Summary
CUT&RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。
Abstract
クロマチン上のタンパク質の結合位置を決定することは、その機能および潜在的な調節標的を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降(ChIP)は、30年以上にわたりタンパク質の局在を決定するためのゴールドスタンダードであり、超音波処理または酵素消化クロマチンから目的のタンパク質を引き出すための抗体の使用によって定義されています。より最近では、抗体テザリング技術は、その感度の増加のためにクロマチン上のタンパク質局在を評価するために普及している。Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) は、クロマチン免疫切断 (ChIC) のゲノムワイド誘導体であり、ミクロコッカスヌクレアーゼ (pA-MNase) に連結された組換えプロテイン A を利用して、目的のタンパク質を標的とする抗体の IgG 定常領域を同定し、目的のタンパク質に隣接する DNA の部位特異的切断を可能にします。CUT&RUNは、ヒストン修飾、転写因子、およびヌクレオソームリモデリング因子などの他のクロマチン結合タンパク質をプロファイリングするために使用することができる。重要なことに、CUT&RUNは、真色または異色に関連するタンパク質およびヒストン修飾のいずれかの局在化を評価するために使用することができる。これらの理由から、CUT&RUNは広範囲のタンパク質の結合プロファイルを決定するための強力な方法です。最近、CUT&RUNは低集団の細胞および単一細胞における転写因子プロファイリングに最適化されており、最適化されたプロトコルは超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)と呼ばれています。ここでは、uliCUT&RUNを使用した単一細胞因子プロファイリングのための詳細なプロトコルを、手動の96ウェル形式で提示する。
Introduction
多くの核タンパク質は、クロマチンと相互作用してDNAテンプレート化された活性を促進または防止することによって機能する。これらのクロマチン相互作用タンパク質の機能を決定するためには、これらのタンパク質が結合しているゲノム位置を特定することが重要です。1985年の開発以来、クロマチン免疫沈降法(ChIP)は、タンパク質がクロマチン1,2に結合する場所を特定するためのゴールドスタンダードとなっています。従来のChIP技術は、以下の基本的なワークフローを有する:細胞を回収し、架橋し(通常はホルムアルデヒドで)、クロマチンを剪断し(通常は架橋を必要とする過酷な超音波処理法で)、目的のタンパク質を標的とする抗体を用いて免疫沈降させ、続いて二次抗体(アガロースまたは磁気ビーズに結合)、架橋を逆転させ、 タンパク質とRNAを消化してDNAを精製し、このChIP富化DNAを分析のテンプレートとして使用します(放射性標識プローブ1、2、qPCR3、マイクロアレイ5、6、またはシーケンシング4を使用)。マイクロアレイと超並列ディープシーケンシングの出現により、ChIPチップ5,6およびChIP-seq4が最近開発され、クロマチン上のタンパク質局在のゲノムワイドな同定が可能になりました。ChIPの架橋は、ChIP-exo7およびChIP-nexus8による解像度の大幅な進歩により、その出現以来強力で信頼性の高い技術でした。ChIP-seqの開発と並行して、ChIP(N-ChIP)のネイティブ(非架橋)プロトコルが確立されており、従来の架橋ChIP技術9で行われる超音波処理とは対照的に、クロマチンを断片化するためにヌクレアーゼ消化(しばしばミクロコッカスヌクレアーゼまたはMNaseを使用する)を利用する。しかし、ChIPとN-ChIPの両方の架橋技術に対する大きな欠点の1つは、実験操作後のDNA収率が低いため、高い細胞数が必要であることです。したがって、近年では、低セル入力のためのChIP技術の最適化に向けて多くの努力が払われています。これらの努力の結果、適用性と入力要件が異なる多くの強力なChIPベースの技術が開発されました10,11,12,13,14,15,16,17,18。しかし、単一細胞ChIP-seqベースの技術は、特に非ヒストンタンパク質については欠けていた。
2004年、クロマチン内因性切断(ChEC)およびクロマチン免疫切断(ChIC)19と呼ばれるクロマチンのタンパク質占有率を決定するための代替技術が開発されました。これらの単一遺伝子座技術は、目的のタンパク質(ChEC)またはプロテインA(ChIC)のいずれかへのMNaseの融合を利用して、目的のタンパク質に隣接するDNAを直接切断します。近年、ChECとChICの両方がクロマチン(それぞれChEC-seqとCUT&RUN)上のゲノムワイドタンパク質プロファイリングに最適化されています20,21。ChEC-seqは因子の局在を決定するための強力な技術ですが、各標的に対してMNase融合タンパク質を開発する必要がありますが、ChICとそのゲノムワイドバリエーションであるCUT&RUNは、目的のタンパク質に向けられた抗体(ChIPと同様に)と組換えプロテインA-MNaseに依存しており、プロテインAは抗体のIgG定常領域を認識できます。代替として、より広い範囲の抗体定常領域を認識できる融合プロテインA/プロテインG-MNase(pA/G-MNase)が開発されている22。CUT&RUNは、クロマチンゲノムワイドでのタンパク質局在を決定するためのChIP-seqの代替手段として急速に普及しています。
超低入力CUT&RUN(uliCUT&RUN)は、低セル入力とシングルセル入力の使用を可能にするCUT&RUNのバリエーションであり、201923で説明されました。ここでは、手動の96ウェルフォーマット単一セルアプリケーションのための方法論が説明される。uliCUT&RUNの開発以来、ヒストンプロファイリングのための2つの選択肢であるCUT&TagとiACT-seqが開発され、ヒストンタンパク質の堅牢で高度に並列なプロファイリングが提供されていることに注意することが重要です24,25。さらに、scCUT&Tagは、単一細胞内の複数の因子のプロファイリング(multiCUT&Tag)および非ヒストンタンパク質への適用のために最適化されている26。CUT&RUNは、細胞ソーターと標準機器にアクセスできる分子生物学ラボでuliCUT&RUNを実行できる低入力ChIP-seqの魅力的な代替手段を提供します。
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Protocol
倫理的声明:すべての研究は、ピッツバーグ大学のInstitutional Biosafety Office of Research Protectionsによって承認されました。
1. 磁気ビーズの調製
メモ:細胞選別の前に行い、使用するまで氷の上に保持してください。
- 反応ごとに30 μLのConA結合常磁性微小球ビーズスラリーを新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに混合し、850 μLの結合バッファーを加え、穏やかにピペッティングして混合します。
注:ConA結合型常磁性微小球は、脂質膜結合を可能にするレクチンコーティングされた磁気ビーズである。 - チューブを磁気ラックの上に置き、ビーズが1〜2分間磁化するようにします。上澄み液がきれいになったら、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して捨てます。
- 磁気ラックからチューブを取り出し、1 mL の結合バッファーに再懸濁してビーズを洗浄します。
- 手順 1.2 と 1.3 を繰り返します。
- ビーズを2分間磁化し、上清を除去して廃棄する。
- 磁気ラックからチューブを取り出し、反応ごとにビーズを30 μLの結合バッファーに再懸濁します。
- 細胞が選別されるまで、洗浄したビーズミックスを氷の上に保持する。
2. 細胞の採取
注:このステップは、接着細胞用に書かれており、マウスE14胚性幹細胞用に最適化されています。細胞の培養および回収は、細胞種に依存する。
- 細胞を37°Cのインキュベーターから取り出し、顕微鏡下で検査して品質を保証します。
- 細胞プレートから培地を吸引し、5mLの1x PBSですすいでください。
- プレートからPBSを吸引し、細胞を回収する(細胞タイプによって異なる従来の細胞採取方法を使用する)。必要に応じて培養皿に対して血清学的ピペットで上下に穏やかにピペッティングすることにより単一細胞懸濁液を得る。
- 細胞懸濁液を15mL円錐管に移し、200 x g で5分間スピンダウンする。
- 培地を吸引して細胞ペレットを廃棄し、5mLのPBS+1%FBSで洗浄する。
- 細胞を200 x g で5分間スピンダウンし、上清を捨て、細胞ペレットを5mLのPBS+1%FBSに再懸濁する。
- 細胞を数え、1 mLの1 x106 細胞を新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに移す。
- 5 μL の 7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD) を加え、チューブウェルを反転させて混合し、サンプルをセルソーターに塗布して、生単一細胞を 96 ウェルプレートの個々のウェルに選別します。
注:7-AAD色素は生細胞から除外されているため、生細胞選別に使用できます。
3. 細胞の選別と溶解
- 細胞ソーティングの前に、各ウェルに 100 μL の核抽出 (NE) バッファーを含むセルソーター対応の 96 ウェルプレートを用意します。
- 製造元の指示に従って細胞を96ウェルプレートに分類します。
- プレートを素早く回転させ(600 x g (30 秒間)、細胞がウェル内のバッファー内にあることを確認します。
注:予備実験では、使用されている細胞が確実にウェルの底に持ち込まれているかどうかをテストする価値があります。 - サンプルを氷の上に15分間保持します。
- サンプルを 600 x g で 4 °C で 5 分間スピンダウンし、慎重にピペットで上清を除去しました (5 μL を残します)。
- 各サンプルを 55 μL の NE バッファーに再懸濁し、30 μL の予備洗浄した ConA 結合常磁性ミクロスフェア (ステップ 1.7 から、結合バッファー内) を各反応に加えます。
- 室温で10分間インキュベートする。
4. MNaseによる早期消化を防ぐためのサンプルのプレブロック
- プレートを96ウェルの磁気ラックに置き、ビーズが最低5分間結合するのを許してから、上清を取り出して廃棄します。
- 核結合ビーズに100 μLのブロッキングバッファーを加え、穏やかなピペッティングで混合します。
- 室温で5分間インキュベートする。
5. 一次抗体の添加
- プレートを96ウェル磁気ラックに置き、上清を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り除いて廃棄します。
- 磁気ラックからプレートを取り出し、穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを100 μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
- プレートを 96 ウェル磁気ラックに戻し、上清が除去されるのを待ってから、上清を取り出して廃棄します。
- 穏やかなピペッティングで反応ごとにビーズを25 μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
- 一次抗体マスターミックスを作成します:1反応あたり25 μLのウォッシュバッファー+ 0.5 μLの抗体。
- 核結合ビーズを穏やかにボルテックスしながら、目的のタンパク質を標的とする抗体で処理する各サンプルに25 μLの一次抗体マスターミックスを追加します(通常、最終希釈は1:100)。コントロールを行う場合は、抗体を含まない洗浄バッファーを25 μL加える。
- 室温で1時間インキュベートする。
- サンプルを96ウェルの磁気ラックに置き、上澄み液を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄します。
- 磁気ラックからプレートを取り出し、ビーズを100μLの洗浄バッファーで洗浄し、ピペッティングで再懸濁します。
6. pA-MNaseまたはpA/G-MNaseの添加
注: プロテイン A は、ウサギなどの特定の種の IgG 分子に対して高い親和性を持ちますが、マウスやラットなどの他の種の IgG には適していません。あるいは、プロテインA/G-MNaseを使用することができる。このハイブリッドは、ウサギ、マウス、およびラットのIgGsに結合し、マウスまたはラットの一次抗体が使用される場合の二次抗体の必要性を回避する。
- プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、上澄み液を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上澄み液を取り出して廃棄します。
- 磁気ラックからプレートを取り出し、各サンプルを25 μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
- pA-MNase マスターミックス (25 μL のウォッシュバッファー + 1 反応あたりの最適化された量の pA-MNase )を作成します。
- 穏やかにボルテックスしながら、対照サンプルを含む各サンプルに25 μLのpA-MNaseマスターミックスを加える。
注:pA-MNaseの濃度は、自家製であれば調製時に変化し、各独立した精製時に使用前に試験する必要があります。pA/G-MNaseの場合、20倍のストックを2.5 μL使用する必要があります。 - サンプルを室温で30分間インキュベートする。
- プレートを96ウェル磁気ラックに置き、上清を最低5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上清を取り除いて廃棄します。
- 磁気ラックからプレートを取り出し、ビーズを100 μLのウォッシュバッファーで洗浄し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。
7. 指向性DNA消化
- プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、上清を最低 5 分間クリアしてから、上清を除去して廃棄します。
- 磁気ラックからサンプルを取り出し、穏やかなピペッティングによってビーズを50μLのウォッシュバッファーに再懸濁します。
- サンプルを氷/水混合液中で5分間0°Cに平衡化します。
- サンプルを0°Cの氷/水浴から取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して100mMCaCl2 を1 μL加えます。大容量のマルチチャンネルピペットを使用して穏やかなピペッティングでよく混合(3〜5回)し、サンプルを0°Cに戻します。
注:ここでうまくミキシングすることは不可欠です。CaCl2 は、目的のタンパク質に隣接するDNAのMNase消化を活性化するために添加される。 - プレートが氷/水浴に戻ったらすぐに10分のタイマーを開始します。
- 50 μLの2XRSTOP+バッファーを各ウェルにピペッティングして反応を停止し、CaCl2 と同じ順序で添加した。
注:過誤を防ぐために、10分の消化が終わる前に2XRSTOP+バッファを作成してください。
8. サンプル分別
- サンプルを37°Cで20分間インキュベートする。
- プレートを 16,000 x g で 4 °C で 5 分間回転させます。
- プレートを96ウェル磁気ラックに置き、上清を最低5分間透明にし、上清を新鮮な96ウェルプレートに移します。ビーズを捨てます。
9. DNA抽出
- 各サンプルに10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)1 μLおよび20 mg/mLプロテイナーゼK0.83 μLを加えます。
警告: SDS 粉末は吸入すると有害です。換気の良い場所では、ゴーグル、手袋、N95グレードの呼吸用保護具を着用し、取り扱いには注意が必要です。 - 穏やかなピペッティングでサンプルを混ぜる。
- サンプルを70°Cで10分間インキュベートする。
- プレートを室温に戻し、46.6 μLの5 M NaClおよび90 μLの50%PEG 4000を添加する。穏やかなピペッティングで混ぜる。
- 各サンプルに33 μLのポリスチレン - マグネタイトビーズを加え、室温で10分間インキュベートする。
注:ポリスチレン - マグネタイトビーズを室温(〜30分)に持ち込み、使用する前によく混ぜてください。 - プレートを磁気ラックの上に置き、上澄み液を約5分間透明にしてから、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に捨てます。
- ビーズを乱すことなく、150μLの80%エタノールで2xをすすいでください。
警告:エタノールは非常に可燃性であり、皮膚、目、および肺の刺激を引き起こします。この手順は、適切な実験用衣服と通気フードに入れて実行します。 - プレートを1000 x g で30秒間短時間回転させます。プレートを96ウェル磁気ラックに戻し、ビーズを乱すことなく残りのEtOHをすべて取り除きます。
- サンプルを約2〜5分間空気乾燥させます。
メモ:ビーズを5分以上乾燥させないでください。EtOHの除去に勤勉であれば、2〜3分間の乾燥で十分である。 - ビーズを37.5 μLの10 mM Tris-HCl(pH 8)で再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。
- プレートを磁気ラックの上に置き、ビーズが 5 分間結合するのを待ちます。
- 36.5 μLの上清を新鮮なサーモサイクラー互換96ウェルプレートに移す。ビーズを捨てます。
注: 実験は、サンプルを -20 °C で保存することでここで停止することも、ライブラリのビルドを続行することもできます (手順 10 ~ 15)。
10. 末端修復、リン酸化、アデニル化
注:試薬は、 材料表で参照されているように供給されています。以下のプロトコールは、NEBNext Ultra DNA IIキットなどの市販キットと同様の方法に従う。
- 5 U/μL の T4 DNA ポリメラーゼを 1 x T4 DNA リガーゼバッファーで 1:20 に希釈します。
- エンドリペア/3'A マスターミックスを調製します: 2 μL の 10x T4 DNA リガーゼバッファー、2.5 μL の 10 mM dNTP、1.25 μL の 10 mM ATP、3.13 μL の 40% PEG 4000、0.63 μL の 10 U/μL T4 PNK、0.5 μL の希釈 T4 DNA ポリメラーゼ、0.5 μL の 5U/μL Taq DNA ポリメラーゼ、1 反応あたりの総容量 13.5 μL です。
注:ピペッティングする前に、必ず40% PEG 4000を室温に持っていきましょう。 - 13.5 μL のエンドリペア/3'A マスターミックスを 36.5 μL の DNA に加えます。
- 反応をクイックボルテックスで混合し、次にクイックスピン(500 x g で10秒間)を混合します。
- 温度>20°Cの加熱蓋を備えた予め冷却されたサーモサイクラー中で以下の反応条件を用いてインキュベートする。 使用反応条件:12°Cで15分間、37°Cで15分間、72°Cで20分間、4°Cで保持する。
11. アダプターライゲーション
メモ: 次の反応を設定している間、サンプルを氷の上に保管してください。ピペッティングする前に、リガーゼ緩衝液を室温にします。アダプター( 材料表を参照)を、10 mM NaCl (pH 7.5) を含む 10 mM Tris-HCl の溶液で希釈します。収量が低いため、CUT&RUN濃縮DNAを事前に定量しないでください。むしろ、0.6 μMの最終作業アダプター濃度を使用して、アダプターの 25 倍希釈を生成します。
- ライゲーションマスターミックスを作成します:55 μLのリガーゼバッファー(2x)、5 μLのT4 DNAリガーゼ、および5 μLの希釈アダプター(1反応あたりの総容量65 μL)。
- ステップ10.5のマスターライゲーションミックスを50 μLのDNAに加えます。
- クイックボルテックスで混合し、続いてクイックスピニング(10秒間500 x g )を行います。
- サーモサイクラー(加熱蓋なし)中で20°Cで15分間インキュベートする。
メモ: すぐに次の手順に進みます。
12. ユーザーダイジェスト
- 各サンプル、ボルテックス、およびスピンに3 μLのUSER酵素を加えます(500 x g で10秒間)。
- サーマルサイクラー中で37°Cで15分間インキュベートする(加熱蓋を50°Cに設定した)。
13. ライゲーション反応後のポリスチレン-マグネタイトビーズクリーンアップ
注:ポリスチレン - マグネタイトビーズが室温(〜30分)で平衡化するようにします。ボルテックスは、使用前にビーズ溶液を均質化する。室温で以下の手順を実行します。
- アダプターライゲーションDNAを含むポリスチレン - マグネタイトビーズ溶液39 μL(0.33x)を各ウェルに加えます。
- ピペッティングで十分に混合し、サンプルを室温で15分間インキュベートして、DNAをビーズに結合させます。
- サンプルを96ウェル磁気ラックに置き、上清が透明になるまで5分間インキュベートします。
- プレートを磁気ラックに保管し、ビーズを乱すことなく上澄み液を慎重に取り出して捨てます。
- ビーズを邪魔することなく、200 μLの80%EtOHでビーズをすすいでください。
- 96ウェルの磁気ラックで30秒間インキュベートして、溶液をクリアできるようにします。
- ビーズを乱すことなく上清を取り出して捨てる。
- 手順 13.5 ~ 13.7 を繰り返して、合計 2 回の洗浄を行います。
- プレートを 500 x g で 10 秒間短時間回転させ、プレートを 96 ウェルの磁気ラックに戻して、ビーズを乱すことなく残留 EtOH を除去します。
- プレートを磁気ラックに保管し、サンプルを2分間空気乾燥させます。
メモ: ビーズを乾かしすぎないでください。 - 磁気ラックからプレートを取り出し、ビーズを28.5 μLの10 mM Tris-HCl(pH 8)に再懸濁します。
警告: 塩酸は非常に腐食性があります。ユーザーは、ゴーグル、手袋、および白衣を着用した化学ヒュームフードで慎重に取り扱う必要があります。 - 泡を出さないように注意しながら、ピペッティングでビーズを徹底的に再懸濁してください。
- 室温で5分間インキュベートする。
- プレートを96ウェル磁気ラックに置き、溶液を5分間透明にします。
- 上清27.5 μLを新しいPCRプレートに移し、ビーズを捨てる。
14. 図書館の充実
注:プライマーはアダプターと同じ溶液で希釈します。このライブラリー構築には、0.6 μM の最終作業プライマー濃度を使用します。
- 希釈されたインデックス付きプライマー( 材料表を参照)を各サンプルに5 μL加える。
注:各サンプルは、シーケンシング後に識別するために異なるインデックスを必要とします。 - PCR マスターミックスを調製します: 10 μL の 5x ハイフィデリティ PCR バッファー、1.5 μL の 10 mM dNTP、5 μL の希釈ユニバーサルプライマー、1 μL の 1 U ホットスタートハイフィデリティポリメラーゼ、1 サンプルあたり 17.5 μL のマスターミックス総量。
- 精製アダプターライゲーション DNA 32.5 μL に 17.5 μL pf PCR ミックスを追加します (このボリュームには 5 μL のインデックス付きプライマーが含まれています)。
- 溶液をピペッティングで混合する。
- 最大ランプ速度が3°C/sの以下の反応条件を用いてサーモサイクラー内でインキュベートする:98°Cで45秒、98°Cで45秒、60°Cで10秒、第2および第3のステップを21回繰り返し、72°Cで1分間、4°Cで保持する。
注:サンプルは、短期保存の場合は4°C、長期保存の場合は-20°Cに保持できます。
15. ポリスチレン - マグネタイトビーズのクリーンアップ
- 各サンプルに60 μL(1.2倍)のポリスチレン - マグネタイトビーズを加える。
- ビーズをピペッティングにより再懸濁し、室温で15分間インキュベートした。
- 溶液が透明になるまで、プレートを磁気ラックに5分間置きます。
- 上清を捨て、ビーズを乱すことなく200 μLの80%EtOHでビーズをすすいでください。
- 洗浄ステップを繰り返して、合計2回の80%EtOH洗浄を行います。
- プレートを 500 x g で 10 秒間回転させ、プレートを 96 ウェルの磁気ラックに置き、ビーズが 5 分間結合するのを許します。
- ピペットは、ビーズを乱すことなく余分なEtOHを除去し、ビーズを2分間風乾させる。
メモ: ビーズを乾かしすぎないでください。 - ビーズをヌクレアーゼフリー水21 μLに再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。
- プレートを磁気ラックの上に置き、溶液を5分間透明にします。
- 上清20 μLを新しいプレートに移す。
注:実験は、サンプルを-20°Cで保管することでここで停止することができます。 - 1x HS試薬を使用して、蛍光光度計( 材料表を参照)でライブラリー濃度を定量します。
- 濃度が許せば、1.5%アガロースゲル上に30ngのサンプルを低分子量はしごで実行して可視化します。または、フラグメントアナライザーまたは関連する機器で視覚化します。
- Illuminaプラットフォーム上のシーケンスライブラリは、〜50,000〜100,000個の一意にマッピングされた読み取りを取得します。
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Representative Results
ここでは、96ウェルの手動フォーマットuliCUT&RUNを使用してクロマチン上の単一細胞タンパク質プロファイリングのための詳細なプロトコルを提示する。結果は、プロファイリングされるタンパク質(タンパク質の存在量および抗体品質による)、細胞型、およびその他の寄与因子によって異なるが、この技術の予想される結果については、ここで説明する。細胞品質(細胞の外観および生細胞の割合)および単一細胞選別は、NE緩衝液への生細胞選別の前または時に評価されるべきである。ES細胞コロニーおよび細胞選別の一例を図2A、Bに示す。具体的には、低品質の細胞は使用すべきではなく、品質が問題となる場合は、特定の細胞種のガイドラインに従うように注意する必要があります。さらに、細胞選別装置による正確な細胞選別は、実験に先立って評価されるべきである。例えば、試験細胞をHoechst 33342染色を用いて選別および染色し、各ウェルに0または1細胞が見出されることを保証するために計数することができる。単一のセルが見つからない場合は、ソート条件を最適化する必要があります。ライブラリー調製後、サンプルを、シーケンシングの前に、アガロースゲル(アガロースゲル上のDNA可視化に下限があるため、濃度が30ng以上の装填を許容する場合)またはフラグメントアナライザー(またはTapestationまたはBioanalyzerなどの同様の装置)のいずれかで評価することができ、その結果の例を図2Cに示し、D. 具体的には、予想されるサイズ分布は〜150〜〜500 bpです。より高い細胞量では、大きなタンパク質(ヒストンなど)に対して実施されたCUT&RUNは、DNAの大部分が〜270bp見られる右側のサイズ分布を有する。しかし、この肩は通常、単一細胞実験では観察されない。
シーケンシング後、シーケンシング読み取りの品質は、FASTQC を使用して評価する必要があります。一意にマッピングされた読み取りの割合を決定する必要があります。通常、単一細胞実験では、0.5%〜10%の一意マッピング読み取りが観察されます。これらのマッピングパーセンテージは、他のDNAベースの単一細胞技術30と同様である。次に、マッピング後の読み取りのサイズ分布を決定して、プロファイルが事前シーケンスに類似していることを確認する必要があります(アダプターシーケンスが読み取りサイズに寄与しなくなります)。
データ品質が評価された後、タンパク質占有率は、UCSCゲノムブラウザまたはIGVを使用して単一遺伝子座ゲノムブラウザ画像を視覚化することができ(図3A)、特定のゲノム座標上のゲノム全体の占有パターンをメタプロット(図3B、下)、ヒートマップ(図3B、上)、または1Dヒートマップ(図3C)を使用して視覚化することができる。データ分析の詳細については、Patty and Hainer27による研究を参照してください。二倍体細胞からの単一細胞データは、各遺伝子座に寄与する最大4回の読み取り(細胞が有糸分裂にあった場合は4回の読み取り)をもたらすが、より頻繁には1回または2回の読み取りをもたらす。したがって、データはバイナリであり、高いバックグラウンドは、高いセル実験と比較して、占有率と間違えやすくなります。したがって、可能であれば、高い細胞数(5,000~100,000細胞)に対して並行してCUT&RUN実験を行い、目的のタンパク質に対するすべての可能な結合位置を取得することをお勧めします。次いで、単一細胞データを、可能な結合位置と比較することができる。図3に示す例では、単一細胞CTCF uliCUT&RUNの結果は、高細胞CTCF uliCUT&RUN(図3A)またはChIP-seq(図3B、C)と比較される。以前に実証したように、CTCF、SOX2、およびNANOG単一細胞uliCUT&RUNピークは、高細胞ChIP-seqデータセットからのより強いピークを主に表していた23。
図1:uliCUT&RUNプロトコルの概略図 細胞を回収し、NE緩衝液を含む96ウェルプレートに選別する。次に、個々の核をConA結合常磁性ミクロスフェアに結合し、抗体(目的のタンパク質を標的とする)およびpA-MNaseまたはpA/G-MNaseを順次添加する。タンパク質隣接DNAはMNase を介して 切断され、次いでDNAはライブラリー調製に使用するために精製される。この図は Biorender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:uliCUT&RUNライブラリーの細胞選別と品質管理の結果の例 。 (A)高品質のマウス胚性幹(ES)細胞の画像。スケールバー:200μm. (B) 採取したES細胞に7AADを加え、FACS装置で選別した後の単一細胞選別からの出力。(C)完成したuliCUT&RANライブラリを描いた臭化エチジウム染色アガロースゲル。レーン1は低分子量ラダーであり、レーン2〜21は、配列決定前に成功した個々の単一細胞uliCUT&RANライブラリーの例である。(D)エチジウムブロマイド染色アガロースゲルは、最適とは言えず、最適でない完成したuliCUT&RUNライブラリーを描写する。レーン1は低分子量のはしご、レーン2は非効率的なMNase消化のために最適ではないライブラリであり、レーン3は適切な消化で成功したライブラリです。(E)シーケンシング前の1つの単一細胞uliCUT&RUNライブラリーのフラグメントアナライザー分布。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単一のES細胞uliCUT&RUNデータについて期待される結果の例。 (A) 高細胞数 (5,000 細胞) CTCF またはネガティブコントロール (No Antibody, No Ab) uliCUT&RUN (上位 2 トラック) および単一細胞 CTCF uliCUT&RUN のブラウザートラック。画像は、許可を得て、パティとヘイナー27から複製されています。(B) 以前に公開されたCTCF ChIP-seqサイト(GSE11724)に対する単一細胞CTCFまたはネガティブコントロール(No Ab)uliCUT&RUNのヒートマップ(上)およびメタプロット(下)。画像はHainer et al.23の許可を得て複製されている。(C) 以前に公開されたCTCF ChIP-seqサイト(GSE11724)上の単一細胞CTCFまたは陰性対照(No Ab)uliCUT&RUNの1Dヒートマップ。画像はHainer et al.23の許可を得て複製されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:このプロトコルで使用される様々なバッファの組成。 必要な原液の使用量は、括弧内に最終濃度を記して記載する。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CUT&RUNは、クロマチン上のタンパク質の局在を決定するための効果的なプロトコルです。他のプロトコルと比較して、1)高い信号対雑音比、2)高速プロトコル、3)必要なシーケンシング読み取りカバレッジが低いため、コスト削減につながるなど、多くの利点があります。プロテインA-またはプロテインA/G-MNaseを使用することで、CUT&RUNを利用可能な任意の抗体で適用することができます。したがって、多くのタンパク質を迅速かつ容易にプロファイリングする可能性を秘めています。しかし、クロマチン上のタンパク質プロファイリングに対する単一細胞への適応は、特に単一細胞トランスクリプトミクス(すなわち、scRNA-seq)と比較すると、RNAに対するDNAのコピー数が少ないため(DNAのコピーが2〜4コピーであるのに対し、数千のRNAコピーが可能である)ため、困難であった。
上記で詳述したプロトコルでは、いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。まず、細胞の適切な選別は細胞(または組織)の種類に依存しており、正確な選別には注意が必要です。実験の前に、単一細胞選別が装置でどの程度効果的であるかをテストすることをお勧めします。第二に、効果的な抗体の選択が不可欠です。単一細胞アプリケーションに進む前に、高細胞数実験(およびノックダウン後のウェスタンブロットによる特異性の確認、CUT&RUN実験での抗体の滴定など)で抗体を試験することをお勧めします。第3に、IgGなどの陰性対照を使用するか、または一次抗体を使用しないことは、実験サンプルとの適切な比較がデータ品質および生物学的結果の解釈に不可欠であるからである。単一細胞実験結果を高い細胞数データセットと比較する場合、ネガティブコントロール単一細胞実験は、高細胞実験で同定された結合部位に対する読み取りカバレッジが低く、むしろゲノム全体にわたって読み取りのランダム分布を有するべきである(クロマチンのオープン領域に対するバイアスを伴う)。第四に、プロテインA-またはプロテインA/G-MNaseを添加および活性化する際には、クロマチンを過剰消化しないように注意する必要があります:手でサンプルを過熱させず、サンプルを氷/水浴温度(0°C)に維持し、適切なタイミングで反応をキレートします。第五に、uliCUT&RUN実験とライブラリーの準備は、材料が少ないため、注意が必要です。例えば、ビーズ結合中に磁気ラック上での長時間のインキュベーションは、上清が除去されたことを確認し、上清を除去する際にビーズを乱さないように注意することは、十分な収率のために不可欠である。第六に、取り組まれている質問に応じて、実施されている単一細胞実験の数は重要な考慮事項である。単一細胞実験の一部は(すべての低入力実験と同様に)失敗するため、適切な解釈に必要な肯定的な実験結果の数は、実験を開始する前に考慮する必要があります。実験に含める細胞の数は、研究者が必要とする実験データの量および抗体の品質に依存する。最後に、このプロトコルの多くの側面の量を減らすことで同等の結果を達成できることに注意してください。体積を50%減少させたステップは、NE緩衝液、洗浄緩衝液、一次抗体混合物(一次抗体の量を含む)、pA−MNase混合物(pA−MNaseの量を含む)、およびライブラリー調製におけるすべてのステップの体積を含む。
クロマチンの因子プロファイリングの複雑な性質に基づいて、多くの潜在的な問題の原因とトラブルシューティングが必要になる可能性がある場所があります。問題が発生する可能性のある多くのステップがあるかもしれませんが、3つの主要な問題が観察されています:1)ライブラリビルドへの入力のための低いDNA収率。2)実験サンプルにおける高いバックグラウンドシグナル、および3)ライブラリー構築後の低収率。ライブラリー調製およびシーケンシングに不十分なDNAがある場合(ポイント1)、次のトラブルシューティングアドバイスに注意してください:a)不完全な膜溶解があった可能性があるため、NEバッファーによる溶解時間を長くすることができます。b)ConA共役常磁性微小球への核の非効率的な結合があった可能性があり、これはこれらのビーズの添加時に適切な混合によって改善することができた。c)添加された抗体が少なすぎる可能性があるため、最も有効な量を特定するために抗体の滴定を行うことが推奨される。d)一次抗体またはプロテインA-またはプロテインA/G-MNaseとのインキュベーション時間が短すぎる(すなわち、結合を可能にするのに十分な時間ではない)か、または長すぎる(これらは天然の未架橋サンプルである)かのいずれかであり、最適化することができる。e)標的タンパク質とクロマチンとの相互作用は、天然条件下で捕捉するには一過性すぎる可能性があるため、CUT&RUNの架橋を行うことができた28。単一セル データセットでは高いバックグラウンドが得られますが、バックグラウンドが高すぎると、バックグラウンドから信号を解釈しにくい場合があります (ポイント 2)。この問題については、次のアドバイスに注意してください: a) プリエンプティブ MNase 消化を防ぐための EDTA によるブロッキング ステップは、増加または最適化される可能性があります。b)過度の切断がある場合、それはプロテインA-またはプロテインA/G-MNaseが多すぎることが原因である可能性があり、したがって適切な量の滴定を行うことができる。c)MNaseによる過剰消化は高いバックグラウンドをもたらす可能性があり、したがって、添加時の塩化カルシウムの適切な混合およびMNase消化時間の最適化を評価するべきである。最後に、効率的なuliCUT&RUN濃縮DNAが回収されたかもしれないが、少量のライブラリーが回収される可能性がある(ポイント3)。この問題では、次のことが推奨されます:a)正しい精製とDNA損失のないことを保証するために、ポリスチレン - マグネタイトビーズの適切な取り扱いと使用。具体的には、損失を防ぐためにビーズを磁化するために15分のインキュベーションと最低5分間のインキュベーションを行うことをお勧めします。b)PCR段階でのライブラリーの増幅不足は低収率をもたらすので、適切なサイクルはqPCRを用いて決定されるべきである(ATAC-seqライブラリー29について以前に確立されたように)。
すべての技術と同様に、uliCUT&RUNには制限があり、実験を開始する前に考慮する必要があります。第一に、これらの実験は天然条件向けに設計および最適化されているため、タンパク質がクロマチンと一過性にしか相互作用しない場合、相互作用の回復を確実にするために架橋アプローチが必要な場合があります。第二に、すべての抗体ベースの技術と同様に、抗体の品質が重要です。実験を行う前に、抗体の品質と一貫性を保証するように注意する必要があります。第3に、MNaseバックグラウンド切断が起こる可能性があり、CUT&RUNでは他の実験と比較してバックグラウンドシグナルが一貫して低いが、単一細胞実験ではバックグラウンドシグナルが高くなる可能性があるため、適切な制御と分析を実行する必要があります。単一細胞プロファイリングデータのバイナリー性は可視化を制限しますが、次元縮小などのより高度な計算ゲノム技術を実行することができます(前述のように27)。最後に、シングルセルプロファイリングはここで96ウェルフォーマットに拡張されましたが、これは10xGenomicsまたは他のフォーマットを利用する他のシングルセル技術と比較してスループットが低いです。
ChEC-seq 20、CUT&Tag 24、CUT&RUN21、uliCUT&RUN23などのテザリングベースのプロファイリング技術は、ChIP-seqなどの従来のプロファイリング技術よりも高速な実験タイムライン、低いバックグラウンド、低コストでクロマチンの因子局在を決定できます。したがって、これらは患者サンプルや初期の発達サンプルなどの貴重なサンプルに適用するための非常にエキサイティングな技術です。さらに、単一細胞への適用は、scRNA-seqおよびscATAC-seq30などの他の単一細胞実験を用いて実施される相補的研究を提供することができる。これらのより広く使用されている単一細胞技術を用いて説明したように、バルク細胞実験と比較して新しい洞察を得ることができる。クロマチンの単一細胞タンパク質プロファイリングは、技術が改善され続け、より多くの並列化を可能にするにつれて、より定期的に使用されるようになると予想されます。
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Disclosures
著者らは、このプロジェクトに関連する競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
この原稿の以前のバージョンを読んでコメントしてくれたHainer Labのメンバーに感謝します。このプロジェクトでは、ピッツバーグのUPMC小児病院にあるピッツバーグ大学健康科学シーケンシングコアで入手可能なNextSeq500を使用して、ディレクターのウィリアム・マクドナルドに特別な感謝を込めてシーケンシングを行いました。この研究は、提供されたコンピュータリソースを通じて、ピッツバーグ大学研究コンピューティングセンターによって部分的に支援されました。この研究は、国立衛生研究所助成金番号R35GM133732(S.J.H.宛)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
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