Summary
Den økte frekvensen av farmako- og toksikonetiske analyser av metaller og metallbaserte forbindelser i sebrafisk kan være fordelaktig for miljømessige og kliniske oversettelsesstudier. Begrensningen av ukjent vannbåren eksponeringsopptak ble overvunnet ved å gjennomføre spormetallanalyse på fordøyd sebrafiskvev ved hjelp av induktivt koblet plasmamassespektrometri.
Abstract
Metaller og metallbaserte forbindelser består av multifarious farmakoaktive og toksikologiske xenobiotika. Fra tungmetalltoksisitet til kjemoterapeutikk har toksikoretikken til disse forbindelsene både historisk og moderne relevans. Sebrafisk har blitt en attraktiv modellorganisme i belyst farmako- og toksikokinika i miljøeksponering og kliniske oversettelsesstudier. Selv om sebrafiskstudier har fordelen av å være høyere gjennomstrømning enn gnagermodeller, er det flere betydelige begrensninger for modellen.
En slik begrensning er iboende i det vannbårne doseringsregimet. Vannkonsentrasjoner fra disse studiene kan ikke ekstrapoleres for å gi pålitelige interne doser. Direkte målinger av metallbaserte forbindelser gir en bedre sammenheng med sammensatte molekylære og biologiske responser. For å overvinne denne begrensningen for metaller og metallbaserte forbindelser ble det utviklet en teknikk for å fordøye sebrafisk larvalvev etter eksponering og kvantifisere metallkonsentrasjoner i vevsprøver ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICPMS).
ICPMS-metoder ble brukt til å bestemme metallkonsentrasjonene av platina (Pt) fra cisplatin og ruthenium (Ru) fra flere nye Ru-baserte kjemoterapeutiske stoffer i sebrafiskvev. I tillegg utmerker denne protokollen konsentrasjoner av Pt som ble beslaglagt i larvalens korri sammenlignet med sebrafiskvevet. Disse resultatene indikerer at denne metoden kan brukes til å kvantisere metalldosen som finnes i larvvev. Videre kan denne metoden justeres for å identifisere spesifikke metaller eller metallbaserte forbindelser i et bredt spekter av eksponerings- og doseringsstudier.
Introduction
Metaller og metallbaserte forbindelser har fortsatt farmakologisk og toksikologiske relevans. Utbredelsen av tungmetalleksponering og dens innvirkning på helsen har eksponentielt økt vitenskapelig undersøkelse siden 1960-tallet og nådde en all-time high i 2021. Konsentrasjonene av tungmetaller i drikkevann, luftforurensning og yrkeseksponering overskrider regulatoriske grenser over hele verden og er fortsatt et problem for arsen, kadmium, kvikksølv, krom, bly og andre metaller. Nye metoder for å kvantifisere miljøeksponering og analysere patologisk utvikling er fortsatt etterspurtmed 1,2,3.
Omvendt har det medisinske feltet utnyttet de fysiokjemiske egenskapene til ulike metaller for klinisk behandling. Metallbaserte legemidler eller metallodrugs har en rik historie med medisinske formål og har vist aktivitet mot en rekke sykdommer, med høyest suksess som kjemoterapeutikk4. Den mest berømte av metallodrugs, cisplatin, er et Pt-basert anticancer-stoff som anses av Verdens helseorganisasjon (WHO) som et av verdens essensielle stoffer5. I 2010 hadde cisplatin og dets Pt-derivater opptil 90% suksessrate i flere kreftformer og ble brukt i omtrent 50% av kjemoterapiregimene 6,7,8. Selv om Pt-baserte kjemoterapeutikk har hatt ugjendrivelig suksess, har den dosebegrensende toksisiteten satt i gang undersøkelser av alternative metallbaserte legemidler med raffinert biologisk levering og aktivitet. Av disse alternativene har Ru-baserte forbindelser blitt de mest populære 9,10,11,12.
Nye modeller og metodikk er nødvendig for å holde tritt med behovet for farmako- og toksikonetiske studier av metall. Sebrafiskmodellen ligger i skjæringspunktet mellom kompleksitet og gjennomstrømning, og er en høy fecundity virveldyr med 70% konservert gen homologi13. Denne modellen har vært en ressurs i farmakologi og toksikologi, med omfattende screeninger for ulike forbindelser for blyoppdagelse, målidentifikasjon og mekanistisk aktivitet 14,15,16,17. Imidlertid er høy gjennomstrømningsscreening av kjemikalier vanligvis avhengig av vannbårne eksponeringer. Gitt at opptaket kan være variabelt basert på de fysisk-kjemiske egenskapene til forbindelsen i oppløsning (dvs. fotodegradering, løselighet), kan dette være en stor begrensning for korrelering av doselevering og respons.
For å overvinne denne begrensningen for sammenligning av dose til høyere vertebrater, ble en metodikk designet for å analysere spormetallkonsentrasjoner i sebrafisk larvvev. Her ble doseresponskurver av dødelige og subletale endepunkter evaluert for cisplatin og nye Ru-baserte anticancerforbindelser. Dødelighet og forsinket klekking ble evaluert for nominelle konsentrasjoner på 0, 3,75, 7,5, 15, 30 og 60 mg/L cisplatin. Pt akkumulering i organismevev ble bestemt av ICPMS-analyse, og organismeopptaket av respektive doser var 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 og 461,9 ng (Pt) per organisme. I tillegg ble sebrafisk larver utsatt for 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / l PMC79. Disse konsentrasjonene ble analytisk fastslått å inneholde 0, 0,17, 0,44, 0,66 og 0,76 mg/l ru. Denne protokollen tillot også å skille konsentrasjoner av Pt som er fanget i larvens korri sammenlignet med sebrafiskvevet. Denne metodikken var i stand til å gi pålitelige, robuste data for sammenligninger av farmako- og toksikonetisk aktivitet mellom en veletablert kjemoterapeutisk og en ny forbindelse. Denne metoden kan brukes på et bredt spekter av metaller og metallbaserte forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB-stammesebrafisken (Danio rerio) ble brukt til alle eksperimenter (se materialtabellen), og husdyrholdsprotokollen (#08-025) ble godkjent av Rutgers University Animal Care and Facilities Committee.
1. Sebrafisk husdyrhold
- Ras og vedlikehold sebrafisken i et resirkulerende akvatisk habitatsystem på en 14 timers lys: 10 h mørk syklus.
- Rens kommunalt vann fra springen gjennom sand og karbonfiltrering for å få vann fra fiskesystemet. Vedlikehold vannsystemet vann ved 28 °C, <0,05 ppm nitritt, <0,2 ppm ammoniakk og pH mellom 7,2 og 7,7.
- Fôr sebrafisken en diett av klekkede Artemia cyster, saltlake reker og fisk diett flake mat.
2. Sebrafisk doseresponsprotokoll (figur 1)
- Forbered sebrafisk eggvannløsning, enten E3 medium eller eggvann laget av bestandssalt i en konsentrasjon på 60 μg / ml oppløst i deionisert vann18. Unngå bruk av metylenblå.
MERK: Gjennom ICPMS ble isobarisk interferens av sebrafisk eggvann identifisert for strontiumoksider, som overlappet med en isotop av ruthenium. Forsiktig skylling av larver før nedstrømsanalyse ameliorated dette problemet. E3 medium kan være et enklere valg for noen på grunn av proprietær sminke av kommersielle havsalter. - Løs opp metall- eller metallbaserte forbindelser i E3 eller eggvann. Virvel for å bryte opp noe aggregert materiale og homogenisere løsningen.
MERK: I eksperimentet som er skissert nedenfor, ble PMC79 og cisplatin oppløst ved maksimale konsentrasjoner på 12,4 mg/l og 60 mg/l med en maksimal konsentrasjon på 0,5 % dimetylsulfoksid (DMSO) for å motstå nedbør.- Fortynn tungmetall- eller metallbaserte forbindelser, som PMC79 og cisplatin, med E3 eller eggvann, og lag minst 5 konsentrasjonsdoser.
- Begynn med lave konsentrasjoner av lagerløsninger i rent kjøretøy (dvs. DMSO), og fortynn deretter med E3 eller eggvann. Vurder de endelige kjøretøykonsentrasjonene nøye.
MERK: Visse metallbaserte forbindelser, som cisplatin, forringes raskt, og løsningene deres må gjøres friske daglig. FORSIKTIG: Håndter tungmetaller og kjemoterapeutikk med forsiktighet. Se gjennom det spesifikke sikkerhetsdatabladet (MSDS) for det aktuelle metallet. Cisplatin kan forårsake øye- og hudirritasjon, være dødelig ved svelging, og kan forårsake toksisitet i nyrer, blod, bloddannende organer og fostervev. Unngå innånding av røyk og kontakt med øyne, hud og klær. Bruk ugjennomtrengelige hansker og klær, og vernebriller eller vernebriller19.
- Begynn med lave konsentrasjoner av lagerløsninger i rent kjøretøy (dvs. DMSO), og fortynn deretter med E3 eller eggvann. Vurder de endelige kjøretøykonsentrasjonene nøye.
- Fortynn tungmetall- eller metallbaserte forbindelser, som PMC79 og cisplatin, med E3 eller eggvann, og lag minst 5 konsentrasjonsdoser.
- Sett opp avlstanker ettermiddagen før eksperimentet i det ideelle forholdet mellom 2 kvinner og 1 mann med en skillevegg på plass mellom kjønnene20.
- Trekk i skillelinjen når lysene tennes for morgensyklusen.
- La sebrafisken avle.
MERK: Hvor lang tid det tar å avl, avhenger av det første eksponeringsstadiet som kreves. For 3 timers postfertilisering, tillat avl i ca. 2 timer. Eggene vil nå 3 hkf etter rengjøring og segregering av egg. - Flytt avlsfisken til en ren tank.
- Samle eggene ved å helle tankvannet gjennom en sil.
- Snu silen over en Petri-tallerken og bruk en spruteflaske fylt med E3 eller eggvann for å skylle eggene inn i parabolen.
- Rengjør retten av mat og avfall før eksperimentell bruk.
- Tilfeldiggjøre omtrent tjue 3 hk embryoer per dose i individuelle hetteglass i glass ved hjelp av en overføringspipette og en liten mengde vann.
- Etter at alle embryoer er i hetteglass, fjern alt eggvann og erstatt med nok doseringsløsning slik at det er ca. 1 tomme løsning over eggets høyde.
MERK: Nødvendigheten av dechorionation bør vurderes nøye. Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon. - Vær oppmerksom på embryoene daglig for lesjoner eller dødelighet. På grunn av den raske utviklingen av embryonal sebrafisk, få daglige bilder ved hjelp av ethvert brightfield mikroskop / kameraoppsett for å identifisere mindre lesjoner mellom dager.
- Ved avslutning av doseresponsen (4-5 dager etter befruktning [dpf], i henhold til OECD-retningslinje21), kombinerer du 3-5 larver før euthanization for sammensatt prøvetaking. Avlive ved rask kjøling ved å fryse i flytende nitrogen.
MERK: Eutanasi gjennom en overdose av MS-222 eller trikain metansulfat kan potensielt forstyrre ICPMS-analysen nedstrøms. Hurtigkjølende eutanasimetoder oppfordres til denne protokollen for å redusere muligheten for forstyrrelser. - Utfør 3 vasker av vev med vann med høy renhet (som omvendt osmose) for å fjerne overflødig forbindelse fra utsiden av vevet.
- Flytt prøvene til syre- og mikrobølgesikre 15 ml polypropylensentrifugerør. Vær forsiktig med å fjerne alt overflødig vann , da gjenværende væske kan fortynne salpetersyren, og derfor oksidasjonspotensialet til syren under vevsforringelse.
MERK: På dette tidspunktet kan vev lagres ved -20 °C inntil videre analyse. For naturlig rikelig metaller vil rengjøring av rørene i et 5% salpetersyrebad før bruk forbedre omgivelsesbakgrunnsnivåene.
3. Vevsfordøyelse og ICPMS-evaluering (figur 2)
- Tilsett ca. 0,25 ml til 15 ml polypropylensentrifugerør for opptil 10 larver (~100 μg) med salpetersyre med høy renhet (69 %). Ultralyd for 1 time for å forfelle prøvene ved hjelp av følgende innstillinger: ultralydbadutgang: 85 W; 42 kHz ± 6%; temperaturområde: 19-27 °C.
FORSIKTIG: Bruk hørselvern under sonikering. Salpetersyre forårsaker alvorlige luftveier, øye og hudforbrenninger. Bruk fullt verneutstyr og arbeid i avtrekkshetten eller på steder med tilstrekkelig ventilasjon. Det kan være brannfarlig med andre materialer. Salpetersyre bør håndteres utelukkende i en avtrekkshette for å forhindre eksponering for damper produsert under fordøyelsen. Ikke inhaler eller innta.- Utfør korte sykluser av vevsfordøyelse (5 min intervaller) i en syresikker mikrobølgefordøyer til alt vev er synlig oksidert (dvs. ensartet, klar-gul løsning).
MERK: Mikrobølgeprotokollen i tabell 1 anbefales å utføres tre ganger og inkluderer et 5 minutters nedkjølingsintervall mellom hvert varmetrinn. - Overvåk integriteten til rørene nøye for å unngå brudd og utføre korte spinn i sentrifugen (313 × g i 1 min) mellom sykluser for å flytte syrekondensasjon til bunnen av røret.
MERK: Hvis vevet er vanskelig å fordøye (spesielt chorions), kan 30% hydrogenperoksid med høy renhet brukes etter syrefordøyelse. Bruk hydrogenperoksidet (6,75 ml) til å fortynne syrekonsentrasjonen til 3,5%, og la prøvene sitte over natten i en avtrekkshette. Hydrogenperoksid vil dekomponeres til H2O og er egnet for ICPMS-analyse. Videre kan alternative metaller oppløses bedre i saltsyre eller en blanding av saltsyre og salpetersyre (dvs. aqua regia). Hydrogenperoksid er skadelig ved svelging og forårsaker alvorlig øyeskade. Bruk hud- og øyebeskyttelse22,23.
- Utfør korte sykluser av vevsfordøyelse (5 min intervaller) i en syresikker mikrobølgefordøyer til alt vev er synlig oksidert (dvs. ensartet, klar-gul løsning).
- Når vevet er synlig oksidert (dvs. ensartet, klargul løsning), fortynn prøvene i en avtrekkshette til 3,5% salpetersyre ved hjelp av 6,75 ml vann og virvel med høy renhet for å blande grundig.
MERK: På dette tidspunktet kan prøvene lagres ved romtemperatur. Dette trinnet er unødvendig hvis hydrogenperoksid ble tilsatt for å hjelpe fordøyelsen i trinn 3.1. - Utfør en matrisetilpasset 7-punkts kalibreringskurve (konsentrasjonsområde på 0,001-10 ppb) ved hjelp av en sertifisert elementær standard (dvs. Pt eller Ru, avhengig av analysen) med metallet av interesse og optimal isotop(er) for å ta hensyn til eventuelle isobariske forstyrrelser.
- Ved hjelp av en lagerkonsentrasjon av den vandige, sertifiserte elementstandarden (Ru, Pt = 1000 ppb), ta en 0,1 ml aliquot og pipet inn i et nytt 15 ml sentrifugerør. Fortynn med 3,5% salpetersyre til et sluttvolum på 10 ml for å produsere en 10 ppb standardløsning.
- Bruk 10 ppb-lageret til å lage følgende serielle fortynninger: 0,1, 1,0 og 5,0 ppb standardløsninger i 3,5% salpetersyre.
- Bruk 0,1-lager, gjør følgende serielle fortynninger: 0,001, 0,005 og 0,01 ppb standardløsninger i 3,5% salpetersyre.
- Klargjør ICPMS-instrumentet (se Tabell over materialer) for eksempelanalyse som følger:
- Før du starter instrumentet, må du sørge for at Argon-gassventilen er åpen, at all rør er ordentlig tilkoblet, og rengjør 5% salpetersyre er åpen for skylleslange og glasstøy mellom prøveanalyser.
- Kontroller tilstanden til brenneren og kjeglene, og sørg for at brennerboksen er godt festet og at dreneringsrøret for sprøytekammeret er riktig koblet til peripumpen.
- Åpne programvaren (se materiallisten).
- Kontroller vakuumavlesningene og sørg for at alle turbopumper kjører på 100%.
- Klikk på START i vinduet Status for plasmakontrollsystem for å starte startsekvensen, slå på plasmapumpen, plasmakjøleren, rense forstøveren og tenne plasmaet. Vent til plasmaet lyser og er stabilt når statusvinduet viser at oppstartssekvensen er fullført. På dette tidspunktet må du observere de grønne prikkene i systemtilstandsvinduet som angir at alle strømforsyninger er på.
- På menylinjen klikker du på Kontroll | autosampler i rullegardinmenyen. Angi autosamplerstativposisjonen for røret som inneholder 5% salpetersyre. La syren komme inn i plasma.
- På menylinjen klikker du på Skanninger | Magnet i rullegardinmenyen. I MagnetScan-vinduet skriver du inn 115 i markermasseposisjonen og klikker enter. La magneten skanne over masseområdet i 115In (114.6083 til 115.3749) i 30 min mens instrumentet varmes opp.
- Etter 30 min bruker du autosamplerkontrollen til å gå til posisjonen til en 1 ppb multielement tuning løsning. Aspirer innstillingsløsningen og still inn instrumentet for å optimalisere signalavlesningen. Juster fakkelposisjonen (X, Y, Z) slik at brenneren er på linje med midten av kjegler og forstøverstrømningshastighet (~ 30 psi) i plasmakontrollvinduet . Gjør de nødvendige justeringene i vinduet Ion Optics Tuning for kilden, detektoren og analysatoren.
- Når signalavlesningen er optimalisert (~1.2 × 106 antall/s for 1 ppb på 115In), klikker du på Stopp i Magnet Scan-vinduet .
- Klikk kalibrer magnet og velg Lav oppløsning i popup-vinduet.
- Klikk OK og åpne filen "Mass Calibration (Low Resolution).smc" for å kalibrere magneten.
MERK: Magnetkalibreringen måler tellingene/s og passer til en kurve gjennom følgende masseområde: 7Li til 238U. - Klikk Lagre | Brukes til å anvende gjeldende magnetkalibrering på analysene. Hvis du måler ukjente prøver med et stort utvalg av konsentrasjoner, utfører du en detektorkalibrering for å sammenligne ionpulstellingssignaler ved lave konsentrasjoner med svekkede ionsignaler produsert ved høyere konsentrasjoner. Analyser prøvene når justeringen og kalibreringen er fullført.
- På menylinjen klikker du på Datainnsamling.
- Klikk på Metodeoppsett i rullegardinmenyen. Bruk en eksisterende metode levert av produsenten, eller opprett en metode basert på elementene av interesse. Juster om nødvendig analysemodus, oppholdstid, bryterforsinkelse, antall sveip/ sykluser, oppløsning, deteksjonsmodus og parkmassen for deflektorinnstillinger.
- Klikk Lagre for å registrere metodeinnstillingene. Optimaliser parametrene for hvert metall og isotop. Se tabell 2 for de spesifikke operasjonsparametrene som brukes i denne studien.
- På menylinjen klikker du på Datainnsamling.
- Klikk på Batch Run i rullegardinmenyen. Alternativt kan du klikke på BATCH-ikonet under menylinjen. Importer de satsvise parameterne fra et regneark, eller opprett en sekvens i vinduet Satsvis kjøring . Angi eksempeltype, plassering av autosamplerstativ, overføringstid, vasketid, replikeringer, prøve-ID og metodefil.
- Ordne batchkjøringen i følgende rekkefølge: standardløsninger for kalibreringskurven (0,001-10 ppb Pt eller Ru), etterfulgt av en kvalitetskontrollstandard, deretter ukjente prøver.
MERK: Standardløsninger måles som tellinger/s på ICPMS, og en lineær regresjon passer gjennom standardene med et relativt standardavvik (RSD) > 0,999. Ukjente måles også som tellinger/s og løses for konsentrasjon i ppb ved hjelp av den lineære regresjonen av kalibreringskurven, y = mx + b. Databehandling kan også fullføres ved hjelp av den refererte programvaren. - Overvåk instrumentdrift og prøvereduserbarhet ved å inkludere en 0,5 ppb kvalitetskontrollstandard hver 5-10 prøve.
MERK: Egnede kvalitetskontrollstandarder bør være et sertifisert standard referansemateriale som er forskjellig fra standarden som brukes i kalibreringskurven.
| Watt | Kraft | Referat |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabell 1: Fordøyelsesprotokoll for mikrobølger for larvvevsmasse. Zebrafish larvalprøver ble fordøyd i 0,25 ml salpetersyre. Denne tabellen er endret fra 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultatene er tidligere publisert24. Vevsopptaksstudier ble utført med vannbårne eksponeringer av cisplatin og en ny Ru-basert anticancer-forbindelse, PMC79. Dødelighet og forsinket klekking ble evaluert for nominelle konsentrasjoner av cisplatin 0, 3,75, 7,5, 15, 30 og 60 mg/L cisplatin. Pt-akkumulering i organismevev ble bestemt av ICPMS-analyse, og organismevev inneholdt respektive doser på 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 og 461,9 ng (Pt) per organisme (figur 3). Analytisk bestemmelse av nominelle konsentrasjoner for cisplatin ble ikke vurdert, gitt den kjente stabiliteten til cisplatin.
Forsinket klekking ble observert ved alle cisplatinkonsentrasjoner. Ytterligere eksperimenter ble utført for Pt-konsentrasjoner med og uten manuell dechorionation. Etter dechorionation ble chorions samlet og analysert for Pt separat. Nonlethal doser av cisplatin brukt til dechorionation studier fastslått at 93-96% av den totale leverte dosen av cisplatin hadde akkumulert i koret med den gjenværende dosen i larvalvevet (figur 4).
Sebrafisk larver ble utsatt for 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg / l PMC79. Disse dosene ble valgt ved å bestemme derivater av en IC50, som beskrevet tidligere16. Disse konsentrasjonene ble analytisk fastslått å inneholde 0, 0,17, 0,44, 0,66 og 0,76 mg/l ru. I motsetning til cisplatin dose-respons kurven, forsinket klekking ble ikke observert i PMC79-eksponerte larver. Chorions ble ikke inkludert i Ruthenium analyse som de naturlig degradert før larval samling. Forskere kan inkludere koranalyse uten forsinket klekking ved å dechorionating og samle chorions ved 24 dpf. Massen av metall i larvvev analysert ved hver konsentrasjon var 0,19, 0,41 og 0,68 ng (Ru) per larve (figur 5). En oppsummering av de toksikologiske endepunktene, inkludert dødelige konsentrasjoner og/eller doser for 50 % av populasjonen (LC50/LD50), effektive konsentrasjoner eller doser for 50 % av populasjonene (EC50/ED50), og det laveste observerte negative effektnivået (LOAEL) finnes i tabell 3.
| Cisplatin | PMC79 | |||||
| Nominell (mg/L) | μM | Pkt (ng) / organisme | Analytisk ru (mg/L) | μM | Ru (ng) / organisme | |
| LC50/LD50 | 31 (95 % KI: 20,5–34,0) | 158 (95 % KI: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (95 % KI: 0,43-1,20) | 7,8 (95 % KI: 4,2–11,8) | NA |
| EF50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| LOAEL | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0,19 (± 0,05) |
Tabell 3: Bestemmelse av oppløsning og metallodrugopptak forbundet med toksikologiske endepunkter. LD50 ble bestemt av metallekvivalent analyse av henholdsvis Pt og Ru for cisplatin og PMC79. LC50-konsentrasjonene for PMC79 ble analytisk bestemt. Analytisk bestemmelse av nominelle cisplatinkonsentrasjoner ble imidlertid ikke utført; gitt den kjente stabiliteten til cisplatin i løsningen, ble det antatt at nominelle og målte konsentrasjoner i løsningen ville være likeverdige. Det forsinkede klekkeendepunktet for cisplatineksponering ble evaluert i form av ED50 og LOAEL. LOAEL-konsentrasjonene av PMC79 ble analytisk bestemt. LOAEL inkluderte lesjoner som blødning langs kaudal vene og hale arterie, spinal krumning og eggeplomme edem. Alle konfidensintervaller på 95 % ble beregnet ved hjelp av Litchfield Wilcoxon-metoden. Denne tabellen er endret fra 24. Forkortelser: CI = konfidensintervall; LC50 = Dødelig konsentrasjon for 50% av befolkningen; LD50 = Dødelig dose for 50% av befolkningen; EC50 = Effektiv konsentrasjon for 50% av befolkningen; LOAEL = laveste observerte bivirkninger.
Figur 1: Zebrafish doseresponsprotokoll. Denne protokollen bruker en modifisert tilnærming tilpasset OECD FET. Laget med Biorender. Forkortelse: OECD = Organisasjonens økonomiske samarbeid og utvikling; FET = akutt giftighet for fiskeembryoer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vevsfordøyelse og ICPMS-evaluering. Fordøyelsesprotokollen er effektiv for å fordøye en komposittprøve av sebrafisk larver. Forkortelse: ICPMS = induktivt koblet plasmamassespektrometri. Laget med Biorender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cisplatin doserespons. (A) Prosentvis gjennomsnittlig forsinket klekking ved 5 dpf korrelert med gjennomsnittlig pkt-ekvivalenter bestemt per organisme. (B) Prosentandel gjennomsnittlig dødelighet ved 5 dpf korrelert med gjennomsnittlig pkt-ekvivalenter per organisme. Prosentvis gjennomsnitt: N = 40 per dose. Pkt (ng) per organisme: >4 komposittprøver per dose. To eksperimentelle replikeringer ble utført, hvis områder vises. Dette tallet er endret fra 24. Forkortelse: dpf = dager etter befruktning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av Pkt (ng) tilstede i larver og kor etter eksponering for 7,5 eller 15 mg/l. Kompositt >3 larver eller korioner per prøve; fra venstre mot høyre N = 13, 10, 10 og 11. Feilfelt representerer standardavvik. Mann-Whitney rank-sum test P < 0,001 mellom larver og kor for begge doser. Dette tallet er endret fra 24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: PMC79 doserespons. (A) Prosentvis gjennomsnittlig dødelighet var korrelert med de analytisk fastsatte gjennomsnittlige Ru-ekvivalentene i oppløsning (mg/L). (B) Prosentvis gjennomsnittlig dødelighet etter 5 dager etter befruktning fra samme eksperiment ble korrelert med gjennomsnittlig Ru-ekvivalenter per larve. Dødelighet: N = 40 per dose. Ru (mg/L): N = 6 komposittprøver per dose. Ru (ng) per larve >4 komposittprøver per dose. To eksperimentelle replikeringer ble utført, hvis områder vises. Dette tallet er endret fra 24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Oppholdstid per topp | 4 ms |
| Bryterforsinkelse/-topp (x10micros) | 2 |
| Antall feiringer | 350 |
| Antall sykluser | 1 |
| Instrument oppløsning | 300 |
| Søkemodus | Svekket, Deflektorhopp |
| Park messe | 98.90594 |
| Element (isotoper) | Pkt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tabell 2: Parametere for ICPMS-metode. Parametere for analyse av Pt- og Ru-isotoper for å bestemme vevskonsentrasjoner av henholdsvis cisplatin og PMC79. Sr ble inkludert for å overvåke isobariske forstyrrelser forbundet med tankvannsammensetningen. Denne tabellen er endret fra 24. ICPMS = induktivt koblet plasmamassespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er implementert for å bestemme levering og opptak av metallbaserte anticancer legemidler som inneholder enten Pt eller Ru. Selv om disse metodene allerede er publisert, diskuterer denne protokollen viktige hensyn og detaljer for å tilpasse denne metoden for en rekke forbindelser. OECD-protokollen kombinert med vevsfordøyelse og ICPMS-analyse tillot oss å fastslå at PMC79 var mer potent enn cisplatin og resulterte i ulik vevsakkumulering, noe som tyder på separate mekanismer. Videre, fordi den leverte dosen av cisplatin ble kvantifisert, ble doseresponsresultatene ekstrapolert til pasientpopulasjoner. Subletaldoser (f.eks. LOAEL) var sammenlignbare med intravenøse doseringskonsentrasjoner hos pasienter24.
Selv om denne metoden kan brukes på et bredt spekter av metaller og metallbaserte forbindelser, må nøye undersøkelse av analyttens fysisk-kjemiske egenskaper tas i betraktning. Metallbaserte forbindelser kan være svært vanskelig å oppløse, og ulike kjøretøy kan brukes til å unngå dette. Kjøretøykonsentrasjoner, som DMSO, må kanskje ha høyere konsentrasjoner enn anbefalt i OECD-protokollen. Som sådan er det viktig å opprettholde en ikke-giftig dose ved å nøye overvåke utviklingen av kontroller; kontinuerlig gynging av embryoene under eksponering reduserer nedbør. I tillegg kan organometalliske forbindelser ikke være stabile i vandig løsning. Hvis nedbrytningsprosessen er ukjent, kan studier som involverer 24 timers løsningsfornyelse vurderes eller sammenlignes med ikke-drevne doseresponskurver.
Det anbefales å følge OECD Fish Acute Embryo Toxicity Test (FET) Nummer 23621. Endringer kan imidlertid gjøres for å passe til bestemte formål. Glassbeholdere unngår forvirrende toksikologiske variabler, som plast og myknere, og adsorberer ikke metaller så sterkt, noe som vil fjerne analytter fra eggvannet. For forbindelser som fotodegraderer, for eksempel cisplatin, kan det være gunstig å gjennomføre eksponeringen uten lyssyklus.
Det er mye diskusjon i litteraturen om behovet for dechorionation i sebrafisk dose-respons studier 25,26,27. Argumenter for dechorionation ved 24 HPF antyder at koret begrenser permeabiliteten av forbindelser, og dermed genererer falske negative resultater eller forsterkede doseresponskurver. Selv om disse punktene har fortjeneste, kan det å gjennomføre studier uten dechorionation gi mekanistisk innsikt. Disse studiene tyder på at cisplatin akkumuleres i koreksjonen av embryoene på grunn av alkyleringsaktiviteten (figur 2). De resulterende adducts forsterker strukturen, noe som resulterer i forsinket klekking. PMC79 og andre Ru-baserte anticancer-legemidler forårsaket imidlertid ikke dette fenomenet27. Selv om mange kjemoterapeutiske stoffer vedtar sin anticancer aktivitet ved alkylering, mangelen på forsinket klekking post PMC79 eksponering indikerte en ulik mekanisme. Studier med eller uten dechorionation må vurderes nøye eller gjennomføres parallelt.
Nedstrøms vevsfordøyelse og ICPMS-analyse må vurderes kontinuerlig. Det anbefales å unngå å bruke reagenser som kan forårsake isobariske forstyrrelser og implementere alternative metoder. Reagenser som brukes under doseresponsstudiene, kan påvirke eller reagere med salpetersyren og dets oksidasjonspotensial eller bidra til isobariske forstyrrelser. Det ble oppdaget at saltoppløsningen som brukes til å lage eggvann generert strontium (Sr) oksider, som overlappet med en bestemt isotop av Ru24. Senking av saltkonsentrasjoner eller forsiktig rengjøring av larver kan forbedre dette problemet. Av disse grunnene foreslås det å unngå antimikrobiell metylenblå eller euthanizing agent, trikain. I stedet autoklaverer og deretter øl eggvannet for å fjerne mikrober eller avlive larver ved rask kjøling. Det er viktig på dette trinnet å oppnå lineære isotopiske standardkurver med minimal isobariske forstyrrelser for analytten av interesse.
En viktig begrensning i denne protokollen er at organometalliske forbindelser vil bli oksidert slik at bare metallet forblir. Som sådan kan metabolismestudier ikke utføres. Selv om protokollen kan betraktes som middels gjennomstrømning, kan doseresponsdelen fremskyndes ved hjelp av automatiske kjemiske leveringssystemer og avbildning. Denne protokollen er en ekkel metodikk som kan modifiseres og raffineres for et bredt spekter av metall- og metallbaserte forbindelser for farmako- og toksikonetiske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen interessekonflikter som skal avsløres av noen av forfatterne.
Acknowledgments
Finansiering: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. I tillegg støttes Brittany Karas av opplæringsstipend T32NS115700 fra NINDS, NIH. Forfatterne anerkjenner Andreia Valente og den portugisiske stiftelsen for vitenskap og teknologi (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) for tilførsel av PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
