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Bioengineering

리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 불활성화

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

여기에서는 낮은 강도의 청색 및 보라색 광 조사 하에서 플라 빈 모노 뉴클레오티드 (FMN)의 광분해 중에 생성 된 활성 산소 종으로 병원성 박테리아를 비활성화하는 프로토콜을 제시합니다. FMN 광분해는 위생 공정을위한 간단하고 안전한 방법으로 입증되었습니다.

Abstract

리보플라빈-5'-포스페이트(또는 플라빈 모노뉴클레오티드; FMN)은 가시광선에 민감하다. 활성 산소 종 (ROS)을 포함한 다양한 화합물은 가시 광선 조사시 FMN 광분해로부터 생성 될 수있다. FMN 광분해에서 생성 된 ROS는 황색 포도상 구균 (S. aureus)과 같은 병원성 박테리아를 포함한 미생물에 유해합니다. 이 기사에서는 가시 광선 조사 하에서 FMN과 관련된 광화학 반응을 통해 S. aureus를 비활성화하는 프로토콜을 제시합니다. FMN 광분해 동안 생성 된 슈퍼 옥사이드 라디칼 음이온 ()은 니트로 블루 테트라 졸륨 (Equation 1NBT) 환원을 통해 평가됩니다. 반응성 Equation 1 종에 기인하는 S. aureus의 미생물 생존력은 공정의 효과를 결정하는 데 사용되었습니다. 박테리아 불활성화 비율은 FMN 농도에 비례합니다. 보라색 빛은 청색광 조사보다 S. 아우레우스를 비활성화하는 데 더 효율적입니다., 적색 또는 녹색 빛은 FMN 광분해를 유도하지 않습니다. 본 기사는 위생 공정을위한 간단하고 안전한 방법으로 FMN 광분해를 보여줍니다.

Introduction

리보플라빈 -5'- 인산염 (FMN)은 리비틸 측쇄의 리보플라빈 5'- 위치에서 인산화에 의해 형성되며 에너지를 생성하는 수많은 세포 과정을 위해 모든 플라 보 단백질에 필요합니다. 또한 인체의 일부 기능을위한 비타민의 역할을합니다1. FMN은 리보플라빈2보다 물에 약 200 배 더 잘 녹습니다.

박테리아의 항균 광역학 불활성화(aPDI)는 박테리아 내성 모드에 의존하지 않기 때문에 박테리아 3,4에 대한 내성을 제어하는 효율적인 방법입니다. 임상 적으로 aPDI는 다중 내성 박테리아 5,6,7,8,9로 인한 병원 내 피부 감염을 줄이기 위해 연조직 감염을 치료하는 데 사용됩니다. aPDI는 또한 활성 산소 종 (ROS)을 생성하여 세포 사멸을 생성합니다. 수퍼옥사이드 라디칼 (), 일중항 산소, 하이드록실 라디칼 (•OH) 및 퍼옥실 라디칼과 같은 ROS는 활성 산소(10,11,12)를 포함하고 정상적으로 반응성(Equation 113)인 자유 라디칼 또는 분자이다. ROS에 의해 유발되는 DNA 손상과 유사하게, 막 과산화 및 내피 세포의 파괴는 또한 세포(12)에서 ROS에 기인하는 불리한 생화학적 반응이다.

병원성 박테리아에 대한 aPDI의 사용은 메틸티오니늄클로라이드 14, PEI-c e6 접합체 15, 포르피린16, 이산화 티탄 17, 톨루이딘 블루O18 및 산화 아연 나노 입자 19와 같은 화합물의 존재 하에서 미생물을 불활성화시키는 가시 광선 또는 UV 광원을 포함한다. 톨루이딘 블루 O와 메틸렌 블루는 페 노티 아진 늄 염료이며 메틸렌 블루는 독성이 있습니다. 산화 아연 나노 입자와 UV 조사는 건강 및 환경 적 악영향과 관련이 있습니다. 따라서 가시적 인 조사 하에서 광분해를 통해 신뢰할 수 있고 안전하며 간단한 감광제를 사용하는 것은 추가 연구가 필요합니다.

미량 영양소 인 리보플라빈 또는 FMN은 독성이 없으며 실제로 식품 제조 또는 사료 공급에 사용됩니다20. FMN과 리보플라빈은 모두 빛 조사에 매우 민감합니다2. UV 1,2,21,22,23 및 청색광 조사10,24 하에서이 두 화합물은 여기 상태를 달성합니다. 광분해에 의해 생성 된 활성화 된 리보플라빈 또는 FMN은 삼중 항 상태로 승격되고 ROS는 동시에생성됩니다 2,25. Kumar 등은 자외선에 의해 활성화 된 리보플라빈이 병원성 미생물26에서 DNA의 구아닌 부분에 선택적으로 손상을 일으킨다고보고했다. 자외선에 의한 조사 하에서, 광역학적으로 활성화 된 리보플라빈은 이중 가닥 DNA27에서 산화 스트레스에 대한 바이오 마커 인 8-OH-dG의 생성을 촉진하는 것으로 입증된다. S. 아우 레 우스와 대장균은 리보플라빈 또는 FMN 광분해 동안 ROS에 의해 비활성화되는 것으로보고되었습니다 10,24,28. 저자의 이전 연구에 따르면 리보플라빈과 FMN을 포함하는 광분해 반응은 크리스탈 바이올렛, 트리 아릴 메탄 염료 및 생성하는 항균제 를 감소Equation 1시키고 크리스탈 바이올렛28의 항균 능력의 대부분을 제거합니다. 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 또는 FMN이 청색광에 의해 조사될 때, 생성된 ROS는 시험관내29에서 그들의 중독을 위해 HeLa 세포에서 세포자멸사를 생성한다. 리보플라빈의 존재하에 광화학 처리를 사용하여, Cui 등은 이들의 증식 및 사이토카인 생성을 억제함으로써 림프구를 불활성화시켰다30.

리보플라빈의 광분해는 UV 10,24에 의한 혈액 병원체의 불활성화에 사용되지만, 자외선 조사(30) 하에서 혈액 성분이 손상 될 수있다. 또한 UV에 노출 된 혈소판은 세포막에서 활성화 마커 P- 셀렉틴 및 LIMP-CD63의 성능을 점진적으로 향상시키는 것으로보고되었습니다. UV 및 고강도 조사의 세포 독성을 조사해야하며 가시 광선을 포함하는 FMN 광반응 중에 복잡하지 않고 안전한 감광제가 유용 할 것입니다.

더 짧은 파장의 빛은 더 많은 에너지를 가지며 세포에 심각한 손상을 줄 가능성이 훨씬 더 큽니다. 그러나, 적합한 감광제의 존재 하에서, 저 강도 보라색 빛으로 조사하면 병원성 미생물을 억제 할 수있다. 따라서 보라색 빛을 조사할 때 FMN에 Equation 1 의한 감광성 및 생성은 FMN으로부터 ROS가 박테리아의 불활성화를 증가시키는 경로를 결정하기 위해 연구하는 것이 중요합니다.

항균 제어는 일반적인 문제이며 새로운 항생제의 개발에는 수십 년이 걸리는 경우가 많습니다. 보라색 빛을 조사한 후 FMN에 의해 매개되는 광불활성화는 환경 병원성 박테리아를 전멸시킬 수 있습니다. 이 연구는 FMN 광분해를 유도하여 aPDI를 생성하기 Equation 1 위해 보라색 빛을 사용하는 효과적인 시험관 내 항균 프로토콜을 제시합니다. S. aureus의 미생물 생존력은 FMN 유도 aPDI의 타당성을 결정하는 데 사용됩니다.

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Protocol

1. 광분해 시스템 설정

  1. 도 1에 도시된 바와 같이 불투명한 플라스틱 컵(8cm x 7cm)의 내부에 6개의 발광다이오드(LED)(DC 12V)를 장착하여 광분해 시스템(31)을 구축한다.
  2. 유리 시험관(직경 13mm, 높이 100mm)에 반응물(아래 참조)을 넣고 그림 1과 같이 컵 상단에 튜브를 고정합니다. 실험 설정을 25 ± 3 °C의 일정한 온도의 방에 두십시오.
  3. 적외선 온도계로 광분해 반응 전반에 걸쳐 테스트 장치의 온도를 모니터링하고 기록합니다.
    참고: 그림 2 는 보정된 UV-Vis 광학 분광기를 사용하여 기록된 파란색, 녹색, 빨간색 및 보라색 조명의 방출 스펙트럼을 보여줍니다. 연구에 사용된 청색, 녹색, 적색 및 보라색 LED 조명의 최대 흡광도에 해당하는 파장은 각각 465, 529, 632 및 405nm입니다. LED 칩은 조사 실험 중에 장치를 가열 할 수 있습니다. 각각의 실험에서 전체 광반응 시스템을, 따라서, 온도가 25 ± 3°C로 일정하게 유지되는 방에 두었다.

2. FMN의 광분해에 대한 광 파장의 영향(그림 3)

  1. 100 mM 인산칼륨 완충액(PB)(pH 7.8) 중 0.1mM FMN 용액을 준비한다. FMN 샘플(각각 3mL)을 파란색, 녹색, 빨간색 또는 보라색 빛에 10W/m2 의 강도로 5분 동안 노출시킵니다. 대조군으로 3mL의 FMN 용액을 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. UV/가시광선 분광광도계를 사용하여 250-750nm 범위에서 조사된 FMN 샘플의 흡광도를 기록합니다.

3. 니트로 블루 테트라 졸륨 (NBT) 환원 검출 방법 Equation 1 (그림 4).

참고: 여기에 사용된 NBT 환원법은 리보플라빈 광반응에 대한 분석에서 약간 수정되었습니다. NBT 환원 방법은 FMN 광분해로부터 생성된 수준을 Equation 1 평가하기 위해 사용된다. 광화학적으로 여기된 FMN은 먼저 L-메티오닌에 의해 세미퀴논으로 환원된 다음 전자를 산소에 제공하여 31을 Equation 1 생성합니다. 생성 Equation 1 된 NBT는 560 nm32에서 특징적인 흡광도를 갖는 포르마잔으로 감소시킨다.

  1. PB 73.3mL(100mM, pH 7.8)에 109.3mg의 L-메티오닌을 추가합니다. 용액을 와동시켜 L-메티오닌을 용해시킨다.
  2. L- 메티오닌이 완전히 용해 된 후 NBT 분말 10mg과 0.117mM FMN 1.53mL를 용액에 첨가합니다. 적용된 반응 용액 (즉, FMN, L- 메티오닌 및 NBT의 혼합물)의 각 1mL에 대해, FMN, 메티오닌 및 NBT의 최종 농도는 각각 2.4 x 10-6M, 1.0 x 10-2M 및 1.6 x 10-4M이다.
  3. 반응 용액(1mL)을 10W/m2 의 청색 또는 보라색 LED 광선 조사에 1-5분 동안 노출시킵니다.
  4. 광화학 반응에 의해 생성 된 종 (560 nm에서의 흡광도에서)을 검출하여 NBT를 감소시키고 포르 마잔을 Equation 1 생성합니다.

4. FMN 광분해 후 S. 아우레우스 생존율(그림 5)

  1. S. 아우레우스(BCRC 10451)의 콜로니를 배양 플레이트에서 15mL 스크류 캡이 있는 시험관에 담아 취한 10mL의 리소제니 액체로 전달합니다. 37°C에서 16시간 동안 진탕기에서 배양한다.
  2. 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 멸균된 물을 원심분리 튜브에 추가하여 배양물을 600nm(OD600)(~6 x 107CFU /mL)에서 0.5의 광학 밀도로 희석합니다.
  3. 배양물 0.5mL를 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고, 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔트하여 세포 펠렛을 얻었다.
  4. 1 mL의 FMN-완충 용액 (PB 중의 30, 60, 및 120 μM FMN)을 단계 4.3에서와 같이 수득된 세포 펠릿에 첨가하고, 와동시킨다. 조사 제어를 위해 PB 단독 1mL를 추가하십시오.
  5. 30μM FMN 및 PB 단독을 포함하는 생존 가능한 박테리아 세포 용액 각각 1mL를 유리관에 옮기고 10W/m2 에서 30분 동안 보라색 빛을 조사합니다.
  6. 30, 60 및 120 μM FMN 및 PB 단독을 포함하는 생존 가능한 박테리아 세포 용액 1mL를 유리관에 옮기고 20W/m2 에서 120분 동안 청색광을 조사합니다. 120μM FMN을 포함하는 1mL의 생존 가능한 박테리아 세포 용액으로 다른 유리관을 설치하고 20W/m2 의 청색광을 60분 동안 조사합니다.
  7. 4.5단계와 4.6단계에 설명된 대로 시험관을 설치하고 두꺼운 알루미늄 호일로 덮습니다. 이 튜브는 어두운 컨트롤 역할을합니다.
  8. 30-120 분의 조사 기간 동안 9 ± 1 ° C의 차가운 실내에서 조사 챔버 (및 어두운 제어 장치)를 유지하십시오.
    알림: 컵 내부에 배치된 LED 칩이 조사 실험 중에 광반응 시스템을 가열할 수 있으므로 LED 조명에서 방출되는 열을 무시할 수 없습니다. 따라서, 실험은 9 ± 1°C로 유지되는 냉장실에서 수행되었다.
  9. 조사 후, 각각의 반응 용액으로부터 0.2 mL를 루리아 한천 (LA) 플레이트로 옮긴다. L자형 유리 막대로 플레이트 위에 박테리아를 퍼뜨리고 37°C에서 밤새 배양합니다.
  10. 하룻밤 성장 후 S. aureus 의 생존 가능한 판 수와 비활성화 비율을 계산합니다.
    참고 : S. aureus 의 비활성화 율은 [1-I / D] ×100 %와 동일한 백분율 감소로 계산되며, 여기서 I 및 D 는 각각 조사 된 샘플과 어두운 대조군의 CFU 수를 나타냅니다. 백분율 감소는 비활성화 비율의 음수 값으로 정의됩니다.

5. S. 아우 레우스의 검출 Equation 1 (그림 6) 

  1. 단계 4에 설명된 대로 S. 아우레우스 샘플을 준비합니다.
  2. 멸균된 물로 샘플의 박테리아 밀도를 600nm에서 0.5의 광학 밀도로 희석합니다(OD600, ~6 x 106CFU /mL). 배양액 0.5mL를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔트하여 세포 펠렛을 얻었다.
  3. 0.1093 g의 L- 메티오닌, 0.1 g의 NBT 및 25 mL의 FMN (400, 240 또는 120 μM)을 75 mL의 PB에 첨가하십시오. 적용된 반응물 1mL당 FMN, 메티오닌 및 NBT의 최종 농도는 각각 100(60 또는 30) x 10-6M, 7.3 x 10-3M 및 1.2 x 10-3M입니다.
  4. 1mL의 각 반응물 용액(즉, 다양한 FMN 농도로)을 단계 5.2에서와 같이 얻은 세포 펠릿에 추가합니다. 10 분 동안 10 W / m2 에서 보라색 빛으로 용액을 조사하십시오.
  5. 혼합물을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 디캔트합니다. 펠릿을 1mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 재현탁시켜 환원된 NBT를 추출합니다. 560 nm에서의 흡광도로부터 생성된 Equation 1 종을 검출한다.

6. 통계 분석

  1. 데이터를 세 가지 독립 검정의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현합니다.
  2. 호모세다스틱 2표본 t-검정을 적용하여 두 측정값이 서로 다른지 여부를 평가합니다. p-값이 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

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Representative Results

FMN에 대한 광 파장의 영향
청색, 녹색, 적색 및 보라색 LED를 사용하여 조사되는 0.1mM FMN의 흡광도 스펙트럼은 그림 3에 나와 있습니다. 어두운 제어를위한 FMN (372 nm 및 444 nm)에 대한 두 개의 피크가 있습니다. 녹색광과 적색광은 스펙트럼의 변화가 중요하지 않기 때문에 효과가 없습니다. 한편, 444nm에서 FMN의 흡광도는 10W/m2 에서 5분 동안 청색광과 보라색 광을 조사한 후 각각 약 19% 및 34% 감소하여 청색/보라색 광을 조사하면 FMN 광분해가 증가함을 시사합니다.

감지 Equation 10 청색 또는 보라색 빛을 사용하여 조사되는 FMN에서
NBT 감소는 32의 Equation 1 형성을 결정하기 위해 사용되었다. FMN은 짧은 기간의 방사선에도 가시광선과 자외선에 매우 민감합니다. Equation 1 FMN의 광분해 동안 중간 광화학 반응으로부터 형성된다. 그림 4는 NBT 감소에 대한 FMN의 광화학적 효과가 시간 의존적 방식으로 청색광 또는 보라색 광 조사에 노출된 FMN으로부터 형성되는 것처럼 Equation 1 조사 시간에 의존한다는 것을 보여줍니다. 그러나 청색광과 보라색 빛의 평균 광분해 효과는 그림 4와 유사합니다.

FMN 광분해가 S. 아우레우스 생존력에 미치는 영향
보라색 또는 청색광 조사에 노출 된 FMN이 S. aureus 생존력에 미치는 영향이 결정되었습니다. 청색광 또는 보라색 광 조사를 사용한 FMN 광분해는 S. aureus의 현저한 불활성화를 초래합니다. FMN의 농도가 클수록 그림 5A와 같이 20W/m2에서 120분 동안 청색광 조사에 노출되는 S. 아우레우스의 불활성화 비율이 높아집니다. 120분 동안 20W/m2 청색광 조사 하에 각각 0, 30, 60 및 120μM FMN을 사용하여 S. aureus에 대해 26%, 39%, 43% 및 97%의 불활성화율을 달성했습니다. 그림 5A에 표시된 바와 같이, 120분 동안 20W/m2에서 60μM FMN(에너지 용량, 14.4J/cm2) 또는 20W/m2에서 120μM FMN(에너지 용량, 120μM FMN)을 사용한 청색광 조사를 사용한 S. 아우레우스의 불활성화 속도에는 유의미한 차이(p-값 = 0.20)가 없습니다(에너지 용량, 7.2 J / 센티미터2). 반면에, 도 5B에 도시된 바와 같이, 30분 동안 10 W/m2의 보라색 광 조사 하에서 각각 30μM FMN이 없는 S. 아우레우스에 대해 53% 및 96%의 불활성화율이 달성되었다(에너지 선량 1.8J/cm2). 따라서 청색광 또는 보라색 조사에 노출 된 FMN은 박테리아 불 활성화를 증가시킴으로써 S. aureus의 생존력에 더 큰 영향을 미칩니다. 보라색 광 조사로 처리 된 FMN은 S. 아우 레 우스 불 활성화에보다 효율적입니다.

감지 Equation 10 FMN 처리 된 S. 아우 레 우스에서 보라색 빛 조사
보라색 광 조사 하에서 FMN 처리 된 S. aureus의 Equation 1 생산은 NBT 환원법을 사용하여 결정되었다. 560 nm에서의 흡광도 값을 사용하여 생산 정도 Equation 1 를 평가하였다. S. aureus의 생성에 대한 Equation 1 FMN의 광화학적 효과는 FMN 농도에 비례합니다(그림 6). FMN 처리를하지 않은 S. aureus의 560nm 흡광도 값은 10 분 동안 그리고 어두운 곳에서 10W / m2 보라색 빛 조사에서 각각 0.31 및 0.07입니다 (그림 6). 이것은 보라색 빛 조사 후 처리되지 않은 S. aureus에서 거의 Equation 1 생성되지 않았 음을 시사합니다. 100 μM FMN으로 처리 된 S. aureus에 대한 각각의 560 nm 흡광도 값은 10 분 동안 그리고 어두운 곳에서 10 W / m2 보라색 광 조사에서 각각 1.36 및 0.08입니다. 따라서, FMN 처리 된 S. aureus의 NBT 감소에 대한 광화학적 효과는 보라색 조사 하에서 풍부하게 생성됨에 따라 Equation 1 증가한다.

Figure 1
그림 1: 광반응 시스템의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 이 연구에서 파란색, 녹색, 빨간색 및 보라색 LED 조명의 방출 스펙트럼. 청색, 녹색, 적색 및 보라색 조명의 방출 최대값은 각각 465, 529, 632 및 405nm이고 절반 높이(W1/2)에서의 스펙트럼 폭은 각각 26, 31, 14 및 12nm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 10W/m2에서 다양한 파장의 LED로 5분 동안 처리된 FMN의 흡광도 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : FMN 광분해에 대한 10W / m2에서 1-5 분 동안 청색 및 보라색 광 조사의 효과를 확인하기위한 NBT 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: FMN 광분해가 S. 아우레우스 생존력에 미치는 영향. 백분율 감소는 (A) 20W/m2에서 120분 동안 청색광 조사 하에 FMN으로, (B) 보라색 광 조사 하에서 10W/m2에서 30분 동안 FMN으로 처리된 S. 아우레우스에 대한 불활성화 비율의 음의 값으로 정의됩니다. FMN 농도 및 조사 시간은 그림 상단에 표시됩니다. 120분 동안 20W/m2 청색광 조사에서 60μM FMN 또는 60분 동안 20W/m2 청색광 조사에서 120μM FMN을 사용한 S. 아우레우스의 불활성화 속도에는 유의미한 차이(p=0.20)가 없습니다(A). 결과는 평균 ± SD로 표현되며, 여기서 n=3이다. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: FMN 농도가 S. 아우레우스의 생성에 미치는 영향 10 W/m2에서 10분 동안 보라색 빛 조사.Equation 10 전반적으로 Equation 1 FMN이 없는 경우 S. 아우레우스에서는 거의 생성되지 않지만 어두운 대조군(PB(Dark))에 비해 조사된 샘플(PB(보라색 빛))에서 보라색 광 조사가 약간 증가합니다Equation 1. 결과는 평균 ± SD로 표현되며, 여기서 n=3이다. * p < 0.05; ** p < 0.01; p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

감광제는 화합물의 광화학 반응을 증가시켜 ROS를 생성합니다. 병원성 미생물은 감광제의 존재하에 광 조사에 의해 불 활성화 될 수있다. 이 연구는 외인성 감광제 인 FMN의 보라색 광 조사에 의해 생성 된 ROS로 인한 S. aureus의 aPDI 를 결정합니다.

그림 3에서 볼 수 있듯이 FMN의 경우 보라색 또는 청색광을 사용하여 5 분 동안 조사하면 444nm에서의 흡광도가 크게 감소하고 녹색 또는 적색광으로 조사해도 FMN 흡광도에는 큰 변화가 없습니다. NBT 환원은 전하 전달 과정(10, 33)을 통한 형성을 Equation 1 결정하는데 사용된다. 저자의 이전 연구에서는 청색광, 녹색 또는 적색광 조사에서 FMN을 사용하여 NBT 감소를 Equation 1 사용하는 형성을 결정했습니다. 청색광 조사는 엄청난 양의 Equation 1 광을 생성하는 반면 녹색 및 적색광의 광분해 효율은 청색광에 의해 달성되는 광분해 효율의 3% 미만입니다.10. 이러한 결과는 FMN이 청색 또는 보라색 광 조사에 노출될 때 전하 이동 과정이 생성되고 녹색 또는 적색광에 의한 조사 시 큰 변화가 없음을 보여줍니다.

저자34 의 이전 연구에 따르면 FMN 광분해 메커니즘은 1 차 FMN 광분해 반응 (방정식 1)으로 설명 될 수 있습니다.

Equation 2 (1),

여기서 1FMN* 및 3FMN*은 각각 여기 FMN의 단중항 및 삼중항 상태입니다. 이러한 광유도 FMN에 대한 광용해 반응 메카니즘은 아마도 삼중항-삼중항 소멸 또는 삼중항 기저 상태 담금질 과정35,36,37,38에 의해 개시될 수 있다. FMN의 기저 상태(FMN0)는 방정식 2와 같이 3FMN*에 전자를 제공하고 반환원(FMN•-) 및 반산화(FMN•+) 형태를 생성하는 전자 공여체입니다.

Equation 3 (2)

FMN의 광분해 경로는 감광성으로 인해 발생합니다. FMN은 광분해 반응을 통해 전자적으로 여기 상태인 FMN•으로 승격된 다음 FMN이 전자를 잃으면 중성 FMN이 감소합니다., 아래 식 3-8과 같이:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

여기서 FMN•+ 는 라디칼 양이온 종입니다.

FMN•- 와O2 (3Σg-)의 상호 작용은 반응성 슈퍼옥사이드 라디칼을 생성하고, Equation 1그 뒤를 이어 하이드로퍼옥실 라디칼 HOO•가 생성되며, 이는 양성자와 사이의 반응 Equation 1 에서 생성되어 결국 FMN0의 분해로 이어집니다.

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

여기서 FMN•- 은 라디칼 음이온입니다.

본 연구에서 FMN이 없는 경우 S. aureus의 경우 불활성화율은 30분 동안 10W/m2의 보라색 광 조사 시 53%, 20W/m2의 청색광 조사 시 120분 동안 26%이며, 이는 청색광 조사가 보라색 빛보다 적은 박테리아를 비활성화한다는 것을 시사합니다(그림 5). S. aureus의 포르피린은 405 ± 5 nm에서 최대 흡광도를 가지며 조사 후 박테리아 불 활성화를 유발하지만 외인성 감광제없이 430nm보다 긴 파장에서 방사선 조사는 S. aureus 세포를 비활성화하지 않는 것으로보고되었습니다39.

본 저자의 이전 연구에 따르면 대장균과 S. 아우 레 우스는 리보플라빈 또는 FMN 10,24,40의 광분해를 통한 형성에 의해 유도되는 DNA 절단에 의해 비활성화됩니다. S. aureus에 대한 각각의 불활성화율은 120분 동안 20W/m2 청색광 조사(에너지 선량 14.4J/cm2)에서 120μM FMN을 사용하고 30분 동안 10W/m2 보라색 광선 조사(에너지 선량 1.8J/cm2)에서 30μM FMN을 사용하여 각각 97% 및 96%입니다(그림 5). 따라서, 보라색 빛의 저에너지 선량은 청색광에 비해 FMN 농도가 낮고 조명 기간이 짧은 상태에서 S. 아우레우스를 비활성화할 수 있기 때문에 보라색 빛 조사는 S. 아우레우스를 비활성화하는 데 더 효과적입니다. 보라색 빛에 의해 달성되는 FMN 광분해의 정도는 청색광에 비해 높지만(그림 3), 청색광 및 보라색 광 조사에서 NBT 감소에 대한 FMN의 평균 광분해 효과는 유사합니다(그림 4).

대장균은 일반적인 그람 음성 박테리아입니다. 청색광 조사에 의한 리보플라빈 또는 FMN 광분해는 FMN 10,24,41을 사용할 때 96%의 불활성화율로 ROS10,24,41을 통해 대장균을 비활성화합니다. 반면에 S. aureus는 그람 양성균으로, 여기에서 볼 수 있듯이 보라색 광 조사 하에서 FMN 광분해에 의해 효과적으로 비활성화됩니다 (그림 5). 따라서 청색광 또는 보라색 광 조사 하에서 FMN 광분해 반응은 ROS를 생성하고 그람 음성균과 그람 양성균을 모두 비활성화할 수 있습니다.

그러나 FMN이 없는 경우 보라색 광 조사에 노출된 S. 아우레우스에서는 거의 Equation 1 생성되지 않습니다(그림 6); 따라서 내인성 감광제는 FMN과 같은 외인성 감광제의 존재 효과에 비해 보라색 광 조사 하에서 S. 아우레우스의 생존력을 약간만 감소시킵니다. 동일한 조건에서 보라색 광 조사에 노출 된 FMN은 S. aureus의 생존력을 감소시켜 96 %의 불 활성화율을 나타내며, 이는 내인성 세포 내 감광제 단독보다 훨씬 높습니다. 보라색 빛 조사 하에서 FMN 처리 된 S. aureus의 Equation 1 생산은 그림 6과 같이 크게 증가했습니다. 이러한 결과는 보라색 광선 조사에 노출되었을 때 FMN이 박테리아 불활성화 수준을 높인다는 것을 보여줍니다.

FMN 은 UV 1,2,21,22,23, 청색10,24 및 보라색 빛 31을 사용하여 조사 될 때 광 여기 상태를 달성 할 수 있습니다. 그러나 UV 방사선 및 고강도 단파장 조사로 인한 세포 독성을 고려해야합니다42. 반면에, 더 긴 파장을 갖는 적색 및 녹색 방사선은 FMN 광분해 동안 상당한 양의 ROS를 생성하지 않는다(10). 따라서 S. aureus의 ROS 유도 aPDI는 중간 파장을 갖는 보라색 빛으로 FMN을 조사해야합니다. 보라색 빛에 대한 절반 높이(W1/2)에서의 스펙트럼 폭은 UV 흡수와 겹치는 것을 피하고 UV 방사선(31)으로 인한 위험을 억제하기 위해 좁아야 합니다. 미량 영양소 인 FMN은 인체에 필수적인 비타민입니다. FMN과 같은 적절한 감광제 사용, 저에너지 보라색 빛 조사는 병원성 박테리아를 억제할 수 있습니다., 위생 과정의 안전하고 효과적인 수단을 제공. S. aureus에 대한 FMN의 광분해 반응 외에도 qPCR과 함께 RNA-seq 기술을 사용하여 연구 할 수있는 스트레스 Equation 1 로 인해 발생하는 미생물에 대한 FMN의 광독성과 같은 다른 문제는 추가 조사가 필요합니다.

보라색 광 조사를 통한 FMN 광분해는 ROS가 생성되는 광화학적 산화로 이어지고 차례로 병원성 박테리아의 불활성화를 향상시킵니다. 보라색 빛의 사용은 FMN 광분해에서 중요한 단계로 간주됩니다. 현재 기술의 한계는 자외선 조사로 인한 위험을 피하기 위해 보라색 빛의 파장 간격이 매우 좁아야한다는 것입니다. 현재의 방법은 광섬유를 삽입하여 보라색 빛을 감염된 부위로 향하게하여 깊은 피하 조직 또는 근육과 함께 표면 피부의 감염 치료와 같은 미래의 의료 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 FMN을 사용한 광화학 처리는 효과적인 위생 관행을 보장하는 안전하고 간단한 방법입니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 실험을 지원해 준 Tak-Wah Wong 박사와 Zong-Jhe Hsieh 씨에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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생명 공학 문제 182 FMN 광분해 ROS S. 아우 레 우스 보라색 빛
리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 <em>통한</em> 병원체 불활성화
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