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Bioengineering

राइबोफ्लेविन -5'-फॉस्फेट के दृश्य-प्रकाश फोटोलिसिस के माध्यम से रोगजनकों की निष्क्रियता

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

यहां, हम कम तीव्रता के नीले और बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत फ्लेविन मोनोन्यूक्लियोटाइड (एफएमएन) के फोटोलिसिस के दौरान उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के साथ रोगजनक बैक्टीरिया को निष्क्रिय करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एफएमएन फोटोलिसिस को स्वच्छता प्रक्रियाओं के लिए एक सरल और सुरक्षित तरीका दिखाया गया है।

Abstract

राइबोफ्लेविन -5'-फॉस्फेट (या फ्लेविन मोनोन्यूक्लियोटाइड; एफएमएन) दृश्य प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) सहित विभिन्न यौगिकों को दृश्य प्रकाश के साथ विकिरण पर एफएमएन फोटोलिसिस से उत्पन्न किया जा सकता है। एफएमएन फोटोलिसिस से उत्पन्न आरओएस सूक्ष्मजीवों के लिए हानिकारक हैं, जिनमें रोगजनक बैक्टीरिया जैसे स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) शामिल हैं। यह लेख दृश्य प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन से जुड़े फोटोकैमिकल प्रतिक्रियाओं के माध्यम से, एक उदाहरण के रूप में एस ऑरियस को निष्क्रिय करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एफएमएन फोटोलिसिस के दौरान उत्पन्न सुपरऑक्साइड रेडिकल आयन (Equation 1) का मूल्यांकन नाइट्रो ब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी) कमी के माध्यम से किया जाता है। एस ऑरियस की माइक्रोबियल व्यवहार्यता जिसे प्रतिक्रियाशील Equation 1 प्रजातियों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, का उपयोग प्रक्रिया की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए किया गया था। जीवाणु निष्क्रियता दर एफएमएन एकाग्रता के समानुपाती है। बैंगनी प्रकाश नीली रोशनी विकिरण की तुलना में एस ऑरियस को निष्क्रिय करने में अधिक कुशल है, जबकि लाल या हरे रंग की रोशनी एफएमएन फोटोलिसिस को नहीं चलाती है। वर्तमान लेख एफएमएन फोटोलिसिस को सैनिटरी प्रक्रियाओं के लिए एक सरल और सुरक्षित विधि के रूप में प्रदर्शित करता है।

Introduction

राइबोफ्लेविन -5'-फॉस्फेट (एफएमएन) रिबाइटल साइड-चेन की राइबोफ्लेविन 5'-स्थिति में फॉस्फोराइलेशन द्वारा बनता है और ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए सभी फ्लेवोप्रोटीन द्वारा आवश्यक है। यह मानव शरीर में कुछ कार्यों के लिए विटामिन की भूमिका भी निभाताहै। एफएमएन राइबोफ्लेविन 2 की तुलना में पानी में लगभग200 गुना अधिक घुलनशील है।

बैक्टीरिया का जीवाणुरोधी फोटोडायनामिक निष्क्रियता (एपीडीआई) बैक्टीरिया 3,4 के प्रतिरोध को नियंत्रित करने का एक कुशल तरीका है क्योंकि यह जीवाणु प्रतिरोध के मोड पर निर्भर नहीं करता है। नैदानिक रूप से, एपीडीआई का उपयोग नरम ऊतक संक्रमण के इलाज के लिए किया जाता है ताकि बहु-प्रतिरोधी बैक्टीरिया 5,6,7,8,9 के कारण नोसोकोमियल त्वचा के संक्रमण को कम किया जा सके। एपीडीआई प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को उत्पन्न करके कोशिका मृत्यु का भी उत्पादन करता है। आरओएस, जैसे सुपरऑक्साइड रेडिकल्स (Equation 1), सिंगलेट ऑक्सीजन, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स (•ओएच), और पेरोक्सिल रेडिकल, मुक्त कण या अणु होते हैं जिनमें प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन 10,11,12 होते हैं और सामान्य रूप से प्रतिक्रियाशीलहोते हैं। आरओएस के कारण होने वाली डीएनए क्षति के समान, झिल्ली पेरोक्सीडेशन और एंडोथेलियल कोशिकाओं का विनाश भी प्रतिकूल जैव रासायनिक प्रतिक्रियाएं हैं जिन्हें कोशिकाओंमें आरओएस के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है।

रोगजनक बैक्टीरिया के लिए एपीडीआई के उपयोग में रासायनिक यौगिकों की उपस्थिति में सूक्ष्मजीवों को निष्क्रिय करने के लिए एक दृश्य या यूवी प्रकाश स्रोत शामिल है, जैसे कि मेथिलथियोनियम क्लोराइड14, पीईआई-सीई 6 संयुग्म15, पोर्फिरीन16, टाइटेनियम डाइऑक्साइड17, टोल्यूडाइन ब्लू ओ18, और जिंक ऑक्साइड नैनोकणों19। टोलुइडिन ब्लू ओ और मेथिलीन ब्लू फेनोथियाज़िनियम रंजक हैं और मेथिलीन ब्लू में विषाक्त गुण होते हैं। जिंक ऑक्साइड नैनोकणों और यूवी विकिरण प्रतिकूल स्वास्थ्य और पर्यावरणीय प्रभावों से जुड़े हुए हैं। जैसे, दृश्य विकिरण के तहत फोटोलिसिस के माध्यम से एक विश्वसनीय, सुरक्षित और सरल फोटोसेंसिटाइज़र का शोषण आगे के अध्ययन के योग्य है।

सूक्ष्म पोषक तत्व, राइबोफ्लेविन या एफएमएन, विषाक्त नहीं है और वास्तव में खाद्य निर्माण या भोजन के लिए उपयोग कियाजाता है। एफएमएन और राइबोफ्लेविन दोनों प्रकाश विकिरणके प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं। यूवी 1,2,21,22,23 और नीली रोशनी विकिरण10,24 के तहत, ये दो यौगिक एक उत्तेजित अवस्था प्राप्त करते हैं। सक्रिय राइबोफ्लेविन या एफएमएन जो फोटोलिसिस द्वारा निर्मित होता है, को इसकी ट्रिपल अवस्था में बढ़ावा दिया जाता है और आरओएसएक साथ 2,25 उत्पन्न होता है। कुमार एट अल ने बताया कि यूवी प्रकाश द्वारा सक्रिय राइबोफ्लेविन चुनिंदा रूप सेरोगजनक सूक्ष्मजीवों में डीएनए के गुआनिन मोइटी को बढ़ी हुई चोट का कारण बनता है। यूवी प्रकाश द्वारा विकिरण के तहत, फोटोडायनामिक रूप से सक्रिय राइबोफ्लेविन को 8-ओएच-डीजी की पीढ़ी को बढ़ावा देने के लिए प्रदर्शित किया जाता है, जो डबल-फंसे डीएनए27 में ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए एक बायोमार्कर है। यह बताया गया है कि आरओएस द्वारा राइबोफ्लेविन या एफएमएन फोटोलिसिस 10,24,28 के दौरान एस ऑरियस और ई कोलाई निष्क्रिय हो जाते हैं। लेखकों द्वारा किए गए एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि राइबोफ्लेविन और एफएमएन से जुड़ी फोटोलाइटिक प्रतिक्रियाएं क्रिस्टल वायलेट, एक ट्राइरिलमेथेन डाई और एक जीवाणुरोधी एजेंट को कम करती हैं जो उत्पन्न करती है, और क्रिस्टल वायलेट28 की अधिकांश रोगाणुरोधी क्षमता को समाप्त करती Equation 1है। जब फ्लेविन एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड या एफएमएन को नीली रोशनी द्वारा विकिरणित किया जाता है, तो परिणामस्वरूप आरओएस इन विट्रो29 में उनके विषाक्तता के लिए हेला कोशिकाओं में एपोप्टोसिस का उत्पादन करता है। राइबोफ्लेविन की उपस्थिति में फोटोकैमिकल उपचार का उपयोग करते हुए, कुई एट अल ने उनके प्रसार और साइटोकिन उत्पादन को रोककर लिम्फोसाइटों को निष्क्रिय करदिया।

राइबोफ्लेविन के फोटोलिसिस का उपयोग यूवी10,24 द्वारा रक्त रोगज़नक़ की निष्क्रियता के लिए किया जाता है, लेकिन रक्त घटकों को यूवी प्रकाश विकिरण30 के तहत बिगड़ा जा सकता है। यह भी बताया गया है कि यूवी के संपर्क में प्लेटलेट्स उत्तरोत्तर अपने झिल्ली पर सक्रियण मार्कर पी-सेलेक्टिन और एलआईएमपी-सीडी 63 के प्रदर्शन को बढ़ाते हैं। यूवी और उच्च तीव्रता विकिरण की साइटोटॉक्सिसिटी की जांच करने की आवश्यकता है और एक फोटोसेंसिटाइज़र जो दृश्य प्रकाश से जुड़े एफएमएन फोटोरिएक्शन के दौरान सरल और सुरक्षित है, बहुत उपयोगी होगा।

कम तरंग दैर्ध्य के प्रकाश में अधिक ऊर्जा होती है और कोशिकाओं को गंभीर नुकसान पहुंचाने की अधिक संभावना होती है। हालांकि, एक उपयुक्त फोटोसेंसिटाइज़र की उपस्थिति में, कम तीव्रता वाले बैंगनी प्रकाश के साथ विकिरण रोगजनक सूक्ष्मजीवों को रोक सकता है। वायलेट प्रकाश के साथ विकिरणित होने पर Equation 1 फोटोसेंसिटाइजेशन और एफएमएन द्वारा उत्पादन इस प्रकार अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है, ताकि उस मार्ग को निर्धारित किया जा सके जिसके द्वारा एफएमएन फोटोलिसिस से आरओएस बैक्टीरिया की निष्क्रियता को बढ़ाता है।

रोगाणुरोधी नियंत्रण एक आम मुद्दा है और नई एंटीबायोटिक दवाओं के विकास में अक्सर दशकों लगते हैं। बैंगनी प्रकाश के साथ विकिरण के बाद, एफएमएन द्वारा मध्यवर्ती फोटोनिष्क्रियता पर्यावरणीय रोगजनक बैक्टीरिया को नष्ट कर सकती है। यह अध्ययन एफएमएन फोटोलिसिस चलाने के लिए वायलेट लाइट का उपयोग करके विट्रो में एक प्रभावी रोगाणुरोधी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और इस प्रकार एपीडीआई के लिए उत्पादन करता Equation 1 है। एस ऑरियस की माइक्रोबियल व्यवहार्यता का उपयोग एफएमएन-प्रेरित एपीडीआई की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

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Protocol

1. फोटोलिसिस सिस्टम सेटअप

  1. फोटोलिसिस सिस्टम31 स्थापित करने के लिए चित्र 1 में दिखाए गए अपारदर्शी प्लास्टिक कप (8 सेमी x 7 सेमी) के अंदर छह प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) (डीसी 12 वी) माउंट करें।
  2. ग्लास टेस्ट ट्यूबों (व्यास में 13 मिमी और ऊंचाई में 100 मिमी) में अभिकारक जोड़ें (नीचे देखें) और कप के शीर्ष पर ट्यूबों को सुरक्षित करें जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। प्रयोगात्मक सेटअप को 25 ± 3 डिग्री सेल्सियस के स्थिर तापमान वाले कमरे में रखें।
  3. इन्फ्रारेड थर्मामीटर द्वारा फोटोलाइटिक प्रतिक्रियाओं में परीक्षण इकाइयों के तापमान की निगरानी और रिकॉर्ड करें।
    नोट: चित्रा 2 नीले, हरे, लाल और बैंगनी रोशनी के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दिखाता है, जैसा कि कैलिब्रेटेड यूवी-विस ऑप्टिकल स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके दर्ज किया गया है। अध्ययन में उपयोग की जाने वाली नीली, हरी, लाल और बैंगनी एलईडी रोशनी के लिए अवशोषण अधिकतम के अनुरूप तरंग दैर्ध्य क्रमशः 465, 529, 632 और 405 एनएम हैं। एलईडी चिप्स विकिरण प्रयोगों के दौरान उपकरण को गर्म कर सकते हैं। इसलिए, प्रत्येक प्रयोग में पूरी फोटोरिएक्शन प्रणाली को एक कमरे में रखा गया था जहां तापमान 25 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखा गया था।

2. एफएमएन के फोटोलिसिस पर प्रकाश तरंग दैर्ध्य का प्रभाव (चित्रा 3)

  1. 100 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीबी) (पीएच 7.8) में 0.1 एमएम एफएमएन समाधान तैयार करें। एफएमएन नमूने (प्रत्येक 3 एमएल) को 5 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम2 की तीव्रता पर नीले, हरे, लाल या बैंगनी प्रकाश में उजागर करें। नियंत्रण के रूप में अंधेरे में 3 एमएल एफएमएन समाधान रखें।
  2. यूवी / विजिबल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 250-750 एनएम रेंज में विकिरणित एफएमएन नमूनों के अवशोषण को रिकॉर्ड करें।

3. नाइट्रो ब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी) कमी विधि का पता लगाने Equation 1 के लिए (चित्रा 4)।

नोट: यहां उपयोग की जाने वाली एनबीटी कमी विधि को राइबोफ्लेविन फोटोरिएक्शन के लिए परख से थोड़ा संशोधित किया गया था। एनबीटी रिडक्शन मेथड का उपयोग एफएमएन फोटोलिसिस से उत्पन्न स्तर का मूल्यांकन करने के Equation 1 लिए किया जाता है। फोटोकैमिकल रूप से उत्तेजित एफएमएन को पहले एल-मेथिओनिन द्वारा एक सेमीक्विनोन में कम किया जाता है, जो फिर ऑक्सीजन को एक इलेक्ट्रॉन दान करता है जो 31 को Equation 1 जन्म देता है। इस उत्पाद से एनबीटी का आकार कम हो जाता Equation 1 है, जिसका विशिष्ट अवशोषण 560 एनएम32 है।

  1. 73.3 एमएल पीबी (100 एमएम; पीएच 7.8) में 109.3 मिलीग्राम एल-मेथिओनिन जोड़ें। भंवर एल-मेथिओनिन को भंग करने का समाधान है।
  2. एल-मेथिओनिन पूरी तरह से घुल जाने के बाद, घोल में 10 मिलीग्राम एनबीटी पाउडर और 1.53 एमएल 0.117 एमएम एफएमएन जोड़ें। प्रतिक्रिया समाधान के प्रत्येक 1 एमएल (यानी, एफएमएन, एल-मेथिओनिन और एनबीटी का मिश्रण) के लिए, एफएमएन, मेथिओनिन और एनबीटी की अंतिम सांद्रता क्रमशः 2.4 x 10-6 एम, 1.0 x 10-2 एम और 1.6 x 10-4 एम है।
  3. प्रतिक्रिया समाधान (1 एमएल) को नीले या बैंगनी एलईडी प्रकाश विकिरण के लिए 1-5 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम2 पर उजागर करें।
  4. Equation 1 फोटोकैमिकल प्रतिक्रिया द्वारा उत्पादित प्रजातियों (560 एनएम पर अवशोषण से) का पता लगाएं, जो एनबीटी को कम करता है और फॉर्माज़ान का उत्पादन करता है।

एफएमएन फोटोलिसिस के बाद एस ऑरियस व्यवहार्यता (चित्रा 5)

  1. एक सुसंस्कृत प्लेट से एस ऑरियस (बीसीआरसी 10451) की एक कॉलोनी को 15 एमएल स्क्रू-कैप्ड टेस्ट ट्यूब में ली गई 10 एमएल लाइसोजेनी शोरबा में प्रसारित करें। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर में संस्कृति।
  2. संस्कृति के 0.5 एमएल को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 600 एनएम (ओडी 600) (~ 6 x 107 सीएफयू / एमएल) पर 0.5 के ऑप्टिकल घनत्व के लिए संस्कृति को पतला करनेके लिए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निष्फल पानी जोड़ें।
  3. कल्चर के 0.5 एमएल को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, सेंट्रीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर स्थानांतरित करें और सेल गोली प्राप्त करने के लिए सतह पर तैरने वाले को अलग करें।
  4. चरण 4.3 और भंवर में प्राप्त सेल छर्रों में 1 एमएल एफएमएन-बफर्ड समाधान (पीबी में 30, 60, और 120 μM FMN) जोड़ें। विकिरणित नियंत्रण के लिए, अकेले पीबी के 1 एमएल जोड़ें।
  5. 1 एमएल व्यवहार्य बैक्टीरियल सेल समाधानों में से प्रत्येक को ग्लास ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें अकेले 30 μM FMN और PB होते हैं, और उन्हें 30 मिनट के लिए 10 W / m2 पर बैंगनी प्रकाश के साथ विकिरणित करें।
  6. 30, 60, और 120 μM FMN और PB युक्त व्यवहार्य बैक्टीरियल सेल समाधानों में से प्रत्येक को ग्लास ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 120 मिनट के लिए 20 W / m2 पर नीली रोशनी के साथ विकिरणित करें। 120 μM FMN युक्त 1 एमएल व्यवहार्य बैक्टीरियल सेल समाधान के साथ एक और ग्लास ट्यूब सेट करें और इसे 60 मिनट के लिए 20 W / m2 पर नीली रोशनी के साथ विकिरणित करें।
  7. चरण 4.5 और 4.6 में वर्णित परीक्षण ट्यूबों को सेट करें और उन्हें मोटी एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। ये ट्यूब अंधेरे नियंत्रण के रूप में काम करते हैं।
  8. विकिरण कक्ष (साथ ही अंधेरे नियंत्रण) को 30-120 मिनट विकिरण अवधि के दौरान 9 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे कमरे में रखें।
    नोट: एलईडी लाइट्स द्वारा जारी गर्मी को अनदेखा नहीं किया जा सकता है क्योंकि कप के अंदर रखे गए एलईडी चिप्स विकिरण प्रयोगों के दौरान फोटोरिएक्शन सिस्टम को गर्म कर सकते हैं। इसलिए, प्रयोगों को 9 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए ठंडे कमरे में आयोजित किया गया था।
  9. विकिरण के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया समाधान से 0.2 एमएल को लुरिया आगर (एलए) प्लेट पर स्थानांतरित करें। एल-आकार की ग्लास रॉड द्वारा प्लेट पर बैक्टीरिया फैलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेनें।
  10. रात भर के विकास के बाद एस ऑरियस की व्यवहार्य प्लेट गिनती और निष्क्रियता दर की गणना करें।
    नोट: एस ऑरियस की निष्क्रियता दर की गणना प्रतिशत कमी के रूप में की जाती है, जो [1 -आई / डी] ×100% के बराबर है, जहां आई और डी क्रमशः विकिरणित नमूने और अंधेरे नियंत्रण में सीएफयू की संख्या को दर्शाते हैं। प्रतिशत कमी को निष्क्रियता दर के नकारात्मक मूल्य के रूप में परिभाषित किया गया है।

5. एस ऑरियस में पहचान Equation 1 (चित्रा 6) 

  1. चरण 4 में वर्णित एस ऑरियस नमूने तैयार करें।
  2. निष्फल पानी के साथ नमूनों के जीवाणु घनत्व को 600 एनएम (ओडी 600, ~6 x 10 6 सीएफयू / एमएल) पर 0.5 के ऑप्टिकल घनत्व तक पतला करें। संस्कृति के 0.5 एमएल को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर और सेल गोली प्राप्त करने के लिए सुपरनैटेंट को डिकैंट करें।
  3. पीबी के 75 एमएल में 0.1093 ग्राम एल-मेथिओनिन, 0.1 ग्राम एनबीटी और 25 एमएल एफएमएन (400, 240, या 120 μM) जोड़ें। लागू अभिकारक के प्रत्येक 1 एमएल के लिए, एफएमएन, मेथिओनिन और एनबीटी की अंतिम सांद्रता क्रमशः 100 (60 या 30) x 10-6 एम, 7.3 x 10-3 एम, और 1.2 x 10-3 एम है।
  4. चरण 5.2 में प्राप्त सेल छर्रों में प्रत्येक अभिकारक समाधान (यानी, अलग-अलग एफएमएन सांद्रता के साथ) का 1 एमएल जोड़ें। 10 मिनट के लिए 10 W/m2 पर बैंगनी प्रकाश द्वारा घोल को विकिरणित करें।
  5. मिश्रण को 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को डिकैंटिंग करें। कम एनबीटी को निकालने के लिए 1 एमएल डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में गोली को फिर से निलंबित करें। 560 एनएम पर अवशोषण से उत्पादित Equation 1 प्रजातियों का पता लगाएं।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. तीन स्वतंत्र परीक्षणों के मानक विचलन (एसडी) ± औसत के रूप में डेटा व्यक्त करें।
  2. यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या दो माप अलग-अलग हैं, एक होमोसिडेस्टिक दो-नमूना टी-परीक्षण लागू करें। 0.05 < पी-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माने जाते हैं।

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Representative Results

एफएमएन पर प्रकाश तरंग दैर्ध्य का प्रभाव
नीले, हरे, लाल और बैंगनी एलईडी का उपयोग करके विकिरणित 0.1 एमएम एफएमएन के अवशोषण स्पेक्ट्रा को चित्र 3 में दिखाया गया है। अंधेरे नियंत्रण के लिए एफएमएन (372 एनएम और 444 एनएम) के लिए दो चोटियां हैं। हरे और लाल प्रकाश का कोई प्रभाव नहीं पड़ता है क्योंकि स्पेक्ट्रा में परिवर्तन महत्वहीन होते हैं। दूसरी ओर, 5 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम 2 पर नीले और बैंगनी प्रकाश विकिरण के बाद 444 एनएम पर एफएमएन का संबंधित अवशोषण क्रमशः लगभग 19% और 34% कम हो जाता है,यह सुझाव देता है कि नीले / बैंगनी प्रकाश के साथ विकिरण एफएमएन फोटोलिसिस को बढ़ाता है।

का पता लगाना Equation 10 एफएमएन से जो नीले या बैंगनी प्रकाश का उपयोग करके विकिरणित किया जाता है
32 के गठन को निर्धारित करने के लिए एनबीटी कटौती का Equation 1 उपयोग किया गया था। एफएमएन विकिरण की छोटी अवधि के लिए भी दृश्यमान और यूवी प्रकाश के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। Equation 1 एफएमएन के फोटोलिसिस के दौरान मध्यवर्ती फोटोकैमिकल प्रतिक्रियाओं से बनता है। चित्रा 4 से पता चलता है कि एनबीटी कमी पर एफएमएन का फोटोकैमिकल प्रभाव विकिरण समय पर निर्भर करता है, जैसा Equation 1 कि एफएमएन से समय-निर्भर तरीके से नीले या बैंगनी प्रकाश विकिरण के संपर्क में आता है। नीली रोशनी और बैंगनी प्रकाश का औसत फोटोलाइटिक प्रभाव, हालांकि, चित्र 4 में दिखाए गए समान है।

एस ऑरियस व्यवहार्यता पर एफएमएन फोटोलिसिस का प्रभाव
एस ऑरियस व्यवहार्यता पर बैंगनी या नीली रोशनी विकिरण के संपर्क में आने वाले एफएमएन का प्रभाव निर्धारित किया गया था। नीले या बैंगनी प्रकाश विकिरण का उपयोग करके एफएमएन फोटोलिसिस के परिणामस्वरूप एस ऑरियस की महत्वपूर्ण निष्क्रियता होती है। एफएमएन की सांद्रता जितनी अधिक होगी, एस ऑरियस की निष्क्रियता दर उतनी ही अधिक होगी जो 120 मिनट के लिए 20 डब्ल्यू / एम2 पर नीली रोशनी विकिरण के संपर्क में है जैसा कि चित्र 5 ए में दिखाया गया है। 20 डब्ल्यू/ एम 2 ब्लू लाइट विकिरण के तहत क्रमशः 0, 30, 60, और 120 एसएम एफएमएन का उपयोग करके एस ऑरियस के लिए 26%, 39%, 43% और 97% की निष्क्रियता दर हासिल की गई थी। जैसा कि चित्र 5ए में दिखाया गया है, 120 मिनट के लिए 20 डब्ल्यू/एम 2 पर 60 μM FMN के साथ ब्लू लाइट विकिरण का उपयोग करके S. Aureus के लिए निष्क्रियता दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर (p-मान = 0.20) नहीं है (ऊर्जा खुराक, 14.4 J/cm2) या 60 मिनट के लिए 20 W/m2 पर 120 μM FMN (ऊर्जा खुराक, ऊर्जा खुराक, 7.2 J/cm2)। दूसरी ओर, जैसा कि चित्र 5 बी में दिखाया गया है, 30 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम 2 (1.8 जे/ सेमी 2 की ऊर्जा खुराक) पर बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत क्रमशः 30 μM FMN के बिना और 30 μM FMN के साथ S. ऑरियस के लिए निष्क्रियता दर हासिल की गई थी। इसलिए, नीले या बैंगनी प्रकाश विकिरण के संपर्क में आने वाले एफएमएन का जीवाणु निष्क्रियता को बढ़ाकर एस ऑरियस की व्यवहार्यता पर अधिक प्रभाव पड़ता है। वायलेट प्रकाश विकिरण के साथ इलाज किया गया एफएमएन एस ऑरियस निष्क्रियता में अधिक कुशल है।

का पता लगाना Equation 10 वायलेट प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन-उपचारित एस ऑरियस में
वायलेट प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन-उपचारित एस ऑरियस का Equation 1 उत्पादन एनबीटी कमी विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। उत्पादन की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए 560 एनएम पर अवशोषण मूल्य का Equation 1 उपयोग किया गया था। एस ऑरियस में उत्पादन पर Equation 1 एफएमएन का फोटोकैमिकल प्रभाव एफएमएन एकाग्रता के समानुपाती है (चित्रा 6)। एफएमएन उपचार के बिना एस ऑरियस के लिए 560 एनएम अवशोषण मान क्रमशः 10 मिनट और अंधेरे में 10 डब्ल्यू / एम2 बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत 0.31 और 0.07 हैं (चित्रा 6)। इससे पता चलता है कि बैंगनी प्रकाश विकिरण के बाद अनुपचारित एस ऑरियस में बहुत कम Equation 1 उत्पादन हुआ था। 100 μM FMN के साथ इलाज किए गए S. Aureus के लिए संबंधित 560 nm अवशोषण मान क्रमशः 10 मिनट और अंधेरे में 10 W / m2 बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत 1.36 और 0.08 हैं। इसलिए, एफएमएन-उपचारित एस ऑरियस में एनबीटी की कमी पर फोटोकैमिकल प्रभाव बैंगनी विकिरण के तहत बढ़ता है, जैसा कि Equation 1 बहुतायत से उत्पादित होता है।

Figure 1
चित्र 1: फोटोरिएक्शन सिस्टम का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इस अध्ययन में नीले, हरे, लाल और बैंगनी एलईडी रोशनी के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। नीले, हरे, लाल और बैंगनी रोशनी के लिए उत्सर्जन मैक्सिमा क्रमशः 465, 529, 632 और 405 एनएम पर है, और आधी ऊंचाई (डब्ल्यू1/2) पर वर्णक्रमीय चौड़ाई क्रमशः 26, 31, 14 और 12 एनएम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एफएमएन के अवशोषण स्पेक्ट्रा को 5 मिनट के लिए 10 W/m2 पर विभिन्न तरंगदैर्ध्य के LED के साथ इलाज किया जाता है। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एफएमएन फोटोलिसिस पर 1-5 मिनट के लिए 10 W/m2 पर नीले और बैंगनी प्रकाश विकिरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए NBT में कमी। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एस ऑरियस व्यवहार्यता पर एफएमएन फोटोलिसिस का प्रभाव। प्रतिशत कमी को एस. ऑरियस के लिए निष्क्रियता दर के नकारात्मक मूल्य के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसे 120 मिनट के लिए 20 डब्ल्यू /एम2 पर ब्लू लाइट विकिरण के तहत (ए) एफएमएन के साथ इलाज किया जाता है और (बी) 30 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम2 पर बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन। ध्यान दें कि 120 मिनट के लिए 20 W/m 2 ब्लू लाइट विकिरण पर 60 μM FMN का उपयोग करके S. Aureus के लिए निष्क्रियता दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर (p = 0.20) नहीं है या 60 मिनट (A) के लिए 20 W/m 2 ब्लू लाइट विकिरण पर120 μM FMN है। परिणाम एसडी ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, जहां एन = 3। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एस ऑरियस में उत्पादन पर एफएमएन एकाग्रता का प्रभाव 10 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम 2 पर बैंगनी प्रकाश विकिरण के अधीन है। Equation 10 कुल मिलाकर, एफएमएन की अनुपस्थिति में एस ऑरियस में बहुत कम उत्पादन होता है, हालांकि अंधेरे Equation 1 नियंत्रण (पीबी (डार्क)) के सापेक्ष विकिरणित नमूने (पीबी (वायलेट लाइट)) में बैंगनी प्रकाश विकिरण थोड़ा बढ़ जाता Equation 1 है। परिणाम एसडी ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, जहां एन = 3। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक फोटोसेंसिटाइज़र आरओएस उत्पन्न करने के लिए रासायनिक यौगिकों की फोटोकैमिकल प्रतिक्रिया को बढ़ाता है। रोगजनक सूक्ष्मजीवों को फोटोसेंसिटाइज़र की उपस्थिति में प्रकाश विकिरण द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है। यह अध्ययन एक्सोजेनस फोटोसेंसिटाइज़र, एफएमएन के बैंगनी प्रकाश विकिरण द्वारा उत्पन्न आरओएस के कारण एस ऑरियस के एपीडीआई को निर्धारित करता है।

जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, एफएमएन के लिए, बैंगनी या नीली रोशनी का उपयोग करके विकिरण के 5 मिनट के बाद 444 एनएम पर अवशोषण काफी कम हो जाता है और हरे या लाल प्रकाश के साथ विकिरण के तहत एफएमएन अवशोषण में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होता है। एनबीटी रिडक्शन का उपयोग चार्ज-ट्रांसफर प्रक्रिया10,33 के माध्यम से गठन को निर्धारित करने के Equation 1 लिए किया जाता है। लेखकों द्वारा पिछले अध्ययन में एनबीटी कमी का उपयोग करने के गठन को निर्धारित करने के लिए नीले, हरे या लाल-प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन का Equation 1 उपयोग किया गया था। ब्लू लाइट विकिरण एक बड़ी मात्रा में Equation 1 उत्पादन करता है जबकि हरे और लाल प्रकाश की फोटोलाइटिक दक्षता नीली रोशनी10 द्वारा प्राप्त 3% से कम है। इन परिणामों से पता चलता है कि एक चार्ज-ट्रांसफर प्रक्रिया का उत्पादन तब होता है जब एफएमएन नीले या बैंगनी प्रकाश विकिरण के संपर्क में होता है और हरे या लाल प्रकाश द्वारा विकिरण पर कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होता है।

लेखकों द्वारा पिछले अध्ययनसे पता चला है कि एफएमएन फोटोलिसिस के लिए तंत्र को प्राथमिक एफएमएन फोटोलाइटिक प्रतिक्रियाओं (समीकरण 1) के साथ वर्णित किया जा सकता है:

Equation 2 (1),

जहां 1एफएमएन * और 3एफएमएन * क्रमशः उत्तेजित एफएमएन के एकल और ट्रिपल राज्य हैं। इन फोटोइंड्यूस्ड एफएमएन के लिए फोटोलाइटिक प्रतिक्रिया तंत्र संभवतः ट्रिपल-ट्रिपल विनाश या ट्रिपल-ग्राउंड स्टेट शमन प्रक्रिया35,36,37,38 द्वारा शुरू किए जाते हैं। FMN (FMN0) की जमीनी स्थिति एक इलेक्ट्रॉन दाता है जो 3FMN * को एक इलेक्ट्रॉन प्रदान करता है और अर्ध-कम (FMN •-) और अर्ध-ऑक्सीकृत (FMN •+) रूपों को उत्पन्न करता है, जैसा कि समीकरण 2 में दिखाया गया है

Equation 3 (2)

एफएमएन के लिए फोटोडिग्रेडेशन मार्ग फोटोसेंसिटाइजेशन के परिणामस्वरूप होते हैं। एफएमएन को फोटोलाइटिक प्रतिक्रिया के माध्यम से इलेक्ट्रॉनिक रूप से उत्तेजित अवस्था, एफएमएन में पदोन्नत किया जाता है और फिर, एक तटस्थ एफएमएन कम हो जाता है जब एफएमएन • एक इलेक्ट्रॉन खो देता है, जैसा कि नीचे दिए गए समीकरण 3-8 में दिखाया गया है:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

जहां एफएमएन •+ एक कट्टरपंथी केशन प्रजाति है।

ओ2 (3 ऍजी-) के साथ एफएमएन की बातचीत प्रतिक्रियाशील सुपरऑक्साइड रेडिकल का उत्पादन करती है, Equation 1इसके बाद हाइड्रोपेरोक्सिल रेडिकल, एचओओ • होता है, जो प्रोटॉन और प्रोटॉन के बीच Equation 1 प्रतिक्रिया में उत्पन्न होता है और अंततः एफएमएन0 के क्षरण की ओर जाता है:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

जहां एफएमएन एक कट्टरपंथी आयन है।

वर्तमान अध्ययन में, एफएमएन की अनुपस्थिति में, एस ऑरियस के मामले में निष्क्रियता दर 30 मिनट के लिए 10 डब्ल्यू / एम 2 पर बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत 53% और120 मिनट के लिए 20 डब्ल्यू / एम 2 पर नीली प्रकाश विकिरण के तहत26 % है, यह सुझाव देते हुए कि नीली प्रकाश विकिरण बैंगनी प्रकाश की तुलना में कम बैक्टीरिया को निष्क्रिय करता है (चित्रा 5)। यह पहले बताया गया है कि बहिर्जात फोटोसेंसिटाइज़र के बिना 430 एनएम से अधिक तरंग दैर्ध्य पर विकिरण एस ऑरियस कोशिकाओं को निष्क्रिय नहीं करता है, हालांकि एस ऑरियस में पोर्फिरीन में 405 ± 5 एनएम पर अधिकतम अवशोषण होता है और विकिरण39 के बाद जीवाणु निष्क्रियता का कारण बनता है।

वर्तमान लेखकों द्वारा किए गए एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि ई कोलाई और एस ऑरियस डीएनए दरार द्वारा निष्क्रिय हो जाते हैं जो राइबोफ्लेविन या एफएमएन 10,24,40 के फोटोलिसिस के माध्यम से बनने से प्रेरित होता है। एस ऑरियस के लिए संबंधित निष्क्रियता दर क्रमशः 97% और 96% है, जिसमें 20 डब्ल्यू / एम 2 ब्लू लाइट विकिरण (14.4 जे / सेमी2 की ऊर्जा खुराक) के तहत120 μM FMN का उपयोग 120 मिनट के लिए और 10 W / m2 बैंगनी प्रकाश विकिरण (1.8 J / cm2 की ऊर्जा खुराक) के तहत 30 मिनट के लिए 30 μM FMN का उपयोग किया जाता है (चित्र 5)। इसलिए, बैंगनी प्रकाश विकिरण एस ऑरियस को निष्क्रिय करने में अधिक प्रभावी है क्योंकि बैंगनी प्रकाश की कम ऊर्जा खुराक नीली रोशनी की तुलना में कम एफएमएन सांद्रता और कम रोशनी अवधि की उपस्थिति में एस ऑरियस को निष्क्रिय कर सकती है। यद्यपि बैंगनी प्रकाश द्वारा प्राप्त एफएमएन फोटोलिसिस की सीमा नीली रोशनी की तुलना में अधिक है (चित्रा 3), नीले और बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत एनबीटी कमी पर एफएमएन के औसत फोटोलाइटिक प्रभाव समान हैं (चित्रा 4)।

ई कोलाई एक आम ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है। ब्लू लाइट विकिरण द्वारा राइबोफ्लेविन या एफएमएन फोटोलिसिसएफएमएन 10,24 का उपयोग करते समयआरओएस 10,24,41 के माध्यम से 96% की निष्क्रियता दर के साथ ई कोलाई को निष्क्रिय कर देता है। दूसरी ओर, एस ऑरियस, एक ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु है, जो वायलेट प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन फोटोलिसिस द्वारा प्रभावी रूप से निष्क्रिय है, जैसा कि यहां दिखाया गया है (चित्रा 5)। इसलिए, नीले या बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन फोटोलाइटिक प्रतिक्रिया आरओएस का उत्पादन कर सकती है और ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया दोनों को निष्क्रिय कर सकती है।

एफएमएन की अनुपस्थिति में, हालांकि, एस ऑरियस में बहुत कम Equation 1 उत्पादन होता है जो वायलेट प्रकाश विकिरण (चित्रा 6) के संपर्क में आता है; इसलिए, अंतर्जात फोटोसेंसिटाइज़र केवल वायलेट प्रकाश विकिरण के तहत एस ऑरियस की व्यवहार्यता को थोड़ा कम करते हैं, एफएमएन जैसे बहिर्जात फोटोसेंसिटाइज़र की उपस्थिति में प्रभाव की तुलना में। उन्हीं परिस्थितियों में, वायलेट प्रकाश विकिरण के संपर्क में आने वाले एफएमएन एस ऑरियस की व्यवहार्यता को कम करता है जिसके परिणामस्वरूप 96% निष्क्रियता दर होती है, जो अकेले अंतर्जात इंट्रासेल्युलर फोटोसेंसिटाइज़र की तुलना में बहुत अधिक है। बैंगनी प्रकाश विकिरण के तहत एफएमएन-उपचारित एस ऑरियस के Equation 1 उत्पादन में काफी वृद्धि हुई है, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। इन परिणामों से पता चलता है कि वायलेट प्रकाश विकिरण के संपर्क में आने पर एफएमएन जीवाणु निष्क्रियता के ऊंचे स्तर का कारण बनता है।

एफएमएन यूवी 1,2,21,22,23, ब्लू 10,24 और वायलेट लाइट 31 का उपयोग करके विकिरणित होने पर एक फोटो-उत्तेजित स्थिति प्राप्त कर सकताहै; हालांकि, साइटोटॉक्सिसिटी जो यूवी विकिरण और उच्च तीव्रता वाले लघु-तरंग दैर्ध्य विकिरण के कारण होती है, को 42 माना जाना चाहिए। दूसरी ओर, लंबी तरंग दैर्ध्य वाले लाल और हरे विकिरण एफएमएन फोटोलिसिस10 के दौरान आरओएस की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन नहीं करते हैं। इसलिए, एस ऑरियस के आरओएस-प्रेरित एपीडीआई को वायलेट प्रकाश के साथ एफएमएन को विकिरणित करने की आवश्यकता होती है जिसमें एक मध्यवर्ती तरंग दैर्ध्य होता है। बैंगनी प्रकाश के लिए आधी ऊंचाई (डब्ल्यू1/2) पर वर्णक्रमीय चौड़ाई यूवी अवशोषण के साथ किसी भी ओवरलैप से बचने और यूवी विकिरण31 के कारण जोखिम को रोकने के लिए संकीर्ण होनी चाहिए। सूक्ष्म पोषक तत्व, एफएमएन, मानव शरीर के लिए एक आवश्यक विटामिन होने के नाते हानिरहित है। एफएमएन जैसे उपयुक्त फोटोसेंसिटाइज़र का उपयोग करके, कम ऊर्जा बैंगनी प्रकाश विकिरण रोगजनक बैक्टीरिया को दबा सकता है, जो सैनिटरी प्रक्रिया का एक सुरक्षित और प्रभावी साधन प्रदान करता है। ऑरियस पर एफएमएन की फोटोलाइटिक प्रतिक्रिया के अलावा, अन्य मुद्दों पर आगे की जांच की आवश्यकता है, जैसे कि रोगाणुओं पर एफएमएन की फोटोटॉक्सिसिटी, जो इसके कारण होने Equation 1 वाले तनाव से उत्पन्न होती है, जिसका अध्ययन क्यूपीसीआर के साथ आरएनए-सेक तकनीक का उपयोग करके किया जा सकता है।

वायलेट प्रकाश विकिरण के माध्यम से एफएमएन फोटोलिसिस फोटोकैमिकल ऑक्सीकरण की ओर जाता है जिसके द्वारा आरओएस उत्पन्न होता है और बदले में रोगजनक बैक्टीरिया की निष्क्रियता को बढ़ाता है। वायलेट लाइट का उपयोग एफएमएन फोटोडीकंपोजन में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है। वर्तमान तकनीक की सीमा यह है कि यूवी विकिरण के कारण जोखिम से बचने के लिए बैंगनी प्रकाश का तरंगदैर्ध्य अंतराल काफी संकीर्ण होना चाहिए। वर्तमान विधि में भविष्य के चिकित्सा अनुप्रयोगों की क्षमता है, जैसे कि संक्रमित क्षेत्रों में बैंगनी प्रकाश को निर्देशित करने के लिए ऑप्टिकल फाइबर डालकर गहरे चमड़े के नीचे के ऊतकों या मांसपेशियों के साथ सतह की त्वचा का संक्रमण उपचार। एफएमएन का उपयोग करके फोटोकैमिकल उपचार इसलिए प्रभावी स्वच्छता प्रथाओं को सुनिश्चित करने का एक सुरक्षित और सरल तरीका है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक प्रयोगों के साथ उनके समर्थन के लिए डॉ टाक-वाह वोंग और श्री ज़ोंग-झे सीह के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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बायोइंजीनियरिंग अंक 182 एफएमएन फोटोलिसिस आरओएस एस ऑरियस बैंगनी प्रकाश
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