Summary
斑马鱼中金属和金属基化合物的药代动力学和毒代动力学分析速率的提高对于环境和临床转化研究是有利的。通过使用电感耦合等离子体质谱对消化的斑马鱼组织进行痕量金属分析，克服了未知水性暴露摄取的局限性。
Abstract
金属和金属基化合物包括多种药活性和毒理学异种生物。从重金属毒性到化疗药物，这些化合物的毒代动力学具有历史和现代相关性。斑马鱼已成为环境暴露和临床转化研究中阐明药代动力学和毒代动力学的有吸引力的模式生物。虽然斑马鱼研究具有比啮齿动物模型更高的通量的好处，但该模型存在几个显着的限制。
水源性给药方案固有的一个这样的限制是固有的。这些研究的水浓度不能外推以提供可靠的内部剂量。直接测量金属基化合物可以与化合物相关的分子和生物反应更好地相关。为了克服金属和金属基化合物的这种局限性，开发了一种技术，用于在暴露后消化斑马鱼幼虫组织，并通过电感耦合等离子体质谱（ICPMS）量化组织样品中的金属浓度。
使用ICPMS方法测定斑马鱼组织中几种新型基于Ru的化疗药物中顺铂（Pt）和钌（Ru）的金属浓度。此外，该方案区分了与斑马鱼组织相比，螯合在幼虫绒毛膜中的Pt浓度。这些结果表明，该方法可用于定量幼虫组织中存在的金属剂量。此外，该方法可以调整以在广泛的暴露和剂量研究中鉴定特定的金属或金属基化合物。
Introduction
金属和金属基化合物继续具有药理学和毒理学相关性。自20世纪60年代以来，重金属暴露的流行及其对健康的影响呈指数级增长，并在2021年达到历史最高水平。饮用水，空气污染和职业暴露中重金属的浓度超过了全球范围内的监管限度，并且仍然是砷，镉，汞，铬，铅和其他金属的问题。量化环境暴露和分析病理发展的新方法继续处于高需求状态1，2，3。
相反，医学领域已经利用各种金属的物理化学特性进行临床治疗。金属基药物或金属药物具有丰富的药用历史，并显示出对一系列疾病的活性，其中最有效的是化疗药物4。最著名的金属药物顺铂是一种基于Pt的抗癌药物，被世界卫生组织（WHO）认为是世界上必不可少的药物之一5.2010年，顺铂及其Pt衍生物在几种癌症中的成功率高达90%，并用于约50%的化疗方案6，7，8。尽管基于Pt的化疗药物取得了无可辩驳的成功，但剂量限制性毒性已经启动了对具有精制生物递送和活性的替代金属基药物的研究。在这些替代品中，Ru类化合物已成为最受欢迎的9，10，11，12。
需要新的模型和方法来跟上金属药代动力学和毒代动力学研究的需求速度。斑马鱼模型位于复杂性和通量的交叉点，是一种高繁殖力的脊椎动物，具有70%保守的基因同源性13。该模型一直是药理学和毒理学的资产，对各种化合物进行了广泛的筛选，以进行先导物发现，靶标鉴定和机理活性14，15，16，17。然而，化学品的高通量筛选通常依赖于水性暴露。鉴于摄取可以根据溶液中化合物的物理化学性质（即光降解，溶解度）而变化，这可能是相关剂量递送和反应的主要限制。
为了克服与高等脊椎动物比较剂量的这一局限性，设计了一种方法来分析斑马鱼幼虫组织中的痕量金属浓度。在这里，评估了顺铂和新型基于Ru的抗癌化合物的致死和亚致死终点的剂量 - 反应曲线。对标称浓度为0、3.75、7.5、15、30和60mg/L顺铂的致死性和延迟孵化进行评估。通过ICPMS分析测定微生物组织中Pt的积累，生物体对各剂量的摄取量分别为0.05、8.7、23.5、59.9、193.2和461.9ng（Pt）。此外，斑马鱼幼虫暴露于0，3.1，6.2，9.2，12.4mg / L的PMC79。分析测定这些浓度含有0，0.17，0.44，0.66和0.76mg / L Ru。该方案还允许与斑马鱼组织区分幼虫绒毛膜中螯合的Pt浓度。该方法能够为比较完善的化疗药物和新型化合物之间的药代动力学和毒代动力学活性提供可靠，可靠的数据。该方法可应用于各种金属和金属基化合物。
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Protocol
AB菌株斑马鱼（Danio rerio）用于所有实验（见 材料表），饲养方案（#08-025）由罗格斯大学动物护理和设施委员会批准。
1. 斑马鱼养殖
- 在循环水生生境系统中繁殖和维持斑马鱼，采用14小时光照：10小时黑暗循环。
- 通过沙子和碳过滤净化市政自来水，获得鱼类系统水。将水生系统水保持在28°C，<0.05 ppm亚硝酸盐，<0.2 ppm氨，pH值在7.2至7.7之间。
- 给斑马鱼喂食孵化的卤虫囊肿，盐水虾和鱼的饮食片状食物。
2. 斑马鱼剂量反应方案（图1）
- 制备斑马鱼蛋水溶液，E3培养基或由浓度为60μg/ mL的原浆海盐制成的蛋水，溶解在去离子水中18。避免使用亚甲蓝。
注：通过ICPMS，斑马鱼蛋水的等压干扰被鉴定为锶氧化物，其与钌的同位素重叠。在下游分析之前仔细冲洗幼虫可以改善这个问题。对于某些人来说，E3培养基可能是一个更容易的选择，因为商业海盐的专有成分。 - 将金属或金属基化合物溶解在E3或蛋水中。涡旋以分解任何骨料并使溶液均质化。
注意：在下面概述的实验中，PMC79和顺铂以最大浓度12.4mg / L和60mg / L溶解，最大浓度为0.5%二甲基亚砜（DMSO）以抵抗沉淀。- 用E3或蛋水稀释重金属或金属基化合物，如PMC79和顺铂，制备至少5浓度剂量。
- 从纯载体（即DMSO）中低浓度的储备溶液开始，然后用E3或蛋水稀释。仔细考虑最终的车辆浓度。
注意：某些金属基化合物，如顺铂，降解迅速，其溶液必须每天新鲜。注意：小心处理重金属和化疗药物。查看特定材料安全数据表 （MSDS）， 了解感兴趣的金属。 顺铂 可能引起眼睛和皮肤刺激，吞咽会致命，并可对肾脏、血液、造血器官和胎儿组织造成毒性。避免呼吸烟雾和接触眼睛、皮肤和衣服。戴上不透水的手套和衣服，以及安全眼镜或护目镜19.
- 从纯载体（即DMSO）中低浓度的储备溶液开始，然后用E3或蛋水稀释。仔细考虑最终的车辆浓度。
- 用E3或蛋水稀释重金属或金属基化合物，如PMC79和顺铂，制备至少5浓度剂量。
- 在实验前的下午以2只雌性与1只雄性的理想比例建立繁殖池，并在两性之间放置分隔器20。
- 在早晨周期的灯光亮起时拉动隔板。
- 让斑马鱼繁殖。
注意：育种的时间长短取决于所需的初始暴露阶段。对于3小时的后施肥，允许繁殖约2小时。鸡蛋在清洁和分离鸡蛋后将达到3 hpf。 - 将繁殖的鱼移到干净的水箱中。
- 通过将水箱水倒入过滤器来收集鸡蛋。
- 将过滤器倒置在培养皿上，并使用装满E3或蛋水的喷射瓶将鸡蛋冲洗到培养皿中。
- 在实验使用前清洁盘子中的食物和废物。
- 使用转移移液管和少量水将每剂量约20个3 hpf胚胎随机分配到单独的玻璃瓶中。
- 将所有胚胎放入小瓶中后，取出所有卵子水并更换足够的加样溶液，以使卵子高度以上约1英寸的溶液。
注：应仔细考虑去皮的必要性。有关更多详细信息，请参阅讨论部分。 - 每天观察胚胎的病变或致死性。由于胚胎斑马鱼的快速发育，使用任何明场显微镜/相机设置获取每日图像，以识别几天之间的轻微病变。
- 在剂量反应终止时（受精后4-5天[dpf]，根据经济合作与发展组织[OECD]指南21），在安乐死前将3-5只幼虫合并进行复合取样。通过在液氮中快速冷冻来快速冷却来安乐死。
注意：过量使用MS-222或甲磺酸三卡因而导致的安乐死可能会干扰下游的ICPMS分析。该协议鼓励使用快速冷却安乐死方法，以减少干扰的可能性。 - 用高纯水（如反渗透）对组织进行3次洗涤，以从组织外部除去多余的化合物。
- 将样品移至酸和微波安全的 15 mL 聚丙烯离心管中。小心去除 所有多余的水 ，因为任何剩余的液体都可能稀释硝酸，因此，在组织降解过程中酸的氧化潜力。
注意：此时，组织可以储存在-20°C直至进一步分析。对于天然丰富的金属，在使用前在5%硝酸浴中清洁管子将改善环境背景水平。
3. 组织消化和ICPMS评估（图2）
- 向15 mL聚丙烯离心管中加入约0.25 mL，最多可添加10只幼虫（约100μg）高纯度硝酸（69%）。超声波处理1小时，使用以下设置预消化样品：超声波浴输出：85 W ;42 千赫 ± 6%;温度范围：19-27°C。
注意：超声处理期间佩戴护耳保护装置。 硝酸 会导致严重的呼吸道、眼睛和皮肤灼伤。穿戴全套防护设备，在通风橱或通风充足的地方工作。它可能与其他材料一起易燃。硝酸应仅在通风橱中处理，以防止暴露于消化过程中产生的蒸气。不要吸入或摄入。- 在酸安全的微波蒸煮器中进行短周期的组织消化（间隔5分钟），直到所有组织明显氧化（即均匀的透明黄色溶液）。
注意： 建议使用表1 中的微波协议三次，每个加热步骤之间包括5分钟的冷却间隔。 - 仔细监测管的完整性以避免破裂，并在循环之间在离心机（313× g ，持续1分钟）中进行短旋转，以将酸冷凝物移动到管的底部。
注意：如果组织难以消化（特别是脉络膜），酸消解后可以使用30%的高纯度过氧化氢。使用过氧化氢（6.75 mL）将酸浓度稀释至3.5%，并使样品在通风橱中放置过夜。过氧化氢会分解成H2O，适用于ICPMS分析。此外，替代金属可以更好地溶解在盐酸或盐酸和硝酸的混合物中（即，王水）。 过氧化氢 如果吞咽是有害的，并导致严重的眼睛损伤。戴上皮肤和眼睛保护22，23.
- 在酸安全的微波蒸煮器中进行短周期的组织消化（间隔5分钟），直到所有组织明显氧化（即均匀的透明黄色溶液）。
- 一旦组织明显氧化（即均匀的透明黄色溶液），使用6.75 mL高纯水和涡旋将通风橱中的样品稀释至3.5%硝酸以充分混合。
注意：此时，样品可以在室温下储存。如果在步骤3.1中加入过氧化氢以帮助消化，则不需要此步骤。 - 使用经过认证的元素标准品（即Pt或Ru，取决于测定）与目标金属和最佳同位素进行基质匹配的7点校准曲线（浓度范围为0.001-10 ppb），以考虑任何潜在的同位素干扰。
- 使用经认证的水性元素标准品（Ru，Pt = 1000 ppb）的储备浓度，取0.1 mL等分试样并将移液管移液到新的15 mL离心管中。用3.5%硝酸稀释至最终体积为10 mL，以产生10 ppb标准溶液。
- 使用10 ppb储备液，在3.5%硝酸中进行以下连续稀释：0.1，1.0和5.0 ppb标准溶液。
- 使用0.1储备液，在3.5%硝酸中进行以下连续稀释：0.001，0.005和0.01 ppb标准溶液。
- 准备 ICPMS 仪器（请参阅 材料表） 用于样品分析，如下所示：
- 在启动仪器之前，请确保氩气阀已打开，所有管道均已牢固连接，并且在样品分析之间打开清洁的5%硝酸以冲洗管道和玻璃器皿。
- 检查割炬和锥体的状况，并确保割炬盒牢固地锁定，并且喷雾室排水管已正确连接到围膜。
- 打开软件（请参阅 材料表）。
- 检查真空读数，确保所有涡轮泵均以 100% 运行。
- 单击等离子体控制系统状态窗口中的“开始”以启动顺序，打开等离子体泵、等离子体冷却器，清除雾化器，然后点亮等离子体。等待等离子体点亮且稳定，此时状态窗口将指示启动序列已完成。此时，观察“系统状态”窗口上的绿点，这些绿点指示所有电源都已打开。
- 在菜单栏中，单击下拉菜单中的 控制|自动进样器 。进入含有5%硝酸的管的自动进样器机架位置。让酸进入血浆。
- 在菜单栏中，单击“扫描”|下拉菜单中的磁铁。在“磁扫描”窗口中，在“标记质量位置”中键入 115，然后单击 Enter。当仪器预热时，让磁体在整个质量范围内扫描115In（114.6083至115.3749）30分钟。
- 30分钟后，使用自动进样器控制移动到1 ppb多元素调谐溶液的位置。吸出调谐解决方案并调谐仪器以优化信号读数。调整割炬位置（X，Y，Z），使割炬与等离子体控制窗口中的锥体中心和雾化器流速（〜30 psi）对齐。在“离子光学调谐”窗口中对源、检测器和分析仪进行必要的调整。
- 优化信号读数后（~1.2 × 106 计数/秒，1 ppb 在 115In 上），单击磁体扫描窗口中的停止。
- 单击 校准磁体 ，然后在弹出窗口中选择 低分辨率 。
- 单击 “确定 ”并打开“质量校准（低分辨率）.smc”文件以校准磁体。
注意：磁体校准将测量计数/秒，并通过以下质量范围拟合曲线： 7Li至 238U。 - 点击 保存|用于 将电流磁体校准应用于分析。如果测量具有较大浓度范围的未知样品，请执行检测器校准以将低浓度下的离子脉冲计数信号与较高浓度下产生的衰减离子信号进行比较。调整和校准完成后分析样品。
- 在菜单栏中，单击“ 数据采集”。
- 单击下拉菜单中 的方法设置 。使用制造商提供的现有方法，或基于感兴趣的元素创建方法。如有必要，可针对导流板设置调整分析模式、停留时间、开关延迟、扫描/周期数、分辨率、检测模式和驻球质量。
- 单击“ 保存 ”以记录方法设置。优化每种金属和同位素的参数。有关本研究中使用的具体操作参数，请参见 表 2 。
- 在菜单栏中，单击“ 数据采集”。
- 单击下拉菜单中的 “批量运行 ”。或者，单击菜单栏下方的 BATCH 图标。从电子表格导入批处理参数，或在 “批处理运行” 窗口中创建序列。输入 样品类型、 自动进样器架位置、 转移时间、 洗涤时间、 重复、 样品 ID 和 方法文件。
- 按以下顺序安排批量运行：校准曲线的标准溶液（0.001-10 ppb Pt或Ru），然后是质量控制标准，然后是未知样品。
注意：标准解决方案在 ICPMS 上以计数/秒为单位进行测量，并且线性回归通过相对标准差 （RSD） > 0.999 的标准拟合。未知数也以计数/秒的形式进行测量，并使用校准曲线的线性回归（y = mx + b）求解以ppb为单位的浓度。也可以使用引用的软件完成数据处理。 - 通过每5-10个样品包括0.5 ppb质量控制标准来监测仪器漂移和样品再现性。
注：合适的质量控制标准应是经过认证的标准参考材料，不同于校准曲线中使用的标准。
| 瓦 | 权力 | 纪要 |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
表1：幼虫组织质量的微波消化方案。 斑马鱼幼虫样品在0.25 mL硝酸中消化。此表已从 24 修改。
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Representative Results
这些结果之前已经发布了24。组织摄取研究是在顺铂和一种新型基于Ru的抗癌化合物PMC79的水源暴露下进行的。评估顺铂 0、3.75、7.5、15、30 和 60 mg/L 顺铂标称浓度的致死性和延迟孵化。通过ICPMS分析测定微生物组织中Pt的积累，生物体组织中每个生物体的含量分别为0.05，8.7，23.5，59.9，193.2和461.9ng（Pt） （图3）。鉴于顺铂的已知稳定性，未评估顺铂标称浓度的分析测定。
在所有顺铂浓度下均观察到延迟孵化。对Pt浓度进行了额外的实验，有和没有手动去皮。去皮后，分别收集绒毛膜并分析Pt。用于去皮研究的非致死剂量的顺铂确定，顺铂总递送剂量的93-96%已积聚在绒毛膜中，其余剂量积聚在幼虫组织内（图4）。
斑马鱼幼虫暴露于PMC79的0、3.1、6.2、9.2、12.4 mg/L。通过测定IC50的衍生物来选择这些剂量，如前所述16。分析测定这些浓度含有0，0.17，0.44，0.66和0.76mg / L Ru。与顺铂剂量-反应曲线不同，在PMC79暴露的幼虫中未观察到延迟孵化。绒毛膜未包含在钌分析中，因为它们在幼虫收集之前自然降解。研究人员可以通过以24 dpf的降皮和收集绒毛膜来包括脉络膜分析，而不会延迟孵化。在每种浓度下分析的幼虫组织内的金属质量为每只幼虫0.19，0.41和0.68ng（Ru）（图5）。毒理学终点的摘要，包括50%人群的致死浓度和/或剂量（LC50 / LD50），有效浓度或50%人群的剂量（EC50 / ED50），以及观察到的最低不良反应水平（LOAEL）。
| 顺铂 | 断续器79 | |||||
| 标称（毫克/升） | 微米 | 铂（纳克）/生物体 | 分析 Ru （毫克/升） | 微米 | Ru （ng） / organism | |
| LC50/LD50 | 31 （95% 置信区间： 20.5-34.0） | 158 （95% 置信区间： 105-174） | 193 （± 130） | 0.79 （95% 置信区间： 0.43-1.20） | 7.8 （95% 置信区间： 4.2-11.8） | 那 |
| EC50 | 4.6 | 12.5 | 那 | 那 | 那 | 那 |
| 洛埃尔 | 3.75 | 15.3 | 8.7 （± 4） | 0.17 | 1.7 | 0.19 （± 0.05） |
表3：与毒理学终点相关的溶液和金属药物摄取的测定。 LD50分别通过Pt和Ru的金属当量分析来测定顺铂和PMC79。分析测定PMC79的LC50浓度。然而，没有进行名义顺铂浓度的分析测定;鉴于顺铂在溶液中的已知稳定性，假设溶液中的标称和测量浓度是等效的。顺铂暴露的延迟孵化终点根据ED50和LOAEL进行评估。分析测定PMC79的LOAEL浓度。LOAEL包括病变，例如沿尾静脉和尾动脉出血，脊柱弯曲和卵黄囊水肿。所有95%置信区间均使用利奇菲尔德威尔科克森方法计算。此表已从 24 修改。缩写：CI = 置信区间;LC50 = 50%人口的致死浓度;LD50 =50%人口的致死剂量;EC50 = 50%人口的有效浓度;LOAEL = 观察到的最低不良反应水平。
图1：斑马鱼剂量反应方案。 该协议使用改编自经合组织FET的修改方法。用Biorender制成。简称：经合组织=经济合作与发展组织;FET = 鱼胚胎急性毒性。 请点击此处查看此图的大图。
图2：组织消化和ICPMS评估。 消化方案对于消化斑马鱼幼虫的复合样品是有效的。缩写：ICPMS =电感耦合等离子体质谱。使用Biorender创建。 请点击此处查看此图的大图。
（A）5 dpf时平均延迟孵化的百分比与每个生物体确定的平均Pt当量相关。（B）5 dpf时的平均致死率百分比与每个生物体的平均Pt当量相关。百分比意味着：N = 每剂40。每生物体的铂（ng）：每剂量>4个复合样品。进行了两次实验重复，显示了其范围。此数字已从 24 修改。缩写：dpf = 受精后天数。请点击此处查看此图的大图。
图4：暴露于7.5或15mg / L后幼虫和绒毛膜中存在的Pt（ng）的比较。 每个样品复合>3幼虫或绒毛膜;从左到右 N = 13、10、10 和 11。误差线表示标准差。Mann-Whitney秩和检验P在两种剂量的幼虫和绒毛膜之间<0.001。此数字已从 24 修改。 请点击此处查看此图的大图。
（A）平均致死率百分比与分析确定的溶液中平均Ru当量（mg / L）相关。（B）同一实验受精后5 d的平均致死率百分比与每只幼虫的平均Ru当量相关。致死率：N = 每剂40。Ru （mg/L）： N = 每剂量 6 个复合样品。Ru（ng）每幼虫每剂量>4个复合样品。进行了两次实验重复，显示了其范围。此数字已从 24 修改。请点击此处查看此图的大图。
| 每个峰值的停留时间 | 4 毫秒 |
| 开关延迟/峰值 （x10 微米） | 2 |
| 扫描次数 | 350 |
| 循环次数 | 1 |
| 仪器分辨率 | 300 |
| 检测模式 | 衰减，偏转器跳跃 |
| 公园弥撒 | 98.90594 |
| 元素（同位素） | Pt （192， 194， 195， 196）， Ru （99， 100， 101， 102） Sr （84） |
表2：ICPMS方法参数。 用于分析Pt和Ru同位素的参数，分别确定顺铂和PMC79的组织浓度。Sr被包括在内以监测与水箱水组合物相关的等压干扰。此表已从 24 修改。ICPMS = 电感耦合等离子体质谱。
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Discussion
这里描述的方案已经实施以确定含有Pt或Ru的金属基抗癌药物的递送和摄取。尽管这些方法已经发表，但该协议讨论了使该方法适用于一系列化合物的重要考虑因素和细节。经合组织方案与组织消化和ICPMS分析相结合，使我们能够确定PMC79比顺铂更有效，并导致不同的组织积累，这表明了不同的机制。此外，由于顺铂的递送剂量被量化，剂量反应结果被外推到患者群体。亚致死剂量（例如LOAEL）与患者的静脉给药浓度相当24.
虽然这种方法可以应用于广谱金属和金属基化合物，但必须仔细研究分析物的物理化学性质。金属基化合物可能很难溶解，可以使用各种载体来避免这种情况。车辆浓度，如DMSO，可能需要高于经合组织议定书中建议的浓度。因此，通过密切监测对照的发展来维持无毒剂量很重要;在暴露期间连续摇晃胚胎可减轻降水。此外，有机金属化合物在水溶液中可能不稳定。如果降解过程未知，可以考虑涉及 24 小时溶液更新的研究，或将其与非再生剂量-反应曲线进行比较。
建议遵循经合组织鱼类急性胚胎毒性试验（FET）编号23621。但是，可以进行修改以适应特定目的。玻璃容器避免混淆毒理学变量，如塑料和增塑剂，并且不会强烈吸附金属，这会从蛋水中去除分析物。对于光降解的化合物，如顺铂，在没有光循环的情况下进行曝光可能是有益的。
文献中有很多关于斑马鱼剂量反应研究中需要脱皮的讨论25，26，27。在24 hpf下进行去皮的论点表明，绒毛膜限制了化合物的渗透性，从而产生了假阴性结果或增强的剂量 - 反应曲线。虽然这些观点有其优点，但在没有去皮化的情况下进行研究可能会提供机械上的见解。这些研究表明，顺铂由于其烷化活性而积聚在胚胎的脉络膜中（图2）。由此产生的加合物加固了结构，导致孵化延迟。然而，PMC79和其他基于Ru的抗癌药物并没有引起这种现象27。尽管许多化疗药物通过烷基化来发挥其抗癌活性，但PMC79暴露后缺乏延迟孵化表明存在不同的机制。有或没有脱皮的研究必须仔细考虑或并行进行。
必须持续考虑下游组织消化和 ICPMS 分析。建议避免使用任何可能导致等压干扰的试剂，并实施替代方法。在剂量反应研究期间使用的试剂可能会影响硝酸及其氧化电位或与硝酸发生反应，或导致等压干扰。发现用于制造蛋水的盐溶液产生锶（Sr）氧化物，其与Ru24的特定同位素重叠。降低盐浓度或仔细清洁幼虫可以改善这个问题。由于这些原因，建议避免使用抗菌亚甲基蓝或安乐死剂三卡因。相反，高压灭菌并随后给卵水充气以除去微生物或通过快速冷却对幼虫实施安乐死。在此步骤中，重要的是为感兴趣的分析物实现具有最小等压干扰的线性同位素标准曲线。
该协议的一个重要限制是有机金属化合物将被氧化，使得只有金属残留。因此，不能进行代谢研究。虽然该方案可以被认为是中等通量的，但借助自动化学递送系统和成像，可以加快剂量反应部分。该协议是一种新兴的方法，可以针对用于药代动力学和毒代动力学研究的广谱金属和金属基化合物进行修改和改进。
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Disclosures
任何作者都无需披露任何利益冲突。
Acknowledgments
资助：NJAES-Rutgers NJ01201，NIEHS培训补助金T32-ES 007148，NIH-NIEHS P30 ES005022。此外，布列塔尼卡拉斯还得到了NIDS，NIH的培训补助金T32NS115700的支持。作者感谢Andreia Valente和葡萄牙科学技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia， FCT;PTDC/QUI-QIN/28662/2017）供应PMC79。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
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