Summary
ゼブラフィッシュ中の金属および金属ベースの化合物の薬物療法および毒物動態分析の増加率は、環境および臨床翻訳研究に有利であり得る。未知の水媒介曝露取り込みの限界は、誘導結合プラズマ質量分析法を用いて消化されたゼブラフィッシュ組織に対して微量金属分析を行うことによって克服された。
Abstract
金属および金属ベースの化合物は、多種多様な薬物活性および毒物学的生体異物を含む。重金属毒性から化学療法薬まで、これらの化合物の毒性運動薬は歴史的および現代的関連性の両方を有する。ゼブラフィッシュは、環境曝露および臨床翻訳研究における薬物および毒物動態の解明において魅力的なモデル生物となっている。ゼブラフィッシュの研究はげっ歯類モデルよりもスループットが高いという利点がありますが、モデルにはいくつかの重要な制約があります。
そのような制限の1つは、水媒介性投薬レジメンに内在するものである。これらの研究からの水分濃度は、信頼できる内部投与量を提供するために外挿することはできません。金属ベースの化合物の直接測定は、化合物関連の分子および生物学的応答とのより良い相関を可能にする。金属および金属ベースの化合物に対するこの制限を克服するために、曝露後にゼブラフィッシュの幼虫組織を消化し、誘導結合プラズマ質量分析(ICPMS)によって組織サンプル中の金属濃度を定量する技術が開発された。
ICPMS法を用いて、ゼブラフィッシュ組織におけるいくつかの新規Ru系化学療法薬由来のシスプラチンおよびルテニウム(Ru)由来の白金(Pt)の金属濃度を決定した。さらに、このプロトコルは、ゼブラフィッシュ組織と比較して、幼虫の絨毛膜中に隔離されたPtの濃度を区別した。これらの結果は、この方法が幼虫組織中に存在する金属線量を定量するために適用され得ることを示す。さらに、この方法は、広範囲の曝露および投薬研究において特定の金属または金属ベースの化合物を同定するように調整され得る。
Introduction
金属および金属ベースの化合物は、薬理学的および毒物学的関連性を有し続けている。重金属曝露の有病率と健康への影響は、1960年代以来科学的調査を指数関数的に増加させ、2021年には過去最高に達しました。飲料水、大気汚染、職業ばく露中の重金属の濃度は、世界中の規制限界を超えており、ヒ素、カドミウム、水銀、クロム、鉛、その他の金属の問題として残っています。環境曝露を定量化し、病理学的発達を分析するための新規な方法は、引き続き高い需要がある1,2,3。
逆に、医療分野では、様々な金属の生理化学的性質を臨床治療に活用してきました。金属ベースの薬物または金属製剤は、薬用目的の豊富な歴史を有し、様々な疾患に対する活性を示しており、化学療法薬4として最高の成功を収めている。メタロドラッグの中で最も有名なシスプラチンは、世界保健機関(WHO)が世界の必須薬の1つと見なしているPtベースの抗がん剤です5。2010年、シスプラチンおよびそのPt誘導体は、いくつかの癌において最大90%の成功率を有し、化学療法レジメンの約50%で使用された6、7、8。Ptベースの化学療法薬は反論の余地のない成功を収めてきましたが、用量制限の毒性は、洗練された生物学的送達と活性を有する代替金属ベースの薬物の研究を開始しました。これらの代替物のうち、Ru系化合物は、最も普及している9、10、11、12となっている。
金属薬理学的およびトキシコキネティック研究の必要性の速度に追いつくためには、新しいモデルと方法論が必要です。ゼブラフィッシュモデルは複雑さとスループットの交差点にあり、70%の遺伝子相同性を保持した繁殖力の高い脊椎動物である13。このモデルは薬理学および毒物学における資産であり、リード発見、標的同定、および機構的活性のための様々な化合物の広範なスクリーニング14,15,16,17を有する。しかし、化学物質のハイスループットスクリーニングは、通常、水媒介性曝露に依存しています。取り込みが溶液中の化合物の物理化学的特性(すなわち、光分解、溶解性)に基づいて可変であり得ることを考えると、これは用量送達および応答を相関させる大きな制限となり得る。
より高い脊椎動物との用量の比較のためのこの制限を克服するために、ゼブラフィッシュ幼虫組織中の微量金属濃度を分析する方法論が設計された。ここで、致死的および致死的エンドポイントの用量反応曲線を、シスプラチンおよび新規Ruベースの抗癌化合物について評価した。致死性および孵化遅延は、公称濃度0、3.75、7.5、15、30、および60mg/Lシスプラチンについて評価した。生物組織におけるPt蓄積はICPMS分析によって決定され、各用量の生物摂取量は生物当たり0.05、8.7、23.5、59.9、193.2、および461.9ng(Pt)であった。さらに、ゼブラフィッシュの幼虫は0、3.1、6.2、9.2、12.4 mg/LのPMC79に曝露された。これらの濃度は、0、0.17、0.44、0.66、および0.76 mg/LのRuを含むと分析的に決定された。このプロトコルはまた、ゼブラフィッシュ組織と比較して、幼虫の絨毛膜中に隔離されたPtの濃度の区別を可能にした。この方法論は、十分に確立された化学療法と新規化合物との間の薬物および毒物動態活性の比較のための信頼できる堅牢なデータを提供することができた。この方法は、幅広い金属および金属系化合物に適用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB株ゼブラフィッシュ(Danio rerio)はすべての実験に使用され( 材料表を参照)、畜産プロトコル(#08-025)はラトガース大学動物ケア施設委員会によって承認されました。
1. ゼブラフィッシュの飼育
- ゼブラフィッシュを14時間の光:10時間の暗サイクルで再循環する水生生息地システムで繁殖させ、維持する。
- 砂と炭素ろ過によって地方自治体の水道水を浄化し、魚システムの水を得る。水生系の水を 28 °C、亜硝酸塩 <0.05 ppm、アンモニア <0.2 ppm、pH 7.2 ~ 7.7 に維持します。
- ゼブラフィッシュに孵化したアルテミア嚢胞、ブラインエビ、魚の食事フレーク食品の食事を与えます。
2. ゼブラフィッシュ線量反応プロトコール(図1)
- ゼブラフィッシュの卵水溶液、E3培地、またはストック海塩から作られた卵水を60μg/mLの濃度で脱イオン水18に溶解して調製する。メチレンブルーの使用は避けてください。
注:ICPMSを通じて、ゼブラフィッシュの卵水の等圧干渉が、ルテニウムの同位体と重なった酸化ストロンチウムについて同定された。下流分析の前に幼虫を慎重にすすぐと、この問題が改善されました。E3培地は、市販の海塩の独自の構成のために、一部の人にとってはより簡単な選択かもしれません。 - 金属または金属ベースの化合物をE3または卵水に溶解する。渦は、任意の凝集材料を分解し、溶液を均質化します。
注:以下に概説する実験では、PMC79およびシスプラチンを最大濃度12.4mg/Lおよび60mg/Lで溶解し、最大濃度0.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)で沈殿に抵抗した。- PMC79やシスプラチンなどの重金属または金属ベースの化合物をE3または卵水で希釈し、少なくとも5濃度用量を調製する。
- 純粋なビヒクル(すなわち、DMSO)中の低濃度のストック溶液から始めて、次にE3または卵水で希釈する。最終的な車両濃度を慎重に検討してください。
注:シスプラチンなどの特定の金属ベースの化合物は急速に分解するため、その溶液は毎日新鮮にする必要があります。警告: 重金属および化学療法薬は慎重に取り扱ってください。対象金属の特定材料安全データシート(MSDS)を確認してください。 シスプラチン は、眼および皮膚の刺激を引き起こし、飲み込むと致命的であり、腎臓、血液、造血器官、および胎児組織に毒性を引き起こす可能性がある。煙を吸い込んだり、目、皮膚、衣服に触れたりしないでください。不浸透性の手袋と衣服を着用し,安全眼鏡またはゴーグルを着用する 19.
- 純粋なビヒクル(すなわち、DMSO)中の低濃度のストック溶液から始めて、次にE3または卵水で希釈する。最終的な車両濃度を慎重に検討してください。
- PMC79やシスプラチンなどの重金属または金属ベースの化合物をE3または卵水で希釈し、少なくとも5濃度用量を調製する。
- 実験前の午後に、2人の女性と1人の男性の理想的な比率で繁殖タンクを設置し、男女20の間に仕切りを設置しました。
- 朝のサイクルのためにライトが点灯したら、仕切りを引っ張ります。
- ゼブラフィッシュの繁殖を許可します。
注:繁殖のための時間の長さは、必要な初期曝露段階に依存する。受精後3時間の場合、約2時間の繁殖を許可します。卵は卵をきれいにして分離した後、3馬力に達するでしょう。 - 繁殖魚をきれいなタンクに移動します。
- ストレーナーを通してタンクの水を注ぐことによって卵を集める。
- ストレーナーをペトリ皿の上にひっくり返し、E3または卵水で満たされたホヤボトルを使用して卵を皿にすすぎます。
- 実験的使用前に、食品や廃棄物の皿をきれいにしてください。
- 1回あたり約23 hpfの胚を、トランスファーピペットと少量の水を使用して個々のガラスバイアルにランダム化します。
- すべての胚がバイアルに入ったら、すべての卵水を取り除き、卵の高さから約1インチの溶液があるように十分な投与溶液と交換する。
注:脱絨毛の必要性は慎重に考慮する必要があります。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。 - 病変または致死性について毎日胚を観察してください。胚性ゼブラフィッシュの急速な発達のために、日の間の軽微な病変を識別するために、任意の明視野顕微鏡/カメラの設定を使用して毎日の画像を取得します。
- 用量反応の終了時(受精後4〜5日[dpf]、組織経済協力開発[OECD]ガイドライン21による)に、複合サンプリングのために安楽死前に3〜5匹の幼虫を組み合わせる。液体窒素中で急速冷却して安楽死させる。
注:MS-222またはトリカインメタンスルホン酸塩の過剰摂取による安楽死は、下流のICPMS分析に潜在的に干渉する可能性がある。このプロトコルでは、干渉の可能性を減らすために、急冷安楽死法が推奨されています。 - 高純度の水(逆浸透など)で組織を3回洗浄し、組織の外部から過剰な化合物を除去します。
- サンプルを酸性および電子レンジで安全な 15 mL ポリプロピレン製遠沈管に移動します。残りの液体は硝酸を希釈する可能性があるため、 余分な水分をすべて 除去し、したがって、組織分解中の酸の酸化電位を除去するように注意してください。
注:この時点で、組織はさらなる分析まで-20°Cで保存することができます。自然に豊富な金属の場合、使用前に5%硝酸浴でチューブを洗浄すると、周囲のバックグラウンドレベルが改善されます。
3. 組織消化とICPMS評価(図2)
- 15 mL ポリプロピレン製遠沈管に約 0.25 mL を加え、最大 10 匹の幼虫 (約 100 μg) の高純度硝酸 (69%)を飼育します。次の設定を使用してサンプルを事前消化するために1時間超音波処理する:超音波浴出力:85 W;42 kHz ± 6%;温度範囲:19〜27°C。
警告: 超音波処理中は耳の保護具を着用してください。 硝酸は 、深刻な気道を引き起こします, 目, 皮膚の火傷.完全な保護具を着用し、ヒュームフードまたは十分な換気のある場所で作業してください。それは他の材料と可燃性であり得る。硝酸は、消化中に生成される蒸気への曝露を防ぐために、ヒュームフード内で排他的に取り扱うべきである。吸入または摂取しないでください。- すべての組織が目に見えて酸化されるまで(すなわち、均一で透明な黄色の溶液)、酸に安全なマイクロ波蒸解釜で組織消化の短いサイクル(5分間隔)を実行します。
メモ: 表1 のマイクロ波プロトコルは3回実行することが推奨されており、各加熱ステップ間に5分のクールダウン間隔が含まれています。 - 破裂を避けるためにチューブの完全性を注意深く監視し、サイクル間に遠心分離機で短いスピン(313 × g を1分間)を行い、酸凝縮をチューブの底部に移動します。
注:組織(特に絨毛膜)が消化しにくい場合は、酸消化後に30%の高純度過酸化水素を使用することができます。過酸化水素(6.75 mL)を使用して酸濃度を3.5%に希釈し、サンプルをヒュームフードに一晩置くようにします。過酸化水素はH2Oに分解し、ICPMS分析に適しています。また、代替金属は、塩酸または塩酸と硝酸の混合物(すなわち、王水)によく溶解し得る。過酸化水素は飲み込むと有害であり、深刻な目の損傷を引き起こします。皮膚と目の保護具を着用する22,23.
- すべての組織が目に見えて酸化されるまで(すなわち、均一で透明な黄色の溶液)、酸に安全なマイクロ波蒸解釜で組織消化の短いサイクル(5分間隔)を実行します。
- 組織が目に見えて酸化されたら(すなわち、均一で透明な黄色の溶液)、ヒュームフード内のサンプルを6.75mLの高純度水と渦を使用して3.5%硝酸に希釈し、完全に混合する。
注:この時点で、サンプルは室温で保存することができます。この工程は、工程3.1で消化を助けるために過酸化水素を添加した場合には不要である。 - 潜在的な同圧干渉を考慮するために、目的の金属および最適な同位体を含む認定元素標準物質(すなわち、アッセイに応じてPtまたはRu)を使用して、マトリックスマッチングされた7点検量線(0.001〜10ppbの濃度範囲)を実施する。
- 水性の認定元素標準物質(Ru、Pt=1000ppb)のストック濃度を使用して、0.1mLアリコートおよびピペットを新しい15mL遠沈管に取り込む。3.5%硝酸で希釈して最終容量10mLにし、10ppb標準溶液を調製した。
- 10 ppb ストックを使用して、次の段階希釈を行います: 0.1、1.0、および 5.0 ppb 標準溶液を 3.5% 硝酸で精製します。
- 0.1 ストックを使用して、次の段階希釈を行います: 0.001、0.005、および 0.01 ppb 標準溶液を 3.5% 硝酸で精製します。
- ICPMS インストゥルメントを準備します ( 材料表)は、次のようにサンプル分析のために:
- 装置を起動する前に、アルゴンガスバルブが開いており、すべてのチューブがしっかりと接続されており、サンプル分析の間にチューブやガラス製品をすすぐために清潔な5%硝酸が開いていることを確認してください。
- トーチとコーンの状態を確認し、トーチボックスがしっかりとラッチされ、スプレーチャンバ排水管がペリポンプに正しく接続されていることを確認してください。
- ソフトウェアを開きます( 資料表を参照)。
- 真空測定値を確認し、すべてのターボポンプが100%で動作していることを確認します。
- 「プラズマ制御システムのステータス」ウィンドウで「開始」をクリックして、開始シーケンスを開始し、プラズマポンプ、プラズマチラーの電源を入れ、ネブライザーをパージし、プラズマを点灯させます。ステータスウィンドウに起動シーケンスが完了したことが示され、プラズマが点灯して安定するのを待ちます。この時点で、「システム状態」ウィンドウの緑色の点に、すべての電源機構がオンになっていることを示します。
- メニューバーで、ドロップダウンメニュー のコントロール|オートサンプラー をクリックします。5%硝酸を含むチューブのオートサンプラーラック位置を入力します。酸が血漿に入るのを許します。
- メニューバーで、[スキャン]|ドロップダウンメニューのマグネット。「マグネットスキャン」ウィンドウで、「マーカーの質量位置」に「115」と入力し、「Enter」をクリックします。計器がウォームアップしている間、磁石が質量範囲を115 In(114.6083~115.3749)で30分間スキャンできるようにします。
- 30 分後、オートサンプラー コントロールを使用して、1 ppb の多要素チューニング ソリューションの位置に移動します。チューニングソリューションを吸引し、楽器をチューニングして信号の読み取りを最適化します。トーチの位置(X、Y、Z)を調整して、トーチがプラズマ制御ウィンドウのコーンとネブライザの流量(〜30psi)の中心に揃うようにします。「イオン光学チューニング」ウィンドウで、ソース、検出器、および分析装置に必要な調整を行います。
- 信号の読み取り値が最適化されたら(115 Inで1ppbに対して約1.2 × 106カウント/秒)、マグネットスキャンウィンドウで停止をクリックします。
- 「マグネットのキャリブレーション」をクリックし、ポップアップウィンドウで「低解像度」を選択します。
- 「 OK 」をクリックし、「質量校正(低解像度).smc」ファイルを開いてマグネットを校正します。
注:マグネットキャリブレーションはカウント/秒を測定し、7 Li~238Uの質量範囲に曲線を適合させます。 - 「 |を保存」をクリックします。 現在のマグネットキャリブレーションを解析に適用するために使用します。広範囲の濃度で未知のサンプルを測定する場合は、検出器キャリブレーションを実行して、低濃度のイオンパルスカウント信号と高濃度で生成される減衰イオン信号を比較します。チューニングとキャリブレーションが完了したら、サンプルを分析します。
- メニューバーで、[ データ集録]をクリックします。
- ドロップダウンメニューの [メソッド設定 ]をクリックします。製造元から提供された既存のメソッドを使用するか、目的の要素に基づいてメソッドを作成します。必要に応じて、解析モード、滞留時間、スイッチ遅延、スイープ/サイクル数、分解能、検出モード、および偏向器設定のパーク質量を調整します。
- 「 保存 」をクリックして、メソッド設定を記録します。各金属と同位体のパラメータを最適化します。この研究で使用された特定の動作パラメータについては 、表2 を参照してください。
- メニューバーで、[ データ集録]をクリックします。
- ドロップダウンメニューの [バッチ実行 ]をクリックします。または、メニューバーの下にある バッチ アイコンをクリックします。スプレッドシートからバッチパラメータをートするか、「 バッチ実行」 ウィンドウでシーケンスを作成します。サンプル タイプ、 オートサンプラーラック位置、 搬送時間、 洗浄時間、 反復、 サンプルID、 およびメソッドファイルを入力します。
- バッチ実行を次の順序で配置します:検量線用の標準溶液(0.001-10ppb PtまたはRu)、続いて品質管理標準、次に未知のサンプル。
注: 標準解は ICPMS でカウント/秒として測定され、線形回帰は相対標準偏差 (RSD) が 0.999 >標準に準拠します。未知数もカウント/秒として測定され、検量線の線形回帰 y = mx + b を使用して ppb 単位の濃度を解きます。データ処理は、参照されたソフトウェアを使用して完了することもできます。 - 5-10サンプルごとに0.5ppbの品質管理基準を含めることにより、機器のドリフトとサンプルの再現性を監視します。
注:適切な品質管理基準は、検量線で使用される標準とは異なる認定標準標準物質でなければなりません。
| ワット | 力 | 議事録 |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
表1:幼虫組織塊のためのマイクロ波消化プロトコル。 ゼブラフィッシュ幼虫サンプルを0.25mLの硝酸中で消化した。この表は 24 から変更されました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
これらの結果は、以前に公表されている24。組織取り込み研究は、シスプラチンおよび新規Ruベースの抗癌化合物PMC79の水媒介性曝露を用いて実施された。致死性および孵化遅延は、シスプラチン0、3.75、7.5、15、30、および60mg/Lシスプラチンの公称濃度について評価された。生物組織におけるPt蓄積はICPMS分析によって決定され、生物組織は生物1匹当たり0.05、8.7、23.5、59.9、193.2、および461.9ng(Pt)のそれぞれの用量を含んでい た(図3)。シスプラチンの公称濃度の分析的決定は、シスプラチンの既知の安定性を考えると、評価されなかった。
孵化の遅延は、全てのシスプラチン濃度で観察された。追加の実験を、手動脱絨毛の有無にかかわらずPt濃度について実施した。脱絨毛後、絨毛膜を回収し、Ptについて別々に分析した。非致死量のシスプラチンを絨毛除去試験に用いたところ、送達されたシスプラチンの総用量の93〜96%が、幼虫組織内に残りの用量とともに絨毛膜に蓄積していたことが決定された(図4)。
ゼブラフィッシュの幼虫は、0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg/LのPMC79に曝露された。これらの用量は、先に記載したようにIC50の誘導体を決定することによって選択された16。これらの濃度は、0、0.17、0.44、0.66、および0.76 mg/LのRuを含むと分析的に決定された。シスプラチンの用量反応曲線とは異なり、PMC79ばく露幼虫では孵化の遅延は観察されなかった。絨毛膜は、幼虫の収集前に自然に分解されるため、ルテニウム分析には含まれなかった。研究者は、24dpfで絨毛膜を脱絨毛および収集することによって、孵化を遅らせることなく絨毛膜分析を含むことができる。各濃度で分析された幼虫組織内の金属の質量は、幼虫あたり0.19、0.41、および0.68ng(Ru)であった(図5)。集団の50%に対する致死濃度および/または用量(LC 50/LD 50)、有効濃度、または集団の50%に対する用量(EC50/ED50)、および観察された最も低い有害作用レベル(LOAEL)を含む毒物学的エンドポイントの要約を表3に見出すことができる。
| シスプラチン | PMC79 | |||||
| 公称値(ミリグラム/リットル) | ティッカー | Pt(ng)/生物 | 分析用Ru (mg/L) | ティッカー | Ru (ng) / 生物 | |
| LC 50/LD50 | 31 (95% 信頼区間: 20.5-34.0) | 158(95%信頼区間:105~174) | 193(±130) | 0.79 (95%信頼区間: 0.43~1.20) | 7.8(95%信頼区間:4.2~11.8) | ティッカー |
| EC50 | 4.6 | 12.5 | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー |
| ロアール | 3.75 | 15.3 | 8.7(±4) | 0.17 | 1.7 | 0.19 (± 0.05) |
表3:毒物学的エンドポイントに関連する溶液および金属薬物取り込みの決定。LD50は、それぞれシスプラチンおよびPMC79についてのPtおよびRuの金属等価分析によって決定した。PMC79についてのLC50濃度を分析的に決定した。しかしながら、名目上のシスプラチン濃度の分析的決定は行われなかった。溶液中のシスプラチンの既知の安定性を考えると、溶液中の公称濃度と測定濃度は同等であると考えられた。シスプラチン曝露の遅延ハッチングエンドポイントを、ED50およびLOAELに関して評価した。PMC79のLOAEL濃度を分析的に決定した。LOAELには、尾静脈および尾動脈に沿った出血、脊髄湾曲、および卵黄嚢浮腫などの病変が含まれていた。すべての95%信頼区間は、リッチフィールドウィルコン法を使用して計算しました。この表は 24 から変更されました。略語: CI = 信頼区間;LC50 = 人口の50%の致死濃度;LD50 = 人口の50%の致死量;EC50 = 人口の50%に対する有効濃度;LOAEL = 観察された最も低い有害作用レベル。
図1:ゼブラフィッシュ線量反応プロトコール。 このプロトコルは、OECD FETから適応された修正されたアプローチを使用する。バイオレンダーで作られています。略語: OECD = OECD = 経済協力と開発機構;FET = 魚胚急性毒性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組織消化とICPMS評価 消化プロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫の複合サンプルを消化するのに有効である。略語:ICPMS =誘導結合プラズマ質量分析法。バイオレンダーで作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:シスプラチン用量反応 。 (A)5dpfでの孵化遅延の平均百分率は、生物ごとに決定された平均Pt当量と相関していた。(B)生物当たりの平均Pt当量と相関する5dpfにおける平均致死率百分率。百分率平均:N = 40 1用量あたり。生物当たりPt(ng):1用量あたり>4個の複合サンプル。2つの実験反復が行われ、その範囲が表示される。この数値は 24から修正されています。略語: dpf = 受精後日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:7.5または15mg/Lに曝露した後の幼虫および絨毛膜に存在するPt(ng)の比較。 複合>3幼虫または絨毛膜/サンプル;左から右へ N = 13、10、10、および 11。エラーバーは標準偏差を表す。マン・ホイットニー順位和検定P<、幼虫と絨毛膜の間で0.001であった。この数値は 24から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PMC79用量反応(A)平均致死率は、分析的に決定された溶液中の平均Ru当量(mg/L)と相関していた。(b)同じ実験から受精後5日目における平均致死率百分率は、幼虫当たりの平均Ru当量と相関していた。致死率:N = 40 1用量あたり。Ru(mg/L):N = 1用量あたり6個の複合サンプル。幼虫当たりRu(ng)>1用量当たり4複合サンプル。2つの実験反復が行われ、その範囲が表示される。この数値は24から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ピークあたりの滞留時間 | 4 ミリ秒 |
| スイッチ遅延/ピーク (x10micros) | 2 |
| スイープ数 | 350 |
| サイクル数 | 1 |
| 計測器解像度 | 300 |
| 検出モード | 減衰、ディフレクタージャンプ |
| パークミサ | 98.90594 |
| 元素(同位体) | Pt(192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
表 2: ICPMS メソッドのパラメーター PtおよびRu同位体を分析するためのパラメータは、それぞれシスプラチンおよびPMC79の組織濃度を決定する。Srは、タンク水組成に関連する等圧干渉を監視するために含まれた。この表は 24 から変更されました。ICPMS = 誘導結合プラズマ質量分析法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明するプロトコールは、PtまたはRuのいずれかを含む金属ベースの抗癌剤の送達および取り込みを決定するために実施されている。これらの方法はすでに公開されていますが、このプロトコルでは、この方法論をさまざまな化合物に適応させるための重要な考慮事項と詳細について説明します。OECDのプロトコルと組織消化およびICPMS分析を組み合わせることで、PMC79がシスプラチンよりも強力であり、異種の組織蓄積をもたらし、別々のメカニズムを示唆することができました。さらに、送達されたシスプラチンの用量が定量化されたので、用量反応の結果は患者集団に外挿された。致死量以下(例えば、LOAEL)は、患者24における静脈内投与濃度に匹敵した。
この方法は、幅広いスペクトルの金属および金属ベースの化合物に適用され得るが、分析物の物理化学的特性の慎重な調査を考慮に入れなければならない。金属ベースの化合物は溶解が非常に困難な場合があり、これを避けるために様々なビヒクルを使用することができる。DMSOなどのビヒクル濃度は、OECDプロトコルで推奨されている濃度よりも高い濃度である必要があるかもしれません。そのため、コントロールの開発を注意深く監視することによって無毒な用量を維持することが重要です。曝露中に胚を連続的に揺さぶることは、降水量を緩和する。さらに、有機金属化合物は水溶液中で安定ではないかもしれない。分解過程が不明な場合、24時間の溶液更新を伴う研究は、非更新用量反応曲線と考慮または比較され得る。
OECD魚類急性胚毒性試験(FET)番号23621に従うことが推奨されます。ただし、特定の目的に合わせて変更を加えることができます。ガラス容器は、プラスチックや可塑剤などの毒物学的変数の交絡を避け、卵水から分析物を除去するほど強く金属を吸着しません。シスプラチンなどの光分解する化合物の場合、光サイクルなしで露光を行うことが有益であり得る。
ゼブラフィッシュの線量反応研究における脱絩弾性の必要性に関する文献には多くの議論がある25、26、27。24hpfでの脱絨毛の議論は、絨毛膜が化合物の透過性を制限し、偽陰性の結果または増強された用量反応曲線を生成することを示唆している。これらの点にはメリットがありますが、脱絨毛なしで研究を行うことは、機械的な洞察を提供する可能性があります。これらの研究は、シスプラチンがそのアルキル化活性のために胚の絨毛膜に蓄積することを示唆している(図2)。結果として生じる内転体は構造を補強し、遅延ハッチングをもたらす。しかし、PMC79および他のRuベースの抗癌剤はこの現象を引き起こさなかった27。多くの化学療法薬はアルキル化によって抗癌活性を作用させるが、PMC79曝露後の孵化遅延の欠如は、異種のメカニズムを示した。脱絨毛の有無にかかわらず、研究は慎重に検討または並行して実施されなければならない。
下流の組織消化とICPMS分析は継続的に考慮する必要があります。等圧干渉を引き起こす可能性のある試薬の使用を避け、代替方法を実装することが推奨されます。用量反応試験中に使用される試薬は、硝酸およびその酸化電位に影響を与えたり、反応したり、等圧干渉に寄与する可能性がある。卵水を作るために使用された塩溶液は、Ru24の特定の同位体と重なったストロンチウム(Sr)酸化物を生成することが発見された。塩分濃度を下げたり、幼虫を慎重に清掃したりすることで、この問題を改善することができます。これらの理由から、抗菌メチレンブルーや安楽死剤であるトリカインを避けることが示唆される。代わりに、オートクレーブし、続いて卵水を通気して微生物を除去するか、または急速に冷却することによって幼虫を安楽死させる。このステップでは、目的の分析物に対する最小の等圧干渉で線形同位体標準曲線を達成することが重要です。
このプロトコルの重要な制限は、有機金属化合物が金属のみが残るように酸化されることです。そのため、代謝研究は実施できません。プロトコルは中程度のスループットと考えることができるが、用量反応部分は、自動化学送達システムおよび画像化の助けを借りて迅速化され得る。このプロトコルは、薬物および毒物動態学的研究のための広範囲の金属および金属ベースの化合物に対して修正および精製され得る初期の方法論である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者のいずれかによって開示される利益相反はありません。
Acknowledgments
資金提供: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Training Grant T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022.さらに、Brittany Karasは、NIHのNINDSからのトレーニング助成金T32NS115700によってサポートされています。著者らは、Andreia ValenteとPortuguese Foundation for Science and Technology(Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT;PTDC/QUI-QIN/28662/2017)をPMC79の供給に充てる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
