Summary
Hier beschrijven we een nieuwe, snelle techniek voor het modelleren van open ruggenmergletsel bij ratten die laminectomie elimineert. Laterale hemisectie wordt uitgevoerd terwijl u door een microscoop kijkt. De techniek is veelzijdig en kan ook worden gebruikt in de cervicale, thoracale en lumbale regio's van het ruggenmerg van andere dieren.
Abstract
Open dwarslaesietechnieken die snijwondachtige verwondingen modelleren, zijn tijdrovend en invasief omdat ze laminectomie met zich meebrengen. Deze nieuwe techniek elimineert laminectomie door twee processus spinosus te verwijderen en de staartwervelboog op te tillen en vervolgens te kantelen. Het operatiegebied gaat open zonder dat laminectomie nodig is. Laterale hemisectie wordt vervolgens uitgevoerd met directe zichtbare controle onder een microscoop. Het trauma wordt geminimaliseerd en er is slechts een kleine botwond nodig.
Deze techniek heeft verschillende voordelen: het is sneller en dus minder belastend voor het dier, en de botwond is kleiner. Omdat de laminectomie wordt geëlimineerd, is er minder kans op ongewenst letsel aan het ruggenmerg en zijn er geen botsplinters die problemen kunnen veroorzaken (botsplinters ingebed in het ruggenmerg kunnen zwelling en secundaire schade veroorzaken). Het wervelkanaal blijft intact. De belangrijkste beperking is dat de hemisectie alleen in de tussenwervelruimten kan worden uitgevoerd.
De resultaten tonen aan dat deze techniek veel sneller kan worden uitgevoerd dan de traditionele chirurgische aanpak, met behulp van laminectomie (11 min vs. 35 min). Deze techniek kan nuttig zijn voor onderzoekers die werken met diermodellen van open ruggenmergletsel, omdat het op grote schaal aanpasbaar is en geen extra gespecialiseerde instrumenten vereist.
Introduction
Ruggenmergletsels (SCI's) komen helaas veel voor bij mensen. SCI's kunnen op verschillende manieren gecompliceerd worden, bijvoorbeeld door infecties, en het is klinisch belangrijk om deze verwondingen te bestuderen1. Omdat er geen enkele, definitieve remedie voor dwarslaesie is, zijn diermodellen nog steeds nodig om het begrip van onderzoekers te vergroten en mogelijke behandelingen te bevorderen 2,3. Hoewel gesloten verwondingen meestal worden gemodelleerd (compressie en kneuzing), is het klinisch belangrijk om snijwonden te begrijpen, die alleen kunnen worden gemodelleerd bij open verwondingen4. Open wondmodellen met behulp van transsectie of hemisectie kunnen worden gebruikt om een nauwkeurigere lokalisatie van een wond aan te tonen in vergelijking met gesloten letselmodellen, vanwege de aard van het letsel (kneuzing versus chirurgische snede). Open-wound experimenten kunnen op een gecontroleerde, betrouwbare en reproduceerbaremanier licht werpen op meer specifieke neuronale verwondingen. De volledige of gedeeltelijke doorsnede van het ruggenmerg is een veelgebruikte open-wondtechniek en kan in detail worden bekeken in het artikel van Brown en Martinez6.
Bij het bestuderen van open dwarslaesie bij ratten vertoonden verschillende dieren problemen die voortkwamen uit de operatie: botsplinters van de laminectomie werden ingebed in het ruggenmerg en veroorzaakten zwelling; de grotere botwond had veel tijd nodig om te genezen; De operatie duurde te lang. Er werd een alternatieve chirurgische techniek ontwikkeld om deze problemen op te lossen. Het doel was om een snellere techniek te ontwikkelen die zachter is voor het dier. Deze nieuw ontwikkelde techniek is veel sneller dan traditionele dwarslaesietechnieken. De chirurgische benadering is minimaal invasief, wat resulteert in een kleinere botwond en tegelijkertijd problemen als gevolg van de laminectomie elimineert.
Bij alle open-wondtechnieken wordt de dura7 geopend. Verschillende recente studies hebben verschillende, nieuw ontwikkelde technieken onderzocht, met als doel de vorige methoden te verbeteren 8,9. Hoewel het openen van de dura met deze nieuwe techniek niet kan worden uitgesloten, veroorzaakt het een kleinere wond op de dura en biedt het een betrouwbaar, gecontroleerd letsel aan het ruggenmerg. Bij het raadplegen van de literatuur over dwarslaesietechnieken probeerden veel auteurs de tijd van de operatie te minimaliseren door kleine wijzigingen aan te brengen in de oorspronkelijke techniek10. Laminectomie maakt altijd deel uit van deze chirurgische ingrepen, hoewel het tijdrovend is en een grotere botwond vereist6. Deze chirurgische techniek kan geschikt zijn voor onderzoekers die modellen voor ruggenmergletsel met open wonden gebruiken, met name volledige transsectie of laterale hemisectie die wordt uitgevoerd in de tussenwervelruimten (Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de EU-richtlijn (2010/63/EU) en zijn goedgekeurd door de dierethische commissie van het Hongaarse Nationale Bureau voor de veiligheid van de voedselketen (PEI/001/2894-11/2014). Alle geldende institutionele en overheidsvoorschriften met betrekking tot het ethisch gebruik van dieren werden tijdens dit onderzoek gevolgd.
1. Voorbereiding voor de operatie
- Steriliseer alle instrumenten die tijdens de procedure worden gebruikt (zie de materiaaltabel) en desinfecteer de oppervlakken waar het werk moet worden uitgevoerd voorafgaand aan de procedure.
- Injecteer profylactisch een enkele dosis subcutane antibiotica.
NOTITIE: Zie de materiaaltabel voor details over de dosering van antibiotica. - Laat de dieren 1 uur in de operatiekamer om ze te laten acclimatiseren en hun stress voorafgaand aan de operatie te verminderen.
- Verdoof de rat via een intramusculaire injectie van een combinatie van ketamine en xylazine (ketamine 80 mg/kg lichaamsgewicht (lg) en xylazine 8 mg/kg lg).
OPMERKING: Naast anesthesiebiedt de combinatie k etamine-xylazine voldoende analgesie voor deze procedure. Het analgesieregime kan worden aangepast volgens de institutionele richtlijnen voor diergebruik. - Houd de rat warm tijdens de procedure met behulp van een verwarmde tafel of infrarood licht en houd de ogen vochtig tijdens de anesthesie met oogzalf (indien nodig opnieuw aanbrengen).
- Fixeer het dier op de operatietafel met behulp van chirurgische tape op de voor- en achterpoten en staart en, afhankelijk van de plaats van verwonding, ook op de nek. Plaats de rat indien nodig in een stereotaxisch frame om hem tijdens de operatie te stabiliseren.
- Plaats met behulp van een steriele chirurgische hechting een lus om de bovenste voortanden van de rat en fixeer deze op de rand van de operatietafel.
- Trek de tong zijwaarts naar buiten voor luchtwegbeheer.
- Scheer de vacht op de rug, minimaal 2 cm in elke richting van waar de incisie zal worden gemaakt.
- Desinfecteer de huid van het operatiegebied ten minste drie keer met een povidon-jodiumoplossing en steriel gaas. Wees extra voorzichtig om de vacht rond het gebied te laten weken. Zet de operatieplaats vast met een steriel laken.
- Beoordeel de geschiktheid van de anesthesie voordat u de eerste incisie plaatst door in de tenen en de staart van het dier te knijpen. Blijf de geschiktheid van de anesthesie gedurende de hele procedure controleren.
2. Chirurgie
- Plaats de huidincisie met een scalpelmesje 20. Om het operatiegebied te openen, plaatst u een incisie van 2-2,5 cm lang langs de wervelkolom en snijdt u door alle lagen van de huid. Plaats deze incisie evenwijdig aan de wervelkolom met de L1-wervel als middelpunt, waardoor deze ~1 cm uitstrekt in zowel de craniale als de caudale richting langs de wervelkolom.
- Mobiliseer de zijkanten van de wond door het bindweefsel rond de spieren door te snijden.
- Plaats twee parallelle incisies langs de wervelkolom en penetreer het periosteum. Plaats de incisies aan beide zijden direct naast de processus spinalis en overspan de afstand tussen de wervels Th13 en L1.
- Ontleed de spieren die aan de wervels vastzitten met behulp van een raspatorium totdat alle spinale ligamenten zichtbaar zijn. Plaats een oprolmechanisme.
- Verwijder de processus spinale van de 13eborstwervel en de 1e lendenwervel met behulp van een tandbeentang om het hele operatiegebied te visualiseren. Hierop controleert u de procedure door een vergroot (4x-16x vergroting) microscopisch beeld te bekijken.
- Gebruik indien nodig een steriel gaasje om het bloeden tijdens de procedure onder controle te houden.
- Til voorzichtig de rest van de L1-spinale processen op en til de L1-wervelboog op. Snijd het ligamentum flavum door om toegang te krijgen tot het ruggenmerg. Verhoog de processus caudale wervelkolom verder, waardoor toegang wordt verkregen tot de spinale dura mater, die ook is doorgesneden. Kantel de processus caudale wervelkolom in de craniale richting om de pia mater te visualiseren.
- Kijk door de pia mater naar de achterste mediane ader, waarbij de middellijn van de wervelkolom zichtbaar is.
- Gebruik de ader als een directionele bissectrice en plaats een incisie met een microchirurgisch scalpel terwijl u de ader spaart. Plaats de incisie onder de ader, in het transversale vlak door de anteroposterieure diameter van het ruggenmerg. Snijd de helft van het ruggenmerg door door het mes zijdelings weg te bewegen van de middellijn.
NOTITIE: De incisie is eenzijdig, aan de rechterkant, bij het 4elumbale segment. - Probeer de incisie te plaatsen om te voorkomen dat de voorste slagader van de wervelkolom wordt doorgesneden. Zorg ervoor dat er geen overmatige druk wordt uitgeoefend op het wervellichaam bij het doorsnijden van het ruggenmerg om de voorste ruggenmergslagader aan de ventrale zijde van het ruggenmerg te sparen.
Figuur 1: Illustratie van de stappen van de nieuwe open dwarslaesietechniek bij ratten. (A) De blootgestelde wervels. (B) Spinale processen verwijderd (Th13 en L1). (C) De opgetilde en gekantelde wervelboog van de L1-wervel. (D) Hemisectie uitgevoerd aan de rechterkant, met hemisected ruggenmerg afzonderlijk weergegeven, ingezoomd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Sluit de dura mater niet direct tijdens het sluiten van de wond. Hecht de spieren langs de processus spinale wervelkolom stevig (hechtdraadmaat 4-0), waardoor de kleine wond op de dura mater indirect wordt gesloten.
- Sluit de dorsale bindweefsellaag af met hechtingen.
- Hecht ten slotte de huid rond de incisieplaats.
3. Postoperatieve zorg en follow-up
- Laat de dieren ontwaken in hun kooien. Houd het/de dier(en) warm met behulp van een warmtelamp naast de ruimte met temperatuurregeling. Laat de ratten niet alleen nadat ze wakker zijn geworden na de operatie, en zet ze niet samen met andere ratten in dezelfde kooi.
- Controleer hun ademhalingsfrequentie minstens elke 10 minuten totdat ze volledig wakker zijn. Pas indien nodig zachte stimulatie toe (bijv. wrijf over het hoofd) om het ontwaken uit de anesthesie te bevorderen.
- Als de dieren alert en voldoende actief zijn, breng ze dan veilig terug naar het dierenverblijf.
- Houd de ratten de eerste 24 uur na de operatie nauwlettend in de gaten. Controleer de dieren na de eerste 24 uur na de operatie ten minste tweemaal per dag tot het einde van het experiment en controleer op tekenen van angst.
- Beoordeel ze eenmaal per dag grondig op tekenen van angst met behulp van het relevante institutionele dierenwelzijnsprotocol en zorg er speciaal voor dat hun wonden worden gecontroleerd op tekenen van infectie en ontsteking.
OPMERKING: Stress en infectie beïnvloeden het welzijn van de dieren en de uitkomst van experimenten. - Dien elke dag subcutaan antibiotica toe tot het einde van de experimenten. Houd de dieren in steriele kooien, één dier per kooi, en geef voedsel en water ad libitum, net als voorheen. Aan het einde van de experimenten (of als er tijdens de duur van het experiment een ernstige bijwerking wordt waargenomen), de dieren op humane wijze euthanaseren, in overeenstemming met het relevante institutionele dierenwelzijnsprotocol.
OPMERKING: Hier werden de dieren geëuthanaseerd (in een diepe slaap geïnduceerd door de combinatie van ketamine-xylazine) door eerst een fysiologische zoutoplossing toe te dienen (1/3 ml/g lichaamsgewicht) gevolgd door een paraformaldehydeperfusie van 4% (1 ml/g lichaamsgewicht).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de hemisectie vertonen de ratten verlamming in de ipsilaterale achterpoot (in vivo bewijs van succesvolle hemisectie). Grondige evaluatie van het monster kan alleen worden uitgevoerd na verwijdering van het ruggenmerg (zie figuur 2, waar het verwijderde ruggenmerg zowel aan de ventrale als aan de dorsale zijde te zien is).
Figuur 2: Ventrale en dorsale aanzichten van het verwijderde ruggenmerg na hemisectie. Het gehele verwijderde ruggenmerg gezien vanaf de ventrale zijde (A) en de dorsale zijde (B) naast elkaar weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Eerst wordt het verwijderde ruggenmerg in zijn geheel geanalyseerd onder een microscoop met een vergroting van 4x-16x (om de mate en precisie van het letsel te evalueren). Het monster wordt vervolgens verder geanalyseerd met behulp van histologie, waarbij de plaats van de verwonding gedetailleerder kan worden gezien. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring werd gebruikt om de monsters voor te bereiden (Figuur 3).
Figuur 3: Histologisch monster met hemisectie. Histologisch monster gekleurd met hematoxyline en eosine, met de hemisectie, bekeken onder een microscoop (16x vergroting). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 en Figuur 3 laten zien dat de incisie qua lengte en plaatsing perfect acceptabel is. De kwaliteit van de monsters was minstens even goed als die van dieren waarvan het ruggenmerg was omgesneden met behulp van de traditionele chirurgische benadering met laminectomie (voor een gedetailleerde beschrijving van de traditionele chirurgische methode, zie 6). De beelden verschillen kwalitatief niet van het resultaat van een andere chirurgische benadering, ook al is deze techniek sneller en is er geen laminectomie.
De resultaten tonen aan dat deze techniek veel sneller kan worden uitgevoerd dan de traditionele chirurgische aanpak met laminectomie (11 min vs. 35 min). Het ruggenmerg wordt met deze methode gedurende 10-15 seconden blootgelegd, vergeleken met minimaal 3,5 minuten bij gebruik van laminectomie (tot de sluiting van de dura). Kortom, deze nieuwe minimaal invasieve SCI-methode zonder laminectomie is veel sneller en vereist geen extra gespecialiseerde instrumentatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze minimaal invasieve techniek voor dwarslaesie werd ontwikkeld bij het bestuderen van ratten met ruggenmergletsel, en het team werd geconfronteerd met problemen die voortkwamen uit de operatie zelf (botsplinters van de laminectomie die compressie veroorzaakten en het ruggenmerg beschadigden, een operatie die te lang duurde, langzame genezing van een grote botwond). Door de laminectomie te elimineren, werd de procedure veel sneller (11 min vs. 35 min), bleef de structuur van het wervelkanaal intact, was de botwond veel kleiner en waren er geen botsplinters die het ruggenmerg konden beschadigen.
De verwijdering van de processus spinosus kan niet worden geëlimineerd omdat de verwijdering van de processus spinosus de bovenste (craniale) doornuitsteeksels nodig is om de processus spinosus ondersteboven naar achteren te kantelen. Het verwijderen van de processus spinosus ondersteboven verbetert de zichtbaarheid van het ruggenmerg aanzienlijk, waardoor hemisectie wordt vergemakkelijkt.
De hemisectie is het meest kritische onderdeel van het protocol. Hier wordt de hemisectie uit de vrije hand uitgevoerd, hoewel dit geen vereiste is. In plaats daarvan kan een stereotaxisch instrument worden gebruikt. De rat kan ook in een stereotaxisch frame worden geplaatst om het dier te stabiliseren tijdens de operatie6. Deze stap vereist slechts een kleine aanpassing in de hier beschreven techniek. Dit kan ook handig zijn als iemand met weinig ervaring de procedure uitvoert.
Deze nieuwe techniek is enorm veelzijdig. Hier werd de procedure uitgevoerd in het L4-lendensegment (L1-wervel); Het kan echter worden gebruikt in andere segmenten van het ruggenmerg die zijn afgestemd op de specifieke behoeften van het eigenlijke experiment (deze techniek is ook gebruikt in de thoracale en cervicale regio's). Het kan ook gemakkelijk worden aangepast om een volledige doorsnede van het ruggenmerg uit te voeren in plaats van een hemisectie. Het optillen van de wervelboog maakt directe inspectie van het gegeven deel van het ruggenmerg mogelijk. Zo kan ook een kleine schijf ruggenmergweefsel worden verwijderd om volledige doorsnede te garanderen.
Het gebruik van deze nieuwe techniek is niet beperkt tot ratten, maar kan ook worden toegepast op andere soorten die worden gebruikt om ruggenmergletsels te modelleren (bijv. muizen, varkens, honden). De belangrijkste beperking van deze techniek is dat, omdat de hemisectie (of transsectie) alleen in tussenwervelruimten kan worden uitgevoerd, deze niet geschikt is voor degenen die specifiek de snede in de wervelruimten moeten plaatsen. Bovendien, omdat het een open-wondtechniek is, is het niet optimaal voor het modelleren van kneuzingen of compressieletsels.
Deze techniek kan echter de ideale keuze zijn voor het bestuderen van open dwarslaesie, omdat de hemisectie (of transsectie) nauwkeurig wordt uitgevoerd en gemakkelijk reproduceerbaar is. Spinale banen kunnen ook worden bestudeerd met minder artefacten, omdat het wervelkanaal intact blijft. Het kan vooral nuttig zijn bij het bestuderen van minimaal invasieve therapeutische benaderingen. Met behulp van deze techniek kan de aandacht alleen op de behandeling liggen in plaats van op mogelijke bijwerkingen van de operatie11.
Concluderend kan worden gesteld dat deze nieuwe, minimaal invasieve techniek geen nieuwe apparatuur of dure instellingen vereist, aangezien alleen apparatuur wordt gebruikt die gemakkelijk beschikbaar is in laboratoria die met dieren werken. Het kan gemakkelijk worden aangepast aan de specifieke behoeften van een bepaald onderzoek (plaats van verwonding; hemi- of doorsnede; type dier). Het is ook gemakkelijk te leren. Daarom zou deze aanpassing interessant kunnen zijn voor onderzoekers die werken met open SCI-diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen hebben beïnvloed.
Acknowledgments
De auteurs willen Gergely Ángyán bedanken voor het originele artwork. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Semmelweis University, Boedapest, Hongarije. Deze studie werd ook ondersteund door het Hongaarse operationele programma voor de ontwikkeling van het menselijk potentieel (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Aanvullende steun werd ontvangen van het Thematic Excellence Programme (2020-4.1.1.-TKP2020) van het ministerie van Innovatie en Technologie in Hongarije, in het kader van het thematische programma Therapie van de Semmelweis University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738 (2019).
- Taoka, Y., Okajima, K.
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
