Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63536
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

CUT&RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&RUN של תא יחיד.

Abstract

קביעת המיקומים המחייבים של חלבון על כרומטין חיונית להבנת תפקידו ויעדיו הרגולטוריים הפוטנציאליים. כרומטין אימונופרציפיטציה (ChIP) היה תקן הזהב לקביעת לוקליזציה של חלבון במשך למעלה מ -30 שנה ומוגדר על ידי שימוש בנוגדן כדי לשלוף את חלבון העניין מכרומטין sonicated או מתעכל אנזימטית. לאחרונה, טכניקות קשירת נוגדנים הפכו פופולריות להערכת לוקליזציה של חלבון על כרומטין בשל הרגישות המוגברת שלהם. מחשוף תחת מטרות & שחרור תחת נוקלאז (CUT&RUN) הוא נגזרת רחבת הגנום של Immunocleavage כרומטין (ChIC) ומשתמש חלבון רקומביננטי A קשור לנוקלאז מיקרוקוקאלי (pA-MNase) כדי לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן מיקוד חלבון של עניין, ובכך מאפשר מחשוף ספציפי לאתר של ה- DNA מאגף את החלבון של עניין. ניתן להשתמש ב- CUT&RUN כדי ליצור פרופיל לשינויים בהיסטון, גורמי שעתוק וחלבונים מחייבי כרומטין אחרים כגון גורמי שיפוץ נוקלאוזום. חשוב לציין, CUT&RUN יכול לשמש כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים הקשורים euchromatic או הטרוכרומטיים ושינויים histone. מסיבות אלה, CUT&RUN היא שיטה רבת עוצמה לקביעת פרופילי האיגוד של מגוון רחב של חלבונים. לאחרונה, CUT&RUN עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמי שעתוק באוכלוסיות נמוכות של תאים ותאים בודדים והפרוטוקול הממוטב נקרא CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN). כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל גורם תא יחיד באמצעות uliCUT&RUN בתבנית ידנית 96-well.

Introduction

חלבונים גרעיניים רבים פועלים על ידי אינטראקציה עם כרומטין כדי לקדם או למנוע פעילויות בתבנית DNA. כדי לקבוע את הפונקציה של חלבונים אלה כרומטין אינטראקציה, חשוב לזהות את המיקומים הגנומיים שבהם חלבונים אלה קשורים. מאז התפתחותו בשנת 1985, אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) היה תקן הזהב לזיהוי היכן חלבון נקשר לכרומטין 1,2. לטכניקת ChIP המסורתית יש את זרימת העבודה הבסיסית הבאה: תאים נקצרים ומקושרים (בדרך כלל עם פורמלדהיד), כרומטין הוא גזירה (בדרך כלל עם שיטות sonication קשות, המחייבות crosslinking), החלבון של עניין הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדן המכוון החלבון (או חלבון מתויג) ואחריו נוגדן משני (בשילוב אגרוזים או חרוזים מגנטיים), crosslinking הוא הפוך, חלבון ורנ"א מתעכלים כדי לטהר DNA, ו- CHIP מועשר-DNA זה משמש כתבנית לניתוח (באמצעות בדיקות עם תווית רדיו 1,2, qPCR3, מיקרו-אריות 5,6, או רצף4). עם הופעתם של מיקרו-ערים ורצף עמוק מקביל מאסיבי, צ'יפ-צ'יפ-צ'יפ 5,6 ו-ChIP-seq4 פותחו לאחרונה ומאפשרים זיהוי כללי של לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. Crosslinking ChIP הייתה טכניקה רבת עוצמה ואמינה מאז הופעתה עם התקדמות משמעותית ברזולוציה על ידי ChIP-exo7 ו ChIP-נקסוס8. במקביל להתפתחות של ChIP-seq, פרוטוקולים מקוריים (ללא crosslinking) עבור ChIP (N-ChIP) הוקמו, אשר משתמשים בעיכול נוקלאז (לעתים קרובות באמצעות נוקלאז מיקרוקוקאלי או MNase) כדי לפצל את הכרומטין, בניגוד sonication המבוצע בטכניקות ChIP crosslinking מסורתיות9. עם זאת, חיסרון מרכזי אחד הן בהצלבה של טכנולוגיות ChIP והן בטכנולוגיות N-ChIP היה הדרישה למספרי תאים גבוהים עקב תפוקת דנ"א נמוכה בעקבות המניפולציה הניסיונית. לכן, בשנים האחרונות, מאמצים רבים היו לקראת אופטימיזציה של טכנולוגיות ChIP עבור קלט תא נמוך. מאמצים אלה הביאו לפיתוח טכנולוגיות רבות עוצמה המבוססות על ChIP המשתנות בדרישות הישימות והקלט שלהן 10,11,12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, טכנולוגיות מבוססות ChIP-seq חד-תאיות חסרות, במיוחד עבור חלבונים שאינם histone.

בשנת 2004 פותחה טכנולוגיה חלופית כדי לקבוע את תפוסת החלבון על כרומטין המכונה מחשוף כרומטין אנדוגני (ChEC) ו כרומטין Immunocleavage (ChIC)19. טכניקות לוקוס בודדות אלה משתמשות בהיתוך של MNase לחלבון העניין (ChEC) או לחלבון A (ChIC) לחיתוך ישיר של DNA הסמוך לחלבון העניין. בשנים האחרונות, הן ChEC והן ChIC עברו אופטימיזציה ליצירת פרופיל חלבון רחב גנום על כרומטין (ChEC-seq ו- CUT&RUN, בהתאמה)20,21. בעוד ChEC-seq היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של גורמים, היא דורשת פיתוח חלבוני MNase-היתוך עבור כל מטרה, ואילו ChIC והווריאציה הרחבה של הגנום שלה, CUT&RUN, מסתמכים על נוגדן המכוון לחלבון העניין (כמו עם ChIP) וחלבון רקומביננטי A-MNase, שבו חלבון A יכול לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן. כחלופה, פותח חלבון היתוך A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) שיכול לזהות מגוון רחב יותר של אזורים קבועים נוגדנים22. CUT&RUN הפכה במהירות לחלופה פופולרית ל-ChIP-seq לקביעת לוקליזציה של חלבונים בגנום כרומטין בכל רחבי.

CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN), וריאציה של CUT&RUN המאפשרת שימוש בכניסות נמוכות ותא בודד, תוארה בשנת 201923. כאן מתוארת המתודולוגיה עבור יישום ידני של תא יחיד בתבנית 96 well. חשוב לציין כי מאז הפיתוח של uliCUT&RUN, פותחו שתי חלופות ליצירת פרופיל histone, CUT&Tag ו- iACT-seq, המספקות פרופיל חזק ומקביל מאוד של חלבוני הייסטון24,25. יתר על כן, scCUT&Tag עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמים מרובים בתא יחיד (multiCUT&Tag) וליישום חלבונים שאינם histone26. יחד, CUT&RUN מספקת חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq עם קלט נמוך שבו ניתן לבצע uliCUT&RUN בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית שיש לה גישה לממיין תאים וציוד סטנדרטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המחקרים אושרו על ידי המשרד המוסדי להגנה על בטיחות ביולוגית באוניברסיטת פיטסבורג.

1. הכינו חרוזים מגנטיים

הערה: יש לבצע לפני מיון התאים ולהחזיק בקרח עד לשימוש.

  1. פיפטה 30 μL של מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA תערובת חריזה לכל תגובה לצינור מיקרופוג טרי 1.5 מ"ל ולהוסיף 850 μL של מאגר מחייב, צינורות בעדינות לערבב.
    הערה: מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA הן חרוזים מגנטיים מצופים לציטין המאפשרים כריכת קרום השומנים.
  2. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להתגנט למשך 1-2 דקות. לאחר supernatant פינה, להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
  3. הסר את הצינור מן המתלה המגנטי לשטוף את החרוזים על ידי resuspending ב 1 מ"ל של מאגר מחייב.
  4. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3.
  5. ממגנטים את החרוזים במשך 2 דקות ומסירים את supernatant להשליך.
  6. הסר את הצינור מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 30 μL של מאגר מחייב לכל תגובה.
  7. מחזיקים את תערובת החרוזים השטופה על הקרח עד שהתאים ממוינים.

2. תאי קציר

הערה: שלב זה נכתב עבור תאים דבוקים ומותאם לתאי גזע עובריים מסוג Murine E14. פולחן וקצירת התאים תלויים בסוג התא.

  1. הסר את התאים מן החממה 37 °C °C ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח איכות.
  2. שאפו את המדיה מצלחת התא ושטפו ב-5 מ"ל של 1x PBS.
  3. שאפו PBS מהצלחת וקצורו את התאים (בשיטות קצירת תאים מסורתיות שיהיו שונות לפי סוג התא). השג השעיה של תא יחיד על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית נגד צלחת התרבות, במידת הצורך.
  4. מעבירים את ההשעיה התאית לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומסובבים כלפי מטה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
  5. לשאוף את התקשורת כדי להשליך ולשטוף את גלולה התא עם 5 מ"ל של PBS + 1% FBS.
  6. לסובב את התאים ב 200 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ו resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של PBS + 1% FBS.
  7. לספור את התאים ולהעביר 1 מ"ל של 1 x 106 תאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל טרי.
  8. הוסף 5 μL של 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD), הפוך את הצינור היטב לערבב, ולאחר מכן להחיל את המדגם על סדרן התאים כדי למיין תאים בודדים חיים לתוך בארות בודדות של צלחת 96-well.
    הערה: צבע 7-AAD אינו נכלל בתאים חיים, ולכן ניתן להשתמש בו במיון תאים חיים.

3. מיון תאים ותמוגה

  1. הכן לוחית 96-well תואמת ממיין תאים עם 100 μL של חיץ גרעיני (NE) חוצץ בכל באר לפני מיון התאים.
  2. מיין את התאים ללוחות של 96 בארות בהתאם להוראות היצרן.
  3. סובב במהירות את הצלחת (600 x g עבור 30 s) כדי להבטיח תאים נמצאים במאגר בתוך הבארות.
    הערה: כדאי לבדוק בניסוי ראשוני אם התאים המשמשים מובאים באופן אמין לתחתית הבארות.
  4. החזק את הדגימות על קרח במשך 15 דקות.
  5. לסובב את הדגימות ב 600 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) בזהירות pipette כדי להסיר את supernatant (משאיר מאחור 5 μL).
  6. הגדילו מחדש כל דגימה ב-55 μL של מאגר NE והוסיפו 30 μL של המיקרוספירות הפרמגנטיות המצומדות מראש של ConA (משלב 1.7; במאגר איגוד) לכל תגובה.
  7. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

4. דגימות טרום חסימה כדי למנוע עיכול מוקדם על ידי MNase

  1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר לחרוזים להיקשר לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
  2. הוסיפו 100 μL של חוצץ חסימה לחרוזים הקשורים לגרעין וערבבו עם צינורות עדינים.
  3. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

5. תוספת של נוגדן ראשוני

  1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  2. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 100 μL של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים.
  3. מניחים את הצלחת בחזרה על המתלה המגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
  4. Resuspend החרוזים ב 25 μL של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים.
  5. הפוך תערובת ראשית נוגדנים עיקרית: 25 μL של מאגר לשטוף + 0.5 μL של נוגדן לכל תגובה.
  6. תוך כדי מערבולת עדינה של החרוזים הקשורים לגרעינים, הוסיפו 25 μL של תערובת אמן הנוגדנים העיקרית לכל דגימה המטופלת בנוגדן המכוון לחלבון העניין (בדרך כלל 1:100 דילול סופי). הוסף 25 μL של מאגר לשטוף ללא נוגדן, אם ביצוע פקד.
  7. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  8. מניחים את הדגימות על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
  9. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ולשטוף את החרוזים עם 100 μL של חוצץ לשטוף, resususpending על ידי צינורות.

6. תוספת של pA-MNase או pA/G-MNase

הערה: לחלבון A יש זיקה גבוהה למולקולות IgG ממינים מסוימים כגון ארנבות, אך אינו מתאים ל- IgGs ממינים אחרים כגון עכברים או חולדות. לחלופין, ניתן להשתמש בחלבון A/G-MNase. היברידית זו קושרת ארנבים, עכברים וחולדות IgGs, ומונעת את הצורך בנוגדנים משניים כאשר משתמשים בנוגדנים ראשוניים של עכבר או חולדה.

  1. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  2. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend כל מדגם ב 25 μL של חוצץ לשטוף.
  3. צרו תערובת מאסטר pA-MNase (25 μL של מאגר כביסה + כמות ממוטבת של pA-MNase לכל תגובה).
  4. תוך כדי מערבולת עדינה, הוסיפו 25 μL של תערובת מאסטר pA-MNase לכל דגימה, כולל דגימות הבקרה.
    הערה: הריכוז של pA-MNase משתנה עם ההכנה, אם תוצרת בית, ויש לבדוק לפני השימוש על כל טיהור עצמאי. עבור pA / G-MNase, 2.5 μL של מלאי 20x יש להשתמש.
  5. לדגור על הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  7. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ולשטוף את החרוזים עם 100 μL של חוצץ לשטוף, resuspending על ידי צינורות עדינים.

7. עיכול דנ"א מכוון

  1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
  2. הסר את הדגימות מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 50 μL של חוצץ לשטוף על ידי צינורות עדינים.
  3. שיווי משקל את הדגימות ל 0 °C (5 °F) בתערובת קרח / מים במשך 5 דקות.
  4. הסר את הדגימות מאמבט קרח / מים 0 °C °C (60 °F) והוסף 1 μL של 100 מ"מ CaCl2 באמצעות פיפטה רב ערוצית. ערבבו היטב (3-5 פעמים) עם צנרת עדינה באמצעות פיפטה רב ערוצית גדולה יותר, ולאחר מכן החזירו את הדגימות ל-0 °C (60 °F).
    הערה: ערבוב טוב כאן הוא חיוני. CaCl2 מתווסף כדי להפעיל עיכול MNase של DNA אגף את החלבון של עניין.
  5. התחל טיימר של 10 דקות ברגע שהצלחת חוזרת לאמבטיית הקרח / מים.
  6. עצור את התגובה על ידי צנרת 50 μL של 2XRSTOP + חוצץ לתוך כל באר, באותו סדר כמו CaCl2 נוספה.
    הערה: צור מאגר 2XRSTOP+ לפני שהעיכול של 10 דקות מסתיים כדי למנוע עיכול יתר.

8. פיצול מדגם

  1. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 37 °C (50 °F).
  2. לסובב את הצלחת ב 16,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).
  3. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96 היטב, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולהעביר supernatants לצלחת 96-well טרי. זרוק את החרוזים.

9. מיצוי דנ"א

  1. הוסף 1 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו 0.83 μL של 20 מ"ג / מ"ל חלבון K לכל מדגם.
    אזהרה: אבקת SDS מזיקה אם היא נשאפת. משתמשים צריכים להשתמש בחללים מאווררים היטב לובש משקפי מגן, כפפות, מכונת הנשמה כיתה N95, טיפול בזהירות.
  2. מערבבים את הדגימות על ידי צנרת עדינה.
  3. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב 70 °C (70 °F).
  4. להחזיר את הצלחת לטמפרטורת החדר ולהוסיף 46.6 μL של 5 M NaCl ו 90 μL של 50% PEG 4000. מערבבים על ידי צנרת עדינה.
  5. מוסיפים 33 μL של חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הקפידו להביא חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לטמפרטורת החדר (כ-30 דקות) וערבבו היטב לפני השימוש.
  6. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ולאפשר supernatant לנקות במשך ~ 5 דקות, ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  7. לשטוף 2x עם 150 μL של 80% אתנול מבלי להפריע לחרוזים.
    אזהרה: האתנול דליק מאוד וגורם לגירוי בעור, בעיניים ובריאות. בצע שלב זה עם בגדי מעבדה מתאימים ובברדס מאוורר.
  8. לסובב את הצלחת בקצרה ב 1000 x g עבור 30 s. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96 היטב ולהסיר את כל EtOH שיורית מבלי להפריע לחרוזים.
  9. לייבש את הדגימות באוויר במשך ~ 2-5 דקות.
    הערה: אין לייבש את החרוזים במשך יותר מ-5 דקות. אם חרוץ על הסרת EtOH, 2-3 דקות של ייבוש מספיק.
  10. Resuspend החרוזים עם 37.5 μL של 10m Tris-HCl (pH 8) ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר במשך 5 דקות.
  12. העבר 36.5 μL של supernatant לצלחת תרמוציקלה 96-well תואמת תרמוציקלר טרי. זרוק את החרוזים.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי כאן על ידי אחסון דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או להמשיך בבניית הספרייה (שלבים 10-15).

10. סוף תיקון, זרחן, אדנילציה

הערה: הריאגנטים מקורם כפי שמוזכר בטבלת החומרים. הפרוטוקול שלהלן עוקב אחר שיטה דומה לערכה המסחרית כגון ערכת NEBNext Ultra DNA II.

  1. לדלל 5 U / μL של T4 DNA פולימראז 1:20 במאגר ligase DNA T4 1x.
  2. הכן תיקון קצה/3'A תערובת ראשית: 2 μL של 10x T4 מאגר ligase DNA, 2.5 μL של 10 mM dNTPs, 1.25 μL של 10 mM ATP, 3.13 μL של 40% PEG 4000, 0.63 μL של 10 U / μL T4 PNK, 0.5 μL של פולימראז T4 DNA מדולל, 0.5 μL של 5U / μL Taq DNA פולימראז, עם נפח כולל של 13.5 μL לכל תגובה.
    הערה: הקפד להביא 40% PEG 4000 לטמפרטורת החדר לפני הצנרת.
  3. הוסף 13.5 μL של סוף תיקון/ 3'A תערובת מאסטר ל 36.5 μL של DNA.
  4. מערבבים את התגובה על ידי מערבולת מהירה, ולאחר מכן ספין מהיר (500 x g עבור 10 s).
  5. דגירה באמצעות תנאי התגובה הבאים בתרמוציקלר מקורר מראש עם מכסה מחומם לטמפרטורות >20 °C (50 °F). השתמש בתנאי התגובה: 12 °C (65 °F) במשך 15 דקות, 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות, 72 °C (72 °F) במשך 20 דקות, להחזיק ב 4 °C (60 °F).

11. קשירת מתאם

הערה: שמור את הדגימות על קרח תוך הגדרת התגובה הבאה. אפשר למאגר ligase להגיע לטמפרטורת החדר לפני הצנרת. לדלל את המתאם (ראה טבלת חומרים) בתמיסה של 10 mM Tris-HCl המכיל 10 mM NaCl (pH 7.5). בשל התשואה הנמוכה, אל תכמתו מראש את הדנ"א המועשר של CUT&RUN. במקום זאת, ליצור דילול 25 פי 25 של המתאם, באמצעות ריכוז מתאם עבודה סופי של 0.6 מיקרומטר.

  1. צור תערובת מאסטר קשירה: 55 μL של מאגר ligase (2x), 5 μL של T4 DNA ligase, ו 5 μL של מתאם מדולל, עם נפח כולל של 65 μL לכל תגובה.
  2. הוסף 65 μL של תערובת קשירה מאסטר ל 50 μL של DNA משלב 10.5.
  3. מערבבים על ידי מערבולת מהירה, ואחריו ספינינג מהיר (500 x גרם עבור 10 שניות).
  4. דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר (ללא מכסה מחומם) למשך 15 דקות.
    הערה: המשך מיד לשלב הבא.

12. עיכול המשתמש

  1. הוסף 3 μL של אנזים USER לכל דגימה, מערבולת, ספין (500 x גרם עבור 10 s).
  2. דגירה במחזור תרמי ב 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות (מכסה מחומם להגדיר 50 °C (50 °F).

13. ניקוי חרוזים פוליסטירן-מגנטיט בעקבות תגובת קשירה

הערה: אפשר לחרוזים פוליסטירן-מגנטיט להשתוות בטמפרטורת החדר (~ 30 דקות). מערבולת כדי homogenize פתרון חרוזים לפני השימוש. בצע את השלבים הבאים בטמפרטורת החדר.

  1. הוסף 39 μL (0.33x) של תמיסת חרוזים פוליסטירן-מגנטיט לכל באר המכילה DNA קשור מתאם.
  2. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת, ולאחר מכן לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר DNA להיקשר לחרוזים.
  3. מניחים את הדגימות על מתלה מגנטי של 96 בארות ודוללים במשך 5 דקות עד שהסופר-נרטיב מתבהר.
  4. שמור את הצלחת על המתלה המגנטי ולהסיר בזהירות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
  5. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% EtOH מבלי להפריע לחרוזים.
  6. דגירה עבור 30 שניות על מתלה מגנטי 96-well כדי לאפשר את הפתרון לנקות.
  7. הסר והשלך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
  8. חזור על שלבים 13.5-13.7 עבור סך של שתי שטיפה.
  9. לסובב את הצלחת בקצרה ב 500 x g עבור 10 s, למקם את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well, ולהסיר EtOH שיורית מבלי להפריע לחרוזים.
  10. שמור את הצלחת על המתלה המגנטי וייבש את הדגימות באוויר במשך 2 דקות.
    הערה: אין לייבש יתר על המידה את החרוזים.
  11. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 28.5 μL של 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    זהירות: חומצה הידרוכלורית היא מאכלת מאוד. משתמשים צריכים לטפל בזה בזהירות בברדס אדים כימי לובש משקפי מגן, כפפות, וחלוק מעבדה.
  12. ביסודיות resuspend חרוזים על ידי צינורות, דואג לא לייצר בועות.
  13. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well ולאפשר את הפתרון לנקות במשך 5 דקות.
  15. העבר 27.5 μL של supernatant לצלחת PCR חדשה ולהשליך את החרוזים.

14. העשרת הספרייה

הערה: פריימרים מדוללים עם פתרון זהה לזה של המתאם. עבור בניית ספריה זו, השתמש בריכוז פריימר עבודה סופי של 0.6 מיקרומטר.

  1. הוסף 5 μL של פריימר אינדקס מדולל (ראה טבלת חומרים) לכל מדגם.
    הערה: כל דגימה זקוקה לאינדקס אחר כדי להיות מזוהה לאחר הרצף.
  2. הכינו תערובת מאסטר PCR: 10 μL של 5x מאגר PCR נאמנות גבוהה, 1.5 μL של 10 mM dNTPs, 5 μL של פריימר אוניברסלי מדולל, 1 μL של 1 U חם להתחיל פולימריות נאמנות גבוהה, עם נפח תערובת מאסטר כולל של 17.5 μL לכל מדגם.
  3. הוסף 17.5 μL pf PCR לערבב 32.5 μL של DNA מטוהר מתאם-קשירה (5 μL של פריימר באינדקס כלול בנפח זה).
  4. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת.
  5. דגירה בתרמוציקלר באמצעות תנאי התגובה הבאים עם קצב שיפוע מרבי של 3 °C °C /s: 98 °C (6 °F) עבור 45 s, 98 °C (45 °F) עבור 45 s, 60 °C (60 °F) עבור 10 s, לחזור על השלב השני והשלישי 21 פעמים, 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות, להחזיק ב 4 °C (60 °F).
    הערה: ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) לאחסון לטווח קצר או -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך.

15. ניקוי חרוזים פוליסטירן-מגנטיט

  1. הוסף 60 μL (1.2x) של חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לכל מדגם.
  2. Resuspened את החרוזים על ידי צינורות ודגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי במשך 5 דקות עד שהתמיסה ברורה.
  4. להשליך את supernatant ולשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% EtOH מבלי להפריע החרוזים.
  5. חזור על שלב הכביסה עבור סך של שני 80% EtOH לשטוף.
  6. לסובב את הצלחת ב 500 x g עבור 10 s, מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, ולאפשר לחרוזים להיקשר במשך 5 דקות.
  7. Pipette כדי להסיר עודף EtOH מבלי להפריע לחרוזים ולאפשר לחרוזים להתייבש באוויר במשך 2 דקות.
    הערה: אין לייבש יתר על המידה את החרוזים.
  8. Resuspend החרוזים ב 21 μL של מים ללא נוקלאז ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומאפשרים לפתרון להתפנות למשך 5 דקות.
  10. העבר 20 μL של supernatant לצלחת חדשה.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי כאן על ידי אחסון המדגם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  11. כימות ריכוזי הספרייה באמצעות פלואורומטר (ראה טבלת חומרים), באמצעות ריאגנט HS 1x.
  12. אם הריכוז מאפשר, להפעיל 30 ננוגרם של מדגם על 1.5% ג'ל agarose עם סולם משקל מולקולרי נמוך לדמיין. לחלופין, דמיין באופן חזותי על מנתח קטעים או על כלי קשור.
  13. ספריות רצף בפלטפורמת Illumina כדי להשיג ~ 50,000-100,000 קריאות ממופות באופן ייחודי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל חלבון תא יחיד על כרומטין באמצעות 96-well בפורמט ידני uliCUT&RUN. בעוד התוצאות ישתנו בהתאם לפרופיל החלבון (בשל שפע חלבון ואיכות נוגדנים), סוג התא, וגורמים תורמים אחרים, התוצאות הצפויות עבור טכניקה זו נדונות כאן. יש להעריך את איכות התא (מראה התא ואחוז התאים הקיימים) ואת המיון של תא יחיד לפני או בזמן מיון התא החי למאגר NE. דוגמה למושבות תאים של ES ולמיון תאים מוצגת באיור 2A,B. באופן ספציפי, אין להשתמש בתאים באיכות נמוכה, ואם האיכות היא בעיה, יש להקפיד על ציות להנחיות עבור סוג התא הספציפי. בנוסף, מיון תאים מדויק על ידי מכשיר מיון התא צריך להיות מוערך לפני ניסויים. לדוגמה, תאי בדיקה יכולים להיות ממוינים ומוכתמים באמצעות כתם Hoechst 33342 ונספרים כדי להבטיח שתא אחד או 0 או 1 נמצא בכל באר. אם לא נמצאו תאים בודדים, יש למטב את תנאי המיון. לאחר הכנת הספרייה, ניתן להעריך דגימות על ג'ל אגרווז (אם הריכוז מאפשר טעינה של 30 ננוגרם או יותר, מכיוון שיש גבול נמוך יותר להדמיית DNA על ג'ל אגרווז) או מנתח שברים (או התקן דומה כגון Tapestation או Bioanalyzer) לפני רצף ותוצאות לדוגמה מוצגות באיור 2C, ד. באופן ספציפי, התפלגות הגודל הצפויה היא מ- ~ 150 עד ~ 500 bp. בכמויות תאים גבוהות יותר, CUT&RUN המבוצע על חלבונים גדולים (כגון היסטונים) תהיה התפלגות גודל בצד ימין, שבו רוב ה- DNA ייראה ~ 270 bp; עם זאת, כתף זו בדרך כלל לא נצפתה בניסויים של תא יחיד.

לאחר ריצוף, יש להעריך את איכות קריאות הריצוף באמצעות FASTQC. יש לקבוע את אחוז הקריאות במיפוי ייחודי. בדרך כלל, 0.5%-10% קריאות מיפוי ייחודיות נצפות בניסויים של תא יחיד. אחוזי מיפוי אלה דומים לטכניקות אחרות המבוססות על דנ"א של תא יחיד30. לאחר מכן, יש לקבוע את התפלגות הגודל של הקריאות לאחר המיפוי כדי להבטיח שהפרופיל דומה לרצף מראש (כאשר רצף המתאם אינו תורם עוד לגדלי הקריאה).

לאחר הערכת איכות הנתונים, ניתן לדמיין את תפוסת החלבון בשיטות שונות: ניתן לדמיין תמונות של דפדפן גנום לוקוס יחיד באמצעות דפדפן הגנום של UCSC או IGV (איור 3A) ודפוסי תפוסה כלל-גנומיים על פני קואורדינטות גנומיות ספציפיות ניתן לדמיין באמצעות מטפלוטות (איור 3B, למטה), מפות חום (איור 3B, למעלה) או מפות חום חד-ממדיות (איור 3C). למידע נוסף על ניתוח נתונים, עיין במחקר של פאטי והינר27. נתונים חד-תאיים מתא דיפלואיד יגרמו לעד ארבע קריאות התורמות לכל לוקוס (ארבע קריאות אם התא היה במיטוזה), אך לעתים קרובות יותר קריאה אחת או שתיים. לכן, הנתונים הם בינאריים, ורקע גבוה יכול להיות בטעות בקלות רבה יותר לתפוסה, ביחס לניסויים בתא גבוה. לכן, מומלץ לבצע ניסוי CUT&RUN מקביל על מספר תא גבוה (5,000 עד 100,000 תאים), במידת האפשר, כדי לרכוש את כל המיקומים המחייבים האפשריים עבור חלבון העניין. לאחר מכן, ניתן להשוות נתונים של תא יחיד למיקומי איגוד אפשריים. בדוגמאות המוצגות באיור 3, תוצאות CTCF uliCUT&RUN של תא יחיד משווות ל-CTCF uliCUT&RUN של תא גבוה (איור 3A) או ChIP-seq (איור 3B,C). כפי שהוכח בעבר, פסגות ULICUT&RUN חד-תאיות של CTCF, SOX2 ו- NANOG ייצגו במידה רבה פסגות חזקות יותר ממערכות נתונים ChIP-seq של תאים גבוהים23.

Figure 1
איור 1: סכמטי של פרוטוקול uliCUT&RUN. תאים נקצרים וממוינים ללוח של 96 בארות המכיל מאגר NE. גרעינים בודדים קשורים לאחר מכן למיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA, וברצף נוגדן (מיקוד חלבון העניין) ו- pA-MNase או pA / G-MNase מתווספים. דנ"א הסמוך לחלבון נבקע באמצעות MNase, והדנ"א מטוהר לשימוש בהכנת הספרייה. דמות זו נוצרה עם Biorender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמה לכך היא מיון תאים ובקרת איכות של ספריות uliCUT&RUN. (A) תמונה של תאי גזע עוברי מורין (ES) באיכות גבוהה. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B) יציאה ממיון תא בודד לאחר הוספת 7AAD לתאי ES שנקטפו ומיון במכשיר FACS. (ג) ג'ל אגרוז מוכתם אתידיום ברומיד המתאר ספריות uliCUT&RUN שהושלמו. מסלול 1 הוא סולם במשקל מולקולרי נמוך ומסלולים 2-21 הם דוגמאות לספריות uliCUT&RUN בודדות מוצלחות לפני הרצף. (D) ג'ל אגרוז מוכתם אתידיום ברומיד המתאר ספריות uliCUT&RUN תת-אופטימליות ואופטימליות שהושלמו. מסלול 1 הוא סולם במשקל מולקולרי נמוך, מסלול 2 הוא ספרייה תת-אופטימלית בשל עיכול MNase לא יעיל, ומסלול 3 הוא ספרייה מוצלחת עם עיכול מתאים. (ה) הפצת מנתח הקטעים של ספריית uliCUT&RUN אחת של תא בודד לפני הרצף. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לתוצאות הצפויות עבור נתוני uliCUT&RUN בודדים של תא ES. (A) מסלול דפדפן של מספר תא גבוה (5,000 תאים) CTCF או שליטה שלילית (ללא נוגדן, ללא Ab) uliCUT&RUN (שני הרצועות המובילות) ו- CTCF uliCUT&RUN של תא יחיד. התמונה משוחזרת, באישור, מפטי והינר27. (B) מפות חום (למעלה) ו- metaplots (למטה) של CTCF תא יחיד או שליטה שלילית (ללא Ab) uliCUT&RUN על אתרי CTCF ChIP-seq שפורסמו בעבר (GSE11724). התמונה משוחזרת, באישור, מהינר ואח' 23. (C) מפות חום 1D של CTCF תא יחיד או שליטה שלילית (ללא Ab) uliCUT&RUN על אתרי CTCF ChIP-seq שפורסמו בעבר (GSE11724). התמונה משוחזרת, באישור, מהינר ואח' 23. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב מאגרים שונים המשמשים בפרוטוקול זה. נפח פתרון המלאי הנדרש מופיע עם הריכוז הסופי הכתוב בסוגריים. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CUT&RUN הוא פרוטוקול יעיל לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. יש לו יתרונות רבים ביחס לפרוטוקולים אחרים, כולל: 1) יחס אות לרעש גבוה, 2) פרוטוקול מהיר, ו-3) כיסוי קריאה ברצף נמוך הנדרש ובכך מוביל לחיסכון בעלויות. השימוש בחלבון A- או חלבון A/G-MNase מאפשר להחיל את CUT&RUN עם כל נוגדן זמין; לכן, יש לו את הפוטנציאל במהירות ובקלות פרופיל חלבונים רבים. עם זאת, הסתגלות לתא יחיד עבור כל פרופיל חלבון על כרומטין היה קשה, במיוחד בהשוואה לתעתיק של תא יחיד (כלומר, scRNA-seq), בשל מספר העותק הנמוך של DNA ביחס ל- RNA (שניים עד ארבעה עותקים של DNA לעומת אלפי עותקים אפשריים של עותקי RNA).

בפרוטוקול המפורט לעיל, יש לשקול מספר צעדים קריטיים. ראשית, מיון התאים המתאים תלוי בסוג התא (או הרקמה), ויש לנקוט משנה זהירות למיון מדויק. מומלץ לבדוק עד כמה יעיל מיון של תאים בודדים עם המכשיר לפני כל ניסוי. שנית, בחירת נוגדנים יעילה היא חיונית. לפני שתמשיך ליישום של תא יחיד, מומלץ לבדוק את הנוגדן בניסוי במספר תאים גבוה (כמו גם בדיקות נוגדנים סטנדרטיות אחרות, כגון אישור ספציפיות באמצעות כתם מערבי לאחר נוקאאוט, טיטרציה של הנוגדן בניסויי CUT&RUN וכו '). שלישית, השתמש בבקרה שלילית, כגון IgG או ללא נוגדן ראשוני, מכיוון שהשוואה מתאימה לדגימות הניסוי חיונית לפרשנות איכות הנתונים והתוצאות הביולוגיות. כאשר משווים תוצאות ניסיוניות של תא יחיד לערכת נתונים של מספר תא גבוה, ניסויי השליטה השלילית בתא יחיד צריכים להיות פחות כיסוי קריאה על אותם אתרים מחייבים שזוהו בניסוי התא הגבוה ובמקום זאת יש התפלגות אקראית של קריאות על פני הגנום (עם הטיה עבור אזורים פתוחים של כרומטין). רביעית, יש להקפיד בעת הוספה והפעלת חלבון A- או חלבון A / G-MNase כדי לא לעכל יתר על המידה את הכרומטין: לא לחמם יתר על המידה את הדגימות עם הידיים שלך, לשמור על הדגימות בטמפרטורת קרח / אמבט מים (0 °C (0 °C (0 °C (0 °C (0 °C (0 °F), ו chelate התגובה בזמן המתאים. חמישית, יש להקפיד על כל הניסוי uliCUT&RUN והכנת הספרייה, בשל חומר נמוך. לדוגמה, דגירה מורחבת על המדף המגנטי במהלך כריכת חרוזים כדי להבטיח את supernatant פינה ודואג לא להפריע החרוזים בעת הסרת supernatant חיוניים לתשואה מספקת. שישית, בהתאם לשאלות המטופלות, מספר הניסויים בתא בודד המבוצעים הוא שיקול חשוב. חלק מהניסויים בתאים חד-תאיים ייכשלו (כמו בכל הניסויים בקלט נמוך), ולכן יש לשקול את מספר התוצאות הניסיוניות החיוביות הנדרשות לפרשנות מתאימה לקראת תחילת הניסוי. מספר התאים שייכללו בניסוי תלוי בכמות הנתונים הניסיוניים הנדרשים על ידי החוקר ובאיכות הנוגדן. לבסוף, שים לב כי תוצאות שוות ערך ניתן להשיג עם נפחים מופחתים של היבטים רבים של פרוטוקול זה. שלבים שבהם נפח הנפח הופחת ב -50% כוללים את נפח מאגר NE, מאגר כביסה, תערובת נוגדנים ראשונית (כולל כמות הנוגדנים העיקריים), תערובת pA-MNase (כולל כמות ה- pA-MNase) וכל השלבים בהכנת הספרייה.

בהתבסס על האופי המסובך של פרופיל גורם על כרומטין, ישנם מקורות פוטנציאליים רבים של בעיות ומקומות שבהם פתרון בעיות עשוי להיות נחוץ. אמנם ייתכנו שלבים רבים שבהם בעיות יכולות להתעורר, שלוש בעיות עיקריות נצפו: 1) תשואת DNA נמוכה עבור קלט לתוך בניית הספרייה; 2) אות רקע גבוה בדגימות ניסיוניות, ו -3) תשואה נמוכה לאחר בניית הספרייה. אם אין מספיק דנ"א להכנת ספריה ורצף (נקודה 1), שים לב לעצה הבאה לפתרון בעיות: א) ייתכן שהייתה תמוגה לא שלמה של הממברנה ולכן ניתן להגדיל את זמן התמוגה עם מאגר NE; ב) ייתכן שהיה קשירה לא יעילה של הגרעין למיקרוספירות הפרמגנטיות המצומדות ConA וניתן היה לתקן זאת באמצעות ערבוב מתאים עם הוספת חרוזים אלה; ג) ייתכן שנוספו מעט מדי נוגדנים, ולכן מומלץ לבצע טיטרציה של נוגדן כדי לזהות את הכמות היעילה ביותר; ד) זמני הדגירה עם הנוגדן העיקרי או עם החלבון A- או חלבון A/G-MNase קצרים מדי (כלומר, אין מספיק זמן כדי לאפשר כריכה) או ארוכים מדי (אלה הן דגימות מקוריות, לא מרוסקות), וניתן למטב אותן; ה) האינטראקציה של חלבון היעד עם כרומטין יכול להיות ארעי מדי כדי ללכוד בתנאים מקומיים ולכן crosslinking CUT&RUN יכול להתבצע28. בעוד שערכות נתונים של תא יחיד יניבו רקע גבוה, ייתכן שיש רקע גבוה מדי שבו קשה לפרש את האות מהרקע (נקודה 2). עבור בעיה זו, שים לב לעצה הבאה: א) שלב החסימה עם EDTA כדי למנוע עיכול MNase מראש יכול להיות מוגבר או ממוטב; ב) אם יש חיתוך מוגזם, זה יכול להיות בגלל שיש יותר מדי חלבון A- או חלבון A / G-MNase, ולכן טיטרציה של כמויות מתאימות ניתן לבצע; ג) עיכול יתר על ידי MNase עלול לגרום לרקע הגבוה, ולכן יש להעריך את הערבוב המתאים של סידן כלוריד עם תוספת ואופטימיזציה לזמן העיכול של MNase. לבסוף, ייתכן שהדנ"א היעיל של uliCUT&RUN מועשר נמצא, אך ניתן לשחזר כמות נמוכה של ספריה (נקודה 3). עבור בעיה זו, מומלץ להלן: א) טיפול מתאים ושימוש בחרוזי פוליסטירן-מגנטיט כדי להבטיח את הטיהור הנכון ולא אובדן DNA; באופן ספציפי, מומלץ לקבל 15 דקות דגירה ומינימום של 5 דקות כדי למגנט חרוזים כדי למנוע אובדן; ב) תת-הגברה של הספרייה בשלב PCR תגרום לתשואה נמוכה ולכן יש לקבוע את המחזורים המתאימים באמצעות qPCR (כפי שנקבע בעבר עבור ספריות ATAC-seq29).

כמו בכל הטכנולוגיות, יש מגבלות uliCUT&RUN כי יש לשקול לפני תחילת כל ניסויים. ראשית, ניסויים אלה מתוכננים ומותאמים לתנאים מקומיים, ולכן אם חלבון מקיים אינטראקציה ארעית רק עם כרומטין, ייתכן שיהיה צורך בגישה של קישור צולב כדי להבטיח את התאוששות האינטראקציה. שנית, כמו בכל הטכניקות המבוססות על נוגדנים, איכות הנוגדן חשובה. יש להקפיד להבטיח את האיכות והעקביות של הנוגדן לפני ביצוע ניסויים כלשהם. שלישית, חיתוך רקע MNase יכול להתרחש, ובעוד שיש אות רקע נמוך בעקביות ב- CUT&RUN ביחס לניסויים אחרים, אות הרקע יכול להיות גבוה בניסויים בתא יחיד ולכן יש לבצע בקרות וניתוחים מתאימים. בעוד שהאופי הבינארי של נתוני פרופילים חד-תאיים מגביל את ההדמיה, ניתן לבצע טכנולוגיות גנומיות חישוביות מתקדמות יותר, כגון הפחתה ממדית ואחרות (כפי שתואר בעבר27). לבסוף, בעוד פרופיל תא יחיד הורחב כאן לפורמט 96-well, זוהי תפוקה נמוכה ביחס לטכנולוגיות אחרות של תא יחיד המשתמשות 10xGenomics או פורמטים אחרים.

טכנולוגיות ליצירת פרופילים מבוססות קשירה כגון ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 ו-uliCUT&RUN23, יכולות לקבוע לוקליזציה של פקטור בכרומטין עם ציר זמן ניסיוני מהיר יותר, רקע נמוך יותר ובעלות נמוכה יותר מטכנולוגיות יצירת פרופילים מסורתיות, כגון ChIP-seq. לכן, אלה הן טכנולוגיות מרגשות מאוד עבור יישום דגימות יקרות כגון דגימות המטופל או דגימות התפתחותיות מוקדמות. יתר על כן, יישום לתאים בודדים יכול לספק מחקרים משלימים שבוצעו באמצעות ניסויים אחרים של תא יחיד כגון scRNA-seq ו scATAC-seq30. כפי שתואר באמצעות טכנולוגיות חד-תאיות נפוצות יותר אלה, ניתן להשיג תובנות חדשניות ביחס לניסויים בתאים בתפזורת. פרופיל חלבון חד-תאי על כרומטין צפוי לשמש באופן קבוע יותר ככל שהטכנולוגיות ממשיכות להשתפר ולאפשר הקבלה רבה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים הקשורים לפרויקט זה.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת היינר על הקריאה וההערות על גרסה מוקדמת יותר של כתב יד זה. פרויקט זה השתמש NextSeq500 זמין באוניברסיטת פיטסבורג מדעי הבריאות רצף הליבה בבית החולים לילדים UPMC של פיטסבורג עבור ריצוף עם תודה מיוחדת למנהל שלה, ויליאם מקדונלד. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מרכז אוניברסיטת פיטסבורג למחשוב מחקר באמצעות משאבי המחשב שסופקו. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק מספר R35GM133732 (כדי S.J.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL clear microfuge tubes ThermoFisher Scientific 90410
1.5 mL tube magnetic rack ThermoFisher Scientific 12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge Eppendorf 5404000537
10 cm sterile tissue culture plates ThermoFisher Scientific 150464
10X T4 DNA Ligase buffer New England Biolabs B0202S
15 mL conical tubes VWR 89039-656
1X TE buffer ThermoFisher Scientific 12090015
200 µL PCR tubes Eppendorf 951010022
2X quick ligase buffer New England Biolabs M2200 Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) Fisher Scientific BDB559925
96-well magnetic rack ThermoFisher Scientific 12027 or 12331D
96-well plate VWR 82006-636
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest varies
ATP ThermoFisher Scientific R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads Polysciences 86057-10 ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2) Fisher Scientific AAJ62905AP
Cell sorter BD FACSAria II cell sorter Requires training
Cell-specific media for cell culture Varies
Chloroform ThermoFisher Scientific C298-500 Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns Epoch Life Sciences 1920-250
dNTP set New England Biolabs N0446S
EGTA Sigma Aldrich E3889
Electrophoresis equipment varies
Ethanol Fisher Scientific 22032601 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Fisher Scientific BP2482100
FBS Sigma Aldrich F2442
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycogen VWR 97063-256
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in homemade Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl) Fisher Scientific A144-212 Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control ThermoFisher Scientific 51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood Bakery Company SG404
Manganese Chloride (MnCl2) Sigma Aldrich 244589
Micropipette set Rainin 30386597
Minifuge Benchmark Scientific C1012
NEB Adaptor New England Biolabs E6612AVIAL Adaptor
NEB Universal primer New England Biolabs E6611AVIAL Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit New England Biolabs E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L Indexed Primers
Negative control antibody Antibodies-Online ABIN101961
Nuclease Free water New England Biolabs B1500S
PCR thermocycler Eppendorf 2231000666
Phase lock tubes Qiagen 129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) ThermoFisher Scientific 15593049 Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10814010
Pipette aid Drummond Scientific # 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000 VWR A16151
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-1 CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors ThermoFisher Scientific 78430
ProteinA/G-MNase Epicypher 15-1016 pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN Addgene 86973
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q33230
Qubit Assay tubes ThermoFisher Scientific Q32856
Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer New England Biolabs M2200S
RNase A New England Biolabs T3010
Sodium Acetate  (NaOAc) ThermoFisher Scientific BP333-500
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) ThermoFisher Scientific BP166-500 SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-1 NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine Sigma Aldrich S2626
Standard Inverted Light Microscope Leica 11526213
Standard lab agarose gel materials Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips Varies
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203S
T4 PNK New England Biolabs M0201S
Tabletop vortexer Fisher Scientific 2215414
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S
Thermomixer Eppendorf 5384000020 Alternatively, can use a waterbath
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Triton X-100 Sigma Aldrich 9002-93-1 Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin Fisher Scientific MT25052
Tube rotator VWR 10136084
USER enzyme New England Biolabs M5505S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  2. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  3. Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
  4. Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
  5. Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
  6. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  7. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  8. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
  9. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  10. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  11. Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
  12. Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
  13. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  14. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  15. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
  16. Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
  17. Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
  18. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
  19. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  20. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  21. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  22. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  23. Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
  24. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  25. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  26. Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
  27. Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
  28. Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
  29. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  30. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 180
לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lardo, S. M., Hainer, S. J.… More

Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease. J. Vis. Exp. (180), e63536, doi:10.3791/63536 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter