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Bioengineering

Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para inativar bactérias patogênicas com espécies reativas de oxigênio produzidas durante a fotólise do mononucleotídeo de flavina (FMN) sob irradiação de luz azul e violeta de baixa intensidade. A fotólise FMN demonstra ser um método simples e seguro para processos sanitários.

Abstract

Riboflavina-5'-fosfato (ou mononucleotídeo de flavina; FMN) é sensível à luz visível. Vários compostos, incluindo espécies reativas de oxigênio (ROS), podem ser gerados a partir da fotólise FMN após irradiação com luz visível. As EROs geradas a partir da fotólise da FMN são prejudiciais aos microrganismos, incluindo bactérias patogênicas como Staphylococcus aureus (S. aureus). Este artigo apresenta um protocolo para a desativação de S. aureus, como exemplo, via reações fotoquímicas envolvendo FMN sob irradiação de luz visível. O ânion radical superóxido () gerado durante a fotólise da FMN é avaliado através da redução do tetrazólio azul nitro (Equation 1NBT). A viabilidade microbiana de S. aureus que é atribuída a espécies reativas Equation 1 foi utilizada para determinar a efetividade do processo. A taxa de inativação bacteriana é proporcional à concentração de FMN. A luz violeta é mais eficiente na inativação de S. aureus do que a irradiação de luz azul, enquanto a luz vermelha ou verde não impulsiona a fotólise FMN. O presente artigo demonstra a fotólise da NMF como um método simples e seguro para processos sanitários.

Introduction

A riboflavina-5′-fosfato (FMN) é formada por fosforilação na posição 5′ da riboflavina 5′ da cadeia lateral do ribitil e é necessária por todas as flavoproteínas para numerosos processos celulares para gerar energia. Também desempenha o papel de vitamina para algumas funções no corpo humano1. A FMN é aproximadamente 200 vezes mais solúvel em água do que a riboflavina2.

A inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI) de bactérias é uma forma eficiente de controlar a resistência às bactérias 3,4, pois não depende do modo de resistência bacteriana. Clinicamente, a aPDI é utilizada no tratamento de infecções de tecidos moles, a fim de diminuir a infecção da pele nosocomial devido a bactérias multirresistentes 5,6,7,8,9. O aPDI também produz morte celular através da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). EROs, como radicais superóxidos (), oxigênio singlete, radicais hidroxila (Equation 1•OH) e radicais peroxila, são radicais livres ou moléculas que contêm oxigênio reativo 10,11,12 e são normalmente reativas 13. Semelhante ao dano ao DNA causado pelas EROs, a peroxidação da membrana e a destruição das células endoteliais também são reações bioquímicas adversas que são atribuídas às ERO nas células12.

O uso de aPDI para bactérias patogênicas envolve uma fonte de luz visível ou UV para inativar microrganismos na presença de compostos químicos, como cloreto de metiltionina 14, conjugado PEI-c e6 15, porfirina16, dióxido de titânio17, azul de toluidina O 18 e nanopartículas de óxido de zinco 19. O azul de toluidina O e o azul de metileno são corantes fenotiazinium e o azul de metileno tem propriedades tóxicas. As nanopartículas de óxido de zinco e a irradiação UV estão ligadas a efeitos adversos à saúde e ao meio ambiente. Como tal, a exploração de um fotossensibilizador confiável, seguro e simples via fotólise sob irradiação visível merece um estudo mais aprofundado.

O micronutriente, riboflavina ou FMN, não é tóxico e é de fato usado para fabricação de alimentos ou alimentação20. Tanto a NMF quanto a riboflavina são altamente sensíveis à irradiação luminosa2. Sob irradiação UV 1,2,21,22,23 e luz azul 10,24, estes dois compostos atingem um estado excitado. A riboflavina ativada ou FMN que é produzida pela fotólise é promovida ao seu estado tripleto e as EROs são geradas simultaneamente 2,25. Kumar et al. relataram que a riboflavina ativada pela luz UV causa seletivamente aumento da lesão da porção guanina do DNA em microrganismos patogênicos26. Sob irradiação por luz UV, a riboflavina fotodinamicamente ativada é demonstrada para promover a geração de 8-OH-dG, que é um biomarcador para estresse oxidativo, no DNA de fita dupla27. Relata-se que S. aureus e E. coli são desativados por ERO durante a fotólise de riboflavina ou FMN 10,24,28. Um estudo prévio dos autores mostrou que as reações fotolíticas envolvendo riboflavina e FMN reduzem o violeta cristal, um corante triarilmetano e um agente antibacteriano que gera Equation 1, e eliminam a maior parte da capacidade antimicrobiana do violeta cristal28. Quando o dinucleotídeo de flavina adenina ou FMN é irradiado por luz azul, as EROs resultantes produzem apoptose em células HeLa para seu envenenamento in vitro29. Utilizando tratamento fotoquímico na presença de riboflavina, Cui et al. inativaram linfócitos inibindo sua proliferação e produção de citocinas30.

A fotólise da riboflavina é utilizada para a inativação do patógeno sanguíneo por UV 10,24, mas os componentes sanguíneos podem ser prejudicados sob irradiação de luz UV30. Também é relatado que as plaquetas expostas aos raios UV melhoram progressivamente o desempenho dos marcadores de ativação P-selectina e LIMP-CD63 em suas membranas. A citotoxicidade dos raios UV e da irradiação de alta intensidade precisa ser investigada e um fotossensibilizador que seja descomplicado e seguro durante uma fotorreação FMN envolvendo luz visível seria de grande utilidade.

A luz de comprimentos de onda mais curtos tem mais energia e é muito mais provável que cause danos graves às células. No entanto, na presença de um fotossensibilizador adequado, a irradiação com luz violeta de baixa intensidade pode inibir microrganismos patogênicos. A fotossensibilização e a geração de FMN quando irradiadas com luz violeta são, portanto, importantes para estudar, a fim de determinar a via pela qual as EROs da fotólise da FMN aumentam a inativação de Equation 1 bactérias.

O controle antimicrobiano é um problema comum e o desenvolvimento de novos antibióticos frequentemente leva décadas. Após a irradiação com luz violeta, a fotoinativação que é intermediada pelo FMN pode aniquilar bactérias patogênicas ambientais. Este estudo apresenta um protocolo antimicrobiano eficaz in vitro utilizando luz violeta para conduzir a fotólise da FMN e, assim, gerar Equation 1 para aPDI. A viabilidade microbiana de S. aureus é usada para determinar a viabilidade da aPDI induzida por FMN.

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Protocol

1. Configuração do sistema de fotólise

  1. Montar seis diodos emissores de luz (LED) (DC 12 V) no interior de um copo plástico opaco (8 cm x 7 cm), como mostra a Figura 1 , para estabelecer um sistema de fotólise31.
  2. Adicionar reagentes (ver abaixo) aos tubos de ensaio de vidro (13 mm de diâmetro e 100 mm de altura) e fixar os tubos na parte superior do copo, como mostra a figura 1. Colocar a instalação experimental numa sala com uma temperatura constante de 25 ± 3 °C.
  3. Monitorar e registrar a temperatura das unidades de teste ao longo das reações fotolíticas por um termômetro infravermelho.
    NOTA: A Figura 2 mostra os espectros de emissão para as luzes azul, verde, vermelha e violeta, conforme registrado usando um espectrômetro óptico UV-Vis calibrado. Os comprimentos de onda correspondentes ao máximo de absorvância para as luzes LED azul, verde, vermelha e violeta utilizadas no estudo são 465, 529, 632 e 405 nm, respectivamente. Os chips LED podem aquecer o aparelho durante experimentos de irradiação. Todo o sistema fotorreativo em cada experimento foi, portanto, colocado em uma sala onde a temperatura foi mantida constante a 25 ± 3 °C.

2. O efeito do comprimento de onda da luz na fotólise da FMN (Figura 3)

  1. Preparar uma solução de FMN 0,1 mM em tampão fosfato de potássio (PB) de 100 mM (pH 7,8). Expor amostras de FMN (3 mL cada) à luz azul, verde, vermelha ou violeta a uma intensidade de 10 W/m2 por 5 min. Manter 3 ml de solução de FMN no escuro como controlo.
  2. Registar a absorvância de amostras de FMN irradiadas na gama de 250-750 nm utilizando um espectrofotómetro UV/visível.

3. Método de redução do tetrazólio azul nitro (NBT) para detecção Equation 1 (Figura 4).

NOTA: O método de redução de NBT aqui utilizado foi ligeiramente modificado a partir do ensaio para fotorreação de riboflavina. O método de redução do NBT é utilizado para avaliar o nível de geração da Equation 1 fotólise da FMN. O FMN fotoquimicamente excitado é primeiro reduzido pela L-metionina em uma semiquinona, que então doa um elétron ao oxigênio, dando origem a Equation 131. O as-generated Equation 1 reduz o NBT a formazan, que tem uma absorvância característica a 560 nm32.

  1. Adicionar 109,3 mg de L-metionina a 73,3 mL de PB (100 mM; pH 7,8). Vórtice a solução para dissolver a L-metionina.
  2. Após a L-metionina estar totalmente dissolvida, adicionar 10 mg de NBT em pó e 1,53 ml de 0,117 mM FMN à solução. Para cada 1 mL da solução de reação (ou seja, uma mistura de FMN, L-metionina e NBT) aplicada, as concentrações finais de FMN, metionina e NBT são 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M e 1,6 x 10-4 M, respectivamente.
  3. Expor a solução de reação (1 mL) à irradiação de luz LED azul ou violeta a 10 W/m2 por 1-5 min.
  4. Detectar a espécie (a partir da absorbância a Equation 1 560 nm) produzida pela reação fotoquímica, que reduz o NBT e produz formazan.

4. Viabilidade de S. aureus após fotólise de FMN (Figura 5)

  1. Transmitir uma colônia de S. aureus (BCRC 10451) de uma placa cultivada em 10 mL de caldo de lisogenia tomado em um tubo de ensaio com tampa de rosca de 15 mL. Cultura em agitador a 37 °C durante 16 h.
  2. Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicionar água esterilizada no tubo de centrífuga para diluir a cultura a uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm (OD600) (~6 x 107 UFC/mL).
  3. Transferir 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, centrifugar a 14.000 x g por 10 min e decantar o sobrenadante para obter um pellet celular.
  4. Adicionar 1 mL de solução tamponada com FMN (30, 60 e 120 μM de FMN em PB) aos pellets celulares obtidos como na etapa 4.3 e vórtice. Para controle irradiado, adicione 1 mL de PB sozinho.
  5. Transferir 1 mL de cada uma das soluções viáveis de células bacterianas contendo 30 μM FMN e PB isoladamente para tubos de vidro e irradiá-las com luz violeta a 10 W/m2 por 30 min.
  6. Transfira 1 mL de cada uma das soluções viáveis de células bacterianas contendo 30, 60 e 120 μM FMN e PB isoladamente para tubos de vidro e irradie-as com luz azul a 20 W/m2 por 120 min. Coloque outro tubo de vidro com 1 mL de solução de células bacterianas viáveis contendo 120 μM de FMN e irradie-o com luz azul a 20 W/m2 por 60 min.
  7. Configure os tubos de ensaio conforme descrito nas etapas 4.5 e 4.6 e cubra-os com folhas grossas de alumínio. Esses tubos servem como controles escuros.
  8. Mantenha a câmara de irradiação (bem como os controles escuros) em uma câmara fria a 9 ± 1 °C durante o período de irradiação de 30-120 minutos.
    NOTA: O calor liberado pelas luzes LED não pode ser ignorado, pois os chips LED colocados dentro do copo podem aquecer o sistema de fotorreação durante os experimentos de irradiação. Os experimentos foram, portanto, conduzidos em câmara fria mantida a 9 ± 1 °C.
  9. Após irradiação, transfira 0,2 mL de cada uma das soluções de reação para uma placa de ágar Luria (LA). Espalhe as bactérias sobre a placa por uma haste de vidro em forma de L e incube durante a noite a 37 °C.
  10. Calcular a contagem de placas viáveis e as taxas de inativação de S. aureus após o crescimento noturno.
    NOTA: A taxa de inativação de S. aureus é calculada como a porcentagem de redução, que é igual a [1 -I / D] ×100%, onde I e D denotam, respectivamente, o número de UFCs na amostra irradiada e o controle escuro. A redução percentual é definida como um valor negativo da taxa de inativação.

5. Detecção de Equation 1 em S. aureus (Figura 6)

  1. Prepare as amostras de S. aureus conforme descrito na etapa 4.
  2. Diluir a densidade bacteriana das amostras com água esterilizada para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 UFC/mL). Transfira 0,5 mL da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min e decantar o sobrenadante para obter um pellet celular.
  3. Adicione 0,1093 g de L-metionina, 0,1 g de NBT e 25 mL de FMN (400, 240 ou 120 μM) a 75 mL de PB. Para cada 1 mL do reagente aplicado, as concentrações finais de FMN, metionina e NBT são 100 (60 ou 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M e 1,2 x 10-3 M, respectivamente.
  4. Adicionar 1 ml de cada solução reagente (isto é, com concentrações variáveis de FMN) aos pellets celulares obtidos como na etapa 5.2. Irradiar as soluções por luz violeta a 10 W/m2 durante 10 min.
  5. Centrifugar a mistura a 14.000 x g durante 10 min e decantar o sobrenadante. Ressuscite o pellet em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para extrair o NBT reduzido. Detectar as espécies produzidas Equation 1 a partir da absorbância a 560 nm.

6. Análise estatística

  1. Expresse os dados como média ± desvio padrão (DP) de três testes independentes.
  2. Aplicar um teste t homocedástico de duas amostras para avaliar se duas medidas são diferentes. Valores de p < 0,05 são considerados estatisticamente significativos.

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Representative Results

Efeito do comprimento de onda da luz no FMN
Os espectros de absorbância de 0,1 mM FMN que são irradiados usando LEDs azuis, verdes, vermelhos e violetas são mostrados na Figura 3. Existem dois picos para FMN (372 nm e 444 nm) para o controle escuro. A luz verde e vermelha não tem efeito porque as mudanças nos espectros são insignificantes. Por outro lado, a respectiva absorvância da FMN a 444 nm é reduzida em cerca de 19% e 34%, respectivamente, após irradiação de luz azul e violeta a 10 W/m2 por 5 min, sugerindo que a irradiação com luz azul/violeta aumenta a fotólise da FMN.

Detecção de Equation 10 de FMN que é irradiado usando luz azul ou violeta
A redução do NBT foi utilizada para determinar a formação de Equation 132. O FMN é altamente sensível à luz visível e UV, mesmo por curtos períodos de radiação. Equation 1 é formado a partir das reações fotoquímicas intermediárias durante a fotólise da FMN. A Figura 4 mostra que o efeito fotoquímico da RNF na redução do NBT depende do tempo de irradiação, como Equation 1 é formado a partir do NMF exposto à irradiação de luz azul ou violeta de forma dependente do tempo. O efeito fotolítico médio da luz azul e da luz violeta é, no entanto, semelhante ao mostrado na Figura 4.

Efeito da fotólise da FMN na viabilidade de S. aureus
O efeito da NMF exposta à irradiação de luz violeta ou azul sobre a viabilidade de S. aureus foi determinado. A fotólise FMN usando irradiação de luz azul ou violeta resulta em inativação significativa de S. aureus. Quanto maior a concentração de FMN, maior a taxa de inativação de S. aureus que é exposto à irradiação de luz azul a 20 W/m2 por 120 min, como mostra a Figura 5A. Taxas de inativação de 26%, 39%, 43% e 97% foram alcançadas para S. aureus usando 0, 30, 60 e 120 μM FMN, respectivamente, sob irradiação de luz azul de 20 W/m2 por 120 min. Como mostrado na Figura 5A, não há diferença significativa (p-valor = 0,20) na taxa de inativação de S. aureus usando irradiação de luz azul com FMN de 60 μM a 20 W/m 2 por 120 min (dose de energia, 14,4 J/cm 2) ou 120 μM FMN a 20 W/m 2 por 60 min (dose de energia, 7.2 J/cm2). Por outro lado, como mostra a Figura 5B, taxas de inativação de 53% e 96% foram alcançadas para S. aureus sem e com 30 μM de FMN, respectivamente, sob irradiação de luz violeta a 10 W/m 2 por 30 min (dose de energia de 1,8 J/cm2). Portanto, a FMN exposta à irradiação de luz azul ou violeta tem um efeito maior na viabilidade de S. aureus, aumentando a inativação bacteriana. A FMN tratada com irradiação de luz violeta é mais eficiente na inativação de S. aureus.

Detecção de Equation 10 em S. aureus tratado com FMN sob irradiação de luz violeta
A produção de S. aureus em FMN tratada sob irradiação de luz violeta foi determinada pelo método de Equation 1 redução do NBT. O valor de absorbância a 560 nm foi utilizado para avaliar a extensão da Equation 1 produção. O efeito fotoquímico da FMN sobre Equation 1 a geração em S. aureus é proporcional à concentração de FMN (Figura 6). Os valores de absorbância de 560 nm para S. aureus sem tratamento com FMN são 0,31 e 0,07 sob irradiação de luz violeta de 10 W/m2 por 10 min e no escuro, respectivamente (Figura 6). Isso sugere que pouco Equation 1 foi produzido em S. aureus não tratado após irradiação de luz violeta. Os respectivos valores de absorbância de 560 nm para S. aureus tratados com 100 μM de FMN são 1,36 e 0,08 sob irradiação de luz violeta de 10 W/m2 por 10 min e no escuro, respectivamente. Portanto, o efeito fotoquímico na redução do NBT em S. aureus tratado com FMN aumenta sob irradiação violeta, como Equation 1 é produzido abundantemente.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do sistema de fotorreação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Os espectros de emissão de luzes LED azuis, verdes, vermelhas e violetas neste estudo. Os máximos de emissão para as luzes azul, verde, vermelha e violeta estão em 465, 529, 632 e 405 nm, respectivamente, e as larguras espectrais a meia altura (W1/2) são 26, 31, 14 e 12 nm, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectros de absorbância de FMN tratados com LEDs de vários comprimentos de onda a 10 W/m2 por 5 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Redução de NBT para determinar o efeito da irradiação de luz azul e violeta a 10 W/m2 por 1-5 min na fotólise FMN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Efeito da fotólise da FMN sobre a viabilidade de S. aureus. A redução percentual é definida como um valor negativo da taxa de inativação para S. aureus tratado com (A) FMN sob irradiação de luz azul a 20 W/m2 por 120 min e (B) FMN sob irradiação de luz violeta a 10 W/m2 por 30 min. Note-se que não há diferença significativa (p = 0,20) na taxa de inativação para S. aureus usando 60 μM FMN a 20 W/m 2 irradiação de luz azul por 120 min ou 120 μM FMN a 20 W/m2 irradiação de luz azul por 60 min (A). Os resultados são expressos como média ± DP, onde n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Efeito da concentração de FMN na Equation 10 geração em S. aureus submetido à irradiação de luz violeta a 10 W/m2 por 10 min. No geral, pouco Equation 1 é produzido em S. aureus na ausência de FMN, embora a irradiação da luz violeta aumente Equation 1 ligeiramente na amostra irradiada (PB (luz violeta)) em relação ao controle escuro (PB (Escuro)). Os resultados são expressos como média ± DP, onde n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um fotossensibilizador aumenta a reação fotoquímica de compostos químicos para gerar EROs. Microrganismos patogênicos podem ser inativados por irradiação de luz na presença de fotossensibilizadores. Este estudo determina a aPDI de S. aureus devido a EROs geradas pela irradiação de luz violeta de um fotossensibilizador exógeno, o FMN.

Como mostrado na Figura 3, para FMN, a absorbância a 444 nm é reduzida significativamente após 5 min de irradiação usando luz violeta ou azul e não há alteração significativa na absorvância de FMN sob irradiação com luz verde ou vermelha. A redução de NBT é utilizada para determinar a formação de um processo de transferência de Equation 1 carga10,33. Um estudo anterior dos autores usou FMN sob irradiação de luz azul, verde ou vermelha para determinar a formação do uso de redução de Equation 1 NBT. A irradiação da luz azul produz uma enorme quantidade de luz enquanto a eficiência fotolítica da luz verde e vermelha é inferior a 3% da Equation 1 alcançada pela luz azul10. Esses resultados mostram que um processo de transferência de carga é produzido quando o FMN é exposto à irradiação de luz azul ou violeta e que não há mudança significativa na irradiação por luz verde ou vermelha.

Estudo prévio dos autores34 mostrou que o mecanismo de fotólise da FMN pode ser descrito com reações fotolíticas primárias da FMN (Equação 1):

Equation 2 (1),

onde 1FMN* e 3FMN* são os estados singlete e tripleto do FMN excitado, respectivamente. Os mecanismos de reação fotolítica para essas FMN fotoinduzidas são possivelmente iniciados por uma aniquilação de tripleto-triplo ou um processo de têmpera em estado fundamental de trigêmeos35,36,37,38. O estado fundamental do FMN (FMN0) é um doador de elétrons que fornece um elétron a 3FMN* e gera as formas semi-reduzida (FMN•-) e semi-oxidada (FMN•+), como mostrado na Equação 2

Equation 3 (2)

As vias de fotodegradação para FMN resultam da fotossensibilização. O FMN é promovido ao estado eletronicamente excitado, FMN•, através de uma reação fotolítica e, em seguida, um FMN neutro é reduzido quando o FMN• perde um elétron, como mostrado nas Equações 3-8 abaixo:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

onde FMN•+ é uma espécie de cátion radical.

A interação de FMN•- com O2 (3Σg-) produz o radical superóxido reativo, , seguido pelo radical hidroperoxila, HOO•, Equation 1que é gerado na reação entre Equation 1 e um próton e eventualmente leva à degradação de FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

onde FMN•- é um ânion radical.

No presente estudo, na ausência de NMF, a taxa de inativação no caso de S. aureus é de 53% sob irradiação de luz violeta a 10 W/m 2 por 30 min e de 26% sob irradiação de luz azul a 20 W/m2 por 120 min, sugerindo que a irradiação de luz azul desativa menos bactérias do que a luz violeta (Figura 5). Foi relatado anteriormente que a irradiação em comprimentos de onda superiores a 430 nm sem um fotossensibilizador exógeno não inativa as células de S. aureus, embora as porfirinas em S. aureus tenham uma absorvância máxima a 405 ± 5 nm e causem inativação bacteriana após irradiação39.

Estudo prévio dos presentes autores mostrou que E. coli e S. aureus são desativadas por clivagem do DNA que é induzida pela formação de através da fotólise da riboflavina ou FMN10,24,40. As respectivas taxas de inativação para S. aureus são de 97% e 96%, respectivamente, utilizando-se FMN de 120 μM sob irradiação de luz azul de20 W/m 2 (dose de energia de 14,4 J/cm 2) por 120 min e FMN de 30 μM sob irradiação de luz violeta de 10 W/m 2 (dose de energia de 1,8 J/cm 2) por 30 min (Figura 5). Portanto, a irradiação de luz violeta é mais eficaz na desativação de S. aureus, pois doses de baixa energia de luz violeta podem desativar S. aureus na presença de concentrações mais baixas de FMN e períodos de iluminação mais curtos em comparação com a luz azul. Embora a extensão da fotólise da FMN alcançada pela luz violeta seja maior em comparação com a luz azul (Figura 3), os efeitos fotolíticos médios da FMN na redução da NBT sob irradiação de luz azul e violeta são semelhantes (Figura 4).

E. coli é uma bactéria Gram-negativa comum. A fotólise de riboflavina ou FMN por irradiação de luz azul inativa E. coli via ROS 10,24,41 com uma taxa de inativação de 96% quando se utiliza FMN 10,24. S. aureus, por outro lado, é uma bactéria Gram-positiva, que é efetivamente inativada pela fotólise da FMN sob irradiação de luz violeta, como demonstrado aqui (Figura 5). Portanto, a reação fotolítica FMN sob irradiação de luz azul ou violeta pode produzir ROS e inativar bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.

Na ausência de FMN, no entanto, pouco Equation 1 é produzido em S. aureus que é exposto à irradiação de luz violeta (Figura 6); portanto, fotossensibilizadores endógenos diminuem apenas ligeiramente a viabilidade de S. aureus sob irradiação de luz violeta, em comparação com o efeito na presença de fotossensibilizadores exógenos como o FMN. Sob as mesmas condições, o FMN que é exposto à irradiação de luz violeta diminui a viabilidade do S. aureus para resultar em uma taxa de inativação de 96%, que é muito maior do que a dos fotossensibilizadores intracelulares endógenos sozinhos. A produção de S. aureus tratado com FMN sob irradiação de Equation 1 luz violeta aumentou significativamente, como mostra a Figura 6. Estes resultados mostram que a FMN quando exposta à irradiação de luz violeta causa um nível elevado de inativação bacteriana.

O FMN pode atingir um estado foto-excitado quando irradiado usando UV 1,2,21,22,23, azul 10,24 e luz violeta 31; no entanto, a citotoxicidade causada pela radiação UV e pela irradiação de comprimento de onda curto de alta intensidade deve ser considerada42. Por outro lado, radiações vermelhas e verdes com comprimentos de onda mais longos não produzem quantidades significativas de EROs durante a fotólise da NMF10. Portanto, o aPDI induzido por ROS de S. aureus requer a irradiação de FMN com luz violeta que tem um comprimento de onda intermediário. A largura espectral a meia altura (W1/2) para a luz violeta deve ser estreita para evitar qualquer sobreposição com a absorção UV e inibir o risco devido à radiação UV31. O micronutriente, FMN, é como tal inofensivo, sendo uma vitamina essencial para o corpo humano. Usando um fotossensibilizador apropriado, como o FMN, a irradiação de luz violeta de baixa energia pode suprimir bactérias patogênicas, fornecendo um meio seguro e eficaz do processo sanitário. Além da reação fotolítica da FMN em S. aureus, outras questões merecem maior investigação, como a fototoxicidade da FMN em micróbios, decorrente do estresse causado por Equation 1 , que pode ser estudada usando uma técnica de RNA-seq juntamente com qPCR.

A fotólise de FMN via irradiação de luz violeta leva à oxidação fotoquímica pela qual as EROs são geradas e, por sua vez, aumenta a inativação de bactérias patogênicas. O uso da luz violeta é considerado um passo crítico na fotodecomposição da FMN. A limitação da técnica atual é que o intervalo de comprimento de onda da luz violeta deve ser bastante estreito para evitar o risco devido à irradiação UV. O método atual tem o potencial para futuras aplicações médicas, como o tratamento de infecções da pele superficial, juntamente com tecidos subcutâneos profundos ou músculos, inserindo uma fibra óptica para direcionar a luz violeta para as áreas infectadas. O tratamento fotoquímico usando FMN é, portanto, uma maneira segura e simples de garantir práticas de higiene eficazes.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores são gratos ao Dr. Tak-Wah Wong e ao Sr. Zong-Jhe Hsieh por seu apoio com experimentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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References

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Bioengenharia Edição 182 FMN fotólise ROS S. aureus luz violeta
Inativação de Patógenos <em>via</em> Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato
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