Summary
여기에서는 후궁 절제술을 제거하는 쥐의 개방성 척수 손상을 모델링하는 새롭고 빠른 기술에 대해 설명합니다. 측면 반절부는 현미경을 통해 보면서 수행됩니다. 이 기술은 다재다능하며 다른 동물의 척수의 경추, 흉부 및 요추 영역에도 사용할 수 있습니다.
Abstract
열상과 같은 부상을 모델링하는 개복 척수 손상 기술은 후궁 절제술을 포함하기 때문에 시간이 많이 걸리고 침습적입니다. 이 새로운 기술은 두 개의 가시돌기를 제거하고 꼬리 척추궁을 들어 올린 다음 기울임으로써 후궁 절제술을 제거합니다. 후궁 절제술 없이 수술 부위가 열립니다. 그런 다음 측면 반절부는 현미경으로 직접 육안으로 제어하여 수행됩니다. 외상이 최소화되어 작은 뼈 상처만 있으면 됩니다.
이 기술은 몇 가지 장점이 있습니다 : 더 빠르고, 따라서 동물에게 부담이 적고, 뼈 상처가 더 작습니다. 후궁 절제술이 제거되기 때문에 척수에 원치 않는 손상이 발생할 가능성이 적고 문제를 일으킬 수 있는 뼈 파편이 없습니다(척수에 박힌 뼈 파편은 부종과 2차 손상을 유발할 수 있음). 척추관은 온전하게 남아 있습니다. 주요 제한 사항은 반절제가 추간 공간에서만 수행될 수 있다는 것입니다.
결과는 이 기술이 후궁 절제술을 사용하는 전통적인 수술 방법보다 훨씬 빠르게 수행될 수 있음을 보여줍니다(11분 대 35분). 이 기술은 개방성 척수 손상의 동물 모델을 다루는 연구자들에게 유용할 수 있는데, 이는 광범위하게 적응할 수 있고 추가적인 특수 기구가 필요하지 않기 때문입니다.
Introduction
척수 손상(SCI)은 불행히도 인간에게 흔한 부상입니다. SCI는 감염과 같은 다양한 방식으로 복잡해질 수 있으며, 이러한 부상을 연구하는 것이 임상적으로 중요합니다1. SCI에 대한 단일하고 확실한 치료법이 없기 때문에 연구자들의 이해를 높이고 가능한 치료법을 발전시키기 위해서는 동물 모델이 여전히 필요합니다 2,3. 폐쇄성 부상이 가장 일반적으로 모델링되지만(압박 및 타박상), 개방성 부상에서만 모델링할 수 있는 열상을 이해하는 것이 임상적으로 중요하다4. 절개 또는 반절개를 사용하는 개방성 상처 모델은 부상의 특성(타박상 대 외과적 절단)으로 인해 폐쇄성 부상 모델에 비해 상처의 더 정확한 국소화를 입증하는 데 사용할 수 있습니다. 개방 상처 실험은 통제되고 신뢰할 수 있으며 복제 가능한 방식으로 보다 구체적인 신경 손상에 대한 실마리를 제공할 수 있다5. 척수의 전체 또는 부분 절개는 널리 사용되는 개방 상처 기술이며 Brown과 Martinez의 논문에서 자세히 볼 수 있습니다6.
쥐의 개방성 척수 손상을 연구할 때, 몇몇 동물은 수술로 인해 발생하는 문제를 제시했습니다: 후궁 절제술로 인한 뼈 파편이 척수에 박혀 부종을 일으켰습니다. 더 큰 뼈 상처는 치유하는 데 오랜 시간이 필요했습니다. 수술이 너무 오래 걸렸다. 이러한 문제를 없애기 위해 대체 수술 기법이 개발되었습니다. 목표는 동물에게 더 부드러운 더 빠른 기술을 개발하는 것이 었습니다. 새로 개발된 이 기술은 기존 SCI 기술보다 훨씬 빠릅니다. 수술적 접근법은 최소 침습적이어서 후궁 절제술로 인해 발생하는 문제를 제거하면서 뼈 상처를 작게 만듭니다.
모든 개방 권선 기술에는 경막개방 7이 포함됩니다. 최근의 여러 연구에서는 이전 방법(8,9)을 개선하기 위해 새로 개발된 다양한 기술을 조사했습니다. 이 새로운 기술을 사용하여 경막의 개방을 배제할 수는 없지만, 경막에 더 작은 상처를 유발하는 동시에 척수의 안정적이고 통제된 손상을 제공합니다. 척수 손상 기법에 대한 문헌을 참조한 많은 저자들은 원래의 기법에 약간의 변화를 주어 수술 시간을 최소화하려고 노력했다10. 후궁 절제술은 시간이 많이 걸리고 더 큰 뼈 상처를 만들어야 하지만 항상 이러한 수술 절차의 일부입니다6. 이 수술 기법은 개방성 상처 척수 손상 모델, 특히 추간 공간에서 수행되는 완전 절개 또는 외측 반절개를 사용하는 연구자에게 적합할 수 있습니다(그림 1).
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Protocol
모든 동물 시술은 EU 지침(2010/63/EU)에 따라 수행되었으며 헝가리 국립 식품 사슬 안전 사무소(PEI/001/2894-11/2014)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구 기간 동안 동물의 윤리적 사용에 관한 모든 해당 기관 및 정부 규정을 준수했습니다.
1. 수술 전 준비 사항
- 절차 중에 사용되는 모든 기구를 소독하고( 재료 표 참조) 절차 전에 작업을 수행할 표면을 소독합니다.
- 예방적 차원에서 피하 항생제를 1회 투여한다.
알림: 항생제 투여량에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. - 수술 전에 동물들이 적응하고 스트레스를 줄일 수 있도록 1시간 동안 수술실에 두십시오.
- 케타민과 자일라진(케타민 80mg/kg 체중(bw) 및 자일라진 8mg/kg bw)의 조합의 근육 주사를 통해 쥐를 마취합니다.
알림: 마취 외에도 k에타민-자일라진 조합은 이 절차에 충분한 진통을 제공합니다. 진통 요법은 기관 동물 사용 지침에 따라 수정할 수 있습니다. - 가열된 테이블이나 적외선을 사용하여 시술 중에 쥐를 따뜻하게 유지하고 안과 연고를 사용하여 마취 내내 눈을 촉촉하게 유지합니다(필요에 따라 다시 바르십시오).
- 앞발과 뒷발과 꼬리에 수술용 테이프를 사용하여 동물을 수술대에 고정하고 부상 부위에 따라 목에도 고정합니다. 필요한 경우 쥐를 입체 프레임에 넣어 수술 중에 안정시킵니다.
- 멸균 수술용 봉합사를 사용하여 쥐의 위쪽 앞니 주위에 고리를 놓고 수술대 가장자리에 고정합니다.
- 기도 관리를 위해 혀를 옆으로 당깁니다.
- 절개할 부위의 각 방향으로 최소 2cm 이상 뒷면의 털을 면도합니다.
- 포비돈 요오드 용액과 멸균 거즈를 사용하여 수술 부위의 피부를 최소 3회 소독합니다. 주변 모피를 적시도록 각별히 주의하십시오. 멸균 드레이프로 수술 부위를 고정합니다.
- 동물의 발가락과 꼬리를 꼬집어 첫 번째 절개를 하기 전에 마취의 적절성을 평가합니다. 전체 절차 동안 마취의 적절성을 계속 모니터링하십시오.
2. 수술
- 메스 칼날을 사용하여 피부 절개 부위를 놓습니다 20. 수술 부위를 열려면 척추를 따라 2-2.5cm 길이의 절개를 하여 피부의 모든 층을 절단합니다. L1 척추를 중간점으로 사용하여 이 절개를 척추와 평행하게 배치하여 척추를 따라 두개골과 꼬리 방향으로 ~1cm 확장되도록 합니다.
- 근육을 둘러싼 결합 조직을 절단하여 상처 측면을 동원합니다.
- 척추를 따라 두 개의 평행한 절개를 하여 골막을 관통합니다. Th13 척추뼈와 L1 척추뼈 사이의 거리에 걸쳐 양쪽의 척추 돌기 바로 옆에 절개 부위를 배치합니다.
- 모든 척추 인대가 보일 때까지 raspatorium의 도움으로 척추에 부착 된 근육을 해부합니다. 견인기를 제자리에 놓으십시오.
- 치과용 뼈 겸자를 사용하여 13번째 흉추와 1번째 요추의 척추 돌기를 제거하여 전체 수술 영역을 시각화합니다. 이때, 확대된(4x-16x 배율) 현미경 이미지를 보면서 절차를 제어합니다.
- 필요한 경우 멸균 거즈를 사용하여 시술 전반에 걸쳐 출혈을 조절하십시오.
- L1 척추 돌기의 나머지 부분을 조심스럽게 들어 올려 L1 척추 아치를 들어 올립니다. 척수에 접근하기 위해 인대 플라붐을 절단합니다. 꼬리 척추 돌기를 더 높여 척추 경막에 접근할 수 있도록 합니다. 꼬리 척추 돌기를 두개골 방향으로 기울여 pia mater를 시각화합니다.
- 척추의 정중선을 보여주는 후방 정중 정맥을 위해 pia mater를 살펴보십시오.
- 정맥을 방향성 이등분선으로 사용하여 정맥을 보존하면서 미세 수술 메스를 사용하여 절개합니다. 절개 부위를 정맥 아래, 척수의 전후 직경을 통과하는 횡단면에 놓습니다. 칼날을 중심선에서 옆으로 움직여 척수의 절반을 절단합니다.
참고: 절개는 오른쪽 4번째 요추 분절에서 편측입니다. - 전방 척추 동맥이 절단되지 않도록 절개 부위를 배치하십시오. 척수를 절단할 때 척수의 복부 쪽에 있는 전방 척추 동맥을 살리기 위해 척추체에 과도한 압력이 가해지지 않도록 하십시오.
그림 1: 쥐를 대상으로 한 새로운 개방형 SCI 기법의 단계를 보여주는 삽화. (A) 노출된 척추뼈. (B) 척추 돌기 제거(Th13 및 L1). (C) L1 척추의 들어 올려지고 기울어진 척추 아치. (D) 오른쪽에서 시행된 반절부는 반절제된 척수를 별도로 확대하여 확대한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 상처를 봉합하는 동안 경막을 직접 닫지 마십시오. 척추 돌기를 따라 근육을 단단히 봉합(봉합사 크기 4-0)하여 경막의 작은 상처를 간접적으로 봉합합니다.
- 봉합사로 등쪽 결합 조직층을 닫습니다.
- 마지막으로 절개 부위 주변의 피부를 봉합합니다.
3. 수술 후 관리 및 후속 조치
- 동물들이 우리 안에서 깨어날 수 있도록 합니다. 온도 조절이 가능한 방 외에 열 램프를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 수술 후 깨어난 쥐를 혼자 두지 말고, 다른 쥐와 함께 같은 케이지에 넣지 마십시오.
- 완전히 깨어날 때까지 최소 10분마다 호흡수를 모니터링하십시오. 필요한 경우 부드러운 자극(예: 머리 문지르기)을 가하여 마취에서 깨어날 수 있도록 돕습니다.
- 동물이 경계하고 적절하게 활동하면 안전하게 동물 집으로 다시 이송하십시오.
- 수술 후 처음 24시간 동안 쥐를 면밀히 관찰하십시오. 수술 후 첫 24시간 이후, 실험이 끝날 때까지 적어도 하루에 두 번 동물을 검사하여 고통의 징후를 모니터링하십시오.
- 관련 기관 동물 복지 프로토콜을 사용하여 하루에 한 번 고통의 징후가 있는지 철저히 평가하고 상처에 감염 및 염증 징후가 있는지 확인하는 데 특별한 주의를 기울이십시오.
참고: 스트레스와 감염은 동물의 복지와 실험 결과에 영향을 미칩니다. - 실험이 끝날 때까지 매일 항생제를 피하 투여합니다. 동물을 무균 케이지에 보관하고, 케이지 당 한 마리를 사육하고, 이전과 마찬가지로 음식과 물을 즉시 제공합니다. 실험이 끝날 때(또는 실험 기간 동안 심각한 부작용이 관찰되는 경우) 관련 기관 동물 복지 프로토콜에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.
참고: 여기서, 동물은 먼저 생리식염수 관류(1/3mL/g bw)를 투여한 후 4% 파라포름알데히드 관류(1mL/g bw)를 투여하여 안락사시켰다(케타민-자일라진의 조합에 의해 유도된 깊은 수면 상태에서).
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Representative Results
반절개 후 쥐는 동측 뒷다리에 마비를 보입니다(성공적인 반절부 증거). 철저한 검체 평가는 척수를 제거한 후에만 수행할 수 있습니다(제거된 척수가 복쪽과 등쪽 모두에서 볼 수 있는 그림 2 참조).
그림 2: 반절개 후 제거된 척수의 복부 및 등쪽 모습. 제거된 척수 전체를 복부 쪽(A)과 등쪽(B)에서 나란히 본 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
먼저, 제거된 척수를 현미경으로 4x-16x 배율(손상의 정도와 정밀도를 평가하기 위해)을 사용하여 전체적으로 분석합니다. 그런 다음 검체를 조직학을 사용하여 추가로 분석하여 손상 부위를 더 자세히 볼 수 있습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 샘플을 준비했습니다(그림 3).
그림 3: 반편을 보여주는 조직학적 샘플. 헤마톡실린 및 에오신을 사용하여 염색한 조직학적 샘플, 현미경으로 본 반편 사진(16배 확대). 축척 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2와 그림 3은 절개 부위의 길이와 위치가 완벽하게 수용 가능하다는 것을 보여줍니다. 샘플의 품질은 적어도 후궁 절제술을 통한 전통적인 외과적 접근법을 사용하여 척수를 반절제한 동물로부터 얻은 것만큼 우수했습니다(전통적인 수술 방법에 대한 자세한 설명은 6 참조). 이 영상은 다른 수술적 접근법의 결과와 질적으로 다르지 않지만, 이 기법이 더 빠르고 후궁 절제술이 없습니다.
결과는 이 기술이 후궁 절제술을 사용하는 전통적인 수술 방법보다 훨씬 빠르게 수행될 수 있음을 보여줍니다(11분 대 35분). 척수는 이 방법으로 10-15초 동안 노출되며, 후궁 절제술을 사용하면 최소 3.5분(경막이 닫힐 때까지)이 노출됩니다. 결론적으로, 후궁 절제술을 사용하지 않는 이 새로운 최소 침습 SCI 방법은 훨씬 빠르며 추가적인 특수 기구가 필요하지 않습니다.
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Discussion
이 최소 침습적 척수 손상 기술은 척수 손상 쥐를 연구할 때 개발되었으며, 연구팀은 수술 자체에서 발생하는 문제(후궁 절제술로 인한 뼈 파편이 압박을 유발하고 척수를 손상시키거나, 수술이 너무 오래 걸리거나, 큰 뼈 상처의 치유가 느림)에 직면했습니다. 후궁 절제술을 없앰으로써 시술이 훨씬 빨라졌고(11분 대 35분), 척추관의 구조가 온전하게 유지되었으며, 뼈 상처가 훨씬 작아졌으며, 척수를 손상시킬 수 있는 뼈 파편이 없었습니다.
상부(두개골) 가시돌기의 제거는 하부(꼬리) 가시돌기를 뒤로 기울이는 데 필요하기 때문에 가시돌기의 제거는 제거할 수 없습니다. 하부 가시돌기를 제거하면 척수의 가시성이 크게 향상되어 반박리가 용이해집니다.
반쪽 절개는 프로토콜에서 가장 중요한 부분입니다. 여기서 반절부는 전제 조건은 아니지만 자유롭게 수행됩니다. 대신 입체 악기를 사용할 수 있습니다. 쥐는 수술 중 동물을 안정시키기 위해 입체 프레임에 넣을 수도 있다6. 이 단계에서는 여기에 설명된 기술을 약간만 수정하면 됩니다. 경험이 거의 없는 사람이 절차를 수행하는 경우에도 도움이 될 수 있습니다.
이 새로운 기술은 매우 다재다능합니다. 여기서, 시술은 L4 요추 분절(L1 척추)에서 수행하였다; 그러나 실제 실험의 특정 요구에 맞게 조정된 척수의 다른 부분에서 사용할 수 있습니다(이 기술은 흉부 및 경추 영역에서도 사용되었습니다). 또한 반절개 대신 척수의 완전한 절개를 구현하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 척추궁을 들어 올리면 척수의 특정 부분을 직접 검사할 수 있습니다. 따라서 척수 조직의 작은 디스크를 제거하여 완전한 절개를 보장할 수도 있습니다.
이 새로운 기술의 사용은 쥐에 국한되지 않고 척수 손상을 모델링하는 데 사용되는 다른 종(예: 생쥐, 돼지, 개)에도 적용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 한계는 반절부(또는 횡단)가 추간 공간에서만 수행될 수 있기 때문에 특히 척추 공간에 절단을 배치해야 하는 사람들에게는 적합하지 않다는 것입니다. 또한 개방성 기술이기 때문에 타박상이나 압박 부상을 모델링하는 데 최적이 아닙니다.
그러나 이 기법은 반절편(또는 횡단)이 정밀하게 실행되고 쉽게 재현할 수 있기 때문에 개방형 SCI를 연구하는 데 이상적인 선택이 될 수 있습니다. 척추 경로는 척추관이 손상되지 않은 상태로 남아 있기 때문에 더 적은 수의 인공물로 연구할 수도 있습니다. 최소 침습 치료 접근법을 연구할 때 특히 유용할 수 있습니다. 이 기법을 사용하면 수술의 부작용 대신 치료에만 집중할 수 있다11.
결론적으로, 이 새로운 최소 침습 기술은 동물을 다루는 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 장비만 활용되기 때문에 새로운 장비나 값비싼 설정이 필요하지 않습니다. 주어진 연구의 특정 요구 사항(부상 부위, 반편 또는 절개, 동물 유형)에 쉽게 적용할 수 있습니다. 배우기도 쉽습니다. 따라서 이 수정은 개방형 SCI 동물 모델을 연구하는 연구자들에게 흥미로울 수 있습니다.
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Disclosures
저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 원본 작품에 대해 Gergely Ángyán에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 헝가리 부다페스트에 있는 제멜바이스 대학교(Semmelweis University)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 헝가리 인적 자원 개발 운영 프로그램(EFOP-3.6.2-16-2017-00006)의 지원도 받았습니다. 추가 지원은 Semmelweis University의 Therapy 주제 프로그램의 틀 내에서 헝가리 혁신 기술부의 주제 우수 프로그램(2020-4.1.1.-TKP2020)에서 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738 (2019).
- Taoka, Y., Okajima, K.
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
