Summary
CUT&RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT & RUN.
Abstract
Het bepalen van de bindingslocaties van een eiwit op chromatine is essentieel voor het begrijpen van de functie en potentiële regulerende doelen. Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) is al meer dan 30 jaar de gouden standaard voor het bepalen van eiwitlokalisatie en wordt gedefinieerd door het gebruik van een antilichaam om het eiwit van belang uit gesoniseerd of enzymatisch verteerd chromatine te halen. Meer recent zijn antilichaam-tetheringtechnieken populair geworden voor het beoordelen van eiwitlokalisatie op chromatine vanwege hun verhoogde gevoeligheid. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) is het genoombrede derivaat van Chromatin Immunocleavage (ChIC) en maakt gebruik van recombinant Protein A vastgebonden aan micrococcebasnuclease (pA-MNase) om het IgG-constante gebied van het antilichaam te identificeren dat zich richt op een eiwit van belang, waardoor site-specifieke splitsing van het DNA mogelijk wordt dat het eiwit van belang flankeert. CUT & RUN kan worden gebruikt om histonmodificaties, transcriptiefactoren en andere chromatine-bindende eiwitten zoals nucleosoomremodelleringsfactoren te profileren. Belangrijk is dat CUT&RUN kan worden gebruikt om de lokalisatie van euchromatische of heterochromatische geassocieerde eiwitten en histonmodificaties te beoordelen. Om deze redenen is CUT&RUN een krachtige methode voor het bepalen van de bindingsprofielen van een breed scala aan eiwitten. Onlangs is CUT&RUN geoptimaliseerd voor transcriptiefactorprofilering in lage populaties van cellen en enkele cellen en het geoptimaliseerde protocol wordt ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN) genoemd. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige factorprofilering met behulp van uliCUT & RUN in een handmatig 96-well-formaat.
Introduction
Veel nucleaire eiwitten functioneren door interactie met chromatine om DNA-gemodelleerde activiteiten te bevorderen of te voorkomen. Om de functie van deze chromatine-interagerende eiwitten te bepalen, is het belangrijk om de genomische locaties te identificeren waarop deze eiwitten gebonden zijn. Sinds de ontwikkeling in 1985 is Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) de gouden standaard om te bepalen waar een eiwit bindt aan chromatine 1,2. De traditionele ChIP-techniek heeft de volgende basisworkflow: cellen worden geoogst en gecrosslinkt (meestal met formaldehyde), chromatine wordt geschoren (meestal met agressieve ultrasoonapparaatmethoden, waardoor crosslinking nodig is), het eiwit van belang wordt immunoprecipiteerd met behulp van een antilichaam dat zich richt op het eiwit (of gelabeld eiwit) gevolgd door een secundair antilichaam (gekoppeld aan agarose of magnetische kralen), crosslinking wordt omgekeerd, eiwit en RNA worden verteerd om DNA te zuiveren, en dit ChIP verrijkt-DNA wordt gebruikt als de sjabloon voor analyse (met behulp van radioactief gelabelde sondes 1,2, qPCR3, microarrays 5,6 of sequencing4). Met de komst van microarrays en massaal parallelle diepe sequencing, zijn ChIP-chip 5,6 en ChIP-seq4 recenter ontwikkeld en maken genoombrede identificatie van eiwitlokalisatie op chromatine mogelijk. Crosslinking ChIP is sinds zijn komst een krachtige en betrouwbare techniek met grote vooruitgang in resolutie door ChIP-exo7 en ChIP-nexus8. Parallel aan de ontwikkeling van ChIP-seq zijn native (niet-crosslinking) protocollen voor ChIP (N-ChIP) vastgesteld, die nucleasevertering gebruiken (vaak met behulp van microkokkennuclease of MNase) om het chromatine te fragmenteren, in tegenstelling tot ultrasoonapparaat uitgevoerd in traditionele crosslinking ChIP-technieken9. Een groot nadeel van zowel crosslinking ChIP- als N-ChIP-technologieën is echter de vereiste voor hoge celaantallen vanwege de lage DNA-opbrengst na de experimentele manipulatie. Daarom zijn er in meer recente jaren veel inspanningen geleverd om ChIP-technologieën te optimaliseren voor lage celinvoer. Deze inspanningen hebben geresulteerd in de ontwikkeling van vele krachtige ChIP-gebaseerde technologieën die variëren in hun toepasbaarheid en invoervereisten 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Eencellige ChIP-seq-gebaseerde technologieën ontbreken echter, vooral voor niet-histoneiwitten.
In 2004 werd een alternatieve technologie ontwikkeld om de eiwitbezetting te bepalen op chromatine genaamd Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) en Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Deze single-locus technieken maken gebruik van een fusie van MNase met het eiwit van belang (ChEC) of met eiwit A (ChIC) voor directe knip van DNA naast het eiwit van belang. In meer recente jaren zijn zowel ChEC als ChIC geoptimaliseerd voor genoombrede eiwitprofilering op chromatine (respectievelijk ChEC-seq en CUT&RUN)20,21. Hoewel ChEC-seq een krachtige techniek is voor het bepalen van factorlokalisatie, vereist het de ontwikkeling van MNase-fusie-eiwitten voor elk doelwit, terwijl ChIC en zijn genoombrede variatie, CUT & RUN, vertrouwen op een antilichaam gericht op het eiwit van belang (zoals bij ChIP) en recombinant eiwit A-MNase, waar het eiwit A het IgG-constante gebied van het antilichaam kan herkennen. Als alternatief is een fusie-eiwit A / Eiwit G-MNase (pA / G-MNase) ontwikkeld dat een breder scala aan antilichaamconstante regio's kan herkennen22. CUT&RUN is snel een populair alternatief geworden voor ChIP-seq voor het bepalen van eiwitlokalisatie op chromatine genoombreed.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), een variant van CUT&RUN die het gebruik van lage en single-cell ingangen mogelijk maakt, werd beschreven in 201923. Hier wordt de methodologie voor een handmatige 96-well formaat single-cell applicatie beschreven. Het is belangrijk op te merken dat sinds de ontwikkeling van uliCUT&RUN twee alternatieven voor histonprofilering, CUT&Tag en iACT-seq, zijn ontwikkeld, die robuuste en zeer parallelle profilering van histoneiwitten24,25 bieden. Bovendien is scCUT&Tag geoptimaliseerd voor het profileren van meerdere factoren in een enkele cel (multiCUT&Tag) en voor toepassing op niet-histoneiwitten26. Samen biedt CUT&RUN een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq met lage input, waar uliCUT&RUN kan worden uitgevoerd in elk laboratorium voor moleculaire biologie dat toegang heeft tot een celsorteerder en standaardapparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring: Alle studies werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Office of Research Protections aan de Universiteit van Pittsburgh.
1. Bereid magnetische kralen voor
OPMERKING: Voer uit voordat u de cel sorteert en houd ijs vast tot gebruik.
- Pipetteer 30 μL conA-geconjugeerde paramagnetische microsferen pareldrijfmestmengsel per reactie op een verse microfugebuis van 1,5 ml en voeg 850 μL bindingsbuffer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen.
OPMERKING: ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen zijn lectine-gecoate magnetische kralen die lipidemembraanbinding mogelijk maken. - Plaats de buis op een magnetisch rek en laat de kralen 1-2 minuten magnetiseren. Zodra het supernatant is opgeruimd, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de buis uit het magneetrek en was de kralen door ze opnieuw te gebruiken in 1 ml bindingsbuffer.
- Herhaal stap 1.2 en 1.3.
- Magnetiseer de kralen gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant om weg te gooien.
- Verwijder de buis uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 30 μL bindingsbuffer per reactie.
- Houd het gewassen kralenmengsel op ijs totdat de cellen zijn gesorteerd.
2. Oogst cellen
OPMERKING: Deze stap is geschreven voor gehechte cellen en geoptimaliseerd voor murine E14 embryonale stamcellen. Het kweken en oogsten van de cellen is afhankelijk van het celtype.
- Verwijder de cellen uit de incubator van 37 °C en onderzoek ze onder een microscoop om de kwaliteit te garanderen.
- Zuig de media uit de celplaat en spoel af met 5 ml 1x PBS.
- Zuig PBS uit de plaat en oogst de cellen (met behulp van traditionele celoogstmethoden die per celtype zullen verschillen). Verkrijg eencellige suspensie door zo nodig voorzichtig op en neer te pipetteren met een serologische pipet tegen de kweekschaal.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en draai gedurende 5 minuten met 200 x g naar beneden.
- Zuig de media af om de celkorrel weg te gooien en te wassen met 5 ml PBS + 1% FBS.
- Draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g , gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 5 ml PBS + 1% FBS.
- Tel de cellen en breng 1 ml van 1 x 106 cellen over in een verse microfugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 5 μL 7-Amino-Actinomycine D (7-AAD) toe, keer de buis goed om om te mengen en breng het monster vervolgens aan op de celsorteerder om levende afzonderlijke cellen te sorteren in individuele putten van een 96-well plaat.
OPMERKING: 7-AAD-kleurstof is uitgesloten van levende cellen en kan daarom worden gebruikt bij het sorteren van levende cellen.
3. Cel sorteren en lysis
- Bereid een celsorteerder-compatibele 96-well plaat met 100 μL nucleaire extractie (NE) buffer in elke put voordat de cel wordt gesorteerd.
- Sorteer de cellen in 96-putplaten volgens de instructies van de fabrikant.
- Draai de plaat snel (600 x g gedurende 30 s) om ervoor te zorgen dat cellen zich in de buffer in de putten bevinden.
OPMERKING: Het is de moeite waard om in een voorlopig experiment te testen of de cellen die worden gebruikt betrouwbaar naar de bodem van de putten worden gebracht. - Houd de monsters 15 minuten op ijs.
- Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g en pipetteer voorzichtig om het supernatant te verwijderen (5 μL achterlatend).
- Resuspend elk monster in 55 μL NE-buffer en voeg 30 μL van de voorgewassen ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen (vanaf stap 1.7; in Binding Buffer) toe aan elke reactie.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
4. Pre-block monsters om vroege vertering door MNase te voorkomen
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat de kralen minimaal 5 minuten binden en verwijder en gooi het supernatant weg.
- Voeg 100 μL Blocking Buffer toe aan de kerngebonden kralen en meng met zacht pipetteren.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Toevoeging van primair antilichaam
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 100 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.
- Plaats de plaat terug op het magnetische rek met 96 putten, laat het supernatant wissen en verwijder en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de kralen in 25 μL wasbuffer per reactie met zacht pipetteren.
- Maak een primaire antilichaammastermix: 25 μL washbuffer + 0,5 μl antilichaam per reactie.
- Terwijl u de kerngebonden kralen voorzichtig vortext, voegt u 25 μL van de primaire antilichaammastermix toe aan elk monster dat wordt behandeld met een antilichaam dat zich richt op het eiwit van belang (meestal 1:100 uiteindelijke verdunning). Voeg 25 μL wasbuffer zonder antilichaam toe als u een controle uitvoert.
- Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat uit het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspenderend door pipetteren.
6. Toevoeging van pA-MNase of pA/G-MNase
OPMERKING: Eiwit A heeft een hoge affiniteit voor IgG-moleculen van bepaalde soorten zoals konijnen, maar is niet geschikt voor Igg's van andere soorten zoals muizen of ratten. Als alternatief kan Protein A /G-MNase worden gebruikt. Deze hybride bindt IgG's van konijnen, muizen en ratten, waardoor de noodzaak van secundaire antilichamen wordt vermeden wanneer primaire antilichamen van muizen of ratten worden gebruikt.
- Plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat uit het magnetische rek en breng elk monster opnieuw uit in 25 μL wasbuffer.
- Maak een pA-MNase master mix (25 μL Wash Buffer + geoptimaliseerde hoeveelheid pA-MNase per reactie).
- Voeg tijdens het vortexen voorzichtig 25 μL van de pA-MNase-mastermix toe aan elk monster, inclusief de controlemonsters.
OPMERKING: De concentratie van pA-MNase varieert afhankelijk van de bereiding, indien zelfgemaakt, en moet vóór gebruik bij elke onafhankelijke zuivering worden getest. Voor pA/G-MNase moet 2,5 μL van de 20x bouillon worden gebruikt. - Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Verwijder de plaat van het magneetrek en was de kralen met 100 μL wasbuffer, resuspendatie door zacht pipetteren.
7. Gerichte DNA-vertering
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 bronnen, laat het supernatant minimaal 5 minuten wissen en verwijder en gooi het supernatant vervolgens weg.
- Verwijder de monsters uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw op in 50 μL wasbuffer door zachtjes te pipetteren.
- Breng de monsters gedurende 5 minuten in evenwicht tot 0 °C in een mengsel van ijs en water.
- Verwijder de monsters uit het ijs-/waterbad van 0 °C en voeg 1 μL van 100 mM CaCl2 toe met behulp van een meerkanaalspipet. Meng goed (3-5 keer) met zacht pipetteren met een meerkanaalspipet met een groter volume en breng de monsters terug tot 0 °C.
OPMERKING: Goed mengen is hier essentieel. CaCl2 wordt toegevoegd om de MNase-vertering van DNA te activeren dat het eiwit van belang flankeert. - Start een timer van 10 minuten zodra de plaat weer in het ijs/waterbad ligt.
- Stop de reactie door 50 μL 2XRSTOP+ Buffer in elke put te pipetteren, in dezelfde volgorde als de CaCl2 werd toegevoegd.
OPMERKING: Maak 2XRSTOP + Buffer voordat de 10 minuten vertering voorbij is om oververtering te voorkomen.
8. Fractionering van monsters
- Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Draai de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C op 16.000 x g .
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten, laat het supernatant minimaal 5 minuten leegmaken en breng de bovennatuurlijke stoffen over naar een verse plaat met 96 putten. Gooi de kralen weg.
9. DNA-extractie
- Voeg 1 μL 10% natriumdodecylodylsulfaat (SDS) en 0,83 μL 20 mg/ml proteïnase K toe aan elk monster.
LET OP: SDS poeder is schadelijk bij inademing. Gebruikers moeten in goed geventileerde ruimtes een bril, handschoenen en een N95-grade gasmasker dragen, waarbij ze voorzichtig moeten omgaan. - Meng de monsters door zachtjes te pipetteren.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 70 °C.
- Breng de plaat terug op kamertemperatuur en voeg 46,6 μL van 5 M NaCl en 90 μL van 50% PEG 4000 toe. Meng door zachtjes te pipetteren.
- Voeg 33 μL polystyreen-magnetietkorrels toe aan elk monster en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u polystyreen-magnetiet kralen op kamertemperatuur brengt (~ 30 min) en meng goed voor gebruik. - Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat het supernatant gedurende ~ 5 minuten wissen en gooi het supernatant vervolgens voorzichtig weg zonder de kralen te verstoren.
- Spoel 2x met 150 μL 80% ethanol zonder de kralen te storen.
LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en veroorzaakt huid-, oog- en longirritatie. Voer deze stap uit met geschikte laboratoriumkleding en in een geventileerde capuchon. - Draai de plaat kort op 1000 x g gedurende 30 s. Plaats de plaat terug op een 96-well magnetisch rek en verwijder alle resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.
- Droog de monsters aan de lucht gedurende ~ 2-5 minuten.
LET OP: Droog de kralen niet langer dan 5 min. Als u ijverig bent over het verwijderen van de EtOH, is 2-3 minuten drogen voldoende. - Resuspend de kralen met 37,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de kralen 5 minuten binden.
- Breng 36,5 μL van het supernatant over op een verse thermocycler compatibele 96-well plaat. Gooi de kralen weg.
OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door monsters op te slaan bij -20 °C of kan doorgaan met het bouwen van de bibliotheek (stappen 10-15).
10. Eindreparatie, fosforylering, adenylering
OPMERKING: De reagentia zijn afkomstig zoals vermeld in de tabel met materialen. Het onderstaande protocol volgt een vergelijkbare methode als de commerciële kit zoals DE NEBNext Ultra DNA II-kit.
- Verdun 5 U/μL T4 DNA polymerase 1:20 in 1x T4 DNA ligase buffer.
- Bereid een eindreparatie/3'A mastermix voor: 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer, 2,5 μL van 10 mM dNTPs, 1,25 μL van 10 mM ATP, 3,13 μL van 40% PEG 4000, 0,63 μL van 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL verdund T4 DNA polymerase, 0,5 μL van 5U/μL Taq DNA polymerase, met een totaal volume van 13,5 μL per reactie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u 40% PEG 4000 op kamertemperatuur brengt voordat u pipettert. - Voeg 13,5 μL eindreparatie/3'A mastermix toe aan 36,5 μL DNA.
- Meng de reactie door een snelle vortex en vervolgens een snelle spin (500 x g gedurende 10 s).
- Incubeer met behulp van de volgende reactieomstandigheden in een voorgekoelde thermocycler met een verwarmd deksel voor temperaturen >20 °C. Gebruik de reactieomstandigheden: 12 °C gedurende 15 minuten, 37 °C gedurende 15 minuten, 72 °C gedurende 20 minuten, houd bij 4 °C.
11. Adapter ligatie
OPMERKING: Houd de monsters op ijs tijdens het instellen van de volgende reactie. Laat de ligasebuffer op kamertemperatuur komen voordat u gaat pipetteren. Verdun de adapter (zie materiaaltabel) in een oplossing van 10 mM Tris-HCl met 10 mM NaCl (pH 7,5). Vanwege de lage opbrengst, niet vooraf kwantificeren van het CUT & RUN-verrijkte DNA. Genereer in plaats daarvan 25-voudige verdunningen van de adapter, met behulp van een eindwerkadapterconcentratie van 0,6 μM.
- Maak een ligatiemastermix: 55 μL ligasebuffer (2x), 5 μL T4 DNA-ligase en 5 μL verdunde adapter, met een totaal volume van 65 μL per reactie.
- Voeg 65 μL van het hoofdligatiemengsel toe aan 50 μL DNA uit stap 10.5.
- Meng door snel vortexen, gevolgd door snel draaien (500 x g gedurende 10 s).
- Incubeer bij 20 °C in een thermocycler (zonder verwarmd deksel) gedurende 15 min.
OPMERKING: Ga onmiddellijk verder met de volgende stap.
12. Gebruikersvertering
- Voeg 3 μL USER-enzym toe aan elk monster, vortex en spin (500 x g gedurende 10 s).
- Incubeer in thermische cycler bij 37 °C gedurende 15 minuten (verwarmd deksel ingesteld op 50 °C).
13. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen na ligatiereactie
OPMERKING: Laat polystyreen-magnetietparels in evenwicht brengen bij kamertemperatuur (~ 30 min). Vortex om de kraaloplossing te homogeniseren voor gebruik. Voer de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.
- Voeg 39 μL (0,33x) polystyreen-magnetietkraaloplossing toe aan elke put die adaptor-geligeerd DNA bevat.
- Meng grondig door te pipetteren en incubeer de monsters vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om DNA aan de kralen te laten binden.
- Plaats de monsters op een magnetisch rek met 96 putten en incubeer gedurende 5 minuten totdat het supernatant helder is.
- Houd de plaat op het magnetische rek en verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
- Spoel de kralen af met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.
- Incubeer gedurende 30 s op een magnetisch rek met 96 putten om de oplossing te laten wissen.
- Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Herhaal stap 13,5-13,7 voor in totaal twee wasbeurten.
- Draai de plaat kort op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat terug op een magnetisch rek met 96 putten en verwijder de resterende EtOH zonder de kralen te verstoren.
- Houd de plaat op het magneetrek en droog de monsters gedurende 2 minuten aan de lucht.
LET OP: Droog de kralen niet te veel. - Verwijder de plaat uit het magneetrek en breng de kralen opnieuw uit in 28,5 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).
LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief. Gebruikers moeten er voorzichtig mee omgaan in een chemische zuurkast met een bril, handschoenen en een laboratoriumjas. - Reuspend kralen grondig door pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bubbels ontstaan.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.
- Breng 27,5 μL supernatant over op een nieuwe PCR-plaat en gooi de kralen weg.
14. Bibliotheekverrijking
OPMERKING: Primers worden verdund met dezelfde oplossing als de adapter. Gebruik voor deze bibliotheekopbouw een eindwerkprimerconcentratie van 0,6 μM.
- Voeg 5 μL verdunde geïndexeerde primer (zie Materiaaltabel) toe aan elk monster.
OPMERKING: Elk monster heeft een andere index nodig die na sequencing moet worden geïdentificeerd. - Bereid een PCR-mastermix voor: 10 μL 5x high fidelity PCR-buffer, 1,5 μL van 10 mM dNTPs, 5 μL verdunde Universal primer, 1 μL van 1 U hot start high fidelity polymerase, met een totaal mastermixvolume van 17,5 μL per monster.
- Voeg 17,5 μL pf PCR-mix toe aan 32,5 μL gezuiverd adaptor-geligeerd DNA (5 μL geïndexeerde primer is inbegrepen in dit volume).
- Meng de oplossing door te pipetteren.
- Incubeer in een thermocycler met behulp van de volgende reactieomstandigheden met een maximale hellingsnelheid van 3 °C/s: 98 °C gedurende 45 s, 98 °C gedurende 45 s, 60 °C gedurende 10 s, herhaal de tweede en derde stap 21 keer, 72 °C gedurende 1 minuut, houd bij 4 °C.
OPMERKING: De monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C voor opslag op korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.
15. Polystyreen-magnetiet kraal opruimen
- Voeg 60 μL (1,2x) polystyreen-magnetietparels toe aan elk monster.
- Resuspend de kralen door te pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is.
- Gooi het supernatant weg en spoel de kralen met 200 μL van 80% EtOH zonder de kralen te storen.
- Herhaal de wasstap voor in totaal twee 80% EtOH-wasbeurten.
- Draai de plaat op 500 x g gedurende 10 s, plaats de plaat op een magnetisch rek met 96 putten en laat de kralen 5 minuten binden.
- Pipetteer om overtollige EtOH te verwijderen zonder de kralen te storen en laat de kralen 2 minuten aan de lucht drogen.
LET OP: Droog de kralen niet te veel. - Resuspend de kralen in 21 μL nucleasevrij water en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek en laat de oplossing 5 minuten leegmaken.
- Breng 20 μL van het supernatant over op een nieuwe plaat.
OPMERKING: Het experiment kan hier worden gestopt door het monster bij -20 °C te bewaren. - Kwantificeer bibliotheekconcentraties met een fluorometer (zie Tabel met materialen), met behulp van een 1x HS-reagens.
- Als de concentratie het toelaat, voer dan 30 ng monster uit op 1,5% agarosegel met een ladder met een laag molecuulgewicht om te visualiseren. U kunt ook visualiseren op een Fragment Analyzer of een gerelateerd instrument.
- Sequentiebibliotheken op een Illumina-platform om ~ 50.000-100.000 uniek in kaart gebrachte reads te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor eencellige eiwitprofilering op chromatine met behulp van een 96-well handmatig formaat uliCUT & RUN. Hoewel de resultaten zullen variëren op basis van het eiwit dat wordt geprofileerd (vanwege de overvloed aan eiwitten en de kwaliteit van antilichamen), celtype en andere bijdragende factoren, worden de verwachte resultaten voor deze techniek hier besproken. Celkwaliteit (celuitstraling en percentage levensvatbare cellen) en eencellige sortering moeten worden beoordeeld vóór of op het moment van het sorteren van levende cellen in de NE-buffer. Een voorbeeld van ES-celkolonies en celsortering is weergegeven in figuur 2A,B. In het bijzonder mogen cellen van lage kwaliteit niet worden gebruikt en als de kwaliteit een probleem is, moet ervoor worden gezorgd dat de richtlijnen voor het specifieke celtype worden gevolgd. Bovendien moet de nauwkeurige celsortering door het celsorteerinstrument voorafgaand aan de experimenten worden beoordeeld. Testcellen kunnen bijvoorbeeld worden gesorteerd en gekleurd met behulp van Hoechst 33342-vlek en worden geteld om ervoor te zorgen dat er 0 of 1 cel in elke put wordt gevonden. Als er geen afzonderlijke cellen worden gevonden, moeten de sorteeromstandigheden worden geoptimaliseerd. Na bibliotheekvoorbereiding kunnen monsters worden beoordeeld op een agarosegel (als de concentratie een belasting van 30 ng of meer toelaat, omdat er een ondergrens is voor DNA-visualisatie op een agarosegel) of een Fragment Analyzer (of een vergelijkbaar apparaat zoals een tapestation of bioanalyzer) voorafgaand aan de sequencing en voorbeeldresultaten worden weergegeven in figuur 2C, D. Specifiek is de verwachte grootteverdeling van ~ 150 tot ~ 500 bp. In hogere celhoeveelheden zal CUT & RUN uitgevoerd op grote eiwitten (zoals histonen) een rechtszijdige grootteverdeling hebben, waarbij het grootste deel van het DNA ~ 270 bp zal worden gezien; deze schouder wordt echter meestal niet waargenomen in eencellige experimenten.
Na sequencing moet de kwaliteit van de sequencing reads worden beoordeeld met behulp van FASTQC. Het percentage uniek in kaart gebrachte reads moet worden bepaald. Doorgaans worden 0,5% -10% unieke kaartlezingen waargenomen in eencellige experimenten. Deze mappingpercentages zijn vergelijkbaar met andere op DNA gebaseerde eencellige technieken30. Vervolgens moet de grootteverdeling van de reads na mapping worden bepaald om ervoor te zorgen dat het profiel vergelijkbaar is met pre-sequencing (waarbij de adaptersequentie niet langer bijdraagt aan de leesgroottes).
Nadat de gegevenskwaliteit is beoordeeld, kan de eiwitbezetting worden gevisualiseerd met behulp van verschillende methoden: single locus genome browser-afbeeldingen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van UCSC-genoombrowser of IGV (figuur 3A) en genoombrede bezettingspatronen over specifieke genomische coördinaten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van metaplots (figuur 3B, onder), heatmaps (figuur 3B, boven) of 1D-heatmaps (figuur 3C). Voor meer informatie over data-analyse, zie de studie van Patty en Hainer27. Eencellige gegevens van een diploïde cel zullen resulteren in maximaal vier metingen die bijdragen aan elke locus (vier lezingen als de cel in mitose was), maar vaker één of twee lezingen. Daarom zijn de gegevens binair en kan een hoge achtergrond gemakkelijker worden aangezien voor bezetting, ten opzichte van experimenten met hoge cellen. Daarom wordt aanbevolen om een parallel CUT&RUN-experiment uit te voeren op een hoog celnummer (5.000 tot 100.000 cellen), indien mogelijk, om alle mogelijke bindingslocaties voor het betreffende eiwit te verkrijgen. Vervolgens kunnen eencellige gegevens worden vergeleken met mogelijke bindingslocaties. In de voorbeelden in figuur 3 worden eencellige CTCF uliCUT&RUN-resultaten vergeleken met hoogcellige CTCF uliCUT&RUN (figuur 3A) of ChIP-seq (figuur 3B,C). Zoals eerder aangetoond, vertegenwoordigden CTCF, SOX2 en NANOG eencellige uliCUT & RUN-pieken grotendeels sterkere pieken van hoogcellige ChIP-seq-datasets23.
Figuur 1: Schema van het uliCUT&RUN protocol. Cellen worden geoogst en gesorteerd in een 96-putplaat met NE-buffer. Individuele kernen worden vervolgens gebonden aan ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen, en achtereenvolgens worden een antilichaam (gericht op het eiwit van belang) en pA-MNase of pA / G-MNase toegevoegd. Eiwit-aangrenzend DNA wordt gesplitst via MNase en DNA wordt vervolgens gezuiverd voor gebruik in bibliotheekvoorbereiding. Deze figuur is gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeldresultaten van celsortering en kwaliteitscontrole van uliCUT&RUN-bibliotheken. (A) Afbeelding van hoogwaardige muizenembryonale stamcellen (ES). Schaalbalk: 200 μm. (B) Uitvoer van eencellige sortering na toevoeging van 7AAD aan geoogste ES-cellen en sortering op een FACS-instrument. (C) Ethidium bromide-gekleurde agarose gel met voltooide uliCUT & RUN bibliotheken. Lane 1 is een ladder met een laag molecuulgewicht en lanes 2-21 zijn voorbeelden van succesvolle individuele eencellige uliCUT & RUN-bibliotheken voorafgaand aan sequencing. (D) Ethidium bromide-gekleurde agarose gel met suboptimale en optimale voltooide uliCUT& RUN bibliotheken. Lane 1 is een ladder met een laag molecuulgewicht, lane 2 is een suboptimale bibliotheek vanwege inefficiënte MNase-vertering en lane 3 is een succesvolle bibliotheek met de juiste spijsvertering. (E) Fragment analyzer distributie van één enkele cel uliCUT&RUN bibliotheek voorafgaand aan sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van verwachte resultaten voor uliCUT&RUN-gegevens met één ES-cel. (A) Browser track van hoog celnummer (5.000 cellen) CTCF of negatieve controle (Geen Antilichaam, Geen Ab) uliCUT&RUN (bovenste twee sporen) en eencellige CTCF uliCUT&RUN. Het beeld is, met toestemming, overgenomen van Patty en Hainer27. (B) Heatmaps (boven) en metaplots (onder) van eencellige CTCF of negatieve controle (No Ab) uliCUT&RUN over eerder gepubliceerde CTCF ChIP-seq sites (GSE11724). De afbeelding is, met toestemming, overgenomen van Hainer et al.23. (C) 1D heatmaps van eencellige CTCF of negatieve controle (No Ab) uliCUT&RUN over eerder gepubliceerde CTCF ChIP-seq sites (GSE11724). De afbeelding is, met toestemming, overgenomen van Hainer et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van de verschillende buffers die in dit protocol worden gebruikt. Het benodigde volume van de stamoplossing wordt vermeld met de eindconcentratie tussen haakjes. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CUT&RUN is een effectief protocol om eiwitlokalisatie op chromatine te bepalen. Het heeft veel voordelen ten opzichte van andere protocollen, waaronder: 1) hoge signaal-ruisverhouding, 2) snel protocol en 3) lage sequencing leesdekking vereist, wat leidt tot kostenbesparingen. Het gebruik van Protein A- of Protein A/G-MNase maakt het mogelijk om CUT&RUN toe te passen met elk beschikbaar antilichaam; daarom heeft het de potentie om snel en gemakkelijk veel eiwitten te profileren. Aanpassing aan eencellige voor elke eiwitprofilering op chromatine is echter moeilijk geweest, vooral in vergelijking met eencellige transcriptomica (d.w.z. scRNA-seq), vanwege het lage aantal kopieën van DNA ten opzichte van RNA (twee tot vier kopieën van DNA versus mogelijk duizenden RNA-kopieën).
In het hierboven beschreven protocol moeten verschillende kritieke stappen worden overwogen. Ten eerste is de juiste sortering van cellen afhankelijk van het celtype (of weefsel) en moet worden gezorgd voor een nauwkeurige sortering. Het wordt aanbevolen om voorafgaand aan elk experiment te testen hoe effectief eencellige sortering is met het instrument. Ten tweede is effectieve antilichaamkeuze essentieel. Alvorens over te gaan tot een eencellige toepassing, wordt aanbevolen om het antilichaam te testen in een experiment met een hoog celgetal (evenals andere standaard antilichaamtests, zoals het bevestigen van specificiteit met behulp van western blot na knockdown, titratie van het antilichaam in CUT & RUN-experimenten, enz.). Ten derde, gebruik een negatieve controle, zoals IgG of geen primair antilichaam, omdat een passende vergelijking met de experimentele monsters essentieel is voor de interpretatie van de gegevenskwaliteit en biologische resultaten. Bij het vergelijken van eencellige experimentele resultaten met een dataset met een hoog celnummer, zouden de negatieve controle eencellige experimenten minder leesdekking moeten hebben over die bindingsplaatsen die zijn geïdentificeerd in het hogecellige experiment en eerder een willekeurige verdeling van leesbewerkingen over het genoom moeten hebben (met een vertekening voor open gebieden van chromatine). Ten vierde moet voorzichtigheid worden betracht bij het toevoegen en activeren van het eiwit A- of eiwit A/G-MNase om het chromatine niet te veel te verteren: oververhit de monsters niet met uw handen, houd de monsters op een ijs-/waterbadtemperatuur (0 °C) en cheleer de reactie op het juiste moment. Ten vijfde moet voorzichtigheid worden betracht tijdens het uliCUT & RUN-experiment en de voorbereiding van de bibliotheek, vanwege het lage materiaal. Bijvoorbeeld, uitgebreide incubatie op het magnetische rek tijdens het binden van de kraal om ervoor te zorgen dat het supernatant is verdwenen en ervoor te zorgen dat de kralen niet worden verstoord bij het verwijderen van het supernatant zijn essentieel voor voldoende opbrengst. Ten zesde is, afhankelijk van de vragen die worden behandeld, het aantal eencellige experimenten dat wordt uitgevoerd een belangrijke overweging. Sommige van de eencellige experimenten zullen mislukken (zoals bij alle experimenten met een lage input), en daarom moet het aantal positieve experimentele resultaten dat nodig is voor een juiste interpretatie worden overwogen voordat met het experiment wordt begonnen. Het aantal cellen dat in het experiment moet worden opgenomen, is afhankelijk van de hoeveelheid experimentele gegevens die de onderzoeker nodig heeft en de kwaliteit van het antilichaam. Merk ten slotte op dat gelijkwaardige resultaten kunnen worden bereikt met verminderde volumes van vele aspecten van dit protocol. Stappen waarbij het volume met 50% werd verminderd, omvatten het volume van de NE-buffer, de wasbuffer, het primaire antilichaammengsel (inclusief de hoeveelheid primair antilichaam), het pA-MNase-mengsel (inclusief de hoeveelheid pA-MNase) en alle stappen in de bibliotheekvoorbereiding.
Op basis van de gecompliceerde aard van factorprofilering op chromatine, zijn er veel potentiële bronnen van problemen en plaatsen waar probleemoplossing noodzakelijk kan worden. Hoewel er veel stappen kunnen zijn waar problemen kunnen optreden, zijn er drie belangrijke problemen waargenomen: 1) lage DNA-opbrengst voor invoer in bibliotheekopbouw; 2) hoog achtergrondsignaal in experimentele monsters en 3) lage opbrengst na het bouwen van de bibliotheek. Als er onvoldoende DNA is voor bibliotheekvoorbereiding en sequencing (punt 1), let dan op het volgende advies voor probleemoplossing: a) er kan onvolledige membraanlysis zijn geweest en daarom kan de lysistijd met NE-buffer worden verhoogd; b) er kan sprake zijn geweest van inefficiënte binding van de kern aan de ConA-geconjugeerde paramagnetische microsferen en dit zou kunnen worden verholpen door passende menging bij toevoeging van deze kralen; c) er kan te weinig antilichaam zijn toegevoegd en daarom wordt aanbevolen om een titratie van antilichamen uit te voeren om de meest effectieve hoeveelheid te bepalen; d) incubatietijden met het primaire antilichaam of het eiwit A- of eiwit A/G-MNase zijn ofwel te kort (d.w.z. niet genoeg tijd om binding mogelijk te maken) of te lang (dit zijn inheemse, niet-gekoppelde monsters) en kunnen worden geoptimaliseerd; e) de interactie van het doeleiwit met chromatine zou te vluchtig kunnen zijn om in inheemse omstandigheden te vangen en daarom zou crosslinking CUT&RUN kunnen worden uitgevoerd28. Hoewel eencellige datasets een hoge achtergrond opleveren, kan er een te hoge achtergrond zijn waarbij het signaal moeilijk te interpreteren is vanaf de achtergrond (punt 2). Let voor dit probleem op het volgende advies: a) de blokkeringsstap met EDTA om preventieve MNase-vertering te voorkomen, kan worden verhoogd of geoptimaliseerd; b) als er overmatig snijden is, kan dit te wijten zijn aan het hebben van te veel eiwit A- of eiwit A / G-MNase, en daarom kan een titratie van passende hoeveelheden worden uitgevoerd; c) oververtering door MNase kan resulteren in de hoge achtergrond, en daarom moet de juiste menging van calciumchloride bij toevoeging en optimalisatie voor de MNase-verteringstijd worden beoordeeld. Ten slotte kan efficiënt uliCUT& RUN-verrijkt DNA zijn teruggevonden, maar een lage hoeveelheid bibliotheek kan worden teruggevonden (punt 3). Voor dit probleem wordt het volgende aanbevolen: a) passende behandeling en gebruik van polystyreen-magnetietkralen om de juiste zuivering en geen DNA-verlies te garanderen; in het bijzonder wordt aanbevolen om incubaties van 15 minuten te hebben en een minimum van 5 minuten om kralen te magnetiseren om verlies te voorkomen; b) onderversterking van de bibliotheek in de PCR-fase zou resulteren in een lage opbrengst en daarom moeten de juiste cycli worden bepaald met behulp van qPCR (zoals eerder vastgesteld voor ATAC-seq-bibliotheken29).
Zoals met alle technologieën, zijn er beperkingen aan uliCUT & RUN die moeten worden overwogen voordat u een experiment start. Ten eerste zijn deze experimenten ontworpen en geoptimaliseerd voor inheemse omstandigheden, en daarom, als een eiwit slechts tijdelijk interageert met chromatine, kan een crosslinking-benadering nodig zijn om herstel van de interactie te garanderen. Ten tweede is, zoals bij alle op antilichamen gebaseerde technieken, de kwaliteit van het antilichaam belangrijk. Er moet voor worden gezorgd dat de kwaliteit en consistentie van het antilichaam worden gewaarborgd voordat er experimenten worden uitgevoerd. Ten derde kan MNase-achtergrondsnijden optreden en hoewel er een consistent lager achtergrondsignaal is in CUT & RUN in vergelijking met andere experimenten, kan het achtergrondsignaal hoog zijn in eencellige experimenten en daarom moeten geschikte controles en analyses worden uitgevoerd. Hoewel de binaire aard van eencellige profileringsgegevens de visualisatie beperkt, kunnen meer geavanceerde computationele genomische technologieën, zoals dimensionale reductie en andere, worden uitgevoerd (zoals eerder beschreven27). Ten slotte, terwijl single-cell profiling hier is uitgebreid naar 96-well-formaat, is dit een lage doorvoer in vergelijking met andere single-cell technologieën die 10xGenomics of andere formaten gebruiken.
Op tethering gebaseerde profileringstechnologieën zoals ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 en uliCUT&RUN23 kunnen factorlokalisatie op chromatine bepalen met een snellere experimentele tijdlijn, lagere achtergrond en lagere kosten dan traditionele profileringstechnologieën, zoals ChIP-seq. Daarom zijn dit zeer opwindende technologieën voor toepassing op kostbare monsters zoals patiëntmonsters of vroege ontwikkelingsmonsters. Bovendien kan toepassing op afzonderlijke cellen aanvullende studies opleveren die worden uitgevoerd met behulp van andere eencellige experimenten zoals scRNA-seq en scATAC-seq30. Zoals beschreven met behulp van deze meer breed gebruikte eencellige technologieën, kunnen nieuwe inzichten worden verkregen met betrekking tot bulkcelexperimenten. Verwacht wordt dat eencellige eiwitprofilering op chromatine regelmatiger zal worden gebruikt naarmate de technologieën blijven verbeteren en meer parallellisatie mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen met betrekking tot dit project.
Acknowledgments
We bedanken leden van het Hainer Lab voor het lezen en becommentariëren van een eerdere versie van dit manuscript. Dit project gebruikte de NextSeq500 beschikbaar bij de University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core in het UPMC Children's Hospital of Pittsburgh voor sequencing met speciale dank aan de directeur, William MacDonald. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het University of Pittsburgh Center for Research Computing via de verstrekte computerbronnen. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (aan S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M.
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S.
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
