Summary
Bu çalışma, 3D beyin tümörü modellerinde, yani in vitro kültürde, in ovo modelinde ve in vivo murin modelinde uygulama için esnek interdigitated elektrotların geliştirilmesini açıklamaktadır. Önerilen yöntem, darbeli elektrik alanlarının farklı karmaşıklık seviyelerindeki tümörler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Abstract
Glioblastomun yüksek derecede invazivliği nedeniyle standart onkoloji tedavileri ile ortadan kaldırılması zordur. Darbeli elektrik alanlarına (PEF'ler) dayalı biyoelektrik tedaviler, tedavi verimliliğinin iyileştirilmesi için umut vericidir. Bununla birlikte, özellikle beyin gibi yumuşak dokularda akut ve kronik hasara neden olan sert elektrotlara güvenirler. Bu çalışmada PEF'lerin tümörlere iletilmesinde esnek elektronik kullanılmış ve floresan mikroskopi ile biyolojik yanıt değerlendirilmiştir. İnce, şeffaf bir parilene-C substratı üzerindeki interdigite altın elektrotlar, iletken polimer PEDOT: PSS ile kaplandı ve uyumlu ve biyouyumlu bir cihazla sonuçlandı. PEF'lerin tümörler ve mikro çevreleri üzerindeki etkileri çeşitli biyolojik modeller kullanılarak incelenmiştir. İlk olarak, glioblastoma hücrelerinin tek katmanları, in vitro fenomenleri araştırmak için elektrotların üstünde kültürlendi. Bir ara adım olarak, mühendislik tümör sferoidlerinin bir bıldırcınların embriyonik zarına aşılandığı bir in ovo modeli geliştirilmiştir. Bir bağışıklık sisteminin yokluğu nedeniyle, bu yüksek vaskülarize tümörlere yol açtı. Gelişimin bu erken aşamasında, embriyoların bağışıklık sistemi yoktur ve tümörler yabancı cisim olarak tanınmaz. Böylece, değerli bir 3D kanser modelini temsil eden mevcut embriyo vasküler sisteminden kendi damarlarını geliştirirken hızlı bir şekilde gelişebilirler. Son olarak, PEF'lerin esnek elektrot iletimi, fonksiyonel bir bağışıklık sistemine sahip tam bir organizmada, bir syngenic, ortogreft (intrakraniyal) fare modeli kullanılarak değerlendirildi. Tümör sferoidleri, esnek organik elektrot cihazlarının implantasyonundan önce transgenik multi-floresan farelerin beynine aşılandı. Kapalı bir kraniyal pencere, birkaç hafta boyunca PEF'lerle tedavi sırasında tümörün ve mikro ortamının çoklu foton görüntülemesini sağladı.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) oldukça invaziv bir tümördür ve bu nedenle rezeksiyon, radyoterapi ve kemoterapi gibi standart tedavilerle ortadan kaldırılması zordur. Multimodal tedavilere rağmen prognoz çok kötüdür ve hastaların çoğu tanıdan sonraki 1 yıl içinde hastalık progresyonu yaşar 1,2. Son zamanlarda, biyoelektrik tedavilerin geliştirilmesi, mevcut tedavileri iyileştirmek için büyük bir potansiyel göstermiştir. Bu tedaviler, hücresel membran bütünlüğünü ve tümörlerin mikro ortamını bozmak için tipik olarak tek bir tedavi seansında darbeli elektrik alanlarının (PEF) verilmesini kullanır. Elektroporasyon olarak da bilinen bu hücre zarı bozulması, elektrik alan yoğunluğuna ve darbe sayısına bağlı olarak geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz olabilir. Geri dönüşümsüz elektroporasyon (IRE), elektrik darbelerinin hücre zarlarında ölümcül hasara neden olduğu ve hücre ölümüne yol açan termal olmayan bir doku ablasyon tekniği olarak uygulanır3. Geri dönüşümlü elektroporasyon, kanser hücrelerinde ilaç alımını arttırmak için kemoterapi ilaçlarıyla kombinasyon halinde PEF'lerin verilmesinden oluşan yerleşik bir teknik olan elektrokemoterapide (EKT) uygulanır4. Ayrıca, son zamanlarda yapılan çalışmalar, kanser tedavisi için yüksek verimliliğe sahip EKT'ye alternatif olarak kalsiyum elektroporasyonunu göstermiştir, bu da ucuzdur ve daha az yan etkiye neden olmaktadır5. Bu umut verici gelişmelere rağmen, PEF'ler genellikle yumuşak dokuya zarar verdiği bilinen sert, metalik elektrotlar kullanılarak uygulanır6. Beyin, mekanik uyumsuzluğun iltihaplanmaya ve astroglial yara izine neden olduğu bu tür istilacı cihazlara karşı özellikle hassastır7.
Bu bağlamda, mikrofabrikasyondan murin modeline kadar glioblastoma tümörlerinin 3D modelleri ile birlikte esnek bir PEF dağıtım sistemi sunulmaktadır. Konformal elektrotlar, parilen-C, altın ve PEDOT: PSS 8,9 gibi yumuşak ve biyouyumlu malzemelerin kullanımı da dahil olmak üzere standart ince film mikrofabrikasyon işlemleriyle yapılır. Elektrot parmakları arasında görüntüleme için yeterli şeffaflığı korurken geniş bir yüzey alanını kaplamak için ara basamaklı bir elektrot tasarımı kullanılır10. Tümör modeli için, genetik olarak kodlanmış bir floresan muhabirini ifade eden glioblastoma hücrelerinin 3D sferoidleri, sıvı kaplamalı 96 kuyucuklu plaka yöntemi11'in bir varyasyonu kullanılarak üretilir. Sferoidler, bir bıldırcın embriyosunun koryoallantoik zarına aşılanır ve anjiyogenez veya ilaç toksikolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir in ovo modeli ile sonuçlanır12,13. Tümörler, embriyonik gelişimin bu aşamasında bir bağışıklık sisteminin yokluğunda embriyonun vaskülatürü tarafından aşılanabilir ve vaskülarize edilebilir12. Esnek elektrotlar daha sonra PEF dağıtımının sferoid ve vaskülatürü üzerindeki etkisini incelemek için vaskülarize tümörün üzerine yerleştirilir. Son olarak, bu etkiler, tümör mikroçevresi ve bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere tam bir canlı organizma üzerinde, mühendislik sferoidlerinin murin modellerinin beyin parankimine implante edilmesiyle araştırılmaktadır14. Esnek elektrotlar yerleştirme bölgesinin üstüne yerleştirilir ve kraniyotomi cam bir pencere ile kapatılır ve birkaç hafta boyunca tekrarlanan iki foton görüntülemeye izin verir.
Bu yöntemler, mikroelektronik mühendisliğinden onkoloji uygulamalarına kadar çeşitli alanlara ilgi duyan kişiler için yararlı olacaktır. Mikrofabrikasyon protokolü, PEDOT:PSS ile kaplanmış ince film metal elektrotlar gerektiren herhangi bir uygulama için kullanılabilir ve uyarlanabilir. Ayrıca, antitümör elektriksel tedavilerin değerlendirilmesi için geliştirilen biyolojik modeller, implante edilen materyallere hücresel, vasküler ve immün yanıtın farklılaşmasının araştırılması için genel ilgi çekici olacaktır.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Fransız mevzuatına ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için 24 Kasım 1986 tarihli Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi'ne (86/609/EEC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar üzerindeki araştırma, Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône tarafından yetkilendirilmiş ve Provence Cote D'Azur etik komitesi tarafından onaylanmıştır (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. Esnek cihaz mikrofabrikasyonu (Şekil 1)
- Cam kızakların temizlenmesi
- Sonicate cam 15 dakika boyunca% 2 sabun çözeltisinde kayar. Onları suyla durulayın.
- 15 dakika boyunca% 80 saf aseton ve% 20 saf izopropanol karışımında tekrar sonikat.
DİKKAT: Bu çözücüler zararlı ve yanıcıdır. Kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin ve bunları bir duman başlığı altında tutun. - Slaytları izopropanol ile durulayın ve bir hava tabancasıyla kurulayın.
NOT: Tüm işlem boyunca asetonun substratlar üzerinde kurumadığından emin olun.
- Altın elektrot deseni (Şekil 1A)
- Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm'lik bir parilen-C (PaC) tabakası biriktirin (Şekil 1Aa).
- Temizlenmiş cam kızakları biriktirme odasına yerleştirin. Soğutucunun üzerine sabun püskürtün, kurumasını bekleyin ve biriktirme sisteminin belirlenen soğuk tuzağına yerleştirin. Bu yapışkan önleyici, biriktirme işleminden sonra PaC'nin soğutucudan kolayca çıkarılmasını kolaylaştırır.
DİKKAT: PaC tahriş edicidir ve sağlık açısından tehlike oluşturur. Kullanırken eldiven giyin. - Alüminyum bir teknede 6 g PaC tartın ve fırına yerleştirin. Makineyi boşaltın (P = 10 mTorr) ve biriktirmeye aşağıdaki parametrelerle başlayın: TChiller = -100 °C, TFırın = 690 °C, TBuharlaştırıcı = 175 °C ve TOdası = 135 °C.
- Biriktirme işlemi tamamlandığında ve buharlaştırıcının sıcaklığı 40 °C'nin altında olduğunda, soğutucuyu, buharlaştırıcıyı ve fırını kapatın. Makineyi havalandırın ve örnekleri toplayın.
- Temizlenmiş cam kızakları biriktirme odasına yerleştirin. Soğutucunun üzerine sabun püskürtün, kurumasını bekleyin ve biriktirme sisteminin belirlenen soğuk tuzağına yerleştirin. Bu yapışkan önleyici, biriktirme işleminden sonra PaC'nin soğutucudan kolayca çıkarılmasını kolaylaştırır.
- Numunelerin yüzeyini 30 s (100 W, 50 sccm) oksijen plazma işlemi ile aktive edin.
- Plazma ile muamele edilmiş numuneleri 40 s boyunca 1.000 x g'da negatif bir fotodirenç ile spin-co'layın. Numuneleri 2 dakika boyunca 110 °C'de bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 1Ab).
DİKKAT: Fotorezistlik çözeltisi yanıcıdır ve tahrişe neden olur; KKD giyin ve bir duman başlığı altında tutun. - UV geniş bant temas hizalayıcısının ışın hattına bir i-line filtre yerleştirin ve fotodirenci interdigite elektrot tasarımına sahip bir maske ile açığa çıkarın (Şekil 1Ac).
NOT: 50 veya 250 μm boşluklu ara sayısallaştırılmış elektrotlar bir düzen editörü kullanılarak tasarlanmış ve lazer fotoplotlama ile polyester fotomaskeler üreten bir şirketten fotomaskeler sipariş edilmiştir. - Yukarıdaki numuneleri 110 °C'de bir sıcak tabakta 3 dakika pişirin ve 5 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Maruz kalmayan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonu içermeyen bir geliştiriciye 3 dakika daldırın. Numuneleri suyla durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Ad).
DİKKAT: Geliştirici çözümü tahriş edicidir; KKD giyin ve duman başlığının altına tutun. - Numunelerin yüzeyini 60 s (100 W, 50 sccm) oksijen plazma işlemi ile aktive edin.
- Aşağıdaki gibi bir termal evaporatör ile 20 nm yapışma tabakası krom ve 300 nm altın tabakası biriktirin (Şekil 1Ae).
- Evaporatör makinesini havalandırın ve numuneleri metal vidalarla üst yuvarlak plakaya (aşağı bakacak şekilde) klipsleyin. Özel potaları sırasıyla krom ve altınla doldurun. 5 · 10-6 Torr'un altındaki bir basınca ulaşmak için makineyi kapatın ve boşaltın. Örnek tutucunun rotasyonunu başlatın.
- Krom içeren potayı seçin ve 0,2 Å·s-1 biriktirme hızına ulaşılana kadar içinden geçen akımı yavaşça artırın. Deklanşörü açın ve 20 nm krom birikinceye kadar bekleyin. Deklanşörü kapatın ve akımı 0 mA'ya kadar yavaşça azaltın.
- Altın içeren potayı seçin ve 0,2 Å·s-1 biriktirme oranına ulaşana kadar içinden geçen akımı yavaşça artırın. Altını buharlaştırmak için deklanşörü açın, 10 nm altın birikinceye kadar bekleyin ve ardından yaklaşık 300 nm biriktirilene kadar biriktirme oranını 1,5 ş· s-1'e yükseltin. Deklanşörü kapatın ve akımı yavaşça 0 mA'ya düşürün.
- Numunelerin biriktirildikten sonra 15 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Numune tutucunun dönüşünü durdurun, makineyi havalandırın ve numuneleri toplayın.
- Numuneleri asetonlu bir beherin içine batırın. Fotodirenci kaldırmak için beheri 110 rpm'de ayarlanmış sallanan bir plakaya 15 dakika boyunca yerleştirin. Numuneleri izopropanol ile durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Af).
- Numunelerin yüzeyini 30 s (100 W, 50 sccm) oksijen plazma işlemi ile aktive edin.
- Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm'lik bir PaC yalıtım tabakası biriktirin (bkz. adım 1.2.1) (Şekil 1Ag).
- Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm'lik bir parilen-C (PaC) tabakası biriktirin (Şekil 1Aa).
- Anahat açma (Şekil 1B)
- Numuneleri 35 s için 600 x g'da pozitif bir fotodirenç ile spin-colayın. 2 dakika boyunca 110 °C'de sıcak bir tabağa yerleştirin (Şekil 1Ba).
DİKKAT: Fotorezistlik çözeltisi yanıcıdır ve tahrişe neden olur; KKD giyin ve duman başlığının altına tutun. - UV geniş bant kontak hizalayıcısının ışın çizgisinde i-line filtre olmadığından emin olun ve fotodirenci, cihazın ana hatlarını bir UV geniş bant temas hizalayıcısı ile içeren bir maske ile açığa çıkarın (Şekil 1Bb).
- Maruz kalan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonu içermeyen bir geliştiriciye 4 dakika daldırın. Numuneleri suyla durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Bc).
- Anahattı PaC'nin iki katmanı boyunca reaktif iyon kazıyıcı ile kazıyın (160 W, 22 dakika, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (Şekil 1Bd).
- Kalan fotodirenci asetonla çıkarın, izopropanol ile durulayın ve numuneleri bir hava tabancasıyla kurulayın.
- Numuneleri 35 s için 600 x g'da pozitif bir fotodirenç ile spin-colayın. 2 dakika boyunca 110 °C'de sıcak bir tabağa yerleştirin (Şekil 1Ba).
- PEDOT: PSS kaplama (Şekil 1C)
- 35 s için 70 x g'de% 2'lik bir sabun çözeltisini spin-coat (Şekil 1Ca).
- Bir parilen biriktirme sistemi ile 3 μm'lik bir PaC kurban tabakası biriktirin (bkz. adım 1.2.1) (Şekil 1Cb).
- 35 s için 600 x g'da spin-coat pozitif fotodirenç. Numuneleri 2 dakika boyunca 110 °C'de bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 1Cc).
- UV geniş bant temas hizalayıcısının ışın çizgisinde i-line filtre olmadığından emin olun ve fotodirenci elektrotların aktif yüzeyini içeren bir maske ile açığa çıkarın (Şekil 1Cd).
- Maruz kalan fotodirenci çıkarmak için numuneleri metal iyonu içermeyen bir geliştiriciye 4 dakika daldırın. Numuneleri suyla durulayın ve bir hava tabancasıyla kurutun (Şekil 1Ce).
- Elektrotların aktif yüzeyini açmak için PaC'yi reaktif bir iyon kazıyıcı ile aşındırın (160 W, 24 dakika, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Aktif yüzeyde artık PaC olmadığını mikroskopla kontrol edin (Şekil 1Cf).
- Kalan fotodirenci asetonla çıkarın, izopropanol ile durulayın ve numuneleri bir hava tabancasıyla kurulayın.
- 90 s (100 W, 50 sccm) için oksijen plazma işlemi kullanarak numunelerin yüzeyini aktive edin.
- Kimyasal olarak polimerize PEDOT: PSS'nin ticari bir dispersiyonunu, etilen glikolün% 5 hacmi (EG) ve dodesilbenzen sülfonik asidin% 0.1 hacmi ile karıştırın. 15 dakika boyunca sonikate. Ağırlıkça% 1 (3-glisidiloksipropil) trimetilsiloksan (GOPS) ekleyin ve 5 dakika boyunca sonikat yapın. Çözeltiyi 1,2 μm'lik bir filtreden süzün.
DİKKAT: EG tahriş edicidir ve sağlık tehlikesi oluşturur. DBSA tahriş edici ve aşındırıcıdır. GOPS aşındırıcıdır. Uygun KKD giyin ve bu kimyasalları bir duman başlığı altında tutun.
NOT: Toplam hacim, numune sayısına bağlıdır. 10 standart cam slayt için, aşağıdaki miktarlara karşılık gelen en az 20 mL hazırlayın: 18.78 mL PEDOT: PSS, 1 mL EG, 20 μL DBSA ve 200 μL GOPS. - 35 s için 150 x g'de dört kat PEDOT: PSS çözeltisinin spin-co'su. Her katmanın biriktirilmesinden sonra, numuneleri 110 °C'de bir sıcak plaka üzerinde 60 s pişirin ve bir sonraki katmanı eğirmeden önce 5 dakika oda sıcaklığına soğutun (Şekil 1Cg).
- Kurbanlık PaC tabakasını numuneleri suya batırarak çıkarın (Şekil 1Ch).
- Numuneleri 1 saat boyunca 140 °C'de pişirin.
- PEDOT:PSS filminde kalan sabunu ve düşük molekül ağırlıklı bileşikleri çıkarmak ve numuneleri cam substrattan ayırmak için numuneleri 30 dakika boyunca deiyonize suya batırın (Şekil 1Ci).
- Bağlantılar ve paketleme (Şekil 1D)
- Bakırla kaplanmış bir poliimid film üzerine ince bir akrilik boya tabakası bırakın (Şekil 1Da). Homojen bir boya tabakası elde etmek için bir aerosol kullanın (Şekil 1Db).
- İki dikdörtgen temas pedi (5 mm x 15 mm; 1,5 mm boşluk) elde etmek için akrilik boyayı bir lazerle (75 kHz, 7 W, 1 lazer geçişi, 400 mm·s-1) desenleyin (Şekil 1Dc).
- Bakırı doymuş %30 (w/v) ferrik klorür (FeCl3) ile 40 °C'de 15 dakika suda ıslak kazıyın (Şekil 1Dd).
DİKKAT: FeCl3 tahriş edici ve aşındırıcıdır; duman başlığının altında eldivenlerle tutun. - Akrilik boyayı bir bezle hafifçe ovalayarak asetonla sıyırın (Şekil 1De).
- Desenli poliimid filmi lazerle dikdörtgen şekillere (15 mm x 30 mm) kesin (15 kHz, 10 W, 30 lazer geçişi, 130 mm·s-1) (Şekil 1Df).
- Gümüş macunu üç eksenli bir dağıtım makinesiyle 330 μm çapında bir iğne (5 m · dak-1) ile üç bar basınçta dağıtın (Şekil 1Dg).
DİKKAT: Gümüş macunu tahriş edicidir; eldivenlerle tutun. - PaC probunu cımbız kullanarak dürbün mikroskobu altında poliimid film ile hizalayın ve takın (Şekil 1Dh).
NOT: Hizalama işaretleri, probun temas pedleri üzerinde konumlandırılmasını kolaylaştırmak için adım 1.5.2'de desenlenebilir. - Fırında 140 °C'de 2 saat pişirin.
- Kontakt pedlerin üzerine 1cm2 poliimid koruma bandı yerleştirin (Şekil 1Di).
- PaC probu ve poliimid filmin PDMS'ye bağlandığı arayüzü daldırın (Şekil 1Dj).
- 50 °C'de 2 saat pişirin.
- Kontak pedlerini açmak için koruma bandını çıkarın (Şekil 1Dk).
NOT: İn vitro cihazların mikrofabrikasyonu benzerdir, ancak 1.2.1, 1.3 ve 1.5 numaralı adımlar atlanmalıdır.
2. Glioblastoma GCaMP6f kararlı hücre hattının oluşturulması
- Lentivirüs üretimi
- 75 cm²'lik bir şişede, 4,5 g içeren 10 mL'lik Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı'nda (DMEM) lentivirüs üretimi için optimize edilmiş HEK 293T türevi bir hücre hattını kültürleyin. L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 tetrasiklin içermeyen fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile en az 3 gün boyunca% 80 birleşmeye kadar desteklenir.
- Ortamı şişeden çıkarın. Hücreleri 10 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile nazikçe durulayın.
- 1 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve şişeyi 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
DİKKAT: Tripsin / EDTA çözeltisi sağlık tehlikesi oluşturur; KKD giyin ve duman başlığının altına tutun. - 8 mL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın.
- Petri kabındaki hücreleri ve plakayı 4 x 106 hücreyi 8 mL kültür ortamında sayın.
- Ertesi gün, GCaMP6f genini içeren plazmidin 25 μg'ını ve toplam 600 μL su hacminde püromisine direnç kazandıran bir seçim belirtecini seyreltin. Bir transfeksiyon reaktifi tüpüne ekleyin. 3.000 rpm'de 10 s vorteks yapın ve nanopartiküllerin üretimine izin vermek için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Tüpün içeriğini HEK 293 T hücrelerinin kültürüne damla damla ekleyin ve elle hafifçe sallayın. Hücreleri 37 °C'de en az 4 saat boyunca inkübe edin.
- Nanopartikül kompleksleri içeren ortamları taze ortamlarla değiştirin ve hücreleri 37 ° C'de geri getirin.
- Üç gün sonra, hücresel kalıntıları çıkarmak için süpernatant ve santrifüjü 10 dakika boyunca 500 x g'de toplayın. Viral parçacıklar içeren sıvı fazı toplayın.
NOT: Süpernatanttaki virüs üretimi, kantitatif bir lentiviral titre testi kullanılarak doğrulanabilir ve en az 2 yıl boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
- Glioblastoma hücre transdüksiyonu
- 75 cm²'lik bir şişede, 1 g içeren 10 mL'lik DMEM'deki kültür glioblastoma hücreleri L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 tetrasiklin içermeyen FBS, 100 ünite · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile en az 4 gün boyunca desteklenir.
- Ortamı atın ve adım 2.1.9'da elde edilen süpernatantı hedef hücrelere ekleyin.
- İletimi iyileştirmek için ortama 5 μg · mL-1 Hexadimethrine Bromür ekleyin. 37 °C'de 6 saat inkübe edin. Ortamı 10 mL taze ortamla değiştirin.
DİKKAT: Hekzadimetrin Bromür tahriş edicidir. Eldivenlerle tutun.
- Kararlı bir hücre hattının oluşturulması
- Transdüksiyondan iki ila üç gün sonra, 1 g · içeren 10 mL DMEM ekleyin L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat,% 10 FBS,100 birim · mL-1 penisilin, 100 μg · mL-1 streptomisin ve dönüştürülmemiş hücreleri öldürmek için puromisin ile desteklenir. Bu ortamda en az 3 gün boyunca kültür hücreleri.
DİKKAT: Puromisin tahriş edicidir; eldivenlerle tutun.
NOT: Hücrelerin puromisine duyarlılığı, transdüksiyondan önce, farklı konsantrasyonlarda puromisin içeren önerilen ortamlarında hücreler kültürlenerek test edilmelidir. Bir gün sonra, hücreleri mikroskopla kontrol edin. Antibiyotiğin çok toksik olmadığından ve transfekte edilen hücreleri de öldürebileceğinden emin olmak için hücrelerin çoğunluğunun öldüğü ancak çok azının hala hayatta olduğu yeterli konsantrasyonu seçin. - Ortamı çıkarın ve hücreleri 10 mL PBS ile durulayın.
- Bir Tripsin / EDTA çözeltisinin% 0.25'inden 1 mL'lik bir miktar ekleyin ve şişeyi 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- 8 mL kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın.
- 100 μL hücre süspansiyonu toplayın ve bir hücre sayacı ile hücre konsantrasyonunu ölçün. 60 μm sensörlü el tipi otomatik hücre sayacında 50 μL hücre süspansiyonunu aspire edin.
- 96 delikli bir plakada 1 hücre/kuyu tohumlayın. Örneğin, mL başına 1 x 10 3 hücrelik bir konsantrasyon için, kuyucuk başına 1 / (1 x 103), yani kuyucuk başına 0.001 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Başarı şansını artırmak için her kuyuyu tohumlayın. Kuyu başına toplam 200 μL hacme ulaşmak için kültür ortamı ile tamamlayın.
- Bir gün sonra, bir hücre içeren her kuyuyu bulun ve floresansını kontrol edin (λexc = 490 nm ve λem = 530 nm). Sadece bir transfekte hücre içeren kuyucukları işaretleyin. Kuyu neredeyse birleşene kadar büyümeye birkaç gün devam edin.
- Ortamı atın ve hücreleri 200 μL PBS ile durulayın. 100 μL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve 96 delikli plakayı 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- 100 μL orta ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. Hücre süspansiyonunu bir Petri kabına aktarın. 5 mL orta ekleyin ve Petri kabı neredeyse birleşene kadar hücrelerin birkaç gün büyümesine izin verin.
- Ortamı atın ve hücreleri 5 mL PBS ile durulayın. 1 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve Petri kabını 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- 6 mL orta ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın. Hücre süspansiyonunu bir T25 şişesine aktarın. Şişe neredeyse birleşene kadar büyümeye birkaç gün devam edin.
- Ortamı atın ve hücreleri 5 mL PBS ile durulayın. 1 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin ve T25 şişesini 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. 1 g· içeren 7 mL DMEM ekleyin L-1 glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 FBS, 100 birim · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile desteklenir. Hücre süspansiyonunu yavaşça yıkayın.
- Hücre süspansiyonunu dört T25 şişeye bölün (şişe başına 2 mL) ve her şişeye 5 mL orta madde ekleyin. Şişeler neredeyse birleşene kadar hücrelerin birkaç gün büyümesine izin verin.
- Üç şişe için adım 2.3.12'yi tekrarlayın ve adım 3.1.3 için son şişeyi saklayın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüp içinde aktarın ve 5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini 900 μL'de yeniden askıya alın. homojen bir hücre süspansiyonunu korumak için hücreleri yavaşça karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu kriyojenik depolama şişelerine aktarın. 100 μL dimetil sülfoksit ekleyin. Kriyovalleri gece boyunca -80 ° C'ye yerleştirin. Daha fazla deney için dondurulmuş hücreleri sıvı nitrojene aktarın.
NOT: Transfeksiyonun verimliliği, ortama 5 μM iyonomisin kalsiyum tuzu eklenerek ve bir floresan mikroskobu altında indüklenen floresan artışı kontrol edilerek değerlendirilebilir (λexc = 490 nm ve λem = 530 nm).
- Transdüksiyondan iki ila üç gün sonra, 1 g · içeren 10 mL DMEM ekleyin L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat,% 10 FBS,100 birim · mL-1 penisilin, 100 μg · mL-1 streptomisin ve dönüştürülmemiş hücreleri öldürmek için puromisin ile desteklenir. Bu ortamda en az 3 gün boyunca kültür hücreleri.
3.3D modeller
- Küresel kültür
- Deiyonize (DI) suda% 1 (w / v) agaroz çözeltisi hazırlayın.
- 100 mL DI suyuna 100 g agaroz tozu ekleyin ve çözeltiyi tüm toz çözülene kadar mikrodalga fırında ısıtın. Kümelenmeleri önlemek için çözeltiyi düzenli olarak karıştırın. Çözeltiyi 120 °C'de 20 dakika otoklav yapın.
- Otoklavdan alındıktan sonra, 96 delikli bir plakaya kuyucuk başına 75 μL agaroz çözeltisi dikkatlice ekleyin. Bir menisküs oluşturmak için kuyunun kenarına koyun, yapışmaz yuvarlak bir tabanla sonuçlanır. Oda sıcaklığında 15 dakika katılaşmasına izin verin.
- Hücreleri (adım 2.3.12) adım 2.3.14'te elde edilen şişeden ayırın.
- Glioblastoma hücrelerinin kuyusu başına 10.000 hücre ekleyin ve 1 g · içeren DMEM ile kuyu başına toplam 150 μL hacme ulaşmak için tamamlayın. L-1 glukoz, L-glutamin, sodyum piruvat ve sodyum bikarbonat ve% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 ünite · mL-1 penisilin ve 100 μg · mL-1 streptomisin ile desteklenir.
- Plakayı 3 gün boyunca hareket ettirmeden hücreleri 37 ° C'de inkübe edin. Ardından, daha sonraki deneylere kadar ortamın yarısını her 2 günde bir çok kanallı pipetle taze medyayla değiştirin. Agarozun veya sferoidin kendisinin zarar görmesini önlemek için pipet ucunu kuyunun üst kısmında tutun.
NOT: Sferoidlerin boyutu, tohumlanan hücre sayısına ve hücre hattına bağlıdır, bu nedenle deneylere bağlı olarak uyarlanmalıdır.
- Deiyonize (DI) suda% 1 (w / v) agaroz çözeltisi hazırlayın.
- In ovo modeli
- Döllenmiş Japon bıldırcın yumurtalarını (C. japonica) bir inkübatöre (37 ° C ve% 57 nem) her 2 saatte bir yumurta döndüren otomatik bir rotatöre sahip tepsilere yerleştirin. Bu gün Embriyonik Gün (ED) 0 olarak kabul edilir.
- Plastik tartım teknelerini %70 (w/v) etanol içine yerleştirerek yıkayın. Tartım teknelerini çıkarın ve bir duman başlığı altında kurutun.
NOT: Bu noktadan itibaren, deneyler steril koşullarda yapılmaz. Bununla birlikte, embriyolarda küf gelişmesini önlemek için temiz koşullar gereklidir. - ED3'te, %70 (w/v) etanol ile önceden yıkanmış ince uçlu bir cımbız kullanarak yumurtaları nazikçe açın. Embriyoyu plastik bir tartım teknesine dökün, başka bir tartım teknesiyle örtün ve 3 gün boyunca 37 ° C'de standart nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
- ED6'da, 23 G'lik bir iğne ile koryoallantoik membranda (CAM) küçük bir kesi yapın.
- Bir pipet kullanarak, insizyon üzerine 7 günlük bir sferoid yerleştirin ve embriyoyu daha sonraki deneylere kadar 3 gün boyunca inkübatöre geri koyun.
NOT: Kan damarlarını görselleştirmek için embriyonun gözüne floresan bir boya enjekte edilebilir. - Deney gününde, esnek probu bir mikromanipülatör kullanarak vaskülarize tümörün üzerine yerleştirin.
- Burası in vivo model
NOT: Protokolün bu bölümü, daha önce referansta yayınlanmış olandan uyarlanmıştır.14. Erişkin çok renkli floresan AMU-Neuroinflam fareler (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) kullanıldı; Bu fareler Thy1'in bir alt popülasyonunun etiketlenmesini sunar+ ECFP'nin transgenik ekspresyonu ile nöronlar, periferik LyzM'nin etiketlenmesi+ EGFP'nin transgenik ekspresyonu ve Cd11c kontrolü altında EYFP'yi eksprese eden bir mikroglia alt tipinin etiketlenmesi ile inflamatuar hücreler+. Kısacası, hayvanlar herhangi bir tedavi veya enjeksiyondan önce 2 dakika boyunca% 1.5 izofluran ile hafifçe sakinleştirilir. Ameliyattan önce hayvanlar Ketamin (120 mg/kg; IP) ve Ksilazin (12 mg/kg; IP). Daha sonra, stereotaktik desteğin sabitlenmesiyle ilişkili kulaklardaki herhangi bir ağrıyı hafifletmek için% 3 Lidokain jeli lokal olarak uygulanır. Daha sonra, kraniyotomiye bağlı herhangi bir ağrıyı hafifletmek için% 0.25 Bupivakain çözeltisi cerrahi bölgeye uygulanır. Fare ameliyat için hazırlandıktan sonra, referansa göre 4 mm çapında bir kraniyotomi yapıldı.14. 26 G'lik bir iğne ile, kraniyotominin ortasındaki dura-materde bir delik açıldı ve tümör sferoidine referansta tarif edilen enjeksiyon sistemi enjekte edildi.14. Ek olarak, burada açıklandığı gibi, kraniyotomi cam bir pencereyle kapatılmadan önce GCamp6 veya DsRed üzerine tümör sferoidini eksprese eden esnek bir elektrot yerleştirildi.- Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininden (DPBS) bir damla damla yerleştirin, böylece kraniyotomi örtün. Esnek elektrodu DPBS damlasının üzerine yerleştirin ve probun arkasını temas pedleriyle yavaşça farenin sırtına yerleştirin (Şekil 4B).
NOT: Steril eldivenler ve "sadece uç" tekniği kullanın. Steril olmayan bir yüzeye temas edilirse eldivenleri değiştirin. Bu prosedür sırasında termal destek sağlayın. - DPBS damlasına küçük bir kağıt parçasıyla dokunarak DPBS'yi emmek için prob dura üzerinde düz durup beynin eğriliğini takip edin. Elektrotun yanından kaçmadan elektrotların altında küçük bir DPBS tabakasının kaldığından emin olun. Bu, sonraki adımlarda tutkal dökülmesine karşı bir bariyer sağlar.
NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanı sterilize edin. - Probun üzerine küçük bir damla silikon yapıştırıcı yerleştirin ve 5 mm'lik yuvarlak kapaklı bir camla örtün. Silikon eşit olarak dağıtılana ve kapak camı ile prob arasındaki mesafe minimum olana kadar kapak camını aşağı doğru itin. Silikonun katılaşabilmesi için kapak camını 30 sn daha aşağı itin.
- Kapak camını sabitlemek için, yanlarına hızlı bir şekilde süper yapıştırıcı uygulayın ve tutkal katılaşana kadar aşağı doğru itin.
- Bir kürdan kullanarak, probun boynuna süper yapıştırıcı uygulayın ve süper yapıştırıcının boynun altına çekilmesine dikkat ederek sabit bir destek sağlayın.
- Kronik bir kapak oluşturmak için kafatasını diş çimentosu ile örtün. Sadece kapak camının kenarlarını örtmeye özellikle dikkat edin.
- Probun arkasını kaldırın ve probun boynunun altına çimento uygulayın. Probu kürlenmeden önce çimento üzerine koyun. Probun boynunu künt forseps ile yavaşça aşağı doğru itin, böylece yüzeyi deney sırasında mikroskop hedefinin yolunda değil, kapak camınınkiyle aynı seviyede olur.
- Prob üzerinde sağlam bir tutuş elde etmek için prob boynunun üst kısmını 1,5 mm'den fazla olmayan diş çimento tabakası ile örtün. İki foton görüntüleme için daldırma sıvısı için bir havza oluşturmak üzere kapak camının etrafında 1-2 mm'lik bir mesafede 1,5 mm'lik bir sırt sunan bir çimento kuyusu inşa edin (Şekil 4C).
- Çimento kürlendikten sonra, cerrahi sonrası buprenorfin analjezikleri (0.05 mg / kg, deri altından 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mL) uygulayın ve hayvanı uyanana kadar ılık bir atmosferde tutun. Bu, kızılötesi bir ampule yakınlığın yanı sıra hayvanı bir kağıt havluya sarmayı da içerir.
NOT: Sıcaklığı izlemek için fare hizasına bir termometre yerleştirin. - Bir potansiyostat kullanarak 1-10 kHz aralığında empedansı karakterize edin.
- Hayvanın ameliyattan en az 10 gün iyileşmesine izin verin. Ameliyattan hemen sonra anti-enflamatuar ilaçlar uygulayın ve uygun postoperatif analjezi sağlamak için hayvanın durumunu izlemeye devam edin.
- Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininden (DPBS) bir damla damla yerleştirin, böylece kraniyotomi örtün. Esnek elektrodu DPBS damlasının üzerine yerleştirin ve probun arkasını temas pedleriyle yavaşça farenin sırtına yerleştirin (Şekil 4B).
4. Darbeli Elektrik Alanı (PEF) dağıtımı ve görüntüleme
- Örnekleri bir floresan mikroskobu altına yerleştirin. 3D modellerde, tümörler sadece üstten gözlemlenebilir.
NOT: In ovo modeli için, deneyler bir epifloresan mikroskobu altında gerçekleştirilmiştir (ancak iki foton mikroskobu ile de mümkündür), oysa in vivo model üzerindeki deneyler iki foton mikroskobu altında gerçekleştirilmiştir (Şekil 6). - Pogo pin konektörleri (in vitro) veya timsah klipsleri (in ovo ve in vivo) kullanarak cihazların temas pedlerine bir darbe jeneratörü bağlayın (Şekil 4A). İstenilen parametreleri (darbe sayısı, voltaj, darbe süresi, frekans) ayarlayın ve jeneratörü çalıştırarak PEF'leri uygulayın (Şekil 4A). PEF'lerin etkilerini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için floresanı aynı anda ölçün.
Representative Results
Bu protokol, esnek bir PEF dağıtım sisteminin entegre edildiği iki glioblastoma modeline uygulamaya izin verir. Mikrofabrikasyon ve paketleme adımlarını takiben, esnek elektrotlar, performanslarını değerlendirmek ve doğrulamak için elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ile tuzlu su çözeltisinde karakterize edilir. PEDOT: PSS kaplı elektrotlar, bir kesme frekansı ile ayrılmış tipik kapasitif ve dirençli baskın bölgeleri gösterirken, kaplanmamış elektrotlar sadece kapasitif davranış gösterir (Şekil 2).
Sıvı kaplamalı 96 kuyucuklu plaka yönteminin bir varyasyonu, floresan hücre içi kalsiyum raporlayıcısını kararlı bir şekilde eksprese eden transfekte glioblastoma hücrelerinden yapılmış 3D tümörleri büyütmek için kullanılır. Sferoidlerin büyümesi parlak alan mikroskobu ile gözlemlenebilir (Şekil 3; ED 0). Hücre hattına ve tohumlanan hücre sayısına bağlı olarak küresel ve yoğun sferoidler elde etmek için en az 2 veya 3 güne ihtiyaç vardır.
In ovo modelinde, sferoidler bir bıldırcın embriyosunun koryoallantoik zarına aşılanır (Şekil 3; ED 6). Greftin başarısı birkaç gün sonra floresan mikroskobu ile değerlendirilebilir, çünkü canlı hücreler hücre içi kalsiyuma sahiptir ve bu nedenle floresan şeklindedir (Şekil 3; ED 9). Tümörün vaskülarizasyonu, floresan mikroskop altında kan damarlarına floresan boya enjekte edilerek gözlemlenebilir (Şekil 3; ED9). Bununla birlikte, sferoid çok yoğun olduğu için tümörün içindeki kan damarlarını görselleştirmek her zaman mümkün olmayabilir. Esnek interdijitasyonlu elektrotlar vaskülarize tümörün üzerine yerleştirilir (Şekil 3; ED 9) ve bir darbe jeneratörüne bağlı. Embriyonun kanamasını önlemek için prob hafifçe yerleştirilmelidir; Aksi takdirde, floresan boya yayılabilir ve bu da görüntüleme yoluyla herhangi bir gözlemi engeller. Darbenin biyolojik ortama doğru verilmesi, devreden geçen akımın ölçülmesiyle doğrulanabilir. Bunların ovo modellerinde görüntülenmesi, PEF'lerin bir 3D glioblastoma tümöründeki hücre içi kalsiyum üzerindeki etkisinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve ayrıca tümörün vaskülatürü üzerinde indüklenen vazokonstriksiyonun izlenmesine olanak tanıyarak, bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinin herhangi bir etkisinden kaçınır15.
Glioblastoma üzerindeki PEF etkisinin incelenmesi daha eksiksiz ve öngörücü bir modelde de gerçekleştirilebilir. Gerçekten de, yukarıda tarif edilen in vivo model, bir farenin beyin parankimindeki bir 3D glioblastoma tümörünün aşılanmasından ibarettir (Şekil 4). Tümörün enjeksiyon bölgesi, tümörün büyümesi sırasında fizyolojik biyofiziksel kısıtlamaları özetlemek için çapraz bağlı bir dekstran jel hemi-boncuk ile tıkanır. Her ne kadar referans14'te tarif edilmiş olsa da, dekstran hemi-boncuğunun dura mater'e tam olarak yapıştırılmasının kritik öneme sahip olduğunu tekrar vurgulamakta fayda var; Aksi takdirde, tümör açık duradan kaçabilir ve beyni tamamen kaplayabilir ve görüntülemeyi imkansız hale getirebilir. Herhangi bir kronik görüntüleme için, kraniyal pencere iyileştikçe gerçekleşen doku büyümesi, yeni doku şeffaf olmadığından ve görüntüleri sisli veya kullanılamaz hale getirdiğinden ciddi bir engel oluşturur. Bu nedenle, hemi-boncuğu yerleştirdikten ve yapıştırdıktan sonra, açılan kafatası penceresinin yan duvarlarının, süper yapıştırıcının dura üzerine kaymasına veya akmasına izin vermeden, boşluk duvarının her tarafına titizlikle yerleştirilmiş ince bir süper yapıştırıcı tabakası ile kapatılması gerekir. Esnek prob tümör enjeksiyon bölgesinin üstüne yerleştirildiğinde, iki nedenden dolayı probun altında hiçbir kabarcık kalamaz. İlk olarak, kabarcıklar mevcut olduğunda görüntüleme ilerleyemez. İkincisi, kabarcıklar yalıtkan görevi görür, böylece elektriksel stimülasyon özelliklerini değiştirir. Yukarıda açıklanan önlemleri aldıktan sonra, kraniyotomi, haftalar boyunca kronik görüntülemeye izin vermek için kafatasına yapıştırılmış bir cam pencere ile kapatılır. Tümör GCaMP veya DsRed eksprese eden hücrelerden oluştuğundan, enjeksiyon bir floresan mikroskobu ile doğrulanabilir. İmplantasyondan sonraki performansı doğrulamak için elektrotların elektrokimyasal empedansı ölçülmelidir. Tuzlu su çözeltisindeki empedansla karşılaştırıldığında, biyolojik bir ortamın varlığı nedeniyle 100 Hz'in üzerindeki frekanslarda empedansın in vivo olarak artması beklenmektedir (Şekil 5). Vaskülarize nöral parankim ve tümör infiltrasyonu iki foton mikroskopisi ile haftalar boyunca şeffaf substrat yoluyla gözlemlenebilir ve karakterize edilebilir (Şekil 6). İlgilenilen hücrelerde (bağışıklık hücreleri ve nöronlar) floresan proteinleri eksprese eden transgenik hayvanların kullanımı, örneğin, tek başına elektrot implantasyonu ile indüklenen minimal enflamatuar sürecin gösterilmesine izin verebilir (Şekil 6A) veya büyüyen bir GBM tümörünün üzerine implante edilen PEF uyarılmış bir elektrodun implantasyonundan 26 gün sonra mikroglia ve monositlerin varlığını gösterebilir (Şekil 6B1 ). İkinci durumda, hem periferik-monosit türevi hücreler hem de beyinde yerleşik mikroglial hücreler tümörün etrafında ve içinde bulundu (Şekil 6B2). PEF teslimatı gününde, esnek elektrotların temas pedleri, doğrudan iki foton mikroskobu altında darbe jeneratörüne bağlanabilir. Genel olarak, bu model, beyin tümörü gelişiminde yer alan çeşitli hücre türlerini kullanarak, yaklaşık 500 μm derinliğe kadar biyoelektrik tedavilerin zaman içindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir.
Resim 1: Esnek elektrotların mikrofabrikasyonu . (A) Altın elektrot deseni ve Parilen C substratı. (B) Anahat açıklığı. (C) PEDOT: PSS kaplama. (D) Bağlantılar ve paketleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Esnek altın elektrotların elektrokimyasal empedans spektroskopisi ve bir tuzlu su çözeltisi içinde PSS kaplı soğuk elektrotlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Glioblastomun in ovo modeli. ED 0: Parlak alan mikroskobu ile gözlenen sferoid. ED 3: Açıldıktan 3 gün sonra bir bıldırcın embriyosunun kabuksuz kültürü. ED 6: TAT'a implante edilen tümör, parlak alan mikroskobu ile gözlendi. ED 9: Vaskülarize tümöre yerleştirilen esnek cihaz (yeşil renkte tümör ve kırmızı kan damarları). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İn vivo uygulama. (A) İn vivo deneyler için şema. (B) Kapak camı ve akrilik reçine uygulamasından önce prob yerleştirilmesi. (C) Tamamlanmış prob implantasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İmplante edilmiş bir proba kıyasla bir tuzlu su çözeltisindeki esnek altın elektrotların elektrokimyasal empedans spektroskopisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Elektrotlar aracılığıyla intravital multispektral iki foton görüntüleme . (A) Elektrot implantasyonundan 3 gün sonra kontrol multifloresan AMU-Neuroinflam faresinde sağlıklı beyin yüzeyinin döşenmiş görüntüsü. Camgöbeği, katman 5 piramidal nöronlarının dendritik arborizasyonunu gösterir, yeşil işe alınan granülositleri ve monositleri gösterir ve sarı aktive olmuş mikroglia ve dendritik hücreleri gösterir. Pembe, ısı birikimi nedeniyle kızılötesi difüzyonu gösterir. (B1) A'dakine benzer görüntü, ancak tümör sferoid implantasyonundan 26 gün sonra, korteksin içinde 200 μm derinlikte hemen ardından elektrot implantasyonu. Yeşil ve sarı bağışıklık hücrelerinin birikmesine dikkat edin. (B2) B1'dekine benzer görüntü, ancak elektrotların yüzeyinin 100 μm altında. Kırmızı tümör kütlesinin çevresinde, sarı mikroglia ve dendritik hücreler tarafından sızan mavi nöronal dendritik arborizasyonun varlığına dikkat edin. Koyu mavi, peritümöral kollajenden ikinci bir harmonik sinyal gösterir. (B3) Tümörün çevresinde internöron somaların (oklarla gösterilir) varlığını gösteren B2'nin yakınlaştırılmış görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu çalışmada açıklanan yaklaşım, PEF'lerin farklı biyolojik organizasyon seviyelerindeki etkisini incelemek için entegre bir PEF dağıtım sistemine sahip beyin tümörü modellerini mümkün kılmaktadır. Mikrofabrikasyon protokolü, belirli bir uygulamaya uyarlanabilen elektrot tasarımında büyük ölçüde özgürlük sağlayan standart ince film işlemlerinden oluşur. Bazen, imalat sırasında meydana gelen elektrotların bükülmesini azaltmak için imalatın sonunda ek bir termal tavlama adımı yararlı olabilir.
Bir floresan kalsiyum göstergesini ifade eden stabil bir glioblastoma hücre hattının kullanılması, özellikle çok yoğun olan 3D tümörlerde boya dağıtımı ve retansiyonu ile bağlantılı tüm komplikasyonları önler16. Gerçekten de, standart kimyasal floresan kalsiyum göstergelerine kıyasla uzun bir süre boyunca yüksek bir ekspresyon seviyesi gözlenir17. Bu protokol, nöral aktiviteyi görüntülemek için yaygın olarak kullanıldığı için çeşitli hücre hatlarına uygulanabilir11. Burada, insan ve murin hücre hatları kullanıldı (sırasıyla immün yetmezlikli veya immünkompetan farelerde implantasyon için U87 ve Gl261). Gerçekten de, son zamanlarda yapılan çalışmalar, U87 hücre hattının, orijinal hücrelerinkinden farklı olduğunu, çünkü hücre kültürünün yıllar boyunca birçok mutasyon edinildiğini ve deneysel üreme18'i etkilediğini göstermiştir. 3D tümörlerin hazırlanmasında kullanılan yöntem yüksek verimli, tekrarlanabilir ve hücre hattına, tohumlamadaki hücre sayısına ve büyüme zamanına bağlı olarak belirli bir boyutta sferoidlerin üretilmesine izin verir19. Bununla birlikte, bu sferoidler yoğundur ve bu da tümörün çekirdeğinde görüntüleme yaparken bir dezavantaj sunar.
In ovo modeli, PEF'in beyinde bulunan diğer hücre tipleriyle etkileşime girmeden 3D tümörler ve vaskülatürleri üzerindeki etkisini incelemek için ilk yaklaşım olarak yararlıdır. Bu model ucuz, hızlı, yüksek verimlidir ve hayvan modellerinden daha az etik sorun ortaya çıkarmaktadır. Tüm deney boyunca embriyonun bütünlüğünü korumak önemlidir, çünkü hayatta kalmasını ve görüntülemenin kalitesini etkileyebilir. Bıldırcın yumurtasını açarken embriyonik zarın zarar görmesini önlemek için özel dikkat gösterilmelidir. Greft ve esnek elektrotların yerleştirilmesi de embriyoyu öldürebilecek kanamayı önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Kan damarlarına floresan boya enjeksiyonu, tümör hücrelerinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesini ve floresan mikroskopi ile vaskülarizasyonu sağlar. Göz içi enjeksiyonu, embriyonik sıvıya boya sızmasını önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır, bu da arka planda görüntülemenin kalitesini düşüren artık bir floresana neden olabilir. Bu model, dolaşım sistemine erişime izin verdiği için ilaç alımını takip etmek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, deneyler embriyonun 12 günlük hayatta kalma süresi ile sınırlıdır, böylece in vivo model21'den önemli ölçüde daha kısa olan 7 günlük gözleme izin verilir.
İn vivo beyin tümörü modeli, hayvanlar ani% 20'lik bir kilo kaybı ile belirlenen etik bir deneysel son noktaya ulaşmadan önce 4 ila 5 hafta boyunca izlenebilir. İyi tolere edilir ve elektrotun bağlantı kuyruğu çok uzun değilse yerinde kalır. Aksi takdirde, hayvanlar nihayetinde yırtılabilecek çevirme konektörünü çizme eğilimindedir, bu nedenle uyarıcıya sonraki bağlantıyı önler. Bu 4 haftalık süre, glioblastoma gelişiminin farklı aşamalarını kapsayacak şekilde değerlidir. Aynı hacimdeki tümör hücre yoğunluklarını farklı zaman aralıklarında karşılaştırırken, tümör büyüme kinetiğinin evrimi gözlemlenebilir. Özellikle, bağışıklık anahtarı22 sırasında artmış tümör büyümesi gözlenmiştir. Uyarıcı bir elektrot varlığında yapılan benzer bir çalışma, PEF'in tümör proliferasyon hızı ve immün eliminasyona karşı tümör duyarlılığı üzerindeki etkisi hakkında bilgi verecektir. In ovo modeline kıyasla, in vivo model, bağışıklık hücrelerinin tümör progresyonu üzerindeki etkisini ve PEF'in terapötik etkisine katkılarını incelemek için değerli bir klinik öncesi model olarak görülebilir. Bu protokol, bir kraniyal pencere14 yerleştirmeden önce tümör üzerine esnek bir elektrot cihazının eklenmesiyle önceki bir makaleden uyarlanmıştır. Tümörlerin hem akut hem de kronik biyoelektrik tedavileri, ilk stimülasyonun hücre ölümünü indüklemesi ve immün yanıtın kalıcı düzensizliğini tetiklemesi beklendiği için iki foton mikroskobu ile doğrudan ve sonraki gözlemlerle karakterize edilebilir.
Esnek probun bağlantılarına iki foton mikroskobu altında kolayca erişilebilir. Bu nedenle, elektriksel stimülasyon parametreleri, bir tıp doktorunun hastasının MRI veya BT görüntülerini gözlemlerken girişimsel prosedürleri nasıl gerçekleştireceğine benzer şekilde, sinir dokusu ve / veya hedeflenen hücreler üzerinde gözlemlenen etkiye dayanarak gerçek zamanlı olarak ayarlanabilir. Son bir husus, doku büyümesini önlemek için elektrotun beyindeki süper yapıştırıcı ve silikon yapıştırıcı ile dikkatli bir şekilde kapatılmasının önemidir.
Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, glioblastoma tümör modelleri için esnek organik polimer elektrotlarla PEF tedavisinin etkisini incelemek için yenilikçi bir modeli temsil etmektedir. İki model, etki mekanizmalarının daha iyi anlaşılması için hücresel, vasküler veya bağışıklık etkilerinin ayrılabileceği şekilde farklı karmaşıklık seviyeleri sergiler. Uygun, yüzeysel elektrotlar iyatrojenik hasarı azaltırken, tümör mikroçevresinin bozulmasını sağlar, vazokonstriksiyonu tetikler veya hücre içi kalsiyum15'in düzensizliğini tetikler.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Burada bildirilen çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-18-CE19-0029) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, kararlı bir GCaMP6f hücre hattının oluşturulmasına katkılarından dolayı SM Bardet'e ve in ovo modelindeki yardımı için D. O'Connor'a sıcak bir şekilde teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
- Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
- Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
- Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
- Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
- Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
- Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
- Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
- Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
- Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
- Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).
- Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
- Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).
- Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).
- Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
- Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
- Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301 (2021).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).
