Summary
Den ökade frekvensen av farmako- och toxikokinetiska analyser av metaller och metallbaserade föreningar i zebrafiskar kan vara fördelaktig för miljö- och kliniska översättningsstudier. Begränsningen av okänt vattenburet exponeringsupptag övervanns genom att utföra spårmetallanalys på smält zebrafiskvävnad med induktivt kopplad plasmamasspektrometri.
Abstract
Metaller och metallbaserade föreningar omfattar multifarious farmakoaktiva och toxikologiska xenobiotika. Från tungmetalltoxicitet till kemoterapeutik har toxikokinetiken hos dessa föreningar både historisk och modern relevans. Zebrafisk har blivit en attraktiv modellorganism för att belysa farmako- och toxikokinetik i miljöexponerings- och kliniska översättningsstudier. Även om zebrafiskstudier har fördelen att de har högre genomströmning än gnagaremodeller, finns det flera betydande begränsningar för modellen.
En sådan begränsning är inneboende i den vattenburna doseringsregimen. Vattenkoncentrationer från dessa studier kan inte extrapoleras för att ge tillförlitliga interna doser. Direkta mätningar av de metallbaserade föreningarna möjliggör en bättre korrelation med föreningsrelaterade molekylära och biologiska svar. För att övervinna denna begränsning för metaller och metallbaserade föreningar utvecklades en teknik för att smälta zebrafisklarvvävnad efter exponering och kvantifiera metallkoncentrationer i vävnadsprover genom induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICPMS).
ICPMS-metoder användes för att bestämma metallkoncentrationerna av platina (Pt) från cisplatin och rutenium (Ru) från flera nya Ru-baserade kemoterapeutika i zebrafiskvävnad. Dessutom skilde detta protokoll koncentrationer av Pt som var sekvestrerade i larvens korion jämfört med zebrafiskvävnaden. Dessa resultat indikerar att denna metod kan tillämpas för att kvantitera metalldosen som finns i larvvävnader. Vidare kan denna metod justeras för att identifiera specifika metaller eller metallbaserade föreningar i ett brett spektrum av exponerings- och doseringsstudier.
Introduction
Metaller och metallbaserade föreningar fortsätter att ha farmakologisk och toxikologisk relevans. Förekomsten av tungmetallexponering och dess inverkan på hälsan har exponentiellt ökat den vetenskapliga undersökningen sedan 1960-talet och nådde en all-time high 2021. Koncentrationerna av tungmetaller i dricksvatten, luftföroreningar och yrkesmässig exponering överskrider lagstadgade gränser över hela världen och är fortfarande ett problem för arsenik, kadmium, kvicksilver, krom, bly och andra metaller. Nya metoder för att kvantifiera miljöexponering och analysera patologisk utveckling fortsätter att vara i hög efterfrågan 1,2,3.
Omvänt har det medicinska området utnyttjat de fysiokemiska egenskaperna hos olika metaller för klinisk behandling. Metallbaserade läkemedel eller metallodrugs har en rik historia av medicinska ändamål och har visat aktivitet mot en rad sjukdomar, med högsta framgång som kemoterapeutik4. Den mest kända av metallodrugs, cisplatin, är ett Pt-baserat läkemedel mot cancer som av Världshälsoorganisationen (WHO) anses vara ett av världens viktigaste läkemedel5. År 2010 hade cisplatin och dess Pt-derivat upp till 90% framgångsgrad i flera cancerformer och användes i cirka 50% av kemoterapiregimerna 6,7,8. Även om Pt-baserade kemoterapeutika har haft obestridlig framgång, har den dosbegränsande toxiciteten satt igång undersökningar av alternativa metallbaserade läkemedel med raffinerad biologisk leverans och aktivitet. Av dessa alternativ har Ru-baserade föreningar blivit de mest populära 9,10,11,12.
Nya modeller och metoder krävs för att hålla jämna steg med behovet av metallfarmako- och toxikokinetiska studier. Zebrafiskmodellen ligger i skärningspunkten mellan komplexitet och genomströmning, eftersom det är ett ryggradsdjur med hög fecunditet med 70% bevarad genhomologi13. Denna modell har varit en tillgång inom farmakologi och toxikologi, med omfattande screeningar för olika föreningar för blyupptäckt, målidentifiering och mekanistisk aktivitet 14,15,16,17. Screening av kemikalier med hög genomströmning är dock vanligtvis beroende av vattenburna exponeringar. Med tanke på att upptaget kan variera baserat på de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos föreningen i lösning (dvs. fotonedbrytelse, löslighet) kan detta vara en stor begränsning av korrelerande dosleverans och respons.
För att övervinna denna begränsning för jämförelse av dos med högre ryggradsdjur utformades en metod för att analysera spårmetallkoncentrationer i zebrafisklarvvävnad. Här utvärderades dos-responskurvor för dödliga och subletala effektmått för cisplatin och nya Ru-baserade cancerföreningar. Dödlighet och fördröjd kläckning utvärderades för nominella koncentrationer av 0, 3,75, 7,5, 15, 30 och 60 mg/l cisplatin. Pt-ackumulering i organismvävnad bestämdes genom ICPMS-analys, och organismens upptag av respektive doser var 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 och 461,9 ng (Pt) per organism. Dessutom utsattes zebrafisklarver för 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/l PMC79. Dessa koncentrationer bestämdes analytiskt för att innehålla 0, 0,17, 0,44, 0,66 och 0,76 mg/l Ru. Detta protokoll möjliggjorde också särskiljande av koncentrationer av Pt sekvestrerade i larvernas korion jämfört med zebrafiskvävnaden. Denna metod kunde ge tillförlitliga, robusta data för jämförelser av farmako- och toxikokinetisk aktivitet mellan en väletablerad kemoterapeutisk och en ny substans. Denna metod kan appliceras på ett brett spektrum av metaller och metallbaserade föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB-stammen zebrafisk (Danio rerio) användes för alla experiment (se materialförteckningen), och djurhållningsprotokollet (# 08-025) godkändes av Rutgers University Animal Care and Facilities Committee.
1. Zebrafiskhållning
- Ras och behåll zebrafisken i ett recirkulerande vattenlevande livsmiljösystem på en 14 h ljus: 10 h mörk cykel.
- Rena kommunalt kranvatten genom sand- och kolfiltrering för att få fisksystemvatten. Håll vattensystemets vatten vid 28 °C, <0,05 ppm nitrit, <0,2 ppm ammoniak och pH mellan 7,2 och 7,7.
- Foder zebrafisken en diet av kläckta Artemia-cystor, saltlake räkor och fiskdietflingmat.
2. Zebrafiskens dos-responsprotokoll (Figur 1)
- Förbered zebrafiskens äggvattenlösning, antingen E3-medium eller äggvatten tillverkat av havssalt i en koncentration av 60 μg/ml upplöst i avjoniserat vatten18. Undvik användning av metylenblått.
OBS: Genom ICPMS identifierades isobar interferens av zebrafiskäggvatten för strontiumoxider, som överlappade med en isotop av rutenium. Noggrann sköljning av larverna före nedströms analys förbättrade detta problem. E3-medium kan vara ett enklare val för vissa på grund av den proprietära sminken av kommersiella havssalter. - Lös upp metall- eller metallbaserade föreningar i E3 eller äggvatten. Virvel för att bryta upp allt aggregerat material och homogenisera lösningen.
OBS: I experimentet som beskrivs nedan löstes PMC79 och cisplatin vid maximala koncentrationer av 12,4 mg / L och 60 mg / L med en maximal koncentration av 0,5% dimetylsulfoxid (DMSO) för att motstå utfällning.- Späd tungmetall eller metallbaserade föreningar, såsom PMC79 och cisplatin, med E3 eller äggvatten, bereda minst 5 koncentrationsdoser.
- Börja med låga koncentrationer av stamlösningar i ren fordons (dvs. DMSO), späd sedan med E3 eller äggvatten. Tänk noga på de slutliga fordonskoncentrationerna.
OBS: Vissa metallbaserade föreningar, såsom cisplatin, bryts ned snabbt, och deras lösningar måste göras färska dagligen. VARNING: Hantera tungmetaller och kemoterapeutika med försiktighet. Granska det specifika säkerhetsdatabladet (MSDS) för den metall som är av intresse. Cisplatin kan orsaka ögon- och hudirritation, vara dödlig vid förtäring och kan orsaka toxicitet i njurar, blod, blodbildande organ och fostervävnad. Undvik att andas in ångor och kontakt med ögon, hud och kläder. Använd ogenomträngliga handskar och kläder och skyddsglasögon eller skyddsglasögon19.
- Börja med låga koncentrationer av stamlösningar i ren fordons (dvs. DMSO), späd sedan med E3 eller äggvatten. Tänk noga på de slutliga fordonskoncentrationerna.
- Späd tungmetall eller metallbaserade föreningar, såsom PMC79 och cisplatin, med E3 eller äggvatten, bereda minst 5 koncentrationsdoser.
- Sätt upp avelstankar eftermiddagen före experimentet i det ideala förhållandet mellan 2 honor och 1 hane med en avdelare på plats mellan könen20.
- Dra i avdelaren när lamporna tänds för morgoncykeln.
- Låt zebrafisken uppfödas.
OBS: Hur lång tid det är för avel beror på det inledande exponeringssteg som krävs. För 3 h eftergödsel, tillåt avel i ca 2 timmar. Äggen når 3 hpf efter rengöring och segregering av ägg. - Flytta avelsfisken till en ren tank.
- Samla äggen genom att hälla tankvattnet genom en sil.
- Vänd silen över en petriskål och använd en sprutflaska fylld med E3 eller äggvatten för att skölja äggen i skålen.
- Rengör skålen med mat och avfall före experimentell användning.
- Randomisera cirka tjugo 3 hpf embryon per dos till enskilda glasflaskor med hjälp av en överföringspipett och en liten mängd vatten.
- När alla embryon är i injektionsflaskor, ta bort allt äggvatten och ersätt med tillräckligt med doslösning så att det finns ungefär 1 tum lösning över äggets höjd.
OBS: Nödvändigheten av dechorionation bör noggrant övervägas. Mer information finns i diskussionsavsnittet. - Observera embryon dagligen för lesioner eller dödlighet. På grund av den snabba utvecklingen av embryonal zebrafisk, få dagliga bilder med hjälp av något ljusfältmikroskop / kamerainställning för att identifiera mindre skador mellan dagarna.
- Vid avslutande av dossvaret (4-5 dagar efter befruktning [dpf], enligt Organisationens ekonomiska samarbete och utveckling [OECD] riktlinje21), kombinera 3-5 larver före avlivning för sammansatt provtagning. Avliva genom snabb kylning genom snäppfrysning i flytande kväve.
OBS: Eutanasi genom en överdos av MS-222 eller trikainmetansulfonat kan potentiellt störa ICPMS-analysen nedströms. Snabbkylningsmetoder för eutanasi uppmuntras för detta protokoll för att minska risken för störningar. - Utför 3 tvättar av vävnad med vatten med hög renhet (såsom omvänd osmos) för att avlägsna överskottsföreningen från vävnadens utsida.
- Flytta proverna till syra- och mikrovågssäkra 15 ml polypropencentrifugrör. Var försiktig med att ta bort allt överskott av vatten eftersom eventuell kvarvarande vätska kan späda salpetersyran och därför syrans oxidationspotential under vävnadsnedbrytning.
OBS: Vid denna tidpunkt kan vävnad lagras vid -20 °C tills vidare analys. För naturligt rikliga metaller kommer rengöring av rören i ett 5% salpetersyrabad före användning att förbättra omgivande bakgrundsnivåer.
3. Vävnadsförtunning och ICPMS-utvärdering (figur 2)
- Tillsätt cirka 0,25 ml till 15 ml polypropencentrifugrör för upp till 10 larver (~ 100 μg) salpetersyra med hög renhet (69%). Ultraljud i 1 timme för att försmälta proverna med följande inställningar: ultraljud bad utgång: 85 W; 42 kHz ± 6%; temperaturområde: 19-27 ° C.
VARNING: Använd hörselskydd under ultraljudsbehandling. Salpetersyra orsakar allvarliga luftvägar, ögon- och hudbrännskador. Använd full skyddsutrustning och arbeta i dragskåpan eller på platser med tillräcklig ventilation. Det kan vara brandfarligt med andra material. Salpetersyra bör hanteras uteslutande i en dragskåpa för att förhindra exponering för ångor som produceras under matsmältningen. Andas inte in eller inta.- Utför korta cykler av vävnadsförtunning (5 minuters intervall) i en syrasäker mikrovågskokare tills all vävnad oxideras synligt (dvs enhetlig, klargul lösning).
OBS: Mikrovågsprotokollet i tabell 1 rekommenderas att utföras tre gånger och inkluderar ett 5 minuters nedkylningsintervall mellan varje uppvärmningssteg. - Övervaka rörens integritet noggrant för att undvika bristning och genomföra korta spinn i centrifugen (313 × g i 1 min) mellan cyklerna för att flytta sur kondens till botten av röret.
OBS: Om vävnaden är svår att smälta (särskilt korioner) kan 30% väteperoxid med hög renhet användas efter syraförtunning. Använd väteperoxiden (6,75 ml) för att späda syrakoncentrationen till 3,5% och låt proverna sitta över natten i en draghuva. Väteperoxid sönderdelas tillH2Ooch är lämplig för ICPMS-analys. Vidare kan alternativa metaller lösas bättre i saltsyra eller en blandning av saltsyra och salpetersyra (dvs aqua regia). Väteperoxid är skadligt vid förtäring och orsakar allvarliga ögonskador. Använd hud- och ögonskydd22,23.
- Utför korta cykler av vävnadsförtunning (5 minuters intervall) i en syrasäker mikrovågskokare tills all vävnad oxideras synligt (dvs enhetlig, klargul lösning).
- När vävnaden är synligt oxiderad (dvs enhetlig, klargul lösning), späd proverna i en dragskåpa till 3,5% salpetersyra med 6,75 ml vatten med hög renhet och virvel för att blanda noggrant.
OBS: Vid denna tidpunkt kan proverna förvaras vid rumstemperatur. Detta steg är onödigt om väteperoxid tillsattes för att underlätta matsmältningen i steg 3.1. - Utför en matrismatchad, 7-punkts kalibreringskurva (koncentrationsintervall på 0,001-10 ppb) med hjälp av en certifierad elementär standard (dvs. Pt eller Ru, beroende på analysen) med metallen av intresse och optimala isotoper för att ta hänsyn till eventuella isobariska störningar.
- Använd en lagerkoncentration av den vattenhaltiga, certifierade elementstandarden (Ru, Pt = 1000 ppb), ta en 0,1 ml alikvot och pipett i ett nytt 15 ml centrifugrör. Späd med 3,5% salpetersyra till en slutlig volym av 10 ml för att producera en 10 ppb standardlösning.
- Använd 10 ppb-beståndet och gör följande seriella utspädningar: 0,1, 1,0 och 5,0 ppb standardlösningar i 3,5% salpetersyra.
- Använd 0,1-beståndet och gör följande seriella utspädningar: 0,001, 0,005 och 0,01 ppb standardlösningar i 3,5% salpetersyra.
- Förbereda ICPMS-instrumentet (se Materialtabell) för stickprovsanalys enligt följande:
- Innan du startar instrumentet, se till att Argon-gasventilen är öppen, att alla slangar är ordentligt anslutna och ren 5% salpetersyra är öppen för sköljning av slangar och glas mellan provanalyserna.
- Kontrollera facklans och konernas skick och se till att fackelboxen är ordentligt låst och att sprutkammarens dräneringsrör är ordentligt anslutet till peripumpen.
- Öppna programvaran (se Materialförteckningen).
- Kontrollera vakuumavläsningarna och se till att alla turbopumpar går med 100%.
- Klicka på START i fönstret Status för plasmakontrollsystem för att initiera startsekvensen, slå på plasmapumpen, plasmakylaren, rensa nebulisatorn och tända plasman. Vänta tills plasman är tänd och stabil när statusfönstret indikerar att startsekvensen är klar. Observera nu de gröna prickarna i fönstret Systemtillstånd som indikerar att alla nätaggregat är på.
- Klicka på Control | autosampler i rullgardinsmenyn i menyraden. Ange autosampler rackpositionen för röret som innehåller 5% salpetersyra. Låt syran komma in i plasman.
- Klicka på Skannar | i menyraden Magnet i rullgardinsmenyn. I fönstret MagnetScan skriver du 115 i markeringsmasspositionen och klickar på enter. Låt magneten skanna över massområdet i 115In (114.6083 till 115.3749) i 30 minuter medan instrumentet värms upp.
- Efter 30 minuter använder du autosamplerkontrollen för att flytta till positionen för en 1 ppb multielementjusteringslösning. Aspirera stämningslösningen och ställ in instrumentet för att optimera signalavläsningen. Justera facklans läge (X, Y, Z) så att brännaren är i linje med mitten av konerna och nebulisatorns flödeshastighet (~ 30 psi) i plasmakontrollfönstret . Gör nödvändiga justeringar i fönstret Ion Optics Tuning för Source, Detector och Analyzer.
- När signalavläsningen är optimerad (~ 1,2 × 106 räkningar / s för 1 ppb på 115in), klicka på Stoppa i magnetskanningsfönstret .
- Klicka på Kalibrera magnet och välj Låg upplösning i popup-fönstret.
- Klicka på OK och öppna filen "Masskalibrering (låg upplösning).smc" för att kalibrera magneten.
OBS: Magnetkalibreringen mäter antalet / s och passar en kurva genom följande massområde: 7Li till 238U. - Klicka på Spara | Används för att tillämpa den aktuella magnetkalibreringen på analyserna. Om du mäter okända prover med ett stort antal koncentrationer, utför en detektorkalibrering för att jämföra jonpulsräkningssignaler vid låga koncentrationer med dämpade jonsignaler som produceras vid högre koncentrationer. Analysera proverna när justeringen och kalibreringen är klar.
- Klicka på Datainsamling i menyraden.
- Klicka på Metodinställning i rullgardinsmenyn. Använd en befintlig metod som tillhandahålls av tillverkaren, eller skapa en metod baserad på de intressanta elementen. Justera vid behov analysläget, uppehållstiden, brytarfördröjningen, antalet svep/cykler, upplösning, detekteringsläge och parkmassan för deflektorinställningar.
- Klick Save för att spela in metodinställningarna. Optimera parametrarna för varje metall och isotop. Se tabell 2 för de specifika driftsparametrar som används i denna studie.
- Klicka på Datainsamling i menyraden.
- Klicka på Batch Run i rullgardinsmenyn. Alternativt klickar du på BATCH-ikonen under menyraden. Importera batchparametrarna från ett kalkylblad eller skapa en sekvens i fönstret Batchkörning . Ange exempeltyp, autosamplerrackposition, överföringstid, tvätttid, repliker, exempel-ID och metodfil.
- Ordna batchkörningen i följande ordning: standardlösningar för kalibreringskurvan (0,001-10 ppb Pt eller Ru), följt av en kvalitetskontrollstandard, sedan okända prover.
OBS: Standardlösningar mäts som antal/s på ICPMS, och en linjär regression passar genom standarderna med en relativ standardavvikelse (RSD) > 0,999. Okända mäts också som antal/s och löses för koncentration i ppb med hjälp av kalibreringskurvans linjära regression, y = mx + b. Databehandling kan också slutföras med hjälp av den refererade programvaran. - Övervaka instrumentdrift och provreproducerbarhet genom att inkludera en 0,5 ppb kvalitetskontrollstandard var 5-10: e prov.
OBS: Lämpliga kvalitetskontrollstandarder bör vara ett certifierat standardreferensmaterial som skiljer sig från den standard som används i kalibreringskurvan.
| Watt | Kraft | Protokoll |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tabell 1: Mikrovågs matsmältningsprotokoll för larvvävnadsmassa. Zebrafisk larvprover smältes i 0,25 ml salpetersyra. Denna tabell har ändrats från 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa resultat har tidigare publicerats24. Vävnadsupptagningsstudier genomfördes med vattenburna exponeringar av cisplatin och en ny Ru-baserad cancersjukvård, PMC79. Dödlighet och fördröjd kläckning utvärderades för nominella koncentrationer av cisplatin 0, 3,75, 7,5, 15, 30 och 60 mg/l cisplatin. Pt-ackumulering i organismvävnad bestämdes genom ICPMS-analys, och organismvävnad innehöll respektive doser på 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 och 461,9 ng (Pt) per organism (figur 3). Analytisk bestämning av de nominella koncentrationerna för cisplatin bedömdes inte, med tanke på cisplatins kända stabilitet.
Fördröjd kläckning observerades vid alla cisplatinkoncentrationer. Ytterligare experiment utfördes för Pt-koncentrationer med och utan manuell dechorionation. Efter dechorionation samlades korioner in och analyserades för Pt separat. Icke-dödliga doser av cisplatin som användes för dekorioneringsstudier visade att 93-96% av den totala levererade dosen cisplatin hade ackumulerats i korionen med den återstående dosen i larvvävnaden (Figur 4).
Zebrafisklarver utsattes för 0, 3,1, 6,2, 9,2, 12,4 mg/l PMC79. Dessa doser valdes genom att bestämma derivaten av en IC50, som beskrivits tidigare16. Dessa koncentrationer bestämdes analytiskt för att innehålla 0, 0,17, 0,44, 0,66 och 0,76 mg/l Ru. Till skillnad från cisplatin-dos-responskurvan observerades inte fördröjd kläckning hos PMC79-exponerade larver. Chorions ingick inte i Ruthenium-analysen eftersom de naturligt försämrades före larvinsamling. Forskare kan inkludera korionanalys utan fördröjd kläckning genom att dechorionera och samla korioner vid 24 dpf. Massan av metall i larvvävnader som analyserades vid varje koncentration var 0,19, 0,41 och 0,68 ng (Ru) per larv (figur 5). En sammanfattning av de toxikologiska effektmåtten, inklusive dödliga koncentrationer och/eller doser för 50 % av befolkningen (LC50/LD50), effektiva koncentrationer eller doser för 50 % av populationerna (EC50/ED50) och den lägsta observerade biverkningsnivån (LOAEL) finns i tabell 3.
| Cisplatin | 400.00 | |||||
| Nominell (mg/L) | μM | Pt (ng) / organism | Analytisk Ru (mg / L) | μM | Ru (ng) / organism | |
| LC50/LD50 | 31 (95% CI: 20,5-34,0) | 158 (95% CI: 105-174) | 193 (± 130) | 0,79 (95% CI: 0,43-1,20) | 7,8 (95% CI: 4,2-11,8) | NA |
| (EG) nr 50 | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| LOAEL | 3.75 | 15.3 | 8,7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0,19 (± 0,05) |
Tabell 3: Bestämning av lösnings- och metallodrugupptag i samband med toxikologiska effektmått. LD50 bestämdes genom metallekvivalentanalys av Pt och Ru för cisplatin respektive PMC79. LC50-koncentrationerna för PMC79 bestämdes analytiskt. Analytisk bestämning av nominella cisplatinkoncentrationer utfördes dock inte. Med tanke på den kända stabiliteten hos cisplatin i lösning antogs att nominella och uppmätta koncentrationer i lösning skulle vara ekvivalenta. Det fördröjda kläckningsmåttet för cisplatinexponering utvärderades i termer av ED50 och LOAEL. LOAEL-koncentrationerna av PMC79 bestämdes analytiskt. LOAEL inkluderade lesioner som blödning längs den kaudala venen och svansartären, ryggradskurvatur och äggula sac ödem. Alla 95% konfidensintervall beräknades med Litchfield Wilcoxon-metoden. Denna tabell har ändrats från 24. Förkortningar: CI = konfidensintervall; LC50 = dödlig koncentration för 50% av befolkningen; LD50 = dödlig dos för 50% av befolkningen; EC50 = Effektiv koncentration för 50 % av befolkningen. LOAEL = lägsta observerade biverkningsnivå.
Figur 1: Zebrafiskens dos-responsprotokoll. I detta protokoll används ett modifierat tillvägagångssätt som anpassats från OECD:s FET. Tillverkad med Biorender. Förkortning: OECD = Organisationens ekonomiska samarbete och utveckling; FET = akut toxicitet för fiskembryon. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Vävnadsförtunning och ICPMS-utvärdering. Matsmältningsprotokollet är effektivt för att smälta ett sammansatt prov av zebrafisklarver. Förkortning: ICPMS = induktivt kopplad plasmamasspektrometri. Skapad med Biorender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cisplatin dos-respons. (A) Procentandel genomsnittlig fördröjd kläckning vid 5 dpf korrelerad med medelvärdet pt-ekvivalenter bestämda per organism. B) Procentuell genomsnittlig dödlighet vid 5 dpf korrelerat med medelvärdet för Pt-ekvivalenter per organism. Procent betyder: N = 40 per dos. Pt (ng) per organism: >4 sammansatta prover per dos. Två experimentella replikat genomfördes, vars intervall visas. Denna siffra har ändrats från 24. Förkortning: dpf = dagar efter befruktning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Jämförelse av Pt (ng) som finns i larverna och korionen efter exponering för 7,5 eller 15 mg/l. Sammansatt >3 larver eller ackorder per prov; från vänster till höger N = 13, 10, 10 och 11. Felstaplar representerar standardavvikelse. Mann-Whitney rank-sum test P < 0,001 mellan larver och korion för båda doserna. Denna siffra har ändrats från 24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: PMC79 dos-respons. (A) Procentuell genomsnittlig dödlighet korrelerades med det analytiskt bestämda medelvärdet ru-ekvivalenter i lösning (mg/l). (B) Procentuell genomsnittlig dödlighet vid 5 dagar efter befruktning från samma experiment korrelerades med medelvärdet ru-ekvivalenter per larv. Dödlighet: N = 40 per dos. Ru (mg/L): N = 6 sammansatta prover per dos. Ru (ng) per larv >4 sammansatta prover per dos. Två experimentella replikat genomfördes, vars intervall visas. Denna siffra har ändrats från 24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Uppehållstid per topp | 4 ms |
| Switchfördröjning / topp (x10micros) | 2 |
| Antal svep | 350 |
| Antal cykler | 1 |
| Instrument Resolution | 300 |
| Detekteringsläge | Dämpad, Deflector Jump |
| Parkmässa | 98.90594 |
| Element (isotoper) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tabell 2: Parametrar för ICPMS-metoden. Parametrar för analys av Pt- och Ru-isotoper för att bestämma vävnadskoncentrationer av cisplatin respektive PMC79. Sr ingick för att övervaka isobariska störningar i samband med tankens vattenkomposition. Denna tabell har ändrats från 24. ICPMS = induktivt kopplad plasmamasspektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här har implementerats för att bestämma leverans och upptag av metallbaserade cancerläkemedel som innehåller antingen Pt eller Ru. Även om dessa metoder redan har publicerats, diskuterar detta protokoll viktiga överväganden och detaljer för att anpassa denna metod för en rad föreningar. OECD-protokollet i kombination med vävnadsförtunning och ICPMS-analys gjorde det möjligt för oss att bestämma att PMC79 var mer potent än cisplatin och resulterade i olika vävnadsackumulering, vilket tyder på separata mekanismer. Dessutom, eftersom den levererade dosen cisplatin kvantifierades, extrapolerades dos-responsresultaten till patientpopulationer. Subletala doser (t.ex. LOAEL) var jämförbara med intravenösa doseringskoncentrationer hos patienter24.
Även om denna metod kan tillämpas på ett brett spektrum av metaller och metallbaserade föreningar, måste noggrann undersökning av analytens fysikalisk-kemiska egenskaper beaktas. Metallbaserade föreningar kan vara mycket svåra att lösa upp, och olika fordon kan användas för att undvika detta. Fordonskoncentrationer, såsom DMSO, kan behöva ligga i högre koncentrationer än vad som rekommenderas i OECD-protokollet. Som sådan är det viktigt att upprätthålla en giftfri dos genom att noggrant övervaka utvecklingen av kontroller. kontinuerligt gungande embryon under exponering mildrar nederbörden. Dessutom kan organometalliska föreningar inte vara stabila i vattenlösning. Om nedbrytningsprocessen är okänd kan studier som involverar 24 timmars lösningsförnyelse övervägas eller jämföras med dos-responskurvor utan förnyelse.
Det rekommenderas att följa OECD:s test av akut embryotoxicitet för fisk (FET) nummer 23621. Ändringar kan dock göras för att passa specifika ändamål. Glasbehållare undviker förvirrande toxikologiska variabler, såsom plast och mjukgörare, och adsorberar inte metaller lika starkt, vilket skulle ta bort analyter från äggvattnet. För föreningar som fotonedbryts, såsom cisplatin, kan det vara fördelaktigt att genomföra exponeringen utan en ljuscykel.
Det finns mycket diskussion i litteraturen om behovet av dechorionation i zebrafiskens dos-responsstudier 25,26,27. Argument för dechorionation vid 24 hpf tyder på att korionen begränsar föreningarnas permeabilitet, vilket genererar falskt negativa resultat eller förstärkta dos-responskurvor. Även om dessa punkter har meriter, kan studier utan dechorionation ge mekanistisk insikt. Dessa studier tyder på att cisplatin ackumuleras i embryonernas korion på grund av dess alkylerande aktivitet (Figur 2). De resulterande addukterna förstärker strukturen, vilket resulterar i fördröjd kläckning. PMC79 och andra Ru-baserade läkemedel mot cancer orsakade emellertid inte detta fenomen27. Även om många kemoterapeutika antar sin anticanceraktivitet genom alkylering, indikerade bristen på fördröjd kläckning efter PMC79-exponering en olikartad mekanism. Studier med eller utan dechorionation måste noggrant övervägas eller genomföras parallellt.
Nedströms vävnadsförtunning och ICPMS-analys måste övervägas kontinuerligt. Det föreslås att man undviker att använda reagenser som kan orsaka isobariska störningar och implementera alternativa metoder. Reagenser som används under dos-responsstudierna kan påverka eller reagera med salpetersyran och dess oxidationspotential eller bidra till isobariska störningar. Det upptäcktes att saltlösningen som användes för att göra äggvatten genererade strontiumoxider (Sr), som överlappade med en specifik isotop av Ru24. Att sänka saltkoncentrationerna eller noggrant rengöra larverna kan förbättra denna fråga. Av dessa skäl föreslås att man undviker det antimikrobiella metylenblått eller avlivningsmedlet, trikain. Autoklav och lufta därefter äggvattnet för att avlägsna mikrober eller avliva larverna genom snabb kylning. Det är viktigt vid detta steg att uppnå linjära isotopiska standardkurvor med minimala isobariska störningar för analyten av intresse.
En viktig begränsning av detta protokoll är att organometalliska föreningar kommer att oxideras så att endast metallen förblir. Som sådan kan metabolismstudier inte genomföras. Även om protokollet kan betraktas som medelhög genomströmning, kan dos-responsdelen påskyndas med hjälp av automatiska kemiska leveranssystem och bildbehandling. Detta protokoll är en begynnande metod som kan modifieras och förfinas för ett brett spektrum av metall- och metallbaserade föreningar för farmako- och toxikokinetiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga intressekonflikter som ska avslöjas av någon av författarna.
Acknowledgments
Finansiering: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Dessutom stöds Brittany Karas av utbildningsbidrag T32NS115700 från NINDS, NIH. Författarna erkänner Andreia Valente och den portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) för leverans av PMC79.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
