Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Inaktivering af patogener via fotolyse i synligt lys af riboflavin-5′-phosphat

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Her præsenterer vi en protokol til inaktivering af patogene bakterier med reaktive iltarter produceret under fotolyse af flavinmononukleotid (FMN) under bestråling af blåt og violet lys med lav intensitet. FMN-fotolyse har vist sig at være en enkel og sikker metode til sanitære processer.

Abstract

Riboflavin-5'-phosphat (eller flavinmononukleotid; FMN) er følsom over for synligt lys. Forskellige forbindelser, herunder reaktive iltarter (ROS), kan genereres fra FMN-fotolyse ved bestråling med synligt lys. ROS genereret fra FMN fotolyse er skadelige for mikroorganismer, herunder patogene bakterier såsom Staphylococcus aureus (S. aureus). Denne artikel præsenterer en protokol til deaktivering af S. aureus, som et eksempel, via fotokemiske reaktioner, der involverer FMN under bestråling af synligt lys. Den superoxidradikale anion (), der genereres under FMN-fotolysen, evalueres via nitroblåt tetrazolium (Equation 1NBT) reduktion. Den mikrobielle levedygtighed af S. aureus, der tilskrives reaktive Equation 1 arter, blev brugt til at bestemme effektiviteten af processen. Den bakterielle inaktiveringshastighed er proportional med FMN-koncentrationen. Violet lys er mere effektivt til at inaktivere S. aureus end bestråling af blåt lys, mens det røde eller grønne lys ikke driver FMN-fotolyse. Denne artikel demonstrerer FMN-fotolyse som en enkel og sikker metode til sanitære processer.

Introduction

Riboflavin-5′-phosphat (FMN) dannes ved phosphorylering ved riboflavin 5′-positionen af ribityl sidekæden og kræves af alle flavoproteiner til adskillige cellulære processer for at generere energi. Det spiller også rollen som vitamin for nogle funktioner i menneskekroppen1. FMN er ca. 200 gange mere opløseligt i vand end riboflavin2.

Den antibakterielle fotodynamiske inaktivering (aPDI) af bakterier er en effektiv måde at kontrollere resistens over for bakterier 3,4, fordi den ikke afhænger af bakteriel resistens. Klinisk anvendes aPDI til behandling af bløddelsinfektioner for at mindske infektion af nosokomiel hud på grund af multiresistente bakterier 5,6,7,8,9. aPDI producerer også celledød ved at generere reaktive iltarter (ROS). ROS, såsom superoxidradikaler (), singlet oxygen, hydroxylradikaler (Equation 1•OH) og peroxylradikaler, er frie radikaler eller molekyler, der indeholder reaktivt ilt 10,11,12 og normalt er reaktive 13. I lighed med DNA-skader, der er forårsaget af ROS, er membranperoxidering og ødelæggelse af endotelceller også negative biokemiske reaktioner, der tilskrives ROS i celler12.

Anvendelsen af aPDI til patogene bakterier involverer en synlig eller UV-lyskilde til at inaktivere mikroorganismer i nærvær af kemiske forbindelser, såsom methylthioniniumchlorid 14, PEI-c e6-konjugat 15, porfyrin16, titandioxid 17, toluidinblåtO18 og zinkoxidnanopartikler 19. Toluidinblåt O og methylenblåt er phenothiaziniumfarvestoffer, og methylenblåt har toksiske egenskaber. Zinkoxidnanopartikler og UV-bestråling er forbundet med sundheds- og miljøskadelige virkninger. Som sådan fortjener udnyttelsen af en pålidelig, sikker og enkel fotosensibilisator via fotolyse under synlig bestråling yderligere undersøgelse.

Mikronæringsstoffet, riboflavin eller FMN, er ikke giftigt og anvendes faktisk til fødevarefremstilling eller fodring20. Både FMN og riboflavin er meget følsomme over for lysbestråling2. Under UV 1,2,21,22,23 og bestråling af blåt lys 10,24 opnår disse to forbindelser en exciteret tilstand. Det aktiverede riboflavin eller FMN, der produceres ved fotolyse, fremmes til dets triplettilstand, og ROS genereres samtidigt 2,25. Kumar et al. rapporterede, at riboflavin aktiveret af UV-lys selektivt forårsager øget skade på guanindelen af DNA i patogene mikroorganismer26. Under bestråling med UV-lys er fotodynamisk aktiveret riboflavin påvist at fremme dannelsen af 8-OH-dG, som er en biomarkør for oxidativt stress, i dobbeltstrenget DNA27. Det rapporteres, at S. aureus og E. coli deaktiveres af ROS under riboflavin eller FMN-fotolyse10,24,28. En tidligere undersøgelse foretaget af forfatterne viste, at de fotolytiske reaktioner, der involverer riboflavin og FMN, reducerer krystalviolet, et triarylmethanfarvestof og et antibakterielt middel, der genererer Equation 1, og eliminerer det meste af den antimikrobielle evne af krystalviolet28. Når flavinadenin-dinukleotid eller FMN bestråles af blåt lys, producerer den resulterende ROS apoptose i HeLa-celler til deres forgiftning in vitro29. Ved anvendelse af fotokemisk behandling i nærvær af riboflavin, Cui et al. inaktiverede lymfocytter ved at hæmme deres proliferation og cytokinproduktion30.

Fotolysen af riboflavin anvendes til inaktivering af blodpatogen med UV 10,24, men blodkomponenter kan forringes under UV-lysbestråling30. Det rapporteres også, at blodplader, der udsættes for UV, gradvist forbedrer ydeevnen af aktiveringsmarkørerne P-selectin og LIMP-CD63 på deres membraner. Cytotoksiciteten af UV og højintensiv bestråling skal undersøges, og en fotosensibilisator, der er ukompliceret og sikker under en FMN-fotoreaktion, der involverer synligt lys, ville være til stor nytte.

Lys med kortere bølgelængder har mere energi og er meget mere tilbøjelige til at forårsage alvorlig skade på celler. I nærværelse af et egnet fotosensibilisator kan bestråling med violet lys med lav intensitet imidlertid hæmme patogene mikroorganismer. Fotosensibiliseringen og dannelsen af FMN, når den bestråles med violet lys, er derfor vigtig at studere for at bestemme den vej, hvormed ROS fra FMN-fotolyse øger inaktiveringen af Equation 1 bakterier.

Antimikrobiel bekæmpelse er et almindeligt problem, og udviklingen af nye antibiotika tager ofte årtier. Efter bestråling med violet lys kan fotoinaktivering, der formidles af FMN, udslette miljøpatogene bakterier. Denne undersøgelse præsenterer en effektiv antimikrobiel protokol in vitro ved hjælp af violet lys til at drive FMN-fotolyse og dermed generere Equation 1 til aPDI. Den mikrobielle levedygtighed af S. aureus anvendes til at bestemme gennemførligheden af FMN-induceret aPDI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opsætning af fotolysesystem

  1. Der monteres seks lysemitterende dioder (LED) (DC 12 V) på indersiden af en uigennemsigtig plastikkop (8 cm x 7 cm) som vist i figur 1 for at etablere et fotolysesystem31.
  2. Tilsæt reaktanter (se nedenfor) i glassets reagensglas (13 mm i diameter og 100 mm i højden), og fastgør rørene øverst på koppen som vist i figur 1. Den eksperimentelle opsætning anbringes i et rum med en konstant temperatur på 25 ± 3 °C.
  3. Testenhedernes temperatur overvåges og registreres under de fotolytiske reaktioner ved hjælp af et infrarødt termometer.
    BEMÆRK: Figur 2 viser emissionsspektrene for blåt, grønt, rødt og violet lys, som registreret ved hjælp af et kalibreret UV-Vis optisk spektrometer. Bølgelængderne svarende til absorbansmaksimum for blå, grøn, rød, og violette LED-lys, der anvendes i undersøgelsen, er henholdsvis 465, 529, 632, og 405 nm, henholdsvis. LED-chips kan opvarme apparatet under bestrålingsforsøg. Hele fotoreaktionssystemet i hvert eksperiment blev derfor anbragt i et rum, hvor temperaturen blev holdt konstant på 25 ± 3 °C.

2. Effekten af lysbølgelængde på fotolysen af FMN (figur 3)

  1. Forbered en 0,1 mM FMN-opløsning i 100 mM kaliumphosphatbuffer (PB) (pH 7,8). Udsæt FMN-prøver (3 ml hver) for blåt, grønt, rødt eller violet lys med en intensitet på 10 W/m2 i 5 minutter. Opbevar 3 ml FMN-opløsning i mørke som kontrol.
  2. Absorbansen af bestrålede FMN-prøver registreres i området 250-750 nm ved hjælp af et UV/synligt spektrofotometer.

3. Nitroblå tetrazolium (NBT) reduktionsmetode til påvisning Equation 1 (figur 4).

BEMÆRK: NBT-reduktionsmetoden, der blev anvendt her, blev let modificeret fra analysen for riboflavinfotoreaktion. NBT-reduktionsmetoden bruges til at evaluere niveauet af Equation 1 genereret fra FMN-fotolyse. Den fotokemisk ophidsede FMN reduceres først af L-methionin til en semiquinon, som derefter donerer en elektron til ilt, hvilket giver anledning til Equation 131. Den as-genererede Equation 1 reducerer NBT til formazan, som har en karakteristisk absorbans ved 560 nm32.

  1. Tilsæt 109,3 mg L-methionin til 73,3 ml PB (100 mM; pH 7,8). Vortex opløsningen til opløsning af L-methionin.
  2. Når L-methionin er helt opløst, tilsættes 10 mg NBT-pulver og 1,53 ml 0,117 mM FMN til opløsningen. For hver 1 ml reaktionsopløsning (dvs. en blanding af FMN, L-methionin og NBT), der påføres, er de endelige koncentrationer af FMN, methionin og NBT henholdsvis 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M og 1,6 x 10-4 M.
  3. Udsæt reaktionsopløsningen (1 ml) for bestråling af blåt eller violet LED-lys ved 10 W/m2 i 1-5 minutter.
  4. Detekter Equation 1 arten (fra absorbansen ved 560 nm) produceret af den fotokemiske reaktion, hvilket reducerer NBT og producerer formazan.

4. S. aureus ' levedygtighed efter FMN-fotolyse (figur 5)

  1. Overfør en koloni af S. aureus (BCRC 10451) fra en dyrket plade til 10 ml Lysogeny bouillon taget i et 15 ml skruelåget reagensglas. Kultur i en ryster ved 37 °C i 16 timer.
  2. Overfør 0,5 ml af kulturen til et 1,5 ml centrifugeglas. Tilsæt steriliseret vand i centrifugerøret for at fortynde kulturen til en optisk densitet på 0,5 ved 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 CFU / ml).
  3. 0,5 ml af kulturen overføres til et 1,5 ml centrifugeglas, centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter og supernatanten dekanteres for at opnå en cellepille.
  4. Der tilsættes 1 ml FMN-bufret opløsning (30, 60 og 120 μM FMN i PB) til cellepillerne opnået som i trin 4.3 og hvirvel. Til bestrålet kontrol tilsættes 1 ml PB alene.
  5. Hver af levedygtige bakteriecelleopløsninger, der indeholder 30 μM FMN og PB alene, overføres til glasrør, og de bestråles med violet lys ved 10 W/m2 i 30 minutter.
  6. Hver 1 ml levedygtige bakteriecelleopløsninger indeholdende 30, 60 og 120 μM FMN og PB alene overføres til glasrør og bestråles med blåt lys ved 20 W/m2 i 120 minutter. Opsæt et andet glasrør med 1 ml levedygtig bakteriecelleopløsning indeholdende 120 μM FMN og bestråle det med blåt lys ved 20 W/m2 i 60 minutter.
  7. Opsæt reagensglas som beskrevet i trin 4.5 og 4.6, og dæk dem med tykke aluminiumsfolier. Disse rør tjener som mørke kontroller.
  8. Opbevar bestrålingskammeret (såvel som de mørke kontroller) i et koldt rum ved 9 ± 1 °C i bestrålingsperioden 30-120 minutter.
    BEMÆRK: Varme frigivet af LED-lys kan ikke ignoreres, da LED-chips placeret inde i koppen kan opvarme fotoreaktionssystemet under bestrålingseksperimenter. Forsøgene blev derfor udført i et kølerum, der blev opretholdt ved 9 ± 1 °C.
  9. Efter bestråling overføres 0,2 ml fra hver af reaktionsopløsningerne til en Luria-agarplade (LA). Bakterierne spredes over pladen med en L-formet glasstang og inkuberes natten over ved 37 °C.
  10. Beregn det levedygtige kimtal og inaktiveringshastighederne for S. aureus efter vækst natten over.
    BEMÆRK: Inaktiveringshastigheden for S. aureus beregnes som den procentvise reduktion, som er lig med [1 -I / D] ×100%, hvor I og D angiver henholdsvis antallet af CFU'er i den bestrålede prøve og mørk kontrol. Den procentvise reduktion defineres som en negativ værdi af inaktiveringsgraden.

5. Påvisning af Equation 1 i S. aureus (figur 6)

  1. S. aureus-prøverne fremstilles som beskrevet i trin 4.
  2. Prøvernes bakterietæthed fortyndes med steriliseret vand til en optisk densitet på 0,5 ved 600 nm (OD600, ~6 x 106 CFU/ml). Overfør 0,5 ml af kulturen til et 1,5 ml centrifugeglas. Der centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter, og supernatanten dekanteres for at opnå en cellepille.
  3. Tilsæt 0,1093 g L-methionin, 0,1 g NBT og 25 ml FMN (400, 240 eller 120 μM) til 75 ml PB. For hver 1 ml anvendt reaktant er de endelige koncentrationer af FMN, methionin og NBT henholdsvis 100 (60 eller 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M og 1,2 x 10-3 M.
  4. Der tilsættes 1 ml af hver reaktantopløsning (dvs. med varierende FMN-koncentrationer) til de opnåede cellepellets som i trin 5.2. Opløsningerne bestråles med violet lys ved 10 W/m2 i 10 min.
  5. Blandingen centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter og dekanteres supernatanten. Resuspender pellet i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at ekstrahere den reducerede NBT. Den producerede Equation 1 art afslås fra absorbansen ved 560 nm.

6. Statistisk analyse

  1. Data udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) for tre uafhængige test.
  2. Anvend en homoscedastisk t-test med to prøver for at vurdere, om to målinger er forskellige. P-værdier < 0,05 betragtes som statistisk signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effekt af lysbølgelængde på FMN
Absorbansspektrene på 0,1 mM FMN, der bestråles med blå, grønne, røde og violette lysdioder, er vist i figur 3. Der er to toppe for FMN (372 nm og 444 nm) for den mørke kontrol. Grønt og rødt lys har ingen effekt, fordi ændringer i spektrene er ubetydelige. På den anden side reduceres FMN's absorbans ved 444 nm med henholdsvis ca. 19% og 34% efter bestråling af blåt og violet lys ved 10 W/m2 i 5 minutter, hvilket tyder på, at bestråling med blåt/violet lys øger FMN-fotolyse.

Påvisning af Equation 10 fra FMN, der bestråles med blåt eller violet lys
NBT-reduktion blev brugt til at bestemme dannelsen af Equation 132. FMN er meget følsom over for synligt lys og UV-lys selv i korte perioder med stråling. Equation 1 dannes ud fra de mellemliggende fotokemiske reaktioner under fotolysen af FMN. Figur 4 viser, at FMN's fotokemiske virkning på NBT-reduktion afhænger af bestrålingstiden, som Equation 1 dannes ved FMN, der udsættes for bestråling af blåt eller violet lys på en tidsafhængig måde. Den gennemsnitlige fotolytiske effekt af blåt lys og violet lys er dog den samme som vist i figur 4.

Effekt af FMN-fotolyse på S. aureus-levedygtighed
Virkningen af FMN udsat for bestråling af violet eller blåt lys på levedygtigheden af S. aureus blev bestemt. FMN-fotolyse ved hjælp af bestråling af blåt eller violet lys resulterer i signifikant inaktivering af S. aureus. Jo større koncentrationen af FMN er, desto højere er inaktiveringshastigheden for S. aureus, der udsættes for bestråling af blåt lys ved 20 W/m2 i 120 minutter som vist i figur 5A. Inaktiveringsrater på 26%, 39%, 43% og 97% blev opnået for S. aureus ved anvendelse af henholdsvis 0, 30, 60 og 120 μM FMN under 20 W / m2 bestråling af blåt lys i 120 minutter. Som vist i figur 5A er der ingen signifikant forskel (p-værdi = 0,20) i inaktiveringshastigheden for S. aureus ved bestråling af blåt lys med enten 60 μM FMN ved 20 W/m 2 i 120 min (energidosis, 14,4 J/cm2) eller 120 μM FMN ved 20 W/m2 i 60 minutter (energidosis, 7,2 J/cm2). På den anden side, som vist i figur 5B, blev inaktiveringsrater på 53% og 96% opnået for S. aureus uden og med henholdsvis 30 μM FMN under bestråling af violet lys ved 10 W/m2 i 30 minutter (energidosis på 1,8 J/cm2). Derfor har FMN udsat for bestråling af blåt eller violet lys en større effekt på levedygtigheden af S. aureus ved at øge bakterieinaktiveringen. FMN behandlet med violet lys bestråling er mere effektiv i S. aureus inaktivering.

Påvisning af Equation 10 i FMN-behandlede S. aureus under bestråling af violet lys
Produktionen af FMN-behandlet S. aureus under bestråling af violet lys blev bestemt ved hjælp af Equation 1 NBT-reduktionsmetoden. Absorbansværdien ved 560 nm blev anvendt til at vurdere produktionens omfangEquation 1. FMN's fotokemiske virkning på Equation 1 dannelsen i S. aureus er proportional med FMN-koncentrationen (figur 6). Absorbansværdierne på 560 nm for S. aureus uden FMN-behandling er henholdsvis 0,31 og 0,07 under 10 W/m2 bestråling af violett lys i henholdsvis 10 min og i mørke (figur 6). Dette tyder på, at der kun blev produceret lidt Equation 1 i ubehandlet S. aureus efter bestråling af violet lys. De respektive absorbansværdier på 560 nm for S. aureus behandlet med 100 μM FMN er henholdsvis 1,36 og 0,08 under 10 W/m2 bestråling af violet lys i henholdsvis 10 minutter og i mørke. Derfor øges den fotokemiske effekt på NBT-reduktion i FMN-behandlede S. aureus under violet bestråling, som Equation 1 produceres rigeligt.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af fotoreaktionssystemet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Emissionsspektrene for blå, grøn, rød, og violette LED-lys i denne undersøgelse. Emissionsmaksimum for de blå, grønne, røde og violette lys er henholdsvis 465, 529, 632 og 405 nm, og spektralbredderne i halv højde (W1/2) er henholdsvis 26, 31, 14 og 12 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Absorbansspektre af FMN behandlet med lysdioder med forskellige bølgelængder ved 10 W/m2 i 5 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: NBT-reduktion for at bestemme effekten af bestråling af blåt og violet lys ved 10 W/m2 i 1-5 min på FMN-fotolyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Effekt af FMN-fotolyse på S. aureus ' levedygtighed. Den procentvise reduktion defineres som en negativ værdi af inaktiveringsraten for S. aureus behandlet med (A) FMN under bestråling med blåt lys ved 20 W/m2 i 120 min og (B) FMN under bestråling med violet lys ved 10 W/m2 i 30 min. FMN-koncentrationer og bestrålingstider er angivet øverst på figuren. Bemærk, at der ikke er nogen signifikant forskel (p = 0,20) i inaktiveringshastigheden for S. aureus ved anvendelse af 60 μM FMN ved 20 W/m, 2 bestråling af blåt lys i 120 minutter eller 120 μM FMN ved 20 W/m2 bestråling af blåt lys i 60 minutter (A). Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SD, hvor n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Virkning af FMN-koncentration på Equation 10 frembringelse i S. aureus , der udsættes for bestråling af violet lys ved 10 W/m2 i 10 minutter. Generelt produceres der kun lidt Equation 1 i S. aureus uden FMN, selv om bestråling af violet lys stiger en smule Equation 1 i den bestrålede prøve (PB (violet lys)) i forhold til mørk kontrol (PB (mørk)). Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SD, hvor n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fotosensibilisator øger den fotokemiske reaktion af kemiske forbindelser for at generere ROS. Patogene mikroorganismer kan inaktiveres ved lysbestråling i nærvær af fotosensibilisatorer. Denne undersøgelse bestemmer aPDI af S. aureus på grund af ROS genereret af violet lysbestråling af en eksogen fotosensibilisator, FMN.

Som vist i figur 3 reduceres absorbansen ved 444 nm for FMN betydeligt efter 5 minutters bestråling med violet eller blåt lys, og der er ingen signifikant ændring i FMN-absorbansen under bestråling med grønt eller rødt lys. NBT-reduktion bruges til at bestemme dannelsen af Equation 1via en ladningsoverførselsproces10,33. En tidligere undersøgelse foretaget af forfatterne brugte FMN under blå, grøn eller rødt lys bestråling til at bestemme dannelsen af anvendelse af Equation 1 NBT-reduktion. Bestråling af blåt lys producerer en enorm mængdeEquation 1, mens den fotolytiske effektivitet af grønt og rødt lys er mindre end 3% af det, der opnås ved blåt lys10. Disse resultater viser, at der produceres en ladningsoverførselsproces, når FMN udsættes for bestråling af blåt eller violet lys, og at der ikke er nogen signifikant ændring ved bestråling med grønt eller rødt lys.

En tidligere undersøgelse af forfatterne34 viste, at mekanismen for FMN-fotolyse kan beskrives med primære FMN-fotolytiske reaktioner (ligning 1):

Equation 2 (1),

hvor 1FMN* og 3FMN* er henholdsvis singlet- og triplettilstandene for den ophidsede FMN. De fotolytiske reaktionsmekanismer for disse fotoinducerede FMN initieres muligvis af en triplet-triplet-udslettelse eller en triplet-jordtilstandsslukningsproces35,36,37,38. Grundtilstanden for FMN (FMN0) er en elektrondonor, der giver en elektron til 3FMN* og genererer de halvreducerede (FMN•-) og semioxiderede (FMN•+) former, som vist i ligning 2

Equation 3 (2)

Fotonedbrydningsvejene for FMN skyldes fotosensibilisering. FMN forfremmes til den elektronisk exciterede tilstand, FMN•, via en fotolytisk reaktion, og derefter reduceres en neutral FMN, når FMN• mister en elektron, som vist i ligningerne 3-8 nedenfor:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

hvor FMN•+ er en radikal kationart.

Interaktionen mellem FMN•- ogO2 (3Σg-) producerer det reaktive superoxidradikal, efterfulgt af hydroperoxylradikalet, HOO•, Equation 1som genereres i reaktionen mellem Equation 1 og en proton og til sidst fører til nedbrydning af FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

hvor FMN•- er en radikal anion.

I denne undersøgelse er inaktiveringshastigheden i tilfælde af S. aureus i mangel af FMN 53% under bestråling af violet lys ved 10 W / m 2 i 30 minutter og 26% under bestråling af blåt lys ved 20 W / m2 i 120 minutter, hvilket tyder på, at bestråling af blåt lys deaktiverer færre bakterier end violet lys (figur 5). Det er tidligere blevet rapporteret, at bestråling ved bølgelængder på over 430 nm uden et eksogent fotosensibilisator, ikke inaktiverer S. aureus-celler, selv om porfyriner i S. aureus har en maksimal absorbans på 405 ± 5 nm og forårsager bakteriel inaktivering efter bestråling39.

En tidligere undersøgelse af de nuværende forfattere viste, at E. coli og S. aureus deaktiveres ved DNA-spaltning, der induceres ved dannelse af gennem fotolyse af riboflavin eller FMN10,24,40. De respektive inaktiveringsrater for S. aureus er henholdsvis 97 % og 96 % ved anvendelse af 120 μM FMN under 20 W/m2 bestråling med blåt lys (energidosis på 14,4 J/cm2) i 120 minutter og 30 μM FMN under 10 W/m2 bestråling af violet lys (energidosis på 1,8 J/cm2) i 30 minutter (figur 5). Derfor er bestråling af violet lys mere effektiv til at deaktivere S. aureus, da lavenergidoser af violet lys kan deaktivere S. aureus i nærvær af lavere FMN-koncentrationer og kortere belysningsperioder sammenlignet med blåt lys. Selv om omfanget af FMN-fotolyse opnået ved violet lys er højere sammenlignet med blåt lys (figur 3), er FMN's gennemsnitlige fotolytiske virkninger på NBT-reduktion under bestråling af blåt og violet lys de samme (figur 4).

E. coli er en almindelig gramnegativ bakterie. Riboflavin- eller FMN-fotolyse ved bestråling af blåt lys inaktiverer E. coli via ROS 10,24,41 med en inaktiveringshastighed på 96 %, når FMN 10,24 anvendes. S. aureus er derimod en grampositiv bakterie, som effektivt inaktiveres ved FMN-fotolyse under violet lysbestråling, som vist her (figur 5). Derfor kan FMN fotolytisk reaktion under bestråling af blåt eller violet lys producere ROS og inaktivere både gramnegative og grampositive bakterier.

I mangel af FMN produceres der imidlertid kun lidt i S. aureus, der udsættes for bestråling af violet lys (figur 6); derfor reducerer endogene fotosensibilisatorer kun lidt Equation 1 levedygtigheden af S. aureus under violet lysbestråling sammenlignet med effekten i nærvær af eksogene fotosensibilisatorer såsom FMN. Under de samme betingelser reducerer FMN, der udsættes for bestråling af violet lys, levedygtigheden af S. aureus for at resultere i en inaktiveringshastighed på 96%, hvilket er meget højere end for endogene intracellulære fotosensibilisatorer alene. Produktionen af FMN-behandlede S. aureus under bestråling af Equation 1 violet lys er steget betydeligt, som vist i figur 6. Disse resultater viser, at FMN, når det udsættes for bestråling af violet lys, forårsager et forhøjet niveau af bakteriel inaktivering.

FMN kan opnå en fotoexciteret tilstand ved bestråling med UV 1,2,21,22,23, blåt 10,24 og violet lys 31; Den cytotoksicitet, der forårsages af UV-stråling og højintensiv bestråling med kort bølgelængde, skal dog tages i betragtning42. På den anden side producerer rød og grøn stråling med længere bølgelængder ikke betydelige mængder ROS under FMN-fotolyse10. Derfor kræver den ROS-inducerede aPDI af S. aureus bestråling af FMN med violet lys, der har en mellemliggende bølgelængde. Spektralbredden i halv højde (W1/2) for violet lys skal være smal for at undgå overlapning med UV-absorptionen og hæmme risikoen for UV-stråling31. Mikronæringsstoffet, FMN, er som sådan harmløst og er et vigtigt vitamin for menneskekroppen. Ved hjælp af en passende fotosensibilisator som FMN kan bestråling af violet lys med lav energi undertrykke patogene bakterier, hvilket giver et sikkert og effektivt middel til sanitetsprocessen. Ud over FMN's fotolytiske reaktion på S. aureus fortjener andre spørgsmål yderligere undersøgelse, såsom FMN's fototoksicitet på mikrober, der opstår som følge af stress forårsaget af Equation 1 , som kan undersøges ved hjælp af en RNA-seq-teknik sammen med qPCR.

FMN-fotolyse via bestråling af violet lys fører til fotokemisk oxidation, hvorved ROS genereres, og forbedrer igen inaktiveringen af patogene bakterier. Brugen af violet lys betragtes som et kritisk trin i FMN-fotonedbrydning. Begrænsningen ved den nuværende teknik er, at bølgelængdeintervallet for violet lys skal være ret snævert for at undgå risikoen på grund af UV-bestråling. Den nuværende metode har potentiale til fremtidige medicinske anvendelser, såsom infektionsbehandling af overfladehud sammen med dybe subkutane væv eller muskler ved at indsætte en optisk fiber for at lede det violette lys til de inficerede områder. Fotokemisk behandling med FMN er derfor en sikker og enkel måde at sikre effektiv hygiejnepraksis på.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for Dr. Tak-Wah Wong og Mr. Zong-Jhe Hsieh for deres støtte med eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jian, H. L., Cheng, C. W., Chen, L. Y., Liang, J. Y. The photochemistry of riboflavin. MC-Transaction on Biotechnology. 3, 1-11 (2011).
  2. Lin, Y., Eitenmiller, R. R., Landen, W. O. Riboflavin. Vitamin analysis for the health and food sciences. , CRC Press. 329-360 (2008).
  3. Xie, L. J., Wang, R. L., Wang, D., Liu, L., Cheng, L. Visible-light-mediated oxidative demethylation of N(6)-methyl adenines. Chemical Communications. 53 (77), 10734-10737 (2017).
  4. Tim, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 150, 2-10 (2015).
  5. Maisch, T., et al. Photodynamic inactivation of multi-resistant bacteria (PIB) - a new approach to treat superficial infections in the 21st century. Journal of the German Society of Dermatology. 9 (5), 360-366 (2011).
  6. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbes. Current Opinion in Microbiology. 33, 67-73 (2016).
  7. Del Rosso, J. Q. Oral Doxycycline in the management of acne vulgaris: Current perspectives on clinical use and recent findings with a new double-scored small tablet formulation. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 8 (5), 19-26 (2015).
  8. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dematologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  9. Yuann, J. M. P., et al. Effects of free radicals from doxycycline hyclate and minocycline hydrochloride under blue light irradiation on the deactivation of Staphylococcus aureus, including a methicillin-resistant strain. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 226, 112370 (2022).
  10. Liang, J. Y., Cheng, C. W., Yu, C. H., Chen, L. Y. Investigations of blue light-induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide on inactivation of E. coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 143, 82-88 (2015).
  11. Yang, M. J., et al. Effects of blue-light-induced free radical formation from catechin hydrate on the inactivation of Acinetobacter baumannii, Including a carbapenem-resistant strain. Molecules. 23 (7), 1631 (2018).
  12. Yuann, J. M. P., et al. A study of catechin photostability using photolytic processing. Processes. 9 (2), 293 (2021).
  13. Yuann, J. M. P., Wang, J. S., Jian, H. L., Lin, C. C., Liang, J. Y. Effects of Clinacanthus nutans (Burm. f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction. MC-Transaction on Biotechnology. 4 (1), 45-59 (2012).
  14. Rineh, A., et al. Attaching NorA efflux pump inhibitors to methylene blue enhances antimicrobial photodynamic inactivation of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii in vitro and in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 28 (16), 2736-2740 (2018).
  15. Dai, T., et al. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  16. Nitzan, Y., Ashkenazi, H. Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli B by a cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology. 42 (6), 408-414 (2001).
  17. Tseng, C. C., et al. Altered susceptibility to the bactericidal effect of photocatalytic oxidation by TiO2 is related to colistin resistance development in Acinetobacter baumannii. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (19), 8549-8561 (2016).
  18. Boluki, E., et al. Antimicrobial activity of photodynamic therapy in combination with colistin against a pan-drug resistant Acinetobacter baumannii isolated from burn patient. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 18, 1-5 (2017).
  19. Yang, M. Y., et al. Blue light irradiation triggers the antimicrobial potential of ZnO nanoparticles on drug-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 180, 235-242 (2018).
  20. Code of Federal Regulations. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2009-title21-vol6/pdf/CFR-2009-title21-vol6-sec582-5695.pdf (2022).
  21. Lu, C. Y., et al. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 52 (1-3), 111-116 (1999).
  22. Sato, K., et al. The primary cytotoxicity in ultraviolet-a-irradiated riboflavin solution is derived from hydrogen peroxide. The Journal of Investigative Dermatology. 105 (4), 608-612 (1995).
  23. Tripathi, A. K., et al. Attenuated neuroprotective effect of riboflavin under UV-B irradiation via miR-203/c-Jun signaling pathway in vivo and in vitro. Journal of Biomedical Science. 21 (1), 39 (2014).
  24. Liang, J. Y., et al. Blue light induced free radicals from riboflavin on E. coli DNA damage. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 119, 60-64 (2013).
  25. Ottaway, P. B. The Technology of Vitamins in Food. , Chapman and Hall. London. Ch. 5 233-244 (1993).
  26. Kumar, V., et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology. 80 (1), 15-21 (2004).
  27. Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K., Kawanishi, S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5'site of 5'-GG-3'sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13221-13227 (1993).
  28. Liang, J. Y., Yuann, J. M. P., Hsie, Z. J., Huang, S. T., Chen, C. C. Blue light induced free radicals from riboflavin in degradation of crystal violet by microbial viability evaluation. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 174, 355-363 (2017).
  29. Yang, M. Y., Chang, C. J., Chen, L. Y. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 173, 325-332 (2017).
  30. Cui, Z., Huang, Y., Mo, Q., Wang, X., Qian, K. Inactivation of lymphocytes in blood products using riboflavin photochemical treatment with visible light. Photochemistry and Photobiology. 84 (5), 1195-1200 (2008).
  31. Wong, T. W., Cheng, C. W., Hsieh, Z. J., Liang, J. Y. Effects of blue or violet light on the inactivation of Staphylococcus aureus by riboflavin-5′-phosphate photolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 173, 672-680 (2017).
  32. Russell, L. F., Vanderslice, J. T. Comprehensive review of vitamin B2 analytical methodology. Journal of Micronutrient Analysis. 8, 257-310 (1990).
  33. Cheng, C. W., Chen, L. Y., Chou, C. W., Liang, J. Y. Investigations of riboflavin photolysis via coloured light in the nitro blue tetrazolium assay for superoxide dismutase activity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 148, 262-267 (2015).
  34. Huang, S. T., et al. Effects of 462 nm light-emitting diode on the inactivation of Escherichia coli and a multidrug-resistant by tetracycline photoreaction. Journal of Clinical Medicine. 7 (9), 278 (2018).
  35. Barua, M. G., Escalada, J. P., Bregliani, M., Pajares, A., Criado, S. Antioxidant capacity of (+)-catechin visible-light photoirradiated in the presence of vitamin B2. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 22 (6), 282-289 (2017).
  36. Castillo, C., Criado, S., Díaz, M., García, N. A. Riboflavin as a sensitiser in the photodegradation of tetracyclines. Kinetics, mechanism and microbiological implications. Dyes and Pigments. 72 (2), 178-184 (2007).
  37. Huvaere, K., Sinnaeve, B., Van Bocxlaer, J., Skibsted, L. H. Flavonoid deactivation of excited state flavins: reaction monitoring by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (36), 9261-9272 (2012).
  38. Massad, W. A., Bertolotti, S., Garcia, N. A. Kinetics and mechanism of the vitamin B2-sensitized photooxidation of isoproterenol. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 428-433 (2004).
  39. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 285 (2), 227-232 (2008).
  40. Huang, S. T., et al. The influence of the degradation of tetracycline by free radicals from riboflavin-5'-phosphate photolysis on microbial viability. Microorganisms. 7 (11), 500 (2019).
  41. Maisch, T., et al. Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLoS One. 9 (12), 111792 (2014).
  42. Grijzenhout, M., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage. British Journal of Haematology. 83 (4), 627-632 (1993).

Tags

Bioengineering udgave 182 FMN fotolyse ROS S. aureus violet lys
Inaktivering af patogener <em>via</em> fotolyse i synligt lys af riboflavin-5′-phosphat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T.… More

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter