Summary
Her beskriver vi en ny, rask teknikk som modellerer åpen ryggmargsskade hos rotter som eliminerer laminektomi. Lateral hemiseksjon utføres mens du ser gjennom et mikroskop. Teknikken er allsidig og kan også brukes i livmorhals-, thorax- og lumbale områder i ryggmargen til andre dyr.
Abstract
Åpne ryggmargsskade teknikker modellering laceration-lignende skader er tidkrevende og invasive fordi de involverer laminektomi. Denne nye teknikken eliminerer laminektomi ved å fjerne to spinøse prosesser og løfte, og deretter vippe den kaudale vertebrale buen. Det kirurgiske området åpnes uten behov for laminektomi. Lateral hemiseksjon utføres deretter med direkte synlig kontroll under et mikroskop. Traumet minimeres, og krever bare et lite beinsår.
Denne teknikken har flere fordeler: den er raskere og derfor mindre byrde for dyret, og beinsåret er mindre. Fordi laminektomi er eliminert, er det mindre sjanse for uønsket skade på ryggmargen, og det er ingen bensplinter som kan forårsake problemer (bensplinter innebygd i ryggmargen kan forårsake hevelse og sekundær skade). Vertebralkanalen forblir intakt. Hovedbegrensningen er at hemiseksjonen kun kan utføres i de intervertebrale rommene.
Resultatene viser at denne teknikken kan utføres mye raskere enn den tradisjonelle kirurgiske tilnærmingen, ved bruk av laminektomi (11 min vs. 35 min). Denne teknikken kan være nyttig for forskere som arbeider med dyremodeller av åpen ryggmargsskade, da den er allment tilpasningsdyktig og ikke krever noen ekstra spesialisert instrumentering.
Introduction
Ryggmargsskader (SCI) er dessverre utbredte skader hos mennesker. Ryggmargsskadene kan kompliseres på ulike måter, for eksempel ved infeksjoner, og det er klinisk viktig å studere disse skadene1. Fordi det ikke finnes en enkelt, bestemt kur for SCI, er det fortsatt behov for dyremodeller for å fremme forståelsen av forskere og fremme mulige behandlinger 2,3. Selv om lukkede skader oftest modelleres (kompresjon og kontusjon), er det klinisk viktig å forstå kuttskader, som bare kan modelleres i åpne skader4. Åpne sårmodeller ved hjelp av transeksjon eller hemiseksjon kan brukes til å demonstrere en mer presis lokalisering av et sår sammenlignet med lukkede skademodeller, på grunn av skadens art (kontusjon vs. kirurgisk kutt). Åpne såreksperimenter kan kaste lys over mer spesifikke nevronskader på en kontrollert, pålitelig og repliserbar måte5. Fullstendig eller delvis transeksjon av ryggmargen er en mye brukt åpen sårteknikk og kan ses i detalj i artikkelen av Brown og Martinez6.
Når man studerte åpen ryggmargsskade hos rotter, presenterte flere dyr problemer som oppsto fra operasjonen: beinsplinter fra laminektomi ble innebygd i ryggmargen og forårsaket hevelse; det større beinsåret trengte lang tid på å gro; Operasjonen tok for lang tid. En alternativ kirurgisk teknikk ble utviklet for å eliminere disse problemene. Målet var å utvikle en raskere teknikk som er mer skånsom for dyret. Denne nyutviklede teknikken er mye raskere enn tradisjonelle SCI-teknikker. Den kirurgiske tilnærmingen er minimalt invasiv, noe som resulterer i et mindre bein sår samtidig som det eliminerer problemer som oppstår fra laminektomi.
Alle teknikker med åpent sår innebærer å åpne dura7. Flere nyere studier har undersøkt ulike, nyutviklede teknikker, med sikte på å forbedre de tidligere metodene 8,9. Selv om åpningen av dura ikke kan utelukkes ved hjelp av denne nye teknikken, forårsaker det et mindre sår på dura samtidig som det gir en pålitelig, kontrollert skade på ryggmargen. Etter å ha konsultert litteraturen om ryggmargsskadeteknikker, forsøkte mange forfattere å minimere operasjonstiden ved å implementere mindre endringer i den opprinnelige teknikken10. Laminectomy er alltid en del av disse kirurgiske prosedyrene, selv om det er tidkrevende og krever et større bein sår som skal gjøres6. Denne kirurgiske teknikken kan være aktuell for forskere som bruker modeller for ryggmargsskade med åpne sår, nærmere bestemt komplett transseksjon eller lateralt hemisenter utført i mellomvirvelrommene (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til EU-direktivet (2010/63 / EU) og ble godkjent av dyreetikkomiteen i det ungarske nasjonale næringsmiddelsikkerhetskontoret (PEI/001/2894-11/2014). Alle gjeldende institusjonelle og statlige forskrifter om etisk bruk av dyr ble fulgt under denne studien.
1. Forberedelse før kirurgi
- Steriliser alle instrumenter som brukes under prosedyren (se materialfortegnelsen) og desinfiser overflatene der arbeidet skal utføres før prosedyren.
- Injiser en enkelt dose subkutane antibiotika profylaktisk.
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om antibiotikadosering. - La dyrene stå i operasjonssalen i 1 time for å akklimatisere dem og redusere stresset før operasjonen.
- Bedøv rotta via en intramuskulær injeksjon av en kombinasjon av ketamin og xylazin (ketamin 80 mg/kg kroppsvekt og xylazin 8 mg/kg kroppsvekt).
MERK: I tillegg til anestesigir kombinasjonen k etamin-xylazin tilstrekkelig analgesi for denne prosedyren. Analgesiregimet kan modifiseres i henhold til institusjonelle retningslinjer for bruk av dyr. - Hold rotta varm under prosedyren ved hjelp av et oppvarmet bord eller infrarødt lys og hold øynene fuktige gjennom anestesien ved hjelp av oftalmisk salve (bruk på nytt etter behov).
- Fikser dyret på operasjonsbordet ved hjelp av kirurgisk tape på for- og bakpotene og halen, og avhengig av skadestedet, også på nakken. Plasser om nødvendig rotta i en stereotaksisk ramme for å stabilisere den under operasjonen.
- Ved hjelp av steril kirurgisk sutur, plasser en løkke rundt rottens øvre fortenner og fest dette på kanten av operasjonsbordet.
- Trekk ut tungen sidelengs for luftveishåndtering.
- Barber pelsen på ryggen, minst 2 cm i hver retning av hvor snittet skal gjøres.
- Desinfiser huden på operasjonsområdet minst tre ganger, ved hjelp av en povidon-jodoppløsning og sterilt gasbind. Vær spesielt forsiktig med å suge pelsen rundt området. Fest operasjonsstedet med en steril drapering.
- Vurder tilstrekkeligheten av anestesien før du plasserer det første snittet ved å klemme tærne og halen på dyret. Fortsett å overvåke tilstrekkelig anestesi under hele prosedyren.
2. Kirurgi
- Plasser hudsnittet med et skalpellblad 20. For å åpne det kirurgiske området, plasser et 2-2,5 cm langt snitt langs ryggraden, og skjær gjennom alle lagene i huden. Plasser dette snittet parallelt med ryggsøylen ved å bruke L1-vertebraen som midtpunkt, slik at den strekker seg ~ 1 cm i både kranial og kaudal retning langs ryggraden.
- Mobiliser sidene av såret ved å kutte gjennom bindevevet rundt musklene.
- Plasser to parallelle snitt langs ryggraden, penetrerer periosteum. Plasser snittene rett ved siden av ryggprosessene på begge sider, som spenner over avstanden mellom Th13- og L1-ryggvirvlene.
- Dissekere musklene festet til ryggvirvlene ved hjelp av et raspatorium til alle spinalbåndene er synlige. Sett på plass en retractor.
- Fjern spinalprosessene til den 13. thoraxvirvelen og 1. lumbale vertebra ved hjelp av tannbentang for å visualisere hele operasjonsområdet. Herpå kontrollerer du prosedyren ved å vise et forstørret (4x-16x forstørrelse) mikroskopisk bilde.
- Bruk sterilt gasbind for å kontrollere blødning gjennom hele prosedyren, når det er nødvendig.
- Løft forsiktig resten av L1 spinal prosesser, heve L1 vertebral bue. Kutt ligamentum flavum for å få tilgang til ryggmargen. Øk de kaudale spinalprosessene ytterligere, noe som gir tilgang til spinal dura mater, som også er kuttet. Tips de kaudale spinalprosessene i kranieretningen for å visualisere pia materen.
- Se gjennom pia mater for den bakre medianvenen, som viser midtlinjen i ryggraden.
- Bruk venen som en retningsbestemt bisektor, plasser et snitt ved hjelp av en mikrokirurgisk skalpell mens du sparer venen. Plasser snittet under venen, i tverrplanet gjennom ryggmargens anteroposterior diameter. Skjær halvparten av ryggmargen ved å flytte bladet sideveis bort fra midtlinjen.
MERK: Snittet er ensidig, på høyre side, ved 4. lumbalsegment. - Prøv å plassere snittet for å unngå å kutte den fremre spinalarterien. Sørg for at overtrykk ikke påføres vertebrallegemet når du kutter ryggmargen for å spare den fremre spinalarterien på ventralsiden av ryggmargen.
Figur 1: Grafikk som viser trinnene i den nye åpne SCI-teknikken hos rotter. (A) De eksponerte ryggvirvlene. (B) Spinale prosesser fjernet (Th13 og L1). (C) Den løftede og vippede ryggvirvelbuen til L1-vertebraen. (D) Hemiseksjon utført på høyre side, med hemisektet ryggmarg vist separat, zoomet inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Ikke lukk dura materen direkte under sårlukking. Tett sutur (suturstørrelse 4-0) musklene langs ryggprosessene, indirekte lukker det lille såret på dura materen.
- Lukk det dorsale bindevevslaget med suturer.
- Til slutt, sutur huden rundt snittstedet.
3. Postoperativ behandling og oppfølging
- La dyrene våkne i burene sine. Hold dyret/dyrene varme ved hjelp av en varmelampe i tillegg til det temperaturkontrollerte rommet. Ikke la rottene være alene etter at de våkner etter operasjonen, og ikke sett dem sammen med andre rotter i samme bur.
- Overvåk respirasjonsfrekvensen minst hvert 10. minutt til de er helt våkne. Bruk om nødvendig mild stimulering (f.eks. gni hodet) for å hjelpe oppvåkningen fra anestesi.
- Når dyrene er våkne og tilstrekkelig aktive, transporter dem trygt tilbake til dyrehuset.
- Hold rottene under nøye overvåkning de første 24 timene etter operasjonen. Etter de første 24 timene etter operasjonen, sjekk dyrene minst to ganger om dagen til slutten av forsøket, og kontroller for tegn på nød.
- Vurder dem grundig en gang om dagen for tegn på nød ved hjelp av den relevante institusjonelle dyrevelferdsprotokollen, og vær spesielt forsiktig med å sjekke sårene deres for tegn på infeksjon og betennelse.
MERK: Stress og infeksjon påvirker dyrenes velferd og utfallet av eksperimenter. - Administrer antibiotika subkutant hver dag til slutten av forsøkene. Hold dyrene i sterile bur, ett dyr per bur, og gi mat og vann ad libitum, samme som før. På slutten av forsøkene (eller hvis det observeres en alvorlig bivirkning i løpet av forsøkets tidsramme), avlive dyrene humant, i samsvar med den relevante institusjonelle dyrevelferdsprotokollen.
MERK: Her ble dyrene avlivet (i dyp søvn indusert av kombinasjonen ketamin-xylazin) ved først å administrere en fysiologisk saltvannsperfusjon (1/3 ml / g kroppsvekt) etterfulgt av en 4% paraformaldehydperfusjon (1 ml / g kroppsvekt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter hemisseksjonen viser rottene lammelse i den ipsilaterale baklemmen (in vivo bevis på vellykket hemisiseksjon). Grundig prøvetaking kan først gjøres etter fjerning av ryggmargen (se figur 2, der den fjernede ryggmargen kan ses både ventral og dorsal).
Figur 2 Ventrale og dorsale bilder av fjernet ryggmarg etter hemisium. Hele den fjernede ryggmargen sett fra ventral side (A) og dorsalside (B) vist side om side. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Først analyseres den fjernede ryggmargen i sin helhet under et mikroskop ved bruk av 4x-16x forstørrelse (for å evaluere graden og presisjonen av skaden). Prøven analyseres deretter videre ved hjelp av histologi, hvor skadestedet kan ses mer detaljert. Til fremstilling av prøvene ble det brukt hematoksylin og eosin (H&E) (figur 3).
Figur 3 Histologisk prøve som viser hemiseksjon. Histologisk prøve farget med hematoksylin og eosin, som viser hemiseksjonen, sett under et mikroskop (16x forstørrelse). Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 og figur 3 viser at snittet er helt akseptabelt i lengde og plassering. Kvaliteten på prøvene var minst like god som fra dyr med hemisektet ryggmarg ved tradisjonell kirurgisk tilnærming med laminektomi (for en detaljert beskrivelse av den tradisjonelle kirurgiske metoden, se 6). Bildene er ikke kvalitativt forskjellige fra resultatet av noen annen kirurgisk tilnærming, selv om denne teknikken er raskere og det ikke er noen laminektomi.
Resultatene viser at denne teknikken kan utføres mye raskere enn den tradisjonelle kirurgiske tilnærmingen ved bruk av laminektomi (11 min vs. 35 min). Ryggmargen eksponeres i 10-15 s med denne metoden, sammenlignet med minimum 3,5 min ved bruk av laminektomi (inntil lukking av dura). Som konklusjon er denne nye minimalt invasive SCI-metoden uten laminektomi mye raskere og krever ingen ekstra spesialisert instrumentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne minimalt invasive ryggmargsskadeteknikken ble utviklet når man studerte ryggmargsskadede rotter, og teamet ble møtt med problemer som følge av selve operasjonen (beinsplinter fra laminektomi forårsaker kompresjon og skade ryggmargen, kirurgi tar for lang tid, langsom helbredelse av et stort bein sår). Ved å eliminere laminektomi ble prosedyren mye raskere (11 min mot 35 min), strukturen i vertebralkanalen forble intakt, beinsåret var mye mindre, og det var ingen beinsplinter som kunne skade ryggmargen.
Fjernelsen av de spinøse prosessene kan ikke elimineres fordi fjerning av den øvre (kraniale) spinøse prosessen er nødvendig for å vippe den nedre (caudal) spinøse prosessen bakover. Fjernelsen av den nedre spinøse prosessen forbedrer synligheten av ryggmargen, noe som letter hemiseksjon.
Hemisseksjonen er den mest kritiske delen av protokollen. Her utføres hemiseksjonen frihånd, selv om dette ikke er en forutsetning. Et stereotaktisk instrument kan brukes i stedet. Rotta kan også plasseres i en stereotaktisk ramme for å stabilisere dyret under operasjon6. Dette trinnet krever bare en liten endring i teknikken som er skissert her. Dette kan også være nyttig hvis noen med liten erfaring utfører prosedyren.
Denne nye teknikken er ekstremt allsidig. Her ble prosedyren utført ved L4 lumbalsegmentet (L1 vertebra); Det kan imidlertid brukes i andre segmenter av ryggmargen skreddersydd for de spesifikke behovene til selve eksperimentet (denne teknikken har også blitt brukt i thorax og livmorhalsområdene). Det kan også enkelt justeres for å implementere en fullstendig transeksjon av ryggmargen i stedet for en hemiseksjon. Løfting av vertebralbuen tillater direkte inspeksjon av den gitte delen av ryggmargen. Dermed kan en liten plate av ryggmargsvev også fjernes for å sikre fullstendig transseksjon.
Bruken av denne nye teknikken er ikke begrenset til rotter, men kan også brukes på andre arter som brukes til å modellere ryggmargsskader (f.eks. mus, griser, hunder). Hovedbegrensningen i denne teknikken er at fordi hemiseksjonen (eller transeksjonen) kun kan utføres i intervertebrale rom, er den ikke egnet for de som spesifikt trenger kuttet som skal plasseres i vertebrale rom. Dessuten, fordi det er en åpen sårteknikk, er den ikke optimal for modellering av kontusjoner eller kompresjonsskader.
Imidlertid kan denne teknikken være det ideelle valget for å studere åpen SCI, da hemiseksjonen (eller transeksjonen) utføres nøyaktig og er lett reproduserbar. Spinalbaner kan også studeres med færre artefakter ettersom vertebralkanalen forblir intakt. Det kan være spesielt nyttig når man studerer minimalt invasive terapeutiske tilnærminger. Ved hjelp av denne teknikken kan oppmerksomheten utelukkende være på behandlingen i stedet for på mulige bivirkninger av operasjonen11.
Avslutningsvis krever denne nye, minimalt invasive teknikken verken nytt utstyr eller dyre innstillinger, da bare utstyr som er lett tilgjengelig i laboratorier som arbeider med dyr, benyttes. Det kan enkelt tilpasses de spesifikke behovene til en gitt studie (skadested; hemi- eller transseksjon; type dyr). Det er også lett å lære. Derfor kan denne modifikasjonen være av interesse for forskere som arbeider med åpne SCI-dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet rapportert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Gergely Ángyán for det originale kunstverket. Dette forskningsarbeidet ble finansiert av Semmelweis University, Budapest, Ungarn. Denne studien ble også støttet av det ungarske Human Resources Development Operational Program (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Ytterligere støtte ble mottatt fra Thematic Excellence Programme (2020-4.1.1.-TKP2020) fra departementet for innovasjon og teknologi i Ungarn, innenfor rammen av terapiens tematiske program ved Semmelweis University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738 (2019).
- Taoka, Y., Okajima, K.
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
