Summary
Aqui, descrevemos uma nova e rápida técnica de modelagem da lesão medular aberta em ratos que elimina a laminectomia. A hemissecção lateral é realizada durante a visualização através de um microscópio. A técnica é versátil e também pode ser utilizada nas regiões cervical, torácica e lombar da medula espinhal de outros animais.
Abstract
As técnicas abertas de lesão medular modelando lesões laceradas são demoradas e invasivas, pois envolvem laminectomia. Esta nova técnica elimina a laminectomia removendo dois processos espinhosos e levantando, inclinando em seguida o arco vertebral caudal. A área cirúrgica abre-se sem a necessidade de laminectomia. A hemissecção lateral é então realizada com controle visível direto ao microscópio. O trauma é minimizado, necessitando apenas de uma pequena ferida óssea.
Essa técnica tem várias vantagens: é mais rápida e, portanto, menos onerosa para o animal, e a ferida óssea é menor. Como a laminectomia é eliminada, há menos chance de lesão indesejada na medula espinhal, e não há lascas ósseas que possam causar problemas (lascas ósseas embutidas na medula espinhal podem causar inchaço e danos secundários). O canal vertebral permanece íntegro. A principal limitação é que a hemissecção só pode ser realizada nos espaços intervertebrais.
Os resultados mostram que esta técnica pode ser realizada muito mais rapidamente do que a abordagem cirúrgica tradicional, utilizando laminectomia (11 min vs. 35 min). Esta técnica pode ser útil para pesquisadores que trabalham com modelos animais de lesão medular aberta, pois é amplamente adaptável e não requer nenhuma instrumentação especializada adicional.
Introduction
As lesões medulares (LMT) são, infelizmente, lesões prevalentes em humanos. As LMs podem ser complicadas de diferentes maneiras, por exemplo, por infecções, sendo clinicamente importante o estudo dessas lesões1. Como não há cura única e definitiva para a LMT, modelos animais ainda são necessários para aprofundar o entendimento dos pesquisadores e avançar em possíveis tratamentos 2,3. Embora as lesões fechadas sejam mais comumente modeladas (compressão e contusão), é clinicamente importante entender as lacerações, que só podem ser modeladas em lesõesabertas4. Modelos de feridas abertas usando transecção ou hemissecção podem ser usados para demonstrar uma localização mais precisa de uma ferida em comparação com modelos de lesão fechada, devido à natureza da lesão (contusão vs. corte cirúrgico). Experimentos com feridas abertas podem esclarecer lesões neuronais mais específicas de forma controlada, confiável e replicável5. A transecção completa ou parcial da medula espinhal é uma técnica amplamente utilizada na ferida aberta e pode ser vista em detalhes no artigo de Brown e Martinez6.
Ao estudar a lesão medular aberta em ratos, vários animais apresentaram problemas decorrentes da cirurgia: lascas ósseas da laminectomia ficaram embutidas na medula espinhal e causaram inchaço; a ferida óssea maior precisou de muito tempo para cicatrizar; A cirurgia demorou muito. Uma técnica cirúrgica alternativa foi desenvolvida para eliminar esses problemas. O objetivo era desenvolver uma técnica mais rápida e suave para o animal. Esta técnica recém-desenvolvida é muito mais rápida do que as técnicas tradicionais de LM. A abordagem cirúrgica é minimamente invasiva, resultando em uma ferida óssea menor e eliminando os problemas decorrentes da laminectomia.
Todas as técnicas de feridas abertas envolvem a abertura da dura-máter7. Vários estudos recentes têm examinado diferentes técnicas recém-desenvolvidas, com o objetivo de aprimorar os métodos anteriores 8,9. Embora a abertura da dura-máter não possa ser excluída com essa nova técnica, ela causa uma ferida menor na dura-máter, ao mesmo tempo em que oferece uma lesão confiável e controlada da medula espinhal. Consultando a literatura sobre técnicas de lesão medular, muitos autores tentaram minimizar o tempo cirúrgico implementando pequenas modificações na técnicaoriginal10. A laminectomia sempre faz parte desses procedimentos cirúrgicos, embora seja demorada e necessite de uma ferida óssea maior6. Esta técnica cirúrgica pode ser apropriada para pesquisadores que utilizam modelos de lesão medular de ferida aberta, especificamente transecção completa ou hemissecção lateral realizada nos espaços intervertebrais (Figura 1).
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com a Diretiva da UE (2010/63/UE) e aprovados pelo comitê de ética animal do Escritório Nacional de Segurança da Cadeia Alimentar da Hungria (PEI/001/2894-11/2014). Todas as normas institucionais e governamentais aplicáveis quanto ao uso ético de animais foram seguidas durante este estudo.
1. Preparo antes da cirurgia
- Esterilizar todos os instrumentos utilizados durante o procedimento (ver Tabela de Materiais) e desinfetar as superfícies onde o trabalho deve ser realizado antes do procedimento.
- Injetar profilaticamente uma dose única de antibióticos subcutâneos.
NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes sobre a dosagem de antibióticos. - Deixar os animais na sala de cirurgia por 1 h para aclimatá-los e diminuir o estresse antes da cirurgia.
- Anestesiar o rato através de uma injeção intramuscular de uma combinação de quetamina e xilazina (cetamina 80 mg/kg de peso corporal (pc) e xilazina 8 mg/kg pc).
NOTA: Além da anestesia, a combinação de ketamina e xilazina fornece analgesia suficiente para este procedimento. O regime de analgesia pode ser modificado de acordo com as diretrizes institucionais de uso de animais. - Mantenha o rato aquecido durante o procedimento usando uma mesa aquecida ou luz infravermelha e mantenha os olhos úmidos durante toda a anestesia usando pomada oftálmica (reaplique conforme necessário).
- Fixe o animal na mesa cirúrgica usando fita adesiva cirúrgica nas patas dianteiras e traseiras e cauda e, dependendo do local da lesão, também no pescoço. Se necessário, coloque o rato em uma estrutura estereotáxica para estabilizá-lo durante a cirurgia.
- Usando sutura cirúrgica estéril, coloque uma alça ao redor dos dentes anteriores superiores do rato e fixe-a na borda da mesa de operação.
- Puxe a língua para os lados para o manejo das vias aéreas.
- Faça a barba do pelo nas costas, pelo menos 2 cm em cada direção de onde será feita a incisão.
- Desinfetar a pele da área cirúrgica pelo menos três vezes, utilizando solução de iodopovidona e gaze estéril. Tome especial cuidado para molhar a pele que rodeia a área. Fixar o sítio cirúrgico com um campo estéril.
- Avaliar a adequação da anestesia antes de colocar a primeira incisão, pinçando os dedos e a cauda do animal. Continue monitorando a adequação da anestesia durante todo o procedimento.
2. Cirurgia
- Colocar a incisão na pele com lâmina de bisturi 20. Para abrir a área cirúrgica, coloque uma incisão de 2 a 2,5 cm de comprimento ao longo da coluna vertebral, cortando todas as camadas da pele. Posicione esta incisão paralelamente à coluna vertebral usando a vértebra L1 como ponto médio, fazendo com que ela se estenda ~1 cm no sentido cranial e caudal ao longo da coluna vertebral.
- Mobilize os lados da ferida cortando o tecido conjuntivo ao redor dos músculos.
- Colocar duas incisões paralelas ao longo da coluna vertebral, penetrando no periósteo. Coloque as incisões bem ao lado dos processos espinhais em ambos os lados, abrangendo a distância entre as vértebras Th13 e L1.
- Disseque os músculos ligados às vértebras com o auxílio de um raspatório até que todos os ligamentos espinhais estejam visíveis. Coloque um afastador.
- Remover os processos espinhais da13ª vértebra torácica e da1ª vértebra lombar utilizando pinça óssea dentária para visualização de toda a área cirúrgica. A partir daí, controle o procedimento visualizando uma imagem microscópica ampliada (aumento de 4x-16x).
- Use gaze estéril para controlar o sangramento durante todo o procedimento, quando necessário.
- Levante cuidadosamente o restante dos processos espinhais de L1, elevando o arco vertebral de L1. Cortar o ligamento amarelo para acessar a medula espinhal. Eleve ainda mais os processos espinhais caudais, permitindo o acesso à dura-máter espinhal, que também é seccionada. Inclinar os processos espinhais caudais na direção cranial para visualizar a pia-máter.
- Olhe através da pia-máter para a veia mediana posterior, mostrando a linha média da coluna vertebral.
- Usando a veia como bissetriz direcional, coloque uma incisão usando um bisturi microcirúrgico enquanto poupa a veia. Colocar a incisão sob a veia, no plano transversal através do diâmetro anteroposterior da medula espinhal. Separar metade da medula espinhal movendo a lâmina lateralmente para longe da linha central.
OBS: A incisão é unilateral, do lado direito, no4º segmento lombar. - Tente colocar a incisão para evitar o corte da artéria espinhal anterior. Certifique-se de que o excesso de pressão não seja aplicado no corpo vertebral ao cortar a medula espinhal para poupar a artéria espinhal anterior no lado ventral da medula espinhal.
Figura 1: Arte mostrando os passos da nova técnica de LM aberta em ratos. (A) As vértebras expostas. (B) Processos espinhais removidos (Th13 e L1). (C) O arco vertebral levantado e inclinado da vértebra L1. (D) Hemissecção realizada do lado direito, com hemisecção medular mostrada separadamente, ampliada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Não feche a dura-máter diretamente durante o fechamento da ferida. Sutura firme (sutura tamanho 4-0) dos músculos ao longo dos processos espinhais, fechando indiretamente a pequena ferida na dura-máter.
- Fechar a camada de tecido conjuntivo dorsal com suturas.
- Finalmente, suture a pele ao redor do local da incisão.
3. Cuidados e seguimento pós-cirúrgicos
- Permita que os animais despertem em suas gaiolas. Mantenha o(s) animal(is) aquecido(s) usando uma lâmpada de calor, além da sala com temperatura controlada. Não deixe os ratos sozinhos depois que eles despertarem após a cirurgia, e não os coloque junto com outros ratos na mesma gaiola.
- Monitore sua frequência respiratória pelo menos a cada 10 minutos até que estejam totalmente acordados. Se necessário, aplique estimulação suave (por exemplo, esfregue a cabeça) para ajudar no despertar da anestesia.
- Quando os animais estiverem alertas e adequadamente ativos, transporte-os com segurança de volta ao biotério.
- Mantenha os ratos sob vigilância rigorosa durante as primeiras 24 horas após a cirurgia. Após as primeiras 24 h pós-operatórias, verificar os animais pelo menos duas vezes ao dia até o final do experimento, monitorando sinais de angústia.
- Avalie-os minuciosamente uma vez por dia em busca de sinais de angústia usando o protocolo institucional de bem-estar animal relevante e tome cuidado especial para verificar suas feridas em busca de sinais de infecção e inflamação.
NOTA: O stress e a infecção afectam o bem-estar dos animais e o resultado das experiências. - Administrar antibióticos por via subcutânea todos os dias até o final dos experimentos. Manter os animais em gaiolas estéreis, um animal por gaiola, e dar comida e água ad libitum, como antes. No final das experiências (ou se for observada qualquer reacção adversa grave durante o período de tempo da experiência), eutanasiar os animais humanamente, de acordo com o protocolo institucional de bem-estar animal relevante.
OBS: Os animais foram eutanasiados (em sono profundo induzido pela combinação de ketamina e xilazina) administrando-se primeiramente uma perfusão salina fisiológica (1/3 mL/g pc) seguida de uma perfusão de paraformaldeído a 4% (1 mL/g pc).
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Representative Results
Após a hemissecção, os ratos apresentam paralisia no membro posterior ipsilateral (prova in vivo de hemisecção bem-sucedida). A avaliação completa do espécime só pode ser feita após a remoção da medula espinhal (ver Figura 2, onde a medula espinhal removida pode ser vista dos lados ventral e dorsal).
Figura 2: Incidência ventral e dorsal da medula espinhal removida após hemissecção. Toda a medula espinhal removida vista do lado ventral (A) e do lado dorsal (B) mostrada lado a lado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Primeiramente, a medula espinhal removida é analisada em sua totalidade sob um microscópio usando aumento de 4x-16x (para avaliar o grau e a precisão da lesão). O espécime é então analisado por histologia, onde o local da lesão pode ser visto com mais detalhes. Para o preparo das amostras foram utilizadas as colorações de hematoxilina e eosina (H&E) (Figura 3).
Figura 3: Amostra histológica mostrando hemisecção. Fragmento histológico corado pela hematoxilina e eosina, mostrando a hemiseção, visualizada ao microscópio (aumento de 16x). Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 2 e a Figura 3 mostram que a incisão é perfeitamente aceitável em comprimento e colocação. A qualidade das amostras foi pelo menos tão boa quanto as obtidas de animais cujas medulas, foram hemiseccionadas usando a abordagem cirúrgica tradicional com laminectomia (para uma descrição detalhada do método cirúrgico tradicional, ver 6). As imagens não diferem qualitativamente do resultado de qualquer outra abordagem cirúrgica, embora esta técnica seja mais rápida e não haja laminectomia.
Os resultados mostram que esta técnica pode ser realizada muito mais rapidamente do que a abordagem cirúrgica tradicional usando laminectomia (11 min vs. 35 min). A medula espinhal é exposta por 10-15 s com este método, em comparação com um mínimo de 3,5 min usando laminectomia (até o fechamento da dura-máter). Em conclusão, este novo método minimamente invasivo de LM sem laminectomia é muito mais rápido e não requer instrumentação especializada adicional.
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Discussion
Esta técnica minimamente invasiva de lesão medular foi desenvolvida ao estudar ratos com lesão medular, e a equipe se deparou com problemas decorrentes da própria cirurgia (lascas ósseas da laminectomia causando compressão e danificando a medula espinhal, cirurgia demorando muito, cicatrização lenta de uma grande ferida óssea). Ao eliminar a laminectomia, o procedimento tornou-se muito mais rápido (11 min vs. 35 min), a estrutura do canal vertebral permaneceu intacta, a ferida óssea era muito menor e não havia lascas ósseas que pudessem danificar a medula espinhal.
A remoção dos processos espinhosos não pode ser eliminada porque a remoção do processo espinhoso superior (cranial) é necessária para inclinar o processo espinhoso inferior (caudal) para trás. A remoção do processo espinhoso inferior melhora muito a visibilidade da medula espinhal, facilitando a hemissecção.
A hemisecção é a parte mais crítica do protocolo. Aqui, a hemissecção é realizada à mão livre, embora isso não seja um pré-requisito. Um instrumento estereotáxico pode ser usado em seu lugar. O rato também pode ser colocado em uma estrutura estereotáxica para estabilizar o animal durante a cirurgia6. Esta etapa exigirá apenas uma pequena modificação na técnica descrita aqui. Isso também pode ser útil se alguém com pouca experiência estiver realizando o procedimento.
Esta nova técnica é extremamente versátil. Aqui, o procedimento foi realizado no segmento lombar de L4 (vértebra L1); no entanto, pode ser usado em outros segmentos da medula espinhal adaptados às necessidades específicas do experimento real (esta técnica tem sido usada nas regiões torácica e cervical também). Também poderia ser facilmente ajustado para implementar uma transecção completa da medula espinhal em vez de uma hemissecção. O levantamento do arco vertebral permite a inspeção direta da parte dada da medula espinhal. Assim, um pequeno disco de tecido medular também pode ser removido para garantir a transecção completa.
O uso dessa nova técnica não se limita a ratos, mas também pode ser aplicado a outras espécies usadas para modelar lesões medulares (por exemplo, camundongos, porcos, cães). A principal limitação dessa técnica é que, como a hemissecção (ou transecção) só pode ser realizada nos espaços intervertebrais, ela não é indicada para aqueles que precisam especificamente que o corte seja colocado nos espaços vertebrais. Além disso, por ser uma técnica de ferida aberta, não é ideal para modelar contusões ou lesões por compressão.
Entretanto, essa técnica pode ser a escolha ideal para o estudo da LM aberta, uma vez que a hemissecção (ou transecção) é executada com precisão e de fácil reprodutível. As vias da coluna vertebral também podem ser estudadas com menos artefatos, pois o canal vertebral permanece intacto. Pode ser especialmente útil quando se estudam abordagens terapêuticas minimamente invasivas. Com essa técnica, o foco de atenção pode estar apenas no tratamento e não nos possíveis efeitos colaterais da cirurgia11.
Em conclusão, esta nova técnica minimamente invasiva não requer novos equipamentos nem configurações dispendiosas, uma vez que apenas equipamentos prontamente disponíveis em laboratórios que trabalham com animais são utilizados. Pode ser facilmente adaptado às necessidades específicas de um determinado estudo (local da lesão; hemi ou transecção; tipo de animal). Também é fácil de aprender. Portanto, essa modificação pode ser de interesse para pesquisadores que trabalham com modelos animais abertos de LM.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Gergely Ángyán pela obra original. Este trabalho de pesquisa foi financiado pela Universidade Semmelweis, Budapeste, Hungria. Este estudo também foi apoiado pelo Programa Operacional de Desenvolvimento de Recursos Humanos da Hungria (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Foi recebido apoio adicional do Programa de Excelência Temática (2020-4.1.1.-TKP2020) do Ministério da Inovação e Tecnologia da Hungria, no âmbito do programa temático de Terapia da Universidade Semmelweis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
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