Summary
El aumento de la tasa de análisis farmacológicos y toxicocinéticos de metales y compuestos a base de metales en el pez cebra puede ser ventajoso para los estudios de traducción ambiental y clínica. La limitación de la absorción de exposición desconocida en el agua se superó mediante la realización de análisis de metales traza en tejido de pez cebra digerido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente.
Abstract
Los metales y los compuestos a base de metales comprenden xenobióticos farmacoactivos y toxicológicos múltiples. Desde la toxicidad por metales pesados hasta la quimioterapéutica, la toxicocinética de estos compuestos tiene relevancia histórica y moderna. El pez cebra se ha convertido en un organismo modelo atractivo para dilucidar la farmacocinética y la toxicocinética en estudios de exposición ambiental y traducción clínica. Aunque los estudios de pez cebra tienen el beneficio de ser de mayor rendimiento que los modelos de roedores, hay varias restricciones significativas para el modelo.
Una de esas limitaciones es inherente al régimen de dosificación en el agua. Las concentraciones de agua de estos estudios no se pueden extrapolar para proporcionar dosis internas confiables. Las mediciones directas de los compuestos a base de metales permiten una mejor correlación con las respuestas moleculares y biológicas relacionadas con los compuestos. Para superar esta limitación para metales y compuestos a base de metales, se desarrolló una técnica para digerir el tejido larvario de pez cebra después de la exposición y cuantificar las concentraciones de metales dentro de las muestras de tejido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICPMS).
Se utilizaron métodos ICPMS para determinar las concentraciones metálicas de platino (Pt) a partir de cisplatino y rutenio (Ru) de varios quimioterapéuticos novedosos basados en Ru en tejido de pez cebra. Además, este protocolo distinguió las concentraciones de Pt que fueron secuestradas en el corion de la larva en comparación con el tejido del pez cebra. Estos resultados indican que este método se puede aplicar para cuantificar la dosis de metal presente en los tejidos larvales. Además, este método puede ajustarse para identificar metales específicos o compuestos a base de metales en una amplia gama de estudios de exposición y dosificación.
Introduction
Los metales y los compuestos a base de metales siguen teniendo relevancia farmacológica y toxicológica. La prevalencia de la exposición a metales pesados y su impacto en la salud ha aumentado exponencialmente la investigación científica desde la década de 1960 y alcanzó un máximo histórico en 2021. Las concentraciones de metales pesados en el agua potable, la contaminación del aire y la exposición ocupacional exceden los límites regulatorios en todo el mundo y siguen siendo un problema para el arsénico, el cadmio, el mercurio, el cromo, el plomo y otros metales. Los métodos novedosos para cuantificar la exposición ambiental y analizar el desarrollo patológico siguenteniendo una gran demanda 1,2,3.
Por el contrario, el campo médico ha aprovechado las propiedades fisicoquímicas de varios metales para el tratamiento clínico. Los medicamentos a base de metales o metalodrugs tienen una rica historia de propósitos medicinales y han demostrado actividad contra una variedad de enfermedades, con el mayor éxito como la quimioterapéutica4. El más famoso de los metalofármacos, el cisplatino, es un medicamento contra el cáncer a base de Pt considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como uno de los medicamentos esenciales del mundo5. En 2010, el cisplatino y sus derivados Pt tuvieron una tasa de éxito de hasta el 90% en varios cánceres y se utilizaron en aproximadamente el 50% de los regímenes de quimioterapia 6,7,8. Aunque los quimioterapéuticos basados en Pt han tenido un éxito irrefutable, la toxicidad limitante de la dosis ha puesto en marcha investigaciones de fármacos alternativos a base de metales con administración y actividad biológica refinada. De estas alternativas, los compuestos a base de Ru se han convertido en losmás populares 9,10,11,12.
Se requieren nuevos modelos y metodología para mantener el ritmo de la tasa de necesidad de estudios farmacológicos y toxicocinéticos de metales. El modelo de pez cebra se encuentra en la intersección de complejidad y rendimiento, siendo un vertebrado de alta fecundidad con un 70% de homología génica conservada13. Este modelo ha sido un activo en farmacología y toxicología, con extensos exámenes de detección de diversos compuestos para el descubrimiento de plomo, la identificación de objetivos y la actividad mecanicista 14,15,16,17. Sin embargo, el cribado de alto rendimiento de productos químicos generalmente se basa en exposiciones transmitidas por el agua. Dado que la absorción puede ser variable en función de las propiedades fisicoquímicas del compuesto en solución (es decir, fotodegradación, solubilidad), esto puede ser una limitación importante para correlacionar la administración de dosis y la respuesta.
Para superar esta limitación para la comparación de la dosis con vertebrados superiores, se diseñó una metodología para analizar las concentraciones de metales traza en el tejido larvario del pez cebra. Aquí, se evaluaron las curvas dosis-respuesta de los criterios de valoración letales y subletales para el cisplatino y los nuevos compuestos anticancerígenos a base de Ru. La letalidad y el retraso en la eclosión se evaluaron para concentraciones nominales de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 mg/L de cisplatino. La acumulación de Pt en el tejido del organismo se determinó mediante el análisis de ICPMS, y la absorción del organismo de las dosis respectivas fue de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 y 461,9 ng (Pt) por organismo. Además, las larvas de pez cebra fueron expuestas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L de PMC79. Estas concentraciones se determinaron analíticamente para contener 0, 0,17, 0,44, 0,66 y 0,76 mg/L de Ru. Este protocolo también permitió distinguir las concentraciones de Pt secuestrado en el corion de las larvas en comparación con el tejido del pez cebra. Esta metodología fue capaz de proporcionar datos fiables y sólidos para las comparaciones de la actividad farmacocinética y toxicocinética entre un quimioterapéutico bien establecido y un compuesto nuevo. Este método se puede aplicar a una amplia gama de metales y compuestos a base de metales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El pez cebra de la cepa AB (Danio rerio) se utilizó para todos los experimentos (consulte la Tabla de materiales), y el protocolo de cría (# 08-025) fue aprobado por el Comité de Cuidado e Instalaciones de Animales de la Universidad de Rutgers.
1. Cría de pez cebra
- Cría y mantiene al pez cebra en un sistema de hábitat acuático de recirculación en un ciclo de oscuridad de 14 h de luz:10 h.
- Purificar el agua del grifo municipal a través de la arena y la filtración de carbono para obtener agua del sistema de peces. Mantener el agua del sistema acuático a 28 °C, <0.05 ppm nitrito, <0.2 ppm de amoníaco y pH entre 7.2 y 7.7.
- Alimente al pez cebra con una dieta de quistes de Artemia eclosionados, camarones en salmuera y alimentos en escamas de la dieta de los peces.
2. Protocolo dosis-respuesta del pez cebra (Figura 1)
- Preparar una solución de agua de huevo de pez cebra, ya sea E3 medio o agua de huevo hecha de sal marina de stock a una concentración de 60 μg/mL disuelta en agua desionizada18. Evite el uso de azul de metileno.
NOTA: A través de ICPMS, se identificó la interferencia isobárica del agua de huevo de pez cebra para los óxidos de estroncio, que se superponían con un isótopo de rutenio. El enjuague cuidadoso de las larvas antes del análisis aguas abajo mejoró este problema. El medio E3 puede ser una opción más fácil para algunos debido a la composición patentada de sales marinas comerciales. - Disuelva el metal o los compuestos a base de metal en E3 o agua de huevo. Vórtice para romper cualquier material agregado y homogeneizar la solución.
NOTA: En el experimento descrito a continuación, PMC79 y cisplatino se disolvieron a concentraciones máximas de 12,4 mg / L y 60 mg / L con una concentración máxima de 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) para resistir la precipitación.- Diluya metales pesados o compuestos a base de metales, como PMC79 y cisplatino, con E3 o agua de huevo, preparando al menos 5 dosis de concentración.
- Comience con bajas concentraciones de soluciones madre en vehículo puro (es decir, DMSO), luego diluya con E3 o agua de huevo. Considere cuidadosamente las concentraciones finales del vehículo.
NOTA: Ciertos compuestos a base de metales, como el cisplatino, se degradan rápidamente y sus soluciones deben hacerse frescas diariamente. PRECAUCIÓN: Manipule los metales pesados y la quimioterapia con cuidado. Revise la hoja de datos de seguridad de materiales específicos (MSDS) para el metal de interés. El cisplatino puede causar irritación de los ojos y la piel, ser fatal si se ingiere y puede causar toxicidad en los riñones, la sangre, los órganos formadores de sangre y el tejido fetal. Evite los vapores respiratorios y el contacto con los ojos, la piel y la ropa. Use guantes y ropa impermeables, y gafas o gafas de seguridad19.
- Comience con bajas concentraciones de soluciones madre en vehículo puro (es decir, DMSO), luego diluya con E3 o agua de huevo. Considere cuidadosamente las concentraciones finales del vehículo.
- Diluya metales pesados o compuestos a base de metales, como PMC79 y cisplatino, con E3 o agua de huevo, preparando al menos 5 dosis de concentración.
- Instale tanques de cría la tarde anterior al experimento en la proporción ideal de 2 hembras por 1 macho con un divisor en su lugar entre los sexos20.
- Tire del divisor cuando se enciendan las luces para el ciclo de la mañana.
- Permita que el pez cebra se reproduzca.
NOTA: El período de tiempo para la reproducción depende de la etapa de exposición inicial requerida. Durante 3 h después de la fertilización, permita la reproducción durante aproximadamente 2 h. Los huevos alcanzarán los 3 hpf después de limpiar y segregar los huevos. - Mueva los peces reproductores a un tanque limpio.
- Recoge los huevos vertiendo el agua del tanque a través de un colador.
- Invierta el colador sobre una placa de Petri y use una botella de chorro llena de E3 o agua de huevo para enjuagar los huevos en el plato.
- Limpie el plato de alimentos y desechos antes del uso experimental.
- Aleatorizar aproximadamente veinte embriones de 3 hpf por dosis en viales de vidrio individuales utilizando una pipeta de transferencia y una pequeña cantidad de agua.
- Después de que todos los embriones estén en viales, retire toda el agua del huevo y reemplácela con suficiente solución dosificadora para que haya aproximadamente 1 pulgada de solución por encima de la altura del óvulo.
NOTA: La necesidad de la deelección debe considerarse cuidadosamente. Consulte la sección de discusión para obtener más detalles. - Observar los embriones diariamente en busca de lesiones o letalidad. Debido al rápido desarrollo del pez cebra embrionario, obtenga imágenes diarias utilizando cualquier configuración de microscopio / cámara de campo brillante para identificar lesiones menores entre días.
- Al finalizar la respuesta a la dosis (4-5 días después de la fertilización [dpf], según la directriz21 de la Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos [OCDE]), combine 3-5 larvas antes de la eutanasia para el muestreo compuesto. Eutanasia por enfriamiento rápido por congelación instantánea en nitrógeno líquido.
NOTA: La eutanasia a través de una sobredosis de MS-222 o metanosulfonato de tricaína puede interferir potencialmente con el análisis de ICPMS aguas abajo. Se recomiendan métodos de eutanasia de enfriamiento rápido para este protocolo para reducir la posibilidad de interferencia. - Realice 3 lavados de tejido con agua de alta pureza (como ósmosis inversa) para eliminar el exceso de compuesto del exterior del tejido.
- Mueva las muestras a tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml seguros para ácido y microondas. Tenga cuidado de eliminar todo el exceso de agua , ya que cualquier líquido restante puede diluir el ácido nítrico y, por lo tanto, el potencial oxidante del ácido durante la degradación del tejido.
NOTA: En este punto, el tejido puede almacenarse a -20 °C hasta un análisis adicional. Para metales naturalmente abundantes, la limpieza de los tubos en un baño de ácido nítrico al 5% antes de su uso mejorará los niveles de fondo ambiental.
3. Digestión tisular y evaluación del ICPMS (Figura 2)
- Agregue aproximadamente 0,25 ml a los tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml para hasta 10 larvas (~ 100 μg) de ácido nítrico de alta pureza (69%). Ultrasonicar durante 1 h para predigerir las muestras utilizando los siguientes ajustes: salida de baño ultrasónico: 85 W; 42 kHz ± 6%; rango de temperatura: 19-27 °C.
PRECAUCIÓN: Use protección para los oídos durante la sonicación. El ácido nítrico causa quemaduras graves en las vías respiratorias, los ojos y la piel. Use equipo de protección completo y trabaje en la campana de humos o en lugares con ventilación adecuada. Puede ser inflamable con otros materiales. El ácido nítrico debe manipularse exclusivamente en una campana extractora de humos para evitar la exposición a los vapores producidos durante la digestión. No inhale ni ingiera.- Realice ciclos cortos de digestión de tejidos (intervalos de 5 minutos) en un digestor de microondas seguro para el ácido hasta que todo el tejido esté visiblemente oxidado (es decir, una solución uniforme de color amarillo claro).
NOTA: Se recomienda que el protocolo de microondas de la Tabla 1 se realice tres veces e incluye un intervalo de enfriamiento de 5 minutos entre cada paso de calentamiento. - Controle cuidadosamente la integridad de los tubos para evitar la ruptura y realice giros cortos en la centrífuga (313 × g durante 1 minuto) entre ciclos para mover la condensación ácida al fondo del tubo.
NOTA: Si el tejido es difícil de digerir (especialmente los coriones), se puede usar peróxido de hidrógeno de alta pureza al 30% después de la digestión ácida. Use el peróxido de hidrógeno (6.75 ml) para diluir la concentración de ácido al 3.5% y permita que las muestras se sienten durante la noche en una campana de humos. El peróxido de hidrógeno se descompone en H2O y es adecuado para el análisis ICPMS. Además, los metales alternativos pueden disolverse mejor en ácido clorhídrico o una mezcla de ácido clorhídrico y ácido nítrico (es decir, aqua regia). El peróxido de hidrógeno es dañino si se ingiere y causa daños oculares graves. Use protección para la piel y los ojos22,23.
- Realice ciclos cortos de digestión de tejidos (intervalos de 5 minutos) en un digestor de microondas seguro para el ácido hasta que todo el tejido esté visiblemente oxidado (es decir, una solución uniforme de color amarillo claro).
- Una vez que el tejido esté visiblemente oxidado (es decir, una solución uniforme de color amarillo claro), diluya las muestras en una campana de humos a ácido nítrico al 3,5% utilizando 6,75 ml de agua de alta pureza y vórtice para mezclar bien.
NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente. Este paso es innecesario si se agregó peróxido de hidrógeno para ayudar a la digestión en el paso 3.1. - Realice una curva de calibración de 7 puntos emparejada con la matriz (rango de concentración de 0.001-10 ppb) utilizando un estándar elemental certificado (es decir, Pt o Ru, dependiendo del ensayo) con el metal de interés y los isótopos óptimos para tener en cuenta cualquier interferencia isobárica potencial.
- Utilizando una concentración de stock del estándar elemental acuoso y certificado (Ru, Pt = 1000 ppb), tome una alícuota de 0,1 ml y pipete en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Diluir con ácido nítrico al 3,5% a un volumen final de 10 ml para producir una solución estándar de 10 ppb.
- Usando el stock de 10 ppb, haga las siguientes diluciones en serie: soluciones estándar de 0.1, 1.0 y 5.0 ppb en ácido nítrico al 3.5%.
- Usando el stock 0.1, haga las siguientes diluciones en serie: soluciones estándar de 0.001, 0.005 y 0.01 ppb en ácido nítrico al 3.5%.
- Preparar el instrumento ICPMS (véase el Tabla de Materiales) para el análisis de muestras, según se indica a continuación:
- Antes de arrancar el instrumento, asegúrese de que la válvula de gas argón esté abierta, que todos los tubos estén bien conectados y que el ácido nítrico limpio al 5% esté abierto para enjuagar los tubos y la cristalería entre los análisis de muestras.
- Verifique el estado de la antorcha y los conos, y asegúrese de que la caja de la antorcha esté bien cerrada y que el tubo de drenaje de la cámara de pulverización esté conectado correctamente a la peribomba.
- Abra el software (consulte la Tabla de materiales).
- Compruebe las lecturas de vacío y asegúrese de que todas las bombas turbo funcionen al 100%.
- Haga clic en INICIAR en la ventana Estado del sistema de control de plasma para iniciar la secuencia de inicio, encender la bomba de plasma, el enfriador de plasma, purgar el nebulizador y encender el plasma. Espere a que el plasma esté encendido y estable cuando la ventana de estado indique que la secuencia de inicio está completa. En este punto, observe los puntos verdes en la ventana Estado del sistema que indican que todas las fuentes de alimentación están encendidas.
- En la barra de menús, haga clic en Control | muestreador automático en el menú desplegable. Introduzca la posición del bastidor del muestreador automático para el tubo que contiene un 5% de ácido nítrico. Permita que el ácido entre en el plasma.
- En la barra de menús, haga clic en Escanear | Imán en el menú desplegable. En la ventana MagnetScan , escriba 115 en la posición de masa del marcador y haga clic en Entrar. Permita que el imán escanee a través del rango de masa durante 115pulgadas (114.6083 a 115.3749) durante 30 minutos mientras el instrumento se calienta.
- Después de 30 minutos, utilice el control de muestreo automático para pasar a la posición de una solución de ajuste multielemento de 1 ppb. Aspire la solución de afinación y ajuste el instrumento para optimizar la lectura de la señal. Ajuste la posición de la antorcha (X, Y, Z) de modo que la antorcha esté alineada con el centro de los conos y el caudal del nebulizador (~ 30 psi) en la ventana de control de plasma . Realice los ajustes necesarios en la ventana Sintonización de óptica de iones para la fuente, el detector y el analizador.
- Una vez que se haya optimizado la lectura de la señal (~ 1.2 × 106 recuentos / s para 1 ppb en 115 in), haga clic en Detener en la ventana Magnet Scan .
- Haga clic en Calibrar imán y seleccione Baja resolución en la ventana emergente.
- Haga clic en Aceptar y abra el archivo "Calibración de masa (baja resolución).smc" para calibrar el imán.
NOTA: La calibración del imán medirá los recuentos / s y se ajustará a una curva a través del siguiente rango de masa: 7Li a 238U. - Haz clic en Guardar | Se utiliza para aplicar la calibración del imán actual a los análisis. Si mide muestras desconocidas con un amplio rango de concentraciones, realice una calibración del detector para comparar las señales de recuento de pulsos iónicos a bajas concentraciones con las señales de iones atenuadas producidas a concentraciones más altas. Analice las muestras una vez que se completen el ajuste y la calibración.
- En la barra de menú, haga clic en Adquisición de datos.
- Haga clic en Configuración del método en el menú desplegable. Utilice un método existente proporcionado por el fabricante o cree un método basado en los elementos de interés. Si es necesario, ajuste el modo de análisis, el tiempo de permanencia, el retardo del interruptor, el número de barridos/ciclos, la resolución, el modo de detección y la masa de estacionamiento para la configuración del deflector.
- Haga clic en Guardar para registrar la configuración del método. Optimizar los parámetros para cada metal e isótopo. Consulte la Tabla 2 para conocer los parámetros de operación específicos utilizados en este estudio.
- En la barra de menú, haga clic en Adquisición de datos.
- Haga clic en Ejecución por lotes en el menú desplegable. Alternativamente, haga clic en el icono BATCH debajo de la barra de menú. Importe los parámetros de lote desde una hoja de cálculo o cree una secuencia en la ventana Ejecución por lotes . Introduzca el tipo de muestra, la posición del bastidor del muestreador automático, el tiempo de transferencia, el tiempo de lavado, las réplicas, el ID de muestra y el archivo de método.
- Organice el lote en el siguiente orden: soluciones estándar para la curva de calibración (0.001-10 ppb Pt o Ru), seguidas de un estándar de control de calidad, luego muestras desconocidas.
NOTA: Las soluciones estándar se miden como recuentos/s en el ICPMS, y se ajusta una regresión lineal a través de los estándares con una desviación estándar relativa (DSR) > 0,999. Las incógnitas también se miden como recuentos/s y se resuelven para la concentración en ppb utilizando la regresión lineal de la curva de calibración, y = mx + b. El procesamiento de datos también se puede completar utilizando el software al que se hace referencia. - Monitoree la deriva del instrumento y la reproducibilidad de la muestra incluyendo un estándar de control de calidad de 0.5 ppb cada 5-10 muestras.
NOTA: Los estándares de control de calidad adecuados deben ser un material de referencia estándar certificado diferente del estándar utilizado en la curva de calibración.
| Vatios | Poder | Acta |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabla 1: Protocolo de digestión por microondas para la masa de tejido larvario. Las muestras larvales de pez cebra se digirieron en 0,25 ml de ácido nítrico. Esta tabla ha sido modificada de 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Estos resultados han sido publicados previamente24. Se realizaron estudios de captación de tejidos con exposiciones transmitidas por el agua de cisplatino y un nuevo compuesto anticancerígeno a base de Ru, PMC79. La letalidad y el retraso en la eclosión se evaluaron para las concentraciones nominales de cisplatino 0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 mg/L de cisplatino. La acumulación de Pt en el tejido del organismo se determinó mediante el análisis del ICPMS, y el tejido del organismo contenía dosis respectivas de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 y 461,9 ng (Pt) por organismo (Figura 3).. No se evaluó la determinación analítica de las concentraciones nominales de cisplatino, dada la estabilidad conocida del cisplatino.
Se observó un retraso en la eclosión en todas las concentraciones de cisplatino. Se realizaron experimentos adicionales para concentraciones de Pt con y sin decorotinación manual. Después de la decorionación, los coriones se recolectaron y analizaron para Pt por separado. Las dosis no letales de cisplatino utilizadas para estudios de decorolinación determinaron que el 93-96% de la dosis total administrada de cisplatino se había acumulado en el corion con la dosis restante dentro del tejido larvario (Figura 4).
Las larvas de pez cebra estuvieron expuestas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg/L de PMC79. Estas dosis se seleccionaron determinando los derivados de un IC50, como se describió anteriormente16. Estas concentraciones se determinaron analíticamente para contener 0, 0,17, 0,44, 0,66 y 0,76 mg/L de Ru. A diferencia de la curva dosis-respuesta de cisplatino, no se observó un retraso en la eclosión en larvas expuestas a PMC79. Los coriones no se incluyeron en el análisis de rutenio, ya que se degradaron naturalmente antes de la recolección de larvas. Los investigadores pueden incluir el análisis de corion sin eclosión retardada mediante la deselección y recolección de coriones a 24 dpf. La masa de metal dentro de los tejidos larvales analizados en cada concentración fue de 0,19, 0,41 y 0,68 ng (Ru) por larva (Figura 5). En la Tabla 3 se puede encontrar un resumen de los criterios de valoración toxicológicos, incluidas las concentraciones y/o dosis letales para el50% de la población (LC50/LD 50), las concentraciones efectivas o las dosis para el50% de las poblaciones (EC50/ED 50) y el nivel más bajo de efectos adversos observados (LOAEL).
| Cisplatino | PMC79 | |||||
| Nominal (mg/L) | μM | Pt (ng) / organismo | Ru analítico (mg/L) | μM | Ru (ng) / organismo | |
| LC50/LD50 | 31 (IC del 95%: 20,5-34,0) | 158 (IC del 95%: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (IC del 95%: 0,43-1,20) | 7,8 (IC del 95%: 4,2-11,8) | NA |
| CE50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| LOAEL | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0,19 (± 0,05) |
Tabla 3: Determinación de la captación de solución y metalofarmacia asociada a criterios de valoración toxicológicos. LD50 se determinó mediante análisis equivalentes metálicos de Pt y Ru para cisplatino y PMC79, respectivamente. Las concentraciones de LC50 para PMC79 se determinaron analíticamente. Sin embargo, no se realizó la determinación analítica de las concentraciones nominales de cisplatino; dada la estabilidad conocida del cisplatino en solución, se asumió que las concentraciones nominales y medidas en solución serían equivalentes. El criterio de valoración de eclosión retardada para la exposición al cisplatino se evaluó en términos de ED50 y LOAEL. Las concentraciones de LOAEL de PMC79 se determinaron analíticamente. El LOAEL incluyó lesiones como hemorragia a lo largo de la vena caudal y la arteria de la cola, curvatura espinal y edema del saco vitelino. Todos los intervalos de confianza del 95% se calcularon mediante el método de Litchfield Wilcoxon. Esta tabla ha sido modificada de 24. Abreviaturas: IC = intervalo de confianza; LC50 = Concentración letal para el 50% de la población; DL50 = Dosis letal para el 50% de la población; CE50 = Concentración efectiva para el 50% de la población; LOAEL = nivel más bajo de efectos adversos observados.
Figura 1: Protocolo dosis-respuesta del pez cebra. Este protocolo utiliza un enfoque modificado adaptado del TJE de la OCDE. Hecho con Biorender. Abreviatura: OCDE = Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos; FET = toxicidad aguda del embrión de pescado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Digestión tisular y evaluación del ICPMS. El protocolo de digestión es eficaz para digerir una muestra compuesta de larvas de pez cebra. Abreviatura: ICPMS = espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. Creado con Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Dosis-respuesta al cisplatino. (A) Porcentaje medio de eclosión retardada a 5 dpf correlacionado con los equivalentes medios de Pt determinados por organismo. (B) Porcentaje de letalidad media a 5 dpf correlacionada con los equivalentes medios de Pt por organismo. Porcentaje significa: N = 40 por dosis. Pt (ng) por organismo: >4 muestras compuestas por dosis. Se realizaron dos réplicas experimentales, cuyos rangos se muestran. Esta cifra se ha modificado de 24. Abreviatura: dpf = días después de la fertilización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de Pt (ng) presente en las larvas y el corion después de la exposición a 7,5 o 15 mg/L. Compuesto >3 larvas o coriones por muestra; de izquierda a derecha N = 13, 10, 10 y 11. Las barras de error representan la desviación estándar. La prueba de suma de rango de Mann-Whitney P < 0,001 entre larvas y corion para ambas dosis. Esta cifra se ha modificado de 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Dosis-respuesta PMC79. (A) La letalidad media porcentual se correlacionó con los equivalentes medios de Ru determinados analíticamente en solución (mg/L). (B) El porcentaje de letalidad media a los 5 días después de la fertilización del mismo experimento se correlacionó con los equivalentes medios de Ru por larva. Letalidad: N = 40 por dosis. Ru (mg/L): N = 6 muestras compuestas por dosis. Ru (ng) por larva >4 muestras compuestas por dosis. Se realizaron dos réplicas experimentales, cuyos rangos se muestran. Esta cifra se ha modificado de 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tiempo de permanencia por pico | 4 ms |
| Retardo/Pico del interruptor (x10micros) | 2 |
| Número de barridos | 350 |
| Número de ciclos | 1 |
| Resolución de instrumentos | 300 |
| Modo de detección | Atenuado, salto deflector |
| Misa del Parque | 98.90594 |
| Elemento (isótopos) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tabla 2: Parámetros del método ICPMS. Parámetros para el análisis de isótopos Pt y Ru para determinar las concentraciones tisulares de cisplatino y PMC79, respectivamente. Sr se incluyó para monitorear las interferencias isobáricas asociadas con la composición del agua del tanque. Esta tabla ha sido modificada de 24. ICPMS = espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo descrito aquí se ha implementado para determinar la administración y la absorción de medicamentos contra el cáncer a base de metal que contienen Pt o Ru. Aunque estos métodos ya han sido publicados, este protocolo discute consideraciones y detalles importantes para adaptar esta metodología para una variedad de compuestos. El protocolo de la OCDE junto con la digestión tisular y el análisis ICPMS nos permitió determinar que PMC79 era más potente que el cisplatino y dio lugar a una acumulación de tejido dispar, lo que sugiere mecanismos separados. Además, debido a que se cuantificó la dosis administrada de cisplatino, los resultados dosis-respuesta se extrapolaron a las poblaciones de pacientes. Las dosis subletales (p. ej., LOAEL) fueron comparables a las concentraciones de dosificación intravenosa en pacientes24.
Aunque este método puede aplicarse a un amplio espectro de metales y compuestos a base de metales, se debe tener en cuenta una investigación cuidadosa de las propiedades fisicoquímicas del analito. Los compuestos a base de metal pueden ser muy difíciles de disolver, y se pueden usar varios vehículos para evitar esto. Es posible que las concentraciones de vehículos, como el DMSO, deban estar en concentraciones más altas que las recomendadas en el protocolo de la OCDE. Como tal, es importante mantener una dosis no tóxica vigilando de cerca el desarrollo de los controles; balancear continuamente los embriones durante la exposición mitiga la precipitación. Además, los compuestos organometálicos pueden no ser estables en solución acuosa. Si se desconoce el proceso de degradación, se pueden considerar estudios que impliquen una renovación de la solución de 24 h o compararlos con las curvas de dosis-respuesta sin renovación.
Se recomienda seguir la Prueba de Toxicidad Embrionaria Aguda (FET) de Peces de la OCDE Número 23621. Sin embargo, se pueden hacer modificaciones para adaptarse a propósitos específicos. Los envases de vidrio evitan confundir variables toxicológicas, como el plástico y los plastificantes, y no adsorben los metales con tanta fuerza, lo que eliminaría los analitos del agua del huevo. Para los compuestos que se fotodegradan, como el cisplatino, puede ser beneficioso realizar la exposición sin un ciclo de luz.
Existe mucha discusión en la literatura sobre la necesidad de decorionación en estudios dosis-respuesta de pez cebra 25,26,27. Los argumentos a favor de la decorolinación a 24 hpf sugieren que el corion limita la permeabilidad de los compuestos, generando así resultados falsos negativos o curvas dosis-respuesta aumentadas. Aunque estos puntos tienen mérito, la realización de estudios sin decoroción puede proporcionar una visión mecanicista. Estos estudios sugieren que el cisplatino se acumula en el corion de los embriones debido a su actividad alquilante (Figura 2). Los aductos resultantes refuerzan la estructura, lo que resulta en un retraso en la eclosión. Sin embargo, PMC79 y otros medicamentos contra el cáncer basados en Ru no causaron este fenómeno27. Aunque muchos quimioterapéuticos promulgan su actividad anticancerígena por alquilación, la falta de eclosión retardada después de la exposición a PMC79 indicó un mecanismo dispar. Los estudios con o sin decororonación deben considerarse cuidadosamente o realizarse en paralelo.
La digestión tisular aguas abajo y el análisis de ICPMS deben considerarse continuamente. Se sugiere evitar el uso de reactivos que puedan causar interferencias isobáricas e implementar métodos alternativos. Los reactivos utilizados durante los estudios de dosis-respuesta pueden afectar o reaccionar con el ácido nítrico y su potencial oxidante o contribuir a las interferencias isobáricas. Se descubrió que la solución salina utilizada para hacer agua de huevo generaba óxidos de estroncio (Sr), que se superponían con un isótopo específico de Ru24. Reducir las concentraciones de sal o limpiar cuidadosamente las larvas puede mejorar este problema. Por estas razones, se sugiere evitar el azul de metileno antimicrobiano o el agente eutanásico, la tricaína. En su lugar, autoclave y posteriormente airear el agua del huevo para eliminar los microbios o sacrificar las larvas mediante un enfriamiento rápido. Es importante en este paso lograr curvas estándar isotópicas lineales con interferencias isobáricas mínimas para el analito de interés.
Una limitación importante de este protocolo es que los compuestos organometálicos se oxidarán de tal manera que solo quede el metal. Como tal, no se pueden realizar estudios de metabolismo. Aunque el protocolo puede considerarse de rendimiento medio, la porción dosis-respuesta puede acelerarse con la ayuda de sistemas automáticos de administración de productos químicos e imágenes. Este protocolo es una metodología incipiente que puede modificarse y refinarse para un amplio espectro de compuestos metálicos y metálicos para estudios farmacológicos y toxicocinéticos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de intereses que puedan ser revelados por ninguno de los autores.
Acknowledgments
Financiación: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Además, Brittany Karas cuenta con el apoyo de la subvención de capacitación T32NS115700 de NINDS, NIH. Los autores reconocen a Andreia Valente y a la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) para el suministro de PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
