैरिलीन सी सब्सट्रेट। (बी) रूपरेखा खोलना। (सी) पेडोट: पीएसएस कोटिंग। (डी) कनेक्शन और पैकेजिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: लचीले सोने के इलेक्ट्रोड और PEDOT: PSS लेपित ठंडे इलेक्ट्रोड की इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी एक खारे घोल में। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लियोब्लास्टोमा का इनओवो मॉडल। ईडी 0: स्फेरॉइड को एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया। ईडी 3: खुलने के 3 दिन बाद बटेर भ्रूण की शेल कम संस्कृति। ईडी 6: सीएएम में प्रत्यारोपित ट्यूमर एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया। ईडी 9: संवहनी ट्यूमर (हरे रंग में ट्यूमर और लाल रंग में रक्त वाहिकाओं) पर रखा लचीला उपकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विवो अनुप्रयोग में (ए) विवो प्रयोगों के लिए योजना। (बी) कवर ग्लास और ऐक्रेलिक राल के आवेदन से पहले जांच प्लेसमेंट। (सी) पूर्ण जांच आरोपण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: प्रत्यारोपित जांच की तुलना में खारे घोल में लचीले सोने के इलेक्ट्रोड की इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: इलेक्ट्रोड के माध्यम से इंट्रावाइटल मल्टीस्पेक्ट्रल टू-फोटॉन इमेजिंग। (ए) इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण के 3 दिन बाद एक नियंत्रण मल्टीफ्लोरोसेंट एएमयू-न्यूरोइन्फ्लेम माउस में स्वस्थ मस्तिष्क की सतह की टिल्ड छवि। सियान परत 5 पिरामिड न्यूरॉन्स के डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन को दर्शाता है, हरा रंग ग्रैन्यूलोसाइट्स और मोनोसाइट्स की भर्ती दिखाता है, और पीला सक्रिय माइक्रोग्लिया और डेंड्राइटिक कोशिकाओं को दिखाता है। गुलाबी गर्मी संचय के कारण अवरक्त प्रसार दिखाता है। (B1) ए के समान छवि लेकिन ट्यूमर स्फेरॉइड प्रत्यारोपण के 26 दिनों के बाद कॉर्टेक्स के अंदर 200 μm गहरा है, जिसके तुरंत बाद इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण होता है। हरे और पीले प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संचय पर ध्यान दें। (B2) इलेक्ट्रोड की सतह के नीचे बी 1 लेकिन 100 μm के समान छवि। लाल ट्यूमर द्रव्यमान की परिधि में नीले न्यूरोनल डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन की उपस्थिति पर ध्यान दें जो पीले माइक्रोग्लिया और डेंड्राइटिक कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ की जाती है। गहरा नीला पेरिट्यूमरल कोलेजन से एक दूसरा हार्मोनिक संकेत दिखाता है। (B3) ट्यूमर के आसपास के क्षेत्र में इंटरन्यूरॉन सोमा (तीर द्वारा इंगित) की उपस्थिति को दर्शाते हुए बी 2 का ज़ूम दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस काम में वर्णित दृष्टिकोण जैविक संगठन के विभिन्न स्तरों पर पीईएफ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत पीईएफ वितरण प्रणाली के साथ मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल को सक्षम बनाता है। माइक्रोफैब्रिकेशन प्रोटोकॉल में मानक पतली-फिल्म प्रक्रियाएं होती हैं, जो इलेक्ट्रोड डिजाइन में स्वतंत्रता की एक बड़ी डिग्री प्रदान करती हैं जिन्हें विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कभी-कभी, निर्माण के दौरान होने वाले इलेक्ट्रोड के झुकाव को कम करने के लिए, निर्माण के अंत में एक अतिरिक्त थर्मल एनीलिंग चरण उपयोगी हो सकता है।

फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक को व्यक्त करने वाली एक स्थिर ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन का उपयोग डाई डिलीवरी और प्रतिधारण से जुड़ी सभी जटिलताओं से बचता है, खासकर 3 डी ट्यूमर में जो बहुत घनेहैं। दरअसल, मानक रासायनिक फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक17 की तुलना में लंबी अवधि में एक उच्च अभिव्यक्ति स्तर देखा जाता है। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है, क्योंकि इसका उपयोग आमतौर पर इमेजिंग तंत्रिका गतिविधि11 के लिए किया जाता है। यहां, मानव और मुराइन सेल लाइनों का उपयोग किया गया था (क्रमशः इम्यूनोडेफिशिएंट या इम्यूनोसक्षम चूहों में आरोपण के लिए यू 87 और जीएल 261)। दरअसल, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि यू 87 सेल लाइन मूल कोशिकाओं से अलग है क्योंकि सेल संस्कृति के वर्षों में कई उत्परिवर्तन प्राप्त किए गए थे, जो प्रयोगात्मक पुनरुत्पादक18 को प्रभावित करते थे। 3 डी ट्यूमर की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली विधि उच्च-थ्रूपुट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और सेल लाइन, सीडिंग पर कोशिकाओं की संख्या और विकास के समय के आधार पर एक विशिष्ट आकार के स्फेरॉइड की पीढ़ी की अनुमति देतीहै। हालांकि, ये स्फेरॉइड घने होते हैं, जो ट्यूमर के मूल में इमेजिंग करते समय एक नुकसान प्रस्तुत करता है।

इन ओवो मॉडल मस्तिष्क में मौजूद अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत के बिना, 3 डी ट्यूमर और उनके वाहिका पर पीईएफ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पहले दृष्टिकोण के रूप में उपयोगी है। यह मॉडल सस्ती, तेज, उच्च-थ्रूपुट है, और पशु मॉडल की तुलना में कम नैतिक मुद्दों को उठाता है। पूरे प्रयोग के दौरान भ्रूण की अखंडता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह इसके अस्तित्व और इमेजिंग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। भ्रूण झिल्ली को नुकसान से बचने के लिए बटेर अंडे को खोलते समय विशेष सावधानी बरतनी चाहिए। भ्रूण को मारने वाले रक्तस्राव से बचने के लिए ग्राफ्ट और लचीले इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट को भी सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। रक्त वाहिकाओं में फ्लोरोसेंट डाई का इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ वैस्कुलराइजेशन की अनुमति देता है। भ्रूण के तरल में डाई रिसाव से बचने के लिए इंट्राओकुलर इंजेक्शन सावधानी से किया जाना चाहिए, जो पृष्ठभूमि में अवशिष्ट प्रतिदीप्ति का कारण बन सकता है जो इमेजिंग की गुणवत्ता को कम करता है। इस मॉडल का उपयोग दवा अपटेक का पालन करने के लिए भी किया जा सकता है, क्योंकि यह संचार प्रणाली तक पहुंच की अनुमति देता है। हालांकि, प्रयोग भ्रूण के 12-दिन के जीवित रहने के समय से सीमित हैं, इस प्रकार 7 दिनों के अवलोकन की अनुमति देते हैं, जो विवो मॉडल21 की तुलना में काफी कम है।

विवो ब्रेन ट्यूमर मॉडल की निगरानी 4 से 5 सप्ताह तक की जा सकती है, इससे पहले कि जानवर अचानक 20% वजन घटाने द्वारा निर्धारित एक नैतिक प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक पहुंच जाएं। यह अच्छी तरह से सहन किया जाता है और जगह पर रहता है यदि इलेक्ट्रोड की कनेक्टिंग पूंछ बहुत लंबी नहीं है। अन्यथा, जानवर फ्लिपिंग कनेक्टर को खरोंचते हैं, जो अंततः फट सकता है, इसलिए उत्तेजक के बाद के कनेक्शन को रोकता है। यह 4 सप्ताह की अवधि फिर भी ग्लियोब्लास्टोमा विकास के विभिन्न चरणों को कवर करने के लिए मूल्यवान है। अलग-अलग समय अंतराल पर रुचि की एक ही मात्रा में ट्यूमर सेल घनत्व की तुलना करते समय, ट्यूमर विकास कैनेटीक्स का विकास देखा जा सकता है। विशेष रूप से, प्रतिरक्षा स्विच22 के समय ट्यूमर की वृद्धि देखी गई थी। एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड की उपस्थिति में एक समान अध्ययन ट्यूमर प्रसार दर और प्रतिरक्षा उन्मूलन के लिए ट्यूमर संवेदनशीलता पर पीईएफ के प्रभाव पर सूचित करेगा। ओवो मॉडल की तुलना में, इन विवो मॉडल को ट्यूमर की प्रगति पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रभाव और पीईएफ के चिकित्सीय प्रभाव में उनके योगदान का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को कपाल विंडो 14 रखने से पहले ट्यूमर पर एक लचीले इलेक्ट्रोड डिवाइस के अतिरिक्त पिछले लेख से अनुकूलितकिया गया है। ट्यूमर के तीव्र और पुराने बायोइलेक्ट्रिक उपचार दोनों को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ प्रत्यक्ष और बाद के अवलोकनों की विशेषता हो सकती है, यह देखते हुए कि प्रारंभिक उत्तेजना से कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के स्थायी विकृति को ट्रिगर करने की उम्मीद है।

लचीली जांच के कनेक्शन दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से सुलभ हैं। विद्युत उत्तेजना मापदंडों को इस प्रकार तंत्रिका ऊतक और / या लक्षित कोशिकाओं पर देखे गए प्रभाव के आधार पर वास्तविक समय में समायोजित किया जा सकता है, जैसे कि एक चिकित्सा चिकित्सक अपने रोगी की एमआरआई या सीटी छवियों को देखते समय पारंपरिक प्रक्रियाएं करेगा। एक अंतिम विचार ऊतक पुन: विकास को रोकने के लिए सुपरग्लू और सिलिकॉन गोंद के साथ मस्तिष्क पर इलेक्ट्रोड की सावधानीपूर्वक सीलिंग का महत्व है।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर मॉडल के लिए लचीले कार्बनिक बहुलक इलेक्ट्रोड के साथ पीईएफ थेरेपी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। दो मॉडल जटिलता के विभिन्न स्तरों को प्रदर्शित करते हैं जैसे कि कार्रवाई के तंत्र की बेहतर समझ के लिए सेलुलर, संवहनी या प्रतिरक्षा प्रभाव को अलग किया जा सकता है। अनुरूप, सतही इलेक्ट्रोड ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के विघटन को सक्षम करते हुए आयट्रोजेनिक क्षति को कम करते हैं, जिससे इंट्रासेल्युलर कैल्शियम15 के वाहिकासंकीर्णन या विकृति को ट्रिगर किया जाता है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

यहां रिपोर्ट किए गए काम को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर-18-सीई 19-0029) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक एक स्थिर जीसीएएमपी 6 एफ सेल लाइन की पीढ़ी में उनके योगदान के लिए एसएम बर्डेट और इन ओवो मॉडल के साथ उनकी मदद के लिए डी ओ'कॉनर को गर्मजोशी से धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane Sigma 440167 GOPS
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
4-Dodecylbenzenesulfonic acid Sigma 44198 DBSA
96-well plate Falcon 353075
Acetone Technic 530
Acrylic resin Fischer scientific NC1455685
agarose Sigma A9539
autoclave Tuttnauer 3150 EL
AZ 10XT Microchemicals Positive photoresist
AZ 826 MIF Developer Merck 10056124960 Metal-ion-free developer for the negative photoresist
AZ Developer Merck 10054224960 Metal-ion-free developer for the positive photoresist
AZ nLof 2070 Microchemicals Negative photoresist
Buprenorphine Axience
Carprofen Rimadyl
Centrifuge Sorvall Legend X1R Thermo Scientific 75004260
CMOS camera Prime 95B Photometrics
CO2 incubator HERAcell 150i Thermo scientific
DAC board National Instruments USB 6259
Déco spray Pébéo Cultura 3167860937307 Black acrylic paint
Dextran Texas Red 70.000 Thermofisher D1830
Die bonding paste "Epinal" Hitachi EN-4900GC Silver paste
Dimethyl sulfoxide Sigma D2438
Dispensing machine Tianhao TH-2004C
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I Gibco 10567-014
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma D6429
Egg incubator COUVAD'OR 160 lafermedemanon.com
Ethylene glycol Carl Roth 6881.1
Fertilized eggs of Japanese quail Japocaille
Fetal Bovine Serum VWR S181BH
Flask Greiner 658170
Fluorescence macroscope Leica MZFLIII
Gl261 DSMZ ACC 802
Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th Neyco
Handheld automated cell counter Millipore PHCC00000
Heating and drying oven Memmert UF110
Hexadimethrine Bromide Sequa-brene Sigma S2667
hot plate Delta 6 HP 350 Süss Microtec
Illumination system pE-4000 CoolLed
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) Spectra Physics (USA)
Ionomycin calcium salt Sigma I3909
Kapton tape SCOTCH 92 33x19 3M Polyimide protection tape
Lab made pulse generator
Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 SCS
Lenti-X 293 T cell line Takara Bio 63218 HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production
Lenti-X GoStix Plus Takara Bio 631280 Quantitative lentiviral titer test
Mask aligner MJB4 Süss Microtec
Micro-90 Concentrated cleaning solution International Products M9050-12
Microscope slides 76 x 52 x 1 mm Marienfeld 1100420
Needles 30G BD Microlance 3 304000
PalmSens4 potentiostat PalmSens
parylene-c : dichloro-p-cyclophane SCS 300073
PCB Processing Tanks Mega Electronics PA104
PEDOT:PSS Clevios PH 1000 Heraeus
penicillin / streptomycin Gibco 15140-122
Petri dish Falcon 351029
pGP-CMV-GCaMP6f Addgene 40755 plasmid
Phosphate Buffer Saline solution Thermofisher D8537
Plasma treatment system PE-100 Plasma Etch
PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher Oxford Instruments
Plastic mask Selba
Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm VWR 10770-454
Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow chemicals 1673921
Polyimide copper film 60 µm (Kapton) Goodfellow IM301522
Propan-2-ol Technic 574
Protolaser S LPKF
puromycin Gibco A11103
Round cover glass 5 mm diameter Fischer scientific 50-949-439
Scepter Sensors - 60 µm Millipore PHCC60050
Silicone adhesive Kwik-Sil World Precision Instruments
spin coater Süss Microtec
Spin Coater Laurell WS-650
Super glue Office depot
tetracycline-free fœtal bovine Serum Takara Bio 631105
Thermal evaporator Auto 500 Boc Edwards
Two-photon microscope Zeiss LSM 7MP
U87-MG ATCC HTB-14 Human glioblastoma cells
Ultrasonic cleaner VWR
Vortex VTX-3000L LMS VTX100323410
Xfect single shots reagent Takara Bio 631447 Transfection reagent

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 186
ग्लियोब्लास्टोमा के स्पंदित इलेक्ट्रिक फील्ड थेरेपी के लिए लचीले कार्बनिक इलेक्ट्रॉनिक उपकरण
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Lefevre, M. C., Kaszas, A., Dijk,… More

Lefevre, M. C., Kaszas, A., Dijk, G., Baca, M., Baudino, O., Marchiori, B., Kergoat, L., Moreau, D., Debarbieux, F., O'Connor, R. P. Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma. J. Vis. Exp. (186), e63527, doi:10.3791/63527 (2022).

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