Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הערכה אקוקרדיוגרפית של מורפולוגיה של חדר שמאל, תפקוד וזרימת דם כלילית בעכברים בני 7 ימים.
Abstract
אקוקרדיוגרפיה היא הליך לא פולשני המאפשר הערכה של פרמטרים מבניים ותפקודיים במודלים של מחלות לב וכלי דם בבעלי חיים ומשמש להערכת ההשפעה של טיפולים פוטנציאליים במחקרים פרה-קליניים. מחקרי אקו-לב נערכים בדרך כלל בעכברים בוגרים צעירים (כלומר, בני 4-6 שבועות). ההערכה של תפקוד הלב וכלי הדם של ילודים מוקדמים אינה מבוצעת בדרך כלל בגלל גודלם הקטן של גורי העכברים והקשיים הטכניים הנלווים. אחד האתגרים החשובים ביותר הוא שהאורך הקצר של איברי הגורים מונע מהם להגיע לאלקטרודות בפלטפורמת האקו-קרדיוגרפיה. טמפרטורת הגוף היא האתגר השני, שכן גורים רגישים מאוד לשינויים בטמפרטורה. לכן, חשוב לקבוע מדריך מעשי לביצוע מחקרי אקו-לב בגורי עכברים קטנים כדי לסייע לחוקרים לזהות שינויים פתולוגיים מוקדמים ולחקור את התקדמות מחלות לב וכלי דם לאורך זמן. העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול לביצוע אקוקרדיוגרפיה בגורי עכברים בגיל צעיר של 7 ימים. כמו כן מתואר אפיון אקוקרדיוגרפי של מורפולוגיה לבבית, תפקוד וזרימה כלילית בעכברים ילודים.
Introduction
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבחון את המורפולוגיה של הלב, תפקודו וזרימת העורקים הכליליים בגורי עכברים ילודים בני 7 ימים באמצעות אקוקרדיוגרפיה. הרציונל מאחורי פיתוח טכניקה זו הוא לקבוע שינויים מוקדמים בזרימה הכלילית ובתפקוד הלב במודלים של עכברים של מחלות לב1. האופי הלא פולשני של אקוקרדיוגרפיה הוא יתרון משום שהוא מאפשר לחוקרים להעריך את תפקוד הלב וכלי הדם בתנאים פיזיולוגיים ומספק לחוקרים כלי סינון לחקר טיפולים ממוקדים לטיפול במחלות לב וכלי דם 2,3. באופן מסורתי, מחקרים אקוקרדיוגרפיים נערכים עם עכברים בוגרים צעירים (4-6 שבועות); עם זאת, חלק מדגמי העכברים (כלומר, מודלים מהונדסים גנטית) כבר מציגים שינויים פתולוגיים ותפקוד לקוי של הלב בגיל זה. לכן, מחקרי לב באמצעות מודלים של בעלי חיים התמקדו בעיקר בחומרים טיפוליים המשפרים או מטפלים בתפקוד לקוי של הלב. לעומת זאת, לאחרונה, מאמצי המחקר הופנו להתמקד באמצעי מניעה והתערבויות מוקדמות במחלות לב4.
מחקרים קודמים תיארו את השימוש באקוקרדיוגרפיה למדידת תפקוד הלב במודלים של אוטם שריר הלב בעכברים ילודים 5,6; עם זאת, מחקרים אלה נכשלו במדידת הזרימה הכלילית, והכי חשוב, לא הצליחו לרשום נתוני אלקטרוקרדיוגרמה (א.ק.ג.) ודופק (HR) במהלך ההליך, ככל הנראה בשל גודלן הקטן של איברי הגורים, שלא הצליחו להגיע לרפידות האלקטרודה. אנו מתגברים על בעיה זו בפרוטוקול זה על ידי הצמדת רדיד אלומיניום לגפיים כדי לאפשר להן להגיע לרפידות האלקטרודה וליצור מעגל א.ק.ג. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר ומאפיין את זרימת העורקים הכליליים בעכברים ילודים.
מחקר זה השיג תמונות במצב B ובמצב M בתצוגות פאראסטרנליות ארוכות וקצרות למדידת פרמטרים מבניים ופונקציונליים 2,3. הפרמטרים המורפולוגיים כללו מידות פרוזדורים שמאליים, מידות חדר שמאל (LV), עובי דופן LV, מסת LV ועובי דופן יחסי (RWT). הפרמטרים הפונקציונליים כללו שבר פליטה (EF), קיצור שברים (FS), תפוקת לב (CO) ומהירות קיצור סיבים היקפיים (Vcf). דופלר גל דופק (PW) שימש למדידת זרימה אבי העורקים בראייה פאראסטרנלית קצרת צירים (PSAX) ולמדידת זרימת דם מיטרלית בראייה אפית בעלת ארבעה תאים. התצוגה האפיקלית בעלת ארבעת התאים שימשה גם לביצוע דופלר רקמה בחלק המחיצות של טבעת המסתם המיטרלי. זרימה כלילית בעורק הכלילי הקדמי השמאלי (LAD) נבדקה גם באמצעות תצוגה פרסטרנלית ארוכת ציר (PLAX). עתודת זרימה כלילית (CFR) חושבה לאחר אתגר לחץ שנגרם על ידי ריכוז איזופלורן מוגבר.
הפרוטוקול הנוכחי מדגים כי מחקרי אקו-לב יכולים להתבצע בגיל צעיר מאוד בעכברים ילודים, ובכך לאפשר זיהוי מוקדם של פתולוגיות לב ומחקרי מעקב אורכיים של המודינמיקה LV ופרמטרים של זרימה כלילית במודלים שונים של עכברים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את התפקיד של שינויים גנטיים או התערבויות פרמקולוגיות בתפקוד הלב בגילאים מוקדמים לאחר הלידה. יתר על כן, הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לקביעת הופעת מחלות לב בשלב מוקדם בחיים, ובכך מאפשר לחוקרים לפתוח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס השלבים הראשונים של מחלות לב במודלים שונים של עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו. לצורך הניסויים נעשה שימוש בעכברי FVB/N בני 7 ימים. הפרוטוקול מחולק להכנת עכברים, רכישת תמונת אקוקרדיוגרפיה וטיפול בבעלי חיים לאחר הדמיה.
1. הכנת עכבר
- השיגו את העכברים בני 7 הימים מכלוב הרבייה.
הערה: בגיל צעיר זה, קשה לקבוע את מין החיה על ידי בדיקה גופנית. - הניחו ג'ל א.ק.ג. (ראו טבלת חומרים) על רפידות האלקטרודה המחוממות. הניחו פסי רדיד אלומיניום (~1.5 אינץ' x 0.25 אינץ') על גבי רפידות האלקטרודות כדי להרחיב את טווח האלקטרודות ולאבטח באמצעות סרט הדבקה (איור 1A). לאחר מכן, מניחים את ג'ל האק"ג על גבי רצועות רדיד האלומיניום.
הערה: ודא שהג'ל שמתחת לרצועות רדיד האלומיניום אינו מתייבש במהלך ההליך. במקרה כזה, הוסיפו עוד ג'ל כדי לשמור על המוליכות. - גזרו אצבע מכפפת ניטריל והתאימו אותה כך שתכסה גם את חרוט האף איזופלורן/חמצן בצד אחד וגם את אף העכבר בצד השני (איור 1B).
- הכניסו את גור העכבר לתא האינדוקציה של האיזופלוראן והתחילו בהעברת איזופלוראן בריכוז של 2.5% המונע על-ידי 100% חמצן (איור 1C).
- הניחו את הגור המרדים בתנוחת שכיבה על משטח ההדמיה עם הכפות על גבי רפידות רדיד האלומיניום ואבטחו באמצעות סרט הדבקה. ודא שהמעגל החשמלי הושלם ושהאק"ג מקליט.
- הפחיתו את אספקת האיזופלוראן ל-1.5% המונעים על ידי 100% חמצן. הדקו את האצבע החתוכה מהכפפה סביב אפו של הגור באמצעות סרט הדבקה. אשרו את עומק ההרדמה על ידי צביטה בכפותיו של הגור.
- הניחו שכבה עבה של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש על פלג גופו העליון של הגור. השתמשו בשני גלילי גזה כדי לשמור על ג'ל האולטרסאונד במקומו (איור 1D).
- השתמשו במנורת חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הרגילה של הגור (איור 1E).
הערה: בדיקה רקטלית לא שימשה לניטור טמפרטורת הגוף במחקר הנוכחי בשל גודלו הקטן של הגור.
2. רכישת תמונה אקו-קרדיוגרפית וניתוחה
- בצע אקוקרדיוגרפיה טרנסתוראקית באמצעות מכשיר אקוקרדיוגרפיה המצויד במתמר מערך ליניארי במהירות 40 MHz עבור מצב B וב- 32 MHz עבור דופלר (קצב פריימים 233) (ראה טבלת חומרים), בהתאם לפרוטוקולי אקוקרדיוגרפיה של עכברים בוגרים 7,8,9.
- הימנעו מהפעלת לחץ מוגזם על חלל החזה של הגור בעת הנחת מתמר ההד במהלך רכישת תמונה אקוקרדיוגרפית.
הערה: בשל גודלו הקטן של הגור, משקל המתמר עצמו עלול לגרום לשינוי בתפקוד הלב או למוות. - צלם את תצוגת ה- PLAX של מערכת היציאה של החדר השמאלי והאטריום השמאלי.
- הניחו את המתמר במחזיק, עם סימן האינדקס לכיוון הכתף הימנית של הגור.
- הנמיכו את המתמר עד שהוא בא במגע עם הג'ל ודמיינו את מערכת היציאה של החדר השמאלי במצב B (איור 2A).
- השתמשו במצב M בעלוני אבי העורקים כדי למדוד את הקוטר המרבי של אטריום שמאל (LA) בסוף סיסטולה (איור 2B, טבלה 1). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
- צלם את תצוגת PSAX של החדר השמאלי כדי למדוד את מידות התא, עובי הדופן, זרימת אבי העורקים וזרימת הריאה.
- סובב את המתמר ~ 90° בכיוון השעון של PLAX כדי לקבל את תצוגת PSAX.
- מקם את הבדיקה ברמה של השרירים הפפילריים והשתמש במצב M כדי למדוד את הקטרים הפנימיים של החדר השמאלי (LVID), עובי המחיצה הבין-חדרית (IVS) ו- PW במהלך סיסטולה ודיאסטולה (איור 3A, טבלה 1). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
- חשב את RWT, אינדקס של היפרטרופיה, באמצעות ממדי התא הדיאסטולי כדלקמן 3,10:
(PW + IVS בסוף הדיאסטולה) / (LVID בסוף הדיאסטולה) - הזז את המתמר לכיוון בסיס הלב והשתמש בצבע דופלר כדי לדמיין את עורק הריאה. לחץ על PW Doppler כדי לכמת את מהירות זרימת השיא הריאתי, פרופילי זרימה ריאתית, זמן פליטה ריאתית (PET) וזמן האצה ריאתית (PAT)11,12 (איור 3B). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
- הזיזו את המתמר עוד יותר לכיוון הבסיס והשתמשו בדופלר צבע כדי לדמיין את זרימת אבי העורקים (איור 3C). השתמש בדופלר PW כדי לדמיין את זרימת הדם ולמדוד את זמן הפליטה של אבי העורקים (AET). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
- חשב את ה- Vcf (circ/sec)13,14, אינדיקטור לביצועי שריר הלב, באמצעות דיאסטולה סופית של LVID (LVIDd), LVID end-systole (LVIDs) ו- AET באופן הבא (טבלה 1):
(LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
- צלם את התצוגה האפית בעלת ארבעת התאים.
- הניחו את הפלטפורמה בתנוחת טרנדלנבורג, הטו אותה שמאלה והתאימו את הגשושית כדי לדמיין את ארבעת התאים (איור 4A).
- השתמש בדופלר צבע כדי לדמיין את זרימת הדם וב- PW דופלר בקצה עלוני המסתם המיטרלי במרכז פתח המסתם המיטרלי כדי לרשום את הזרימה המיטרלית. לחץ על חנות Cine כדי להקליט את הנתונים.
- בתצוגה זו, חשב את הפרמטרים הבאים 2,3,10 (איור 4B וטבלה 1):
- חישוב יחס E/A, שהוא המהירות המרבית של זרימת הדם בשלב המוקדם של הדיאסטולה (E) על פני המהירות המרבית של זרימת הדם בשלב המאוחר של הדיאסטולה (A).
- קבע את זמן ההאטה של גל E (DT), שהוא הזמן משיא E ועד סוף הדיאסטולה המוקדמת.
- חישוב זמן הרפיה איזובולומי LV (IVRT), שהוא הזמן מסגירת מסתם אבי העורקים ועד לפתיחת המסתם המיטרלי.
- חישוב זמן התכווצות איזובולומי LV (IVCT), שהוא הזמן מסגירת המסתם המיטרלי ועד לפתיחת המסתם האאורטלי.
- השתמש בדופלר רקמה בצד המחיצות של טבעת המסתם המיטרלי בתצוגה של ארבעה תאים כדי למדוד את מהירות ההרפיה הגבוהה של שריר הלב במילוי הדיאסטולי המוקדם (e') ובמילוי הדיאסטולי המאוחר (a'), כמו גם את שיא מהירות ההתכווצות הסיסטולית של שריר הלב (s') (איור 4C וטבלה 1). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
- צלם את תצוגת ה- PLAX המתוקנת כדי לבחון את העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.
- השתמשו בתצוגת PLAX15 שונה, הזיזו את המתמר לרוחב והטו את הקרן לכיוון החלק הקדמי (איור 5A).
- הזז את הבדיקה והשתמש בדופלר צבע כדי לדמיין את מקור העורק הכלילי הראשי השמאלי (LCA) שנוצר מאבי העורקים. זהה את עורק ה- LAD שנוצר מה- LCA ועובר בין דופן החדר השמאלי הקדמי לבין מערכת היציאה של החדר הימני16,17. בעמדה זו, הפעילו את PW Doppler כדי למדוד את זרימת ה-LAD (איור 5B). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים.
- חשב את הפרמטרים הבאים של זרימת עורקים כליליים LAD (איור 5C וטבלה 2): מהירות זרימה כלילית שיא (CFV), CFV ממוצע ואינטגרל מהירות-זמן (VTI).
הערה: כל הפרמטרים הללו נמדדים בריכוז איזופלוראן בסיסי של 1.5% (בסיס). - העלו את ריכוז האיזופלוראן ל-2.5% והמתינו 5 דקות כדי להשיג זרימה מקסימלית (איור 5C). לחץ על הלחצן Cine Store כדי להקליט את הנתונים. חישוב CFR כיחס בין CFV שיא דיאסטולי בזרימה מקסימלית לשיא דיאסטולי CFV בבסיס18,19,20 (טבלה 2):
CFR = שיא דיאסטולי CFV (2.5%) / שיא דיאסטולי CFV (1.5%)
3. ניטור וטיפול בבעלי חיים לאחר הדמיה
- לאחר השלמת ההדמיה האקו-קרדיוגרפית, נקו בזהירות את הגור ואפשרו לו להתאושש מההרדמה למשך כ-2 דקות.
- לפני החזרת הגור לכלוב שלו, מרחו את הגור במצעים של אם הכלוב כדי למנוע דחייה או קניבליזציה.
- שימו לב להתנהגות האם במשך כ -30 דקות לאחר ההליך. אם נצפתה התנהגות אגרסיבית, הרדימו את הגור בהתאם להנחיות הנוהל של בעלי החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה נעשה שימוש בגורי עכברים בני 7 ימים כדי לאפיין את המורפולוגיה של הלב, תפקודו וזרימת העורקים הכליליים. הטיפול בעכבר צריך להיעשות בזהירות, ופלטפורמת העכבר חייבת להיות מותאמת לגודל הקטן של הגורים, כפי שמתואר באיור 1. תמונה מייצגת של תצוגת PLAX מוצגת באיור 2A ובסרטון משלים 1. בתצוגה זו, מצב M שימש למדידת קוטר האטריום השמאלי (LA) (איור 2B). תצוגת PSAX (סרטון משלים 2) שימשה למדידת ממדי החדר השמאלי (איור 3A), הזרימה הריאתית (איור 3B) וזרימת אבי העורקים (איור 3C). התצוגה האפית בעלת ארבעת התאים (וידאו משלים 3 ואיור 4A) שימשה כדי לבחון את מהירויות זרימת הדם על פני המסתם המיטרלי (איור 4B), כמו גם את ההרפיה והתכווצות שריר הלב בשסתום המיטרלי (איור 4C).
תצוגת PLAX ששונתה שימשה לבחינת הפרמטרים של זרימת עורקים כליליים LAD (איור 5A,B ווידאו משלים 4), כפי שתואר קודם לכן15,16,21. באיור 5C, תוצאות מייצגות של השיא הדיאסטולי CFV, CFV ממוצע ו-VTI מוצגות במצב זרימה במנוחה (1.5% איזופלורן) ו-5 דקות לאחר הגדלת האיזופלוראן ל-2.5% כדי לגרום להרחבת כלי דם מקסימלית. הערכים המוגברים של פרמטרים אלה (כלומר, שיא CFV, CFV ממוצע ו- VTI) 5 דקות לאחר תוספת איזופלורן מאשרים את התגובה הצפויה להיפרמיה בעכברים ילודים18. CFR חושב כיחס בין שיא דיאסטולי CFV במהלך התרחבות כלי דם מקסימלית המושרה על ידי 2.5% איזופלורן לשיא דיאסטולי CFV בבסיס של 1.5% ריכוז איזופלורן18. כל המדידות והחישובים נספרו בממוצע על פני 3 מחזורים רצופים, והתוצאות המייצגות מוצגות בטבלה 1 ובטבלה 2.
איור 1: הגדרת פלטפורמה אקו-קרדיוגרפית והכנת גור עכברים בן 7 ימים . (A) פסי רדיד אלומיניום מונחים על רפידות האלקטרודה של הפלטפורמה ומאובטחים באמצעות סרט הדבקה. (B) אצבע הכפפה נחתכת ומותאמת לחרוט האף איזופלורן/חמצן. (C) הגור ממוקם בתא האינדוקציה של האיזופלורן, והעברת האיזופלוראן מתחילה בריכוז של 2.5%. (D) הגור ממוקם במצב שכיבה עם כפות הנוגעות ברצועות רדיד האלומיניום ומאובטח בנייר דבק. שני גלילים של גזה משמשים כדי לשמור על הג'ל האקוסטי במקום. (E) מנורת חימום ממוקמת קרוב לגור כדי לשמור על טמפרטורת גופו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מבט פארא-סטרנלי על ציר ארוך (PLAX ) של החדר השמאלי. (A) תמונות במצב B של החדר השמאלי (LV), האטריום השמאלי (LA) ואבי העורקים. (B) מצב M משמש למדידת קוטר LA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מבט פארא-סטרנלי על ציר קצר (PSAX) של החדר השמאלי. (A) תמונות במצב B של החדר השמאלי. (B) דגימה במצב M של המחיצה הבין-חדרית בדיאסטולה (IVSd), קוטר פנימי של החדר השמאלי בדיאסטולה (LVIDd) ועובי דופן אחורית בדיאסטולה (PWd). (C) תמונות מייצגות של מהירות זרימת השיא הריאתי, זמן הפליטה הריאתית (PET) וזמן ההאצה הריאתית (PAT). (D) תמונות מייצגות של זמן הפליטה של אבי העורקים (AET). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תצוגה אפית בעלת ארבעה תאים. (A) תמונה במצב B של החדר השמאלי (LV), החדר הימני (RV), האטריום השמאלי (LA) והאטריום הימני (RA). (B) תמונות מייצגות של מהירות זרימת הדם המרבית בשלב המוקדם של הדיאסטולה (E), מהירות זרימת הדם המרבית בשלב המאוחר של הדיאסטולה (A), זמן ההאטה (DT), זמן ההתכווצות האיזו-נפחית (IVCT) וזמן ההרפיה האיזו-נפחית (IVRT). (C) תמונות דופלר רקמה של מהירות הרפיה שריר הלב המוקדמת במילוי הדיאסטולי המוקדם (e'), מילוי דיאסטולי מאוחר (a') ומהירות שיא שריר הלב הסיסטולי (s). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תצוגה פרסטרנלית שונה של ציר ארוך. (A) מיקום פלטפורמה ומתמר בתצוגה פרסטרנלית בעלת ציר ארוך. (B) הדמיה והקלטה של זרימת עורקים כליליים יורדת קדמית שמאלית (LAD). LVOT = מערכת זרימת החדר השמאלי. (C) שיא מהירות הזרימה הכלילית (CFV), CFV ממוצע ואינטגרל זמן מהירות (VTI) בדיאסטולה נמדדים ב-1.5% איזופלוראן (קו בסיס) ו-5 דקות לאחר העלאת ריכוז האיזופלוראן ל-2.5%; עכברים בני 7 ימים, N = 7; נתונים המוצגים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| פרמטרים אקוקרדיוגרפיים | WT (n = 7) | |
| ממוצע ± SD | ||
| מורפולוגיה | לוס אנג'לס (מ"מ) | 1.25 ± 0.11 |
| PWd (מ"מ) | 0.40 ± 0.06 | |
| LVIDd (מ"מ) | 1.98 ± 0.34 | |
| LV Mass (g) | 10.92 ± 3.53 | |
| ר.ו.ט. | 0.39 ± 0.09 | |
| פונקציה סיסטולית | משאבי אנוש (פעימות לדקה) | 500.69 ± 40.04 |
| EF(%) | 81.97 ± 10.76 | |
| SV (מ"ל) | 10.16 ± 3.44 | |
| CO (מ"ל/דקה) | 5.04 ± 1.53 | |
| s' (cm/s) | 16.16 ± 3.56 | |
| Vcf (circ/s) | 10.50 ± 3.12 | |
| פונקציה דיאסטולית | E/A | 1.25 ± 0.11 |
| E/e' | 45.58 ± 11.44 | |
| DT (ים) | 23.97 ± 2.63 | |
| IVRT (ים) | 16.27 ± 2.11 | |
טבלה 1: הערכה אקוקרדיוגרפית של מורפולוגיה ותפקוד של חדר שמאל בגורי עכברים בני 7 ימים.
| פרמטרים של זרימה כלילית | בסיסית | 5 דק' | CFR | |
| איזופלורן 1.5% | איזופלורן 2.5% | 5 דקות/קו בסיס | ||
| דיאסטולה | מהירות שיא (מ"מ/שנייה) | 516.58 ± 113.04 | 599.43 ± 101.34 | 1.18 ± 0.18 |
| מהירות ממוצעת (מ"מ/שנייה) | 308.50 ± 63.44 | 351.50 ± 53.98 | ||
| VTI (מ"מ) | 25.23 ± 5.86 | 30.65 ± 7.75 | ||
| סיטול | מהירות שיא (מ"מ/שנייה) | 121.81 ± 40.52 | 163.13 ± 32.59* | |
| מהירות ממוצעת (מ"מ/שנייה) | 84.82 ± 27.16 | 114.70 ± 21.84* | ||
| VTI (מ"מ) | 5.21 ± 1.84 | 7.76 ± 2.08* | ||
| דופק (פעימות לדקה) | 536.20 ± 128.90 | 540.80 ± 233.15 | ||
| קצב נשימה (סל"ד) | 69.60 ± 15.89 | 38.80 ± 24.18 | ||
טבלה 2: הערכה אקוקרדיוגרפית של זרימת עורקים כליליים בגורי עכברים בני 7 ימים. עכברים בני שבעה ימים, N = 7; נתונים המוצגים כממוצע ± SD; מבחן ה-t של הסטודנט שימש לניתוח הנתונים; *עמ' < 0.05; CFR = עתודת זרימה כלילית; VTI = אינטגרל זמן מהירות.
סרטון משלים 1: מבט פאראסטרנלי על ציר ארוך של זרימת החדר השמאלי והאטריום השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון משלים 2: מבט על ציר קצר פאראסטרנלי של החדר השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון משלים 3: הנוף האפיקלי בן ארבעת הקאמריות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון משלים 4: התצוגה הפרסטרנלית המשתנה של זרימת עורקים כליליים יורדת קדמית שמאלית. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעידן הרפואה המונעת, נדרשת הערכה מוקדמת של שינויים בתפקוד הלב וכלי הדם כדי לקבוע את הופעת המחלה ולתכנן טיפולים התערבותיים מתאימים. עכברים משמשים יותר ויותר כמודלים פרה-קליניים במחקרי לב, ומחקרים אקוקרדיוגרפיים נערכים בדרך כלל עם עכברים בוגרים צעירים. עם זאת, כדי ללמוד את התפקיד של שינויים גנטיים או התערבויות פרמקולוגיות בשלבים המוקדמים של מחלות לב, הדמיה אקוקרדיוגרפית צריך להיות יזום מוקדם יותר בחיים. באופן בעייתי, מחקרים אקוקרדיוגרפיים בעכברים יילודים הם מאתגרים מבחינה טכנית. במחקר זה קבענו פרוטוקול לביצוע מדידות אקו-לב בעכברים כבר בגיל 7 ימים. זה חשוב במיוחד עבור מודלים עכברים מהונדסים, שבו מחיקה או ביטוי יתר של גן הוא האמין לגרום לבעיות בתפקוד הלב וכלי הדם. זיהוי מוקדם של הפרעות לב וכלי דם במודלים אלה של בעלי חיים מאפשר לחוקרים לתכנן טיפולים תרופתיים המונעים את התקדמות המחלה.
בשל גודלם הקטן של העכברים בני 7 הימים, כמה שיקולים טכניים בפרוטוקול זה כללו שמירה על טמפרטורות הגוף הרגילות שלהם ומזעור אורך ההליך האקוקרדיוגרפי. פלטפורמה מחוממת, מנורת חימום וג'ל אקוסטי שחומם מראש שימשו למניעת היפותרמיה. באופן אידיאלי, הטמפרטורה של החיה צריכה להיות מנוטרת באמצעות בדיקה רקטלית; עם זאת, בהתחשב בגודלם הקטן של הגורים במחקר זה, לא הצלחנו להשתמש בבדיקה רקטלית במהלך ההליך. יתר על כן, היפרתרמיה היא גם דאגה, ויש לנקוט בזהירות כדי למנוע מהגורים להיות בקרבת מנורת החימום. משך הליך ההד צריך להישמר לפחות משעה כדי למזער שינויי טמפרטורה גדולים ולמנוע את ההשפעות הפיזיולוגיות של הרדמה ממושכת22. בנוסף, מכיוון שגודל הבדיקה האקו-קרדיוגרפית נועד לדמות עכברים בוגרים, מומלץ להשתמש בשכבה עבה יותר של ג'ל אקוסטי כדי להתאים את מרחק המוקד. חשוב גם להזכיר שמערכת ההדמיה ששימשה במחקר זה מחשבת את קצב הנשימה וקצב הלב מהאות הא.ק.ג. שזוהה על ידי רפידות האלקטרודות של הפלטפורמה (טבלה 2). מכיוון שרפידות האק"ג הורחבו כדי להגיע לגפיים של הגור באמצעות רדיד אלומיניום, ייתכן שהאות שזוהה היה מעוות. בעיה נוספת שנתקלנו בה הייתה שבסוף ההליך שמנו לב שהג'ל שמתחת לרצועות רדיד האלומיניום התייבש, מה שאולי השפיע על המוליכות ועל אות האק"ג. באופן אידיאלי, יש להשתמש בפלטפורמה עם רפידות אלקטרודות התואמות את גודל החיה או באלקטרודות מחט שבאות במגע עם גפי הגור כדי לקבל אות א.ק.ג. אמין יותר23,24.
המגבלות של המחקר הנוכחי כוללות את ריכוזי האיזופלורן הגבוהים יותר הדרושים להרדמה של עכברים ילודים. פרוטוקול זה השתמש ב-1.5% איזופלורן לביצוע ניתוחים אקוקרדיוגרפיים, כולל דינמיקת זרימה כלילית. ריכוז האיזופלורן הועלה מ -1.5% ל -2.5% כדי לגרום להיפרמיה ולהעריך CFR. בעכברים בוגרים, הערכת מהירות זרימה כלילית במנוחה מבוצעת באיזופלוראן של 1%, והתגובה ההיפרמית מתבצעת ב-2.5%18,25,26. עם זאת, בעכברים ילודים, 1% isoflurane אינו מספיק כדי לשמור על רמה נאותה של הרדמה. אף על פי כן, המעבר מ-1.5% ל-2.5% איזופלוראן בעכברים ילודים הגדיל את שיא ה-CFV, ה-CFV הממוצע וה-VTI (איור 5C וטבלה 2), ובכך אימת את התרחבות כלי הדם של העורקים הכליליים הנגרמים על-ידי איזופלורן. חשוב גם להזכיר שבפרוטוקול זה נעשה שימוש בתצוגת PLAX שונה כדי להמחיש ולבחון את פרמטרי הזרימה הכליליים של LAD15,16,21; עם זאת, ניתן גם לדמיין את LAD באמצעות PSAX 16,19,21 שונה או תצוגה אפית שונה של ארבעה תאים 16,21. במחקר הנוכחי, ה- PLAX המתוקן נתן לנו תוצאות עקביות יותר בהדמיה והערכה נכונות של זרימה כלילית LAD ו- CFR בעכברים ילודים.
מאמר זה מספק מדריך מעשי להדמיה והערכת תפקוד הלב וכלי הדם בעכברים ילודים. יש לקחת בחשבון כי הפרמטרים של תפקוד הלב משתנים בהתאם לזן העכברים ולגילם. במחקר זה השתמשנו בעכברי FVB/N, ותוצאות אלה עשויות לשמש כערכי ייחוס למחקרים עתידיים עם אותו זן (טבלה 1 וטבלה 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לצ'אד מ. וורן, MS (אוניברסיטת אילינוי בשיקגו), על עריכת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH/NHLBI K01HL155241 ו-AHA CDA849387 ל-PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilating agent | Nair Hair Remover | ||
| Electrode gel | Parker Laboratories | 15-60 | |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| Isoflurane | MedVet | RXISO-250 | |
| Linear array high frequency transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS550D | |
| Mice breeding pair | Charles River Laboratories | FVB/N | Strain Code 207 |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories | 11-08 | |
| Vevo Lab Software | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Verison 5.5.1 |
References
- Le, V. P., Wagenseil, J. E. Echocardiographic Characterization of Postnatal Development in Mice with Reduced Arterial Elasticity. Cardiovascular Engineering and Technology. 3 (4), 424-438 (2012).
- Nagueh, S. F., et al. Recommendations for the Evaluation of Left Ventricular Diastolic Function by Echocardiography: An Update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 17 (12), 1321-1360 (2016).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 16 (3), 233-270 (2015).
- Chrysant, S. G. A new paradigm in the treatment of the cardiovascular disease continuum: focus on prevention. Hippokratia. 15 (1), 7-11 (2011).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial infarction in neonatal mice, a model of cardiac regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocol. 9 (2), 305-311 (2014).
- Chowdhury, S. A. K., et al. Modifications of sarcoplasmic reticulum function prevent progression of sarcomere-linked hypertrophic cardiomyopathy despite a persistent increase in myofilament calcium response. Frontiers in Physiology. 11, 107 (2020).
- Batra, A., et al. Deletion of P21-activated kinase-1 induces age-dependent increased visceral adiposity and cardiac dysfunction in female mice. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1337-1349 (2021).
- Capote, A. E., et al. B-arrestin-2 signaling is important to preserve cardiac function during aging. Frontiers in Physiology. 12, 1302 (2021).
- Armstrong, W. F., Ryan, T., Feigenbaum, H. Feigenbaum's Echocardiography. 7th ed. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2010).
- Su, J., et al. Impact of chronic hypoxia on proximal pulmonary artery wave propagation and mechanical properties in rats. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 314 (6), 1264-1278 (2018).
- Rudski, L. G., et al. Guidelines for the echocardiographic assessment of the right heart in adults: a report from the American Society of Echocardiography endorsed by the European Association of Echocardiography, a registered branch of the European Society of Cardiology, and the Canadian Society of Echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (7), 685-713 (2010).
- Wilson, J. R., Reichek, N. Echocardiographic indices of left ventricular function. A comparison. Chest. 76 (4), 441-447 (1979).
- Stypmann, J., et al. Echocardiographic assessment of global left ventricular function in mice. Lab Animal. 43 (2), 127-137 (2009).
- Wikstrom, J., Gronros, J., Bergstrom, G., Gan, L. M. Functional and morphologic imaging of coronary atherosclerosis in living mice using high-resolution color Doppler echocardiography and ultrasound biomicroscopy. Journal of the American College of Cardiology. 46 (4), 720-727 (2005).
- Douglas, P. S., Fiolkoski, J., Berko, B., Reichek, N. Echocardiographic visualization of coronary artery anatomy in the adult. Journal of the American College of Cardiology. 11 (3), 565-571 (1988).
- Lambertz, H., Lethen, H., Tries, H. P., Kersting, S. Non-invasive assessment of coronary flow reserve - valuable functional information in cardiac workflow. Ultraschall in der Medizin. 25 (1), 25-33 (2004).
- Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: A Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (4), 999-1009 (2016).
- Gan, L. M., Wikstrom, J., Bergstrom, G., Wandt, B. Non-invasive imaging of coronary arteries in living mice using high-resolution echocardiography. Scandinavian Cardiovascular Journal. 38 (2), 121-126 (2004).
- Gan, L. M., Wikstrom, J., Fritsche-Danielson, R. Coronary flow reserve from mouse to man--from mechanistic understanding to future interventions. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (5), 715-728 (2013).
- Krzanowski, M., Bodzon, W., Dimitrow, P. P. Imaging of all three coronary arteries by transthoracic echocardiography. An illustrated guide. Cardiovascular Ultrasound. 1, 16 (2003).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), 21-31 (2011).
- Ha, T. W., Oh, B., Kang, J. O. Electrocardiogram recordings in anesthetized mice using lead II. Journal of Visualized Experiments. (160), e61583 (2020).
- Chu, V., et al. Method for non-invasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6 (2001).
- Hartley, C. J., et al. Effects of isoflurane on coronary blood flow velocity in young, old and ApoE(-/-) mice measured by Doppler ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (4), 512-521 (2007).
- You, J., Wu, J., Ge, J., Zou, Y. Comparison between adenosine and isoflurane for assessing the coronary flow reserve in mouse models of left ventricular pressure and volume overload. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 303 (10), 1199-1207 (2012).
