Summary
O presente protocolo descreve a avaliação ecocardiográfica da morfologia, função e fluxo sanguíneo coronariano do ventrículo esquerdo em camundongos recém-nascidos de 7 dias de idade.
Abstract
A ecocardiografia é um procedimento não invasivo que permite a avaliação de parâmetros estruturais e funcionais em modelos animais de doença cardiovascular e é utilizada para avaliar o impacto de potenciais tratamentos em estudos pré-clínicos. Estudos ecocardiográficos geralmente são realizados em camundongos adultos jovens (ou seja, 4-6 semanas de idade). A avaliação da função cardiovascular neonatal precoce geralmente não é realizada devido ao pequeno tamanho dos filhotes de camundongos e às dificuldades técnicas associadas. Um dos desafios mais importantes é que o curto comprimento dos membros dos filhotes impede que eles atinjam os eletrodos na plataforma ecocardiográfica. A temperatura corporal é o outro desafio, pois os filhotes são muito suscetíveis a mudanças de temperatura. Portanto, é importante estabelecer um guia prático para a realização de estudos ecocardiográficos em filhotes de camundongos pequenos para ajudar os pesquisadores a detectar alterações patológicas precoces e estudar a progressão da doença cardiovascular ao longo do tempo. O presente trabalho descreve um protocolo para a realização de ecocardiografia em filhotes de camundongos na tenra idade de 7 dias de idade. A caracterização ecocardiográfica da morfologia, função e fluxo coronariano cardíaco em camundongos neonatais também é descrita.
Introduction
O objetivo geral deste protocolo é examinar a morfologia, a função e o fluxo da artéria coronária cardíaca em filhotes de camundongos neonatais de 7 dias de idade usando ecocardiografia. A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica é determinar alterações precoces no fluxo coronariano e na função cardíaca em modelos de camundongos de doença cardíaca1. A natureza não invasiva da ecocardiografia é vantajosa, pois permite aos pesquisadores avaliar a função cardiovascular em condições fisiológicas e fornece aos pesquisadores uma ferramenta de triagem para o estudo de terapias direcionadas para o tratamento de doenças cardiovasculares 2,3. Tradicionalmente, estudos ecocardiográficos são realizados com camundongos adultos jovens (4-6 semanas); no entanto, alguns modelos de camundongos (ou seja, modelos geneticamente modificados) já apresentam alterações patológicas e disfunção cardíaca nessa idade. Portanto, a pesquisa cardíaca usando modelos animais tem se concentrado principalmente em agentes terapêuticos que melhoram ou tratam a disfunção cardíaca. Em contrapartida, mais recentemente, os esforços de pesquisa têm sido redirecionados para se concentrarem em medidas preventivas e intervenções precoces em doenças cardíacas4.
Estudos prévios descreveram o uso da ecocardiografia para medir a função cardíaca em modelos de infarto do miocárdio em camundongos neonatais 5,6; no entanto, esses estudos não conseguiram medir o fluxo coronariano e, o mais importante, não registraram dados de eletrocardiograma (ECG) e frequência cardíaca (FC) durante o procedimento, provavelmente devido ao pequeno tamanho dos membros dos filhotes, que não conseguiram atingir as almofadas dos eletrodos. Superamos esse problema neste protocolo anexando folha de alumínio aos membros para permitir que eles alcancem as almofadas do eletrodo e criem um circuito de ECG. Além disso, este protocolo descreve e caracteriza o fluxo da artéria coronária em camundongos neonatais.
Este estudo obteve imagens de modo B e modo M em incidências paraesternais de eixos longos e curtos para medir parâmetros estruturais e funcionais 2,3. Os parâmetros morfológicos incluíram dimensões do átrio esquerdo, dimensões do ventrículo esquerdo (VE), espessura da parede do VE, massa do VE e espessura relativa da parede (RWT). Os parâmetros funcionais incluíram fração de ejeção (FE), encurtamento fracionado (FS), débito cardíaco (CO) e velocidade de encurtamento da fibra circunferencial (CFV). O Doppler de onda de pulso (PW) foi utilizado para medir o fluxo aórtico na visão paraesternal de eixo curto (PSAX) e para medir o fluxo sanguíneo mitral na visão apical de quatro câmaras. A visão apical de quatro câmaras também foi utilizada para a realização do Doppler Tecidual na parte septal do anel valvar mitral. O fluxo coronariano na artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) também foi examinado usando uma visão de eixo longo paraesternal modificada (PLAX). A reserva de fluxo coronariano (CFR) foi calculada após um desafio de estresse induzido pelo aumento da concentração de isoflurano.
O presente protocolo demonstra que os estudos ecocardiográficos podem ser realizados em idade muito precoce em camundongos neonatais, permitindo o reconhecimento precoce de patologias cardíacas e estudos longitudinais de acompanhamento da hemodinâmica do VE e dos parâmetros de fluxo coronariano em diferentes modelos de camundongos. Esta técnica pode ser usada para estudar o papel de alterações genéticas ou intervenções farmacológicas na função cardíaca em idades pós-natais precoces. Além disso, o protocolo fornece uma ferramenta valiosa para determinar o aparecimento de doenças cardíacas no início da vida, permitindo assim que os pesquisadores desbloqueiem os mecanismos moleculares subjacentes aos estágios iniciais das doenças cardíacas em diferentes modelos de camundongos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Illinois em Chicago. Para os experimentos, foram utilizados camundongos FVB/N de 7 dias de idade. O protocolo é dividido em preparação de camundongos, aquisição de imagens ecocardiográficas e cuidados pós-imagem com animais.
1. Preparação do mouse
- Obtenha os ratos de 7 dias de idade da gaiola de reprodução.
NOTA: Nesta idade precoce, é difícil determinar o sexo do animal pelo exame físico. - Coloque o gel de ECG (ver Tabela de Materiais) nas almofadas do eletrodo da plataforma aquecida. Coloque tiras de folha de alumínio (~1,5 pol x 0,25 pol) em cima das almofadas do eletrodo para estender a faixa do eletrodo e fixar com fita adesiva (Figura 1A). Posteriormente, coloque o gel de ECG em cima das tiras de folha de alumínio.
NOTA: Certifique-se de que o gel sob as tiras de folha de alumínio não seque durante o procedimento. Se isso ocorrer, adicione mais gel para manter a condutividade. - Corte um dedo de uma luva nitrílica e encaixe-o para cobrir o cone de isoflurano/oxigênio de um lado e o nariz de rato do outro lado (Figura 1B).
- Colocar o filhote de camundongo na câmara de indução de isoflurano e iniciar a entrega de isoflurano na concentração de 2,5% impulsionada por oxigênio a 100% (Figura 1C).
- Coloque o filhote anestesiado em decúbito dorsal na plataforma de imagem com as patas em cima das almofadas de folha de alumínio e prenda com fita adesiva. Certifique-se de que o circuito elétrico está completo e que o ECG está gravando.
- Diminua a entrega de isoflurano para 1,5% impulsionada por 100% de oxigênio. Prenda o dedo recortado da luva ao redor do nariz do filhote com fita adesiva. Confirme a profundidade da anestesia apertando as patas do filhote.
- Coloque uma camada espessa de gel de ultrassom pré-aquecido em cima da parte superior do corpo do filhote. Use dois rolos de gaze para manter o gel de ultrassom no lugar (Figura 1D).
- Use uma lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal normal do filhote (Figura 1E).
NOTA: Uma sonda retal não foi utilizada para monitorar a temperatura corporal no presente estudo devido ao pequeno tamanho do filhote.
2. Aquisição e análise ecocardiográfica de imagens
- Realizar ecocardiografia transtorácica utilizando um instrumento ecocardiográfico equipado com um transdutor de matriz linear a 40 MHz para o modo B e a 32 MHz para Doppler (taxa de quadros 233) (ver Tabela de Materiais), seguindo protocolos de ecocardiografia de camundongos adultos7,8,9.
- Evite colocar pressão excessiva na cavidade torácica do filhote ao colocar o transdutor de eco durante a aquisição da imagem ecocardiográfica.
NOTA: Devido ao pequeno tamanho do filhote, o peso do próprio transdutor pode resultar em função cardíaca alterada ou morte. - Capture a visão PLAX da via de saída do ventrículo esquerdo e do átrio esquerdo.
- Coloque o transdutor no suporte, com a marca de índice em direção ao ombro direito do filhote.
- Abaixe o transdutor até que ele esteja em contato com o gel e visualize a via de saída do ventrículo esquerdo no modo B (Figura 2A).
- Utilizar o modo-M nos folhetos aórticos para medir o diâmetro máximo do átrio esquerdo (AE) na sístole final (Figura 2B, Tabela 1). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
- Capture a visão PSAX do ventrículo esquerdo para medir as dimensões da câmara, a espessura da parede, o fluxo aórtico e o fluxo pulmonar.
- Gire o transdutor ~90° no sentido horário do PLAX para obter a visualização PSAX.
- Colocar a sonda ao nível dos músculos papilares e utilizar o modo-M para medir os diâmetros internos do ventrículo esquerdo (IDVE), a espessura do septo interventricular (IVS) e a PP durante a sístole e a diástole (Figura 3A, Tabela 1). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
- Calcule o RWT, um índice de hipertrofia, utilizando as dimensões da câmara diastólica da seguinteforma 3,10:
(PW + IVS no final da diástole) / (LVID no final da diástole) - Mova o transdutor em direção à base do coração e use o Doppler colorido para visualizar a artéria pulmonar. Pressione o Doppler PW para quantificar a velocidade de pico de fluxo pulmonar, os perfis de fluxo pulmonar, o tempo de ejeção pulmonar (PET) e o tempo de aceleração pulmonar (PAT)11,12 (Figura 3B). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
- Mova o transdutor ainda mais em direção à base e use o Doppler colorido para visualizar o fluxo aórtico (Figura 3C). Use o Doppler PW para visualizar o fluxo sanguíneo e medir o tempo de ejeção aórtica (AET). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
- Calcule-se o Vcf (circ/seg)13,14, um indicador de desempenho miocárdico, utilizando a diástole final da IDVE (DDVEd), a sístole final da IDVE (DDVEs) e a AET da seguinte forma (Tabela 1):
(LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
- Capture a visão apical de quatro câmaras.
- Coloque a plataforma na posição de Trendelenburg, incline-a para a esquerda e ajuste a sonda para visualizar as quatro câmaras (Figura 4A).
- Use Doppler colorido para visualizar o fluxo sanguíneo e Doppler PW na ponta dos folhetos da valva mitral no centro do orifício da valva mitral para registrar o fluxo mitral. Pressione o Cine Store para registrar os dados.
- Nesta visualização, calcule os seguintes parâmetros 2,3,10 (Figura 4B e Tabela 1):
- Calcule a relação E/A, que é a velocidade máxima do fluxo sanguíneo na fase inicial da diástole (E) sobre a velocidade máxima do fluxo sanguíneo na fase tardia da diástole (A).
- Determine o tempo de desaceleração da onda E (DT), que é o tempo do pico E até o final da diástole inicial.
- Calcule o tempo de relaxamento isovolumétrico do VE (IVRT), que é o tempo desde o fechamento da válvula aórtica até a abertura da válvula mitral.
- Calcule o tempo de contração isovolumica do VE (TCIV), que é o tempo desde o fechamento da valva mitral até a abertura da valva aórtica.
- Utilizar o Doppler tecidual no lado septal do anel valvar mitral em uma visão de quatro câmaras para medir o pico da velocidade de relaxamento miocárdico no enchimento diastólico precoce (e') e no enchimento diastólico tardio (a'), bem como o pico de velocidade de contração miocárdica sistólica (s') (Figura 4C e Tabela 1). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
- Capture a visão PLAX modificada para examinar a artéria coronária descendente anterior esquerda.
- Use uma visão PLAXmodificada 15, movendo o transdutor lateralmente e inclinando o feixe em direção à anterior (Figura 5A).
- Mova a sonda e use o Doppler colorido para visualizar a origem da artéria coronária principal esquerda (ACV) que gera a partir da aorta. Identificar a artéria LAD que gera a partir da ACL e corre entre a parede anterior do ventrículo esquerdo e a via de saída do ventrículo direito16,17. Nesta posição, aplique o Doppler PW para medir o fluxo de LAD (Figura 5B). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados.
- Calcule os seguintes parâmetros de fluxo da artéria coronária LAD (Figura 5C e Tabela 2): velocidade máxima do fluxo coronariano (CFV), CFV média e integral velocidade-tempo (VTI).
NOTA: Todos estes parâmetros são medidos a uma concentração basal de isoflurano de 1,5% (linha de base). - Aumente a concentração de isoflurano para 2,5% e aguarde 5 min para atingir o fluxo máximo (Figura 5C). Pressione o botão Cine Store para gravar os dados. Calcule a CFR como a razão entre a CFV de pico diastólico no fluxo máximo e a CFV de pico diastólico no iníciodo estudo 18,19,20 (Tabela 2):
CFR = CFV pico diastólico (2,5%) / CFV pico diastólico (1,5%)
3. Monitorização e cuidados pós-imagiologia dos animais
- Depois de completar a imagem ecocardiográfica, limpe cuidadosamente o filhote e deixe-o se recuperar da anestesia por aproximadamente 2 min.
- Antes de devolver o filhote à sua gaiola, esfregue o filhote com a cama da mãe da gaiola para evitar a rejeição ou canibalização.
- Observe o comportamento da mãe por cerca de 30 minutos após o procedimento. Se for observado um comportamento agressivo, eutanasie o filhote seguindo as diretrizes do procedimento animal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este estudo utilizou filhotes de camundongos de 7 dias de idade para caracterizar a morfologia cardíaca, a função e o fluxo da artéria coronária. O manuseio do mouse precisa ser feito com cuidado, e a plataforma do mouse deve ser adaptada para o pequeno tamanho dos filhotes, conforme descrito na Figura 1. Uma imagem representativa da visualização PLAX é mostrada na Figura 2A e no Vídeo Suplementar 1. Nessa visão, o modo M foi utilizado para medir o diâmetro do átrio esquerdo (AE) (Figura 2B). A visualização PSAX (Vídeo Suplementar 2) foi utilizada para medir as dimensões da câmara ventricular esquerda (Figura 3A), o fluxo pulmonar (Figura 3B) e o fluxo aórtico (Figura 3C). A visão apical de quatro câmaras (Vídeo Suplementar 3 e Figura 4A) foi utilizada para examinar as velocidades de fluxo sanguíneo através da valva mitral (Figura 4B), bem como as velocidades de relaxamento miocárdico e contração no anel valvar mitral (Figura 4C).
A visão PLAX modificada foi utilizada para examinar os parâmetros de fluxo da artéria coronária LAD (Figura 5A,B e Vídeo Suplementar 4), conforme descrito anteriormente15,16,21. Na Figura 5C, os resultados representativos do pico diastólico de CFV, CFV médio e VTI são mostrados em um estado de fluxo de repouso (isoflurano a 1,5%) e 5 min após o aumento do isoflurano para 2,5% para induzir vasodilatação máxima. Os valores aumentados desses parâmetros (ou seja, CFV pico, CFV médio e ITV) 5 min após o incremento do isoflurano confirmam a resposta esperada à hiperemia nos camundongos neonatais18. A CFR foi calculada como a razão entre o pico diastólico de CFV durante a vasodilatação máxima induzida por isoflurano a 2,5% e o pico diastólico de CFV em uma linha de base de concentração de isoflurano a 1,5%18. Todas as medidas e cálculos foram calculados em média ao longo de 3 ciclos consecutivos, e os resultados representativos são apresentados na Tabela 1 e na Tabela 2.
Figura 1: Configuração da plataforma ecocardiográfica e preparação do filhote de rato de 7 dias de idade . (A) As tiras de folha de alumínio são colocadas nas almofadas de eletrodo da plataforma e fixadas com fita adesiva. (B) O dedo da luva é cortado e adaptado para se ajustar ao cone do nariz de isoflurano/oxigênio. (C) O filhote é colocado na câmara de indução de isoflurano, e a entrega de isoflurano começa na concentração de 2,5%. (D) O filhote é colocado em decúbito dorsal com as patas tocando as tiras de papel alumínio e preso com fita adesiva. Dois rolos de gaze são usados para manter o gel acústico no lugar. (E) Uma lâmpada de aquecimento é colocada perto do filhote para manter sua temperatura corporal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão paraesternal de eixo longo (PLAX) do ventrículo esquerdo. (A) Imagens em modo B da câmara ventricular esquerda (VE), átrio esquerdo (AE) e aorta. (B) O modo M é usado para medir o diâmetro do LA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visão paraesternal de eixo curto (PSAX) do ventrículo esquerdo. (A) Imagens em modo B da câmara ventricular esquerda. (B) Amostra em modo M do septo interventricular na diástole (IVSd), diâmetro interno do ventrículo esquerdo na diástole (DDVEd) e espessura da parede posterior na diástole (PWd). (C) Imagens representativas da velocidade de pico de fluxo pulmonar, do tempo de ejeção pulmonar (PET) e do tempo de aceleração pulmonar (PAT). (D) Imagens representativas do tempo de ejeção aórtica (AET). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visão apical de quatro câmaras. (A) Imagem em modo B do ventrículo esquerdo (VE), ventrículo direito (VD), átrio esquerdo (AE) e átrio direito (AR). (B) Imagens representativas da velocidade máxima de influxo sanguíneo na fase inicial da diástole (E), velocidade máxima de influxo sanguíneo na fase tardia da diástole (A), tempo de desaceleração (DT), tempo de contração isovolumétrica (TCIV) e tempo de relaxamento isovolumétrico (RVIV). (C) Imagens de amostra com Doppler tecidual do pico da velocidade de relaxamento miocárdico no enchimento diastólico inicial (e'), enchimento diastólico tardio (a') e velocidade miocárdica sistólica de pico (s'). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visão de eixo longo paraesternal modificada. (A) Posição da plataforma e do transdutor na visão de eixo longo paraesternal modificada. (B) Visualização e registro do fluxo da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE). VSVE = via de saída do ventrículo esquerdo. (C) A velocidade máxima do fluxo coronariano (CFV), a CFV média e a integral velocidade-tempo (VTI) na diástole são medidas a 1,5% de isoflurano (linha de base) e 5 min após o aumento da concentração de isoflurano para 2,5%; Camundongos de 7 dias de idade, N = 7; dados apresentados como média ± DP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros ecocardiográficos | WT (n = 7) | |
| DP ± médio | ||
| Morfologia | LA (milímetro) | 1,25 ± 0,11 |
| PWd (milímetro) | 0,40 ± 0,06 | |
| LVIDd (milímetro) | 1,98 ± 0,34 | |
| Massa do VE (g) | 10,92 ± 3,53 | |
| RWT | 0,39 ± 0,09 | |
| Função sistólica | FC (bpm) | 500,69 ± 40,04 |
| FE(%) | 81,97 ± 10,76 | |
| SV (ml) | 10,16 ± 3,44 | |
| CO (ml/min) | 5,04 ± 1,53 | |
| s' (cm/s) | 16,16 ± 3,56 | |
| Vcf (circo/s) | 10,50 ± 3,12 | |
| Função diastólica | E/A | 1,25 ± 0,11 |
| E/e» | 45,58 ± 11,44 | |
| DT (s) | 23,97 ± 2,63 | |
| URAI (s) | 16,27 ± 2,11 | |
Tabela 1: Avaliação ecocardiográfica da morfologia e função do ventrículo esquerdo em filhotes de camundongos de 7 dias de idade.
| Parâmetros de Fluxo Coronário | Referência | 5 min | CFR | |
| Isoflurano 1,5% | Isoflurano 2,5% | 5 min/linha de base | ||
| Diástole | Velocidade de pico (mm/s) | 516,58 ± 113,04 | 599,43 ± 101,34 | 1,18 ± 0,18 |
| Velocidade média (mm/s) | 308,50 ± 63,44 | 351,50 ± 53,98 | ||
| VTI (milímetro) | 25,23 ± 5,86 | 30,65 ± 7,75 | ||
| Sítole | Velocidade de pico (mm/s) | 121,81 ± 40,52 | 163,13 ± 32,59* | |
| Velocidade média (mm/s) | 84,82 ± 27,16 | 114,70 ± 21,84* | ||
| VTI (milímetro) | 5,21 ± 1,84 | 7,76 ± 2,08* | ||
| Frequência cardíaca (bpm) | 536,20 ± 128,90 | 540,80 ± 233,15 | ||
| Frequência respiratória (rpm) | 69,60 ± 15,89 | 38,80 ± 24,18 | ||
Tabela 2: Avaliação ecocardiográfica do fluxo arterial coronariano em filhotes de camundongos de 7 dias de idade. Camundongos de sete dias de idade, N = 7; dados apresentados como DP médio ±; para a análise dos dados foi utilizado o teste t de Student; *p < 0,05; CFR = reserva de fluxo coronariano; VTI = integral de tempo de velocidade.
Vídeo Suplementar 1: Vista paraesternal de eixo longo do fluxo de saída do ventrículo esquerdo e do átrio esquerdo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo Suplementar 2: A visão paraesternal de eixo curto da câmara ventricular esquerda. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo Suplementar 3: A visão apical de quatro câmaras. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo Suplementar 4: A visão paraesternal modificada do eixo longo do fluxo da artéria coronária descendente anterior esquerda. Clique aqui para baixar este vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na era da medicina preventiva, a avaliação precoce das alterações na função cardiovascular é necessária para estabelecer o início da doença e projetar terapias intervencionistas apropriadas. Os ratos estão sendo cada vez mais usados como modelos pré-clínicos em pesquisas cardíacas, e os estudos ecocardiográficos são tipicamente conduzidos com camundongos adultos jovens. No entanto, para estudar o papel das alterações genéticas ou intervenções farmacológicas nos estágios iniciais das doenças cardíacas, a imagem ecocardiográfica precisa ser iniciada mais cedo na vida. Problematicamente, estudos ecocardiográficos em camundongos recém-nascidos são tecnicamente desafiadores. Neste estudo, estabelecemos um protocolo para a realização de medidas ecocardiográficas em camundongos com apenas 7 dias de idade. Isso é especialmente importante para modelos de camundongos transgênicos, nos quais acredita-se que a deleção ou superexpressão de um gene cause disfunção cardiovascular. O reconhecimento precoce das anormalidades cardiovasculares nesses modelos animais permite que os pesquisadores projetem tratamentos farmacológicos que impeçam a progressão da doença.
Devido ao pequeno tamanho dos camundongos de 7 dias de idade, algumas considerações técnicas neste protocolo incluíram a manutenção de suas temperaturas corporais normais e a minimização da duração do procedimento ecocardiográfico. Uma plataforma aquecida, uma lâmpada de aquecimento e gel acústico pré-aquecido foram usados para prevenir a hipotermia. Idealmente, a temperatura do animal deve ser monitorada usando uma sonda retal; no entanto, dado o pequeno tamanho dos filhotes deste estudo, não foi possível utilizar uma sonda retal durante o procedimento. Além disso, a hipertermia também é uma preocupação, e é preciso tomar cuidado para evitar que os filhotes estejam próximos à lâmpada de aquecimento. A duração do procedimento ecocardiográfico precisa ser mantida a menos de 1 h para minimizar as principais variações de temperatura e evitar os efeitos fisiológicos da anestesia prolongada22. Além disso, como o tamanho da sonda ecocardiográfica é projetado para a imagem de camundongos adultos, recomenda-se o uso de uma camada mais espessa de gel acústico para ajustar a distância focal. Também é importante mencionar que o sistema de imagem utilizado neste estudo calcula a frequência respiratória e a frequência cardíaca a partir do sinal de ECG detectado pelos almofadas de eletrodos da plataforma (Tabela 2). Como as almofadas de ECG foram estendidas para alcançar os membros do filhote usando papel alumínio, o sinal detectado pode ter sido distorcido. Outro problema encontrado foi que, ao final do procedimento, notamos que o gel sob as tiras de papel alumínio havia secado, o que pode ter afetado a condutividade e o sinal do ECG. Idealmente, uma plataforma com almofadas de eletrodos que correspondam ao tamanho do animal ou eletrodos de agulha que entrem em contato com os membros do filhote deve ser utilizada para obter um sinal de ECG mais confiável23,24.
As limitações do presente estudo incluem as maiores concentrações de isoflurano necessárias para a anestesia de camundongos neonatais. Este protocolo utilizou isoflurano a 1,5% para realizar análises ecocardiográficas, incluindo a dinâmica do fluxo coronariano. A concentração de isoflurano foi aumentada de 1,5% para 2,5% para induzir hiperemia e avaliar a RCF. Em camundongos adultos, a avaliação da velocidade do fluxo coronariano em repouso é realizada a 1% de isoflurano e a resposta hiperêmica é feita a 2,5%18,25,26. No entanto, em camundongos neonatais, o isoflurano a 1% não é suficiente para manter um nível adequado de anestesia. No entanto, a mudança de 1,5% para 2,5% de isoflurano em camundongos neonatais aumentou o pico de CFV, CFV médio e VTI (Figura 5C e Tabela 2), verificando-se a vasodilatação da artéria coronária induzida por isoflurano. Também é importante mencionar que, nesse protocolo, uma visão PLAX modificada foi utilizada para visualizar e examinar os parâmetros de fluxo coronariano da LAD15,16,21; no entanto, o LAD também pode ser visualizado usando um PSAX modificado 16,19,21 ou uma visão apical de quatro câmaras modificada 16,21. No presente estudo, o PLAX modificado nos proporcionou resultados mais consistentes na correta visualização e avaliação do fluxo coronariano de LAD e CFR em camundongos neonatais.
Este artigo fornece um guia prático para imagens e avaliação da função cardiovascular em camundongos neonatais. Deve-se considerar que os parâmetros da função cardíaca variam de acordo com a tensão e a idade dos camundongos. Neste estudo, foram utilizados camundongos com VBF/N, e esses resultados podem ser utilizados como valores de referência para estudos futuros com a mesma cepa (Tabela 1 e Tabela 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Chad M. Warren, MS (University of Illinois at Chicago), pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por subsídios NIH/NHLBI K01HL155241 e AHA CDA849387 para PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilating agent | Nair Hair Remover | ||
| Electrode gel | Parker Laboratories | 15-60 | |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| Isoflurane | MedVet | RXISO-250 | |
| Linear array high frequency transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS550D | |
| Mice breeding pair | Charles River Laboratories | FVB/N | Strain Code 207 |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories | 11-08 | |
| Vevo Lab Software | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Verison 5.5.1 |
References
- Le, V. P., Wagenseil, J. E. Echocardiographic Characterization of Postnatal Development in Mice with Reduced Arterial Elasticity. Cardiovascular Engineering and Technology. 3 (4), 424-438 (2012).
- Nagueh, S. F., et al. Recommendations for the Evaluation of Left Ventricular Diastolic Function by Echocardiography: An Update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 17 (12), 1321-1360 (2016).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. European Heart Journal: Cardiovascular Imaging. 16 (3), 233-270 (2015).
- Chrysant, S. G. A new paradigm in the treatment of the cardiovascular disease continuum: focus on prevention. Hippokratia. 15 (1), 7-11 (2011).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial infarction in neonatal mice, a model of cardiac regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocol. 9 (2), 305-311 (2014).
- Chowdhury, S. A. K., et al. Modifications of sarcoplasmic reticulum function prevent progression of sarcomere-linked hypertrophic cardiomyopathy despite a persistent increase in myofilament calcium response. Frontiers in Physiology. 11, 107 (2020).
- Batra, A., et al. Deletion of P21-activated kinase-1 induces age-dependent increased visceral adiposity and cardiac dysfunction in female mice. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1337-1349 (2021).
- Capote, A. E., et al. B-arrestin-2 signaling is important to preserve cardiac function during aging. Frontiers in Physiology. 12, 1302 (2021).
- Armstrong, W. F., Ryan, T., Feigenbaum, H. Feigenbaum's Echocardiography. 7th ed. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2010).
- Su, J., et al. Impact of chronic hypoxia on proximal pulmonary artery wave propagation and mechanical properties in rats. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 314 (6), 1264-1278 (2018).
- Rudski, L. G., et al. Guidelines for the echocardiographic assessment of the right heart in adults: a report from the American Society of Echocardiography endorsed by the European Association of Echocardiography, a registered branch of the European Society of Cardiology, and the Canadian Society of Echocardiography. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (7), 685-713 (2010).
- Wilson, J. R., Reichek, N. Echocardiographic indices of left ventricular function. A comparison. Chest. 76 (4), 441-447 (1979).
- Stypmann, J., et al. Echocardiographic assessment of global left ventricular function in mice. Lab Animal. 43 (2), 127-137 (2009).
- Wikstrom, J., Gronros, J., Bergstrom, G., Gan, L. M. Functional and morphologic imaging of coronary atherosclerosis in living mice using high-resolution color Doppler echocardiography and ultrasound biomicroscopy. Journal of the American College of Cardiology. 46 (4), 720-727 (2005).
- Douglas, P. S., Fiolkoski, J., Berko, B., Reichek, N. Echocardiographic visualization of coronary artery anatomy in the adult. Journal of the American College of Cardiology. 11 (3), 565-571 (1988).
- Lambertz, H., Lethen, H., Tries, H. P., Kersting, S. Non-invasive assessment of coronary flow reserve - valuable functional information in cardiac workflow. Ultraschall in der Medizin. 25 (1), 25-33 (2004).
- Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: A Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (4), 999-1009 (2016).
- Gan, L. M., Wikstrom, J., Bergstrom, G., Wandt, B. Non-invasive imaging of coronary arteries in living mice using high-resolution echocardiography. Scandinavian Cardiovascular Journal. 38 (2), 121-126 (2004).
- Gan, L. M., Wikstrom, J., Fritsche-Danielson, R. Coronary flow reserve from mouse to man--from mechanistic understanding to future interventions. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (5), 715-728 (2013).
- Krzanowski, M., Bodzon, W., Dimitrow, P. P. Imaging of all three coronary arteries by transthoracic echocardiography. An illustrated guide. Cardiovascular Ultrasound. 1, 16 (2003).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), 21-31 (2011).
- Ha, T. W., Oh, B., Kang, J. O. Electrocardiogram recordings in anesthetized mice using lead II. Journal of Visualized Experiments. (160), e61583 (2020).
- Chu, V., et al. Method for non-invasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6 (2001).
- Hartley, C. J., et al. Effects of isoflurane on coronary blood flow velocity in young, old and ApoE(-/-) mice measured by Doppler ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (4), 512-521 (2007).
- You, J., Wu, J., Ge, J., Zou, Y. Comparison between adenosine and isoflurane for assessing the coronary flow reserve in mouse models of left ventricular pressure and volume overload. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 303 (10), 1199-1207 (2012).
