Summary
Zebra balığındaki metallerin ve metal bazlı bileşiklerin farmakokinetik ve toksikokinetik analizlerinin artan oranı, çevresel ve klinik çeviri çalışmaları için avantajlı olabilir. Bilinmeyen su kaynaklı maruz kalma alımının sınırlaması, endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi kullanılarak sindirilmiş zebra balığı dokusu üzerinde eser metal analizi yapılarak aşılmıştır.
Abstract
Metaller ve metal bazlı bileşikler çok çeşitli farmakoaktif ve toksikolojik ksenobiyotiklerden oluşur. Ağır metal toksisitesinden kemoterapötiklere kadar, bu bileşiklerin toksikokinetik değerleri hem tarihsel hem de modern gün ile ilgilidir. Zebra balığı, çevresel maruziyet ve klinik çeviri çalışmalarında farmakokineziyi ve toksikokinetik aydınlatmada çekici bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı çalışmaları, kemirgen modellerinden daha yüksek verim elde etme avantajına sahip olsa da, modelde birkaç önemli kısıtlama vardır.
Böyle bir sınırlama, su bazlı dozaj rejiminde doğaldır. Bu çalışmalardan elde edilen su konsantrasyonları, güvenilir iç dozajlar sağlamak için tahmin edilemez. Metal bazlı bileşiklerin doğrudan ölçümleri, bileşikle ilgili moleküler ve biyolojik tepkilerle daha iyi bir korelasyon sağlar. Metaller ve metal bazlı bileşikler için bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, zebra balığı larva dokusunu maruz kaldıktan sonra sindirmek ve doku örnekleri içindeki metal konsantrasyonlarını endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) ile ölçmek için bir teknik geliştirilmiştir.
ICPMS yöntemleri, zebra balığı dokusundaki birkaç yeni Ru bazlı kemoterapötikten sisplatinden platin (Pt) ve rutenyum (Ru) metal konsantrasyonlarını belirlemek için kullanıldı. Ek olarak, bu protokol, zebra balığı dokusuna kıyasla larvaların koryonunda tutulan Pt konsantrasyonlarını ayırt etti. Bu sonuçlar, bu yöntemin larva dokularında bulunan metal dozunu ölçmek için uygulanabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem, çok çeşitli maruz kalma ve dozajlama çalışmalarında spesifik metalleri veya metal bazlı bileşikleri tanımlamak için ayarlanabilir.
Introduction
Metaller ve metal bazlı bileşikler farmakolojik ve toksikolojik açıdan önemini korumaktadır. Ağır metal maruziyetinin yaygınlığı ve sağlık üzerindeki etkisi, 1960'lardan bu yana bilimsel araştırmaları katlanarak artırdı ve 2021'de tüm zamanların en yüksek seviyesine ulaştı. İçme suyu, hava kirliliği ve mesleki maruziyetteki ağır metal konsantrasyonları dünya çapında düzenleyici sınırları aşmakta ve arsenik, kadmiyum, cıva, krom, kurşun ve diğer metaller için bir sorun olmaya devam etmektedir. Çevresel maruziyeti ölçmek ve patolojik gelişimi analiz etmek için yeni yöntemler yüksek talep görmeye devam etmektedir 1,2,3.
Tersine, tıp alanı klinik tedavi için çeşitli metallerin fizyokimyasal özelliklerinden yararlanmıştır. Metal bazlı ilaçlar veya metalloilaçlar, zengin bir tıbbi amaç geçmişine sahiptir ve kemoterapötikler4 olarak en yüksek başarı ile bir dizi hastalığa karşı aktivite göstermiştir. Metaloilaçların en ünlüsü olan sisplatin, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından dünyanın temel ilaçlarından biri olarak kabul edilen Pt bazlı bir antikanser ilacıdır5. 2010 yılında, sisplatin ve Pt türevleri birçok kanserde% 90'a varan bir başarı oranına sahipti ve kemoterapi rejimlerinin yaklaşık% 50'sinde kullanıldı 6,7,8. Pt bazlı kemoterapötikler inkar edilemez başarılara sahip olsalar da, doz sınırlayıcı toksisite, rafine biyolojik dağıtım ve aktiviteye sahip alternatif metal bazlı ilaçların araştırılmasını harekete geçirmiştir. Bu alternatiflerden, Ru bazlı bileşikler en popüler 9,10,11,12 haline gelmiştir.
Metal farmakokratik ve toksikokinetik çalışmalara duyulan ihtiyaç oranına ayak uydurmak için yeni modeller ve metodoloji gereklidir. Zebra balığı modeli, karmaşıklık ve verimin kesiştiği noktada yer alır ve %70 korunmuş gen homolojisine sahip yüksek doğurganlığa sahip bir omurgalıdır13. Bu model, kurşun keşfi, hedef tanımlama ve mekanik aktivite için çeşitli bileşikler için kapsamlı taramalar ile farmakoloji ve toksikolojide bir varlık olmuştur14,15,16,17. Bununla birlikte, kimyasalların yüksek verimli taranması tipik olarak su kaynaklı maruziyetlere dayanır. Bu alımın, çözeltideki bileşiğin fizikokimyasal özelliklerine (yani, fotodegradasyon, çözünürlük) bağlı olarak değişken olabileceği göz önüne alındığında, bu, doz dağıtımı ve yanıtını ilişkilendirmenin önemli bir sınırlaması olabilir.
Dozun daha yüksek omurgalılarla karşılaştırılması için bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, zebra balığı larva dokusundaki eser metal konsantrasyonlarını analiz etmek için bir metodoloji tasarlanmıştır. Burada, öldürücü ve subölümcül sonlanım noktalarının doz-yanıt eğrileri, sisplatin ve yeni Ru bazlı antikanser bileşikleri için değerlendirildi. Öldürücülük ve gecikmiş kuluçka, 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ve 60 mg / L sisplatin nominal konsantrasyonları için değerlendirildi. Organizma dokusunda Pt birikimi ICPMS analizi ile belirlendi ve ilgili dozların organizma alımı organizma başına 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ve 461.9 ng (Pt) idi. Ek olarak, zebra balığı larvaları 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L PMC79'a maruz bırakıldı. Bu konsantrasyonların analitik olarak 0, 0.17, 0.44, 0.66 ve 0.76 mg / L Ru içerdiği belirlenmiştir. Bu protokol aynı zamanda larvaların koryonunda tutulan Pt konsantrasyonlarının zebra balığı dokusuna kıyasla ayırt edilmesine de izin verdi. Bu metodoloji, iyi kurulmuş bir kemoterapötik ve yeni bir bileşik arasındaki farmakokinetik ve toksikokinetik aktivitenin karşılaştırılması için güvenilir, sağlam veriler sağlayabilmiştir. Bu yöntem çok çeşitli metallere ve metal bazlı bileşiklere uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB suşu zebra balığı (Danio rerio) tüm deneyler için kullanıldı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve hayvancılık protokolü (#08-025) Rutgers Üniversitesi Hayvan Bakım ve Tesisleri Komitesi tarafından onaylandı.
1. Zebra balığı yetiştiriciliği
- Zebra balığını, 14 saatlik bir ışık: 10 saatlik karanlık döngüde devridaim yapan bir sucul habitat sisteminde yetiştirin ve koruyun.
- Balık sistemi suyu elde etmek için belediye musluk suyunu kum ve karbon filtrasyonu yoluyla arıtın. Su sistemi suyunu 28 °C, <0.05 ppm nitrit, <0.2 ppm amonyak ve pH 7.2 ila 7.7 arasında tutun.
- Zebra balığını yumurtadan çıkmış Artemia kistleri, tuzlu su karidesleri ve balık diyeti pul yiyeceklerinden oluşan bir diyetle besleyin.
2. Zebra balığı doz-yanıt protokolü (Şekil 1)
- Zebra balığı yumurta suyu çözeltisi, E3 orta veya deiyonize suda çözünmüş 60 μg / mL konsantrasyonda stok deniz tuzundan yapılmış yumurta suyu18 hazırlayın. Metilen mavisi kullanımından kaçının.
NOT: ICPMS aracılığıyla, bir rutenyum izotopu ile örtüşen stronsiyum oksitler için zebra balığı yumurta suyunun izobarik girişimi tanımlanmıştır. Aşağı akış analizinden önce larvaların dikkatli bir şekilde durulanması bu sorunu iyileştirdi. E3 ortamı, ticari deniz tuzlarının tescilli yapısı nedeniyle bazıları için daha kolay bir seçim olabilir. - Metal veya metal bazlı bileşikleri E3 veya yumurta suyunda çözün. Herhangi bir agrega malzemesini parçalamak ve çözeltiyi homojenize etmek için vorteks.
NOT: Aşağıda özetlenen deneyde, PMC79 ve sisplatin, çökelmeye direnmek için maksimum% 0.5 dimetil sülfoksit (DMSO) konsantrasyonu ile maksimum 12.4 mg / L ve 60 mg / L konsantrasyonlarında çözülmüştür.- PMC79 ve sisplatin gibi ağır metal veya metal bazlı bileşikleri E3 veya yumurta suyuyla seyreltin, en az 5 konsantrasyon dozu hazırlayın.
- Saf araçta (yani DMSO) düşük konsantrasyonlarda stok çözeltileri ile başlayın, ardından E3 veya yumurta suyu ile seyreltin. Son araç konsantrasyonlarını dikkatlice düşünün.
NOT: Cisplatin gibi bazı metal bazlı bileşikler hızla bozulur ve çözeltileri günlük olarak taze yapılmalıdır. DİKKAT: Ağır metalleri ve kemoterapötikleri dikkatli kullanın. İlgilendiğiniz metal için özel malzeme güvenlik bilgi formunu (MSDS) gözden geçirin. Cisplatin göz ve cilt tahrişine neden olabilir, yutulduğunda ölümcül olabilir ve böbreklerde, kanda, kan oluşturan organlarda ve fetal dokuda toksisiteye neden olabilir. Dumanları solumaktan ve gözlerle, ciltle ve giysilerle temasından kaçının. Geçirimsiz eldiven ve giysiler ve güvenlik gözlükleri veya gözlükler giyin19.
- Saf araçta (yani DMSO) düşük konsantrasyonlarda stok çözeltileri ile başlayın, ardından E3 veya yumurta suyu ile seyreltin. Son araç konsantrasyonlarını dikkatlice düşünün.
- PMC79 ve sisplatin gibi ağır metal veya metal bazlı bileşikleri E3 veya yumurta suyuyla seyreltin, en az 5 konsantrasyon dozu hazırlayın.
- Deneyden önceki öğleden sonra,20 cinsiyeti arasında bir bölücü ile 2 dişiye 1 erkeğin ideal oranında üreme tankları kurun.
- Sabah döngüsü için ışıklar yandığında bölücüyü çekin.
- Zebra balıklarının üremesine izin verin.
NOT: Üreme süresinin uzunluğu, gerekli ilk maruz kalma aşamasına bağlıdır. 3 saat sonrası döllenme için, yaklaşık 2 saat üremeye izin verin. Yumurtalar temizlendikten ve ayrıldıktan sonra 3 hpf'ye ulaşacaktır. - Damızlık balıkları temiz bir tanka taşıyın.
- Tank suyunu bir süzgeçten dökerek yumurtaları toplayın.
- Süzgeci bir Petri kabının üzerine ters çevirin ve yumurtaları yemeğe durulamak için E3 veya yumurta suyuyla dolu bir fışkırtma şişesi kullanın.
- Deneysel kullanımdan önce yiyecek ve atık tabağını temizleyin.
- Bir transfer pipeti ve az miktarda su kullanarak doz başına yaklaşık yirmi 3 hpf embriyoyu ayrı cam şişelere randomize edin.
- Tüm embriyolar şişelerde bulunduktan sonra, tüm yumurta suyunu çıkarın ve yumurtanın yüksekliğinin üzerinde yaklaşık 1 inç çözelti olacak şekilde yeterli dozlama çözeltisi ile değiştirin.
NOT: Dekoryonasyonun gerekliliği dikkatle düşünülmelidir. Daha fazla ayrıntı için tartışma bölümüne bakın. - Embriyoları lezyonlar veya ölümcüllük için günlük olarak gözlemleyin. Embriyonik zebra balıklarının hızlı gelişimi nedeniyle, günler arasında küçük lezyonları tanımlamak için herhangi bir parlak alan mikroskobu / kamera kurulumunu kullanarak günlük görüntüler elde edin.
- Doz yanıtının sona ermesinde (döllenmeden 4-5 gün sonra [dpf], Örgüt Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma [OECD] kılavuzu21'e göre), kompozit örnekleme için ötenaziden önce 3-5 larvayı birleştirin. Sıvı azotta çabuk dondurularak hızlı soğutularak ötenazi.
NOT: MS-222 veya trikain metansülfonat doz aşımı yoluyla ötenazi, aşağı yönde ICPMS analizine potansiyel olarak müdahale edebilir. Bu protokol için girişim olasılığını azaltmak için hızlı soğuyan ötenazi yöntemleri teşvik edilir. - Fazla bileşiği dokunun dışından çıkarmak için yüksek saflıkta suyla (ters ozmoz gibi) 3 doku yıkaması yapın.
- Numuneleri asit ve mikrodalga güvenli 15 mL polipropilen santrifüj tüplerine taşıyın. Kalan herhangi bir sıvı nitrik asidi ve dolayısıyla doku bozulması sırasında asidin oksitleyici potansiyelini seyreltebileceğinden, tüm fazla suyu gidermeye dikkat edin.
NOT: Bu noktada, doku daha fazla analize kadar -20 ° C'de saklanabilir. Doğal olarak bol miktarda bulunan metaller için, tüplerin kullanımdan önce% 5'lik bir nitrik asit banyosunda temizlenmesi, ortam arka plan seviyelerini iyileştirecektir.
3. Doku sindirimi ve ICPMS değerlendirmesi (Şekil 2)
- 10 larvaya (~ 100 μg) kadar yüksek saflıkta nitrik asit (% 69) için 15 mL polipropilen santrifüj tüplerine yaklaşık 0.25 mL ekleyin. Aşağıdaki ayarları kullanarak örnekleri önceden sindirmek için 1 saat boyunca ultrasonikat: ultrasonik banyo çıkışı: 85 W; 42 kHz ± %6; sıcaklık aralığı: 19-27 °C.
DİKKAT: Sonikasyon sırasında kulak koruması takın. Nitrik asit ciddi solunum yolu, göz ve cilt yanıklarına neden olur. Tam koruyucu ekipman giyin ve duman davlumbazında veya yeterli havalandırmaya sahip yerlerde çalışın. Diğer malzemelerle yanıcı olabilir. Nitrik asit, sindirim sırasında üretilen buharlara maruz kalmayı önlemek için sadece bir duman davlumbazında kullanılmalıdır. Nefes almayın veya yutmayın.- Tüm dokular gözle görülür şekilde oksitlenene kadar (yani, üniforma, berrak sarı çözelti) asit güvenli bir mikrodalga çürütücüde kısa doku sindirim döngüleri (5 dakikalık aralıklarla) gerçekleştirin.
NOT: Tablo 1'deki mikrodalga protokolünün üç kez yapılması önerilir ve her ısıtma adımı arasında 5 dakikalık bir bekleme aralığı içerir. - Yırtılmayı önlemek için tüplerin bütünlüğünü dikkatlice izleyin ve asit yoğuşmasını tüpün dibine taşımak için döngüler arasında santrifüjde kısa dönüşler (1 dakika boyunca 313 × g) yapın.
NOT: Dokunun sindirimi zorsa (özellikle koryonlar), asit sindiriminden sonra% 30 yüksek saflıkta hidrojen peroksit kullanılabilir. Asit konsantrasyonunu% 3.5'e seyreltmek için hidrojen peroksiti (6.75 mL) kullanın ve numunelerin bir duman davlumbazında gece boyunca oturmasına izin verin. Hidrojen peroksitH2O'ya ayrışır ve ICPMS analizi için uygundur. Ayrıca, alternatif metaller hidroklorik asit veya hidroklorik asit ve nitrik asit karışımında (yani, aqua regia) daha iyi çözünebilir. Hidrojen peroksit yutulduğunda zararlıdır ve ciddi göz hasarına neden olur. Cilt ve göz koruması kullanın22,23.
- Tüm dokular gözle görülür şekilde oksitlenene kadar (yani, üniforma, berrak sarı çözelti) asit güvenli bir mikrodalga çürütücüde kısa doku sindirim döngüleri (5 dakikalık aralıklarla) gerçekleştirin.
- Doku gözle görülür şekilde oksitlendikten sonra (yani, üniforma, berrak sarı çözelti), numuneleri bir duman davlumbazında, iyice karıştırmak için 6.75 mL yüksek saflıkta su ve vorteks kullanarak% 3.5 nitrik aside seyreltin.
NOT: Bu noktada, numuneler oda sıcaklığında saklanabilir. Adım 3.1'de sindirime yardımcı olmak için hidrojen peroksit eklenmişse, bu adım gereksizdir. - Herhangi bir potansiyel izobarik girişimi hesaba katmak için ilgili metal ve optimum izotop (lar) ile sertifikalı bir element standardı (yani, tahlil bağlı olarak Pt veya Ru) kullanarak matris eşleşmiş, 7 noktalı bir kalibrasyon eğrisi (konsantrasyon aralığı 0.001-10 ppb) yürütün.
- Sulu, sertifikalı element standardının (Ru, Pt = 1000 ppb) stok konsantrasyonunu kullanarak, 0,1 mL'lik bir aliquot alın ve pipet'i yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne alın. 10 ppb'lik standart bir çözelti üretmek için% 3,5 nitrik asit ile 10 mL'lik son hacme kadar seyreltin.
- 10 ppb stoğu kullanarak aşağıdaki seri seyreltmeleri yapın:% 3,5 nitrik asitte 0,1, 1,0 ve 5,0 ppb standart çözeltiler.
- 0,1 stoğunu kullanarak aşağıdaki seri seyreltmeleri yapın:% 3,5 nitrik asitte 0,001, 0,005 ve 0,01 ppb standart çözeltiler.
- ICPMS aygıtını hazırlama (bkz. Malzeme Tablosu) numune analizi için aşağıdaki gibidir:
- Cihazı çalıştırmadan önce, Argon gaz vanasının açık olduğundan, tüm boruların güvenli bir şekilde bağlandığından ve numune analizleri arasında boru ve cam eşyaların durulanması için temiz% 5 nitrik asidin açık olduğundan emin olun.
- Torç ve konilerin durumunu kontrol edin ve torç kutusunun güvenli bir şekilde kilitlendiğinden ve püskürtme odası drenaj borusunun çevre pompasına düzgün bir şekilde bağlandığından emin olun.
- Yazılımı açın ( bkz. Malzeme Tablosu).
- Vakum okumalarını kontrol edin ve tüm turbo pompaların %100 çalıştığından emin olun.
- Başlatma sırasını başlatmak , plazma pompasını, plazma soğutucusunu açmak, nebülizörü temizlemek ve plazmayı aydınlatmak için Plazma Kontrol Sistemi Durumu penceresinde BAŞLAT'a tıklayın. Durum penceresi başlatma sırasının tamamlandığını gösterdiğinde plazmanın yanmasını ve kararmasını bekleyin. Bu noktada, Sistem Durumu penceresinde tüm Güç Kaynaklarının açık olduğunu gösteren yeşil noktalara dikkat edin.
- Menü çubuğunda, açılır menüde Otomatik örnekleyiciyi Kontrol | 'e tıklayın. %5 nitrik asit içeren tüp için otomatik numune alma rafı konumunu girin. Asidin plazmaya girmesine izin verin.
- Menü çubuğunda, Taramalar | Açılır menüdeki mıknatıs. MagnetScan penceresinde, İşaretçi Kütlesi Konumu alanına 115 yazın ve enter'a tıklayın. Cihaz ısınırken mıknatısın kütlearalığında 115 In (114.6083 ila 115.3749) için 30 dakika boyunca tarama yapmasına izin verin.
- 30 dakika sonra, 1 ppb çok elemanlı ayar çözümünün konumuna geçmek için otomatik örnekleyici kontrolünü kullanın. Akort çözümünü aspire edin ve sinyal okumayı optimize etmek için cihazı ayarlayın. Torç konumunu (X, Y, Z) torç, Plazma kontrol penceresindeki konilerin merkezi ve nebülizör akış hızı (~ 30 psi) ile aynı hizada olacak şekilde ayarlayın. İyon Optik Ayarlama penceresinde Kaynak, Dedektör ve Analizör için gerekli ayarlamaları yapın.
- Sinyal okuması optimize edildikten sonra (~1,2 × 115 In'de 1 ppb için 106 sayım/s), Mıknatıs Taraması penceresinde Durdur'u tıklatın.
- Mıknatısı Kalibre Et'e tıklayın ve açılır pencerede Düşük Çözünürlük'ü seçin.
- Tamam'a tıklayın ve Mıknatısı kalibre etmek için "Kütle Kalibrasyonu (Düşük Çözünürlük).smc" dosyasını açın.
NOT: Mıknatıs kalibrasyonu sayımları/sayıları ölçecek ve aşağıdaki kütle aralığında bir eğriye uyacaktır: 7Li ila 238U. - Save | ( Kaydet) seçeneğine tıklayın Mevcut mıknatıs kalibrasyonunu analizlere uygulamak için kullanın. Bilinmeyen numuneleri çok çeşitli konsantrasyonlarla ölçüyorsanız, düşük konsantrasyonlardaki iyon darbe sayım sinyallerini daha yüksek konsantrasyonlarda üretilen zayıflatılmış iyon sinyalleriyle karşılaştırmak için bir Dedektör Kalibrasyonu gerçekleştirin. Ayar ve kalibrasyon tamamlandıktan sonra numuneleri analiz edin.
- Menü çubuğunda, Veri Toplama'ya tıklayın.
- Açılır menüden Yöntem Kurulumu'na tıklayın. Üretici tarafından sağlanan varolan bir yöntemi kullanın veya ilgilenilen öğeleri temel alan bir yöntem oluşturun. Gerekirse, deflektör ayarları için analiz modunu, bekleme süresini, anahtar gecikmesini, süpürme / döngü sayısını, çözünürlüğü, algılama modunu ve park kütlesini ayarlayın.
- Yöntem ayarlarını kaydetmek için Kaydet'i tıklatın. Her metal ve izotop için parametreleri optimize edin. Bu çalışmada kullanılan spesifik operasyon parametreleri için Tablo 2'ye bakınız.
- Menü çubuğunda, Veri Toplama'ya tıklayın.
- Açılır menüden Toplu Çalıştırma'ya tıklayın. Alternatif olarak, menü çubuğunun altındaki BATCH Simgesine tıklayın. Toplu iş parametrelerini bir elektronik tablodan içe aktarın veya Toplu Çalıştırma penceresinde bir sıra oluşturun. Örnek türünü, otomatik örnekleyici raf konumunu, aktarım süresini, yıkama süresini, çoğaltmaları, numune kimliğini ve metot dosyasını girin.
- Toplu iş çalışmasını aşağıdaki sırayla düzenleyin: kalibrasyon eğrisi için standart çözümler (0,001-10 ppb Pt veya Ru), ardından bir kalite kontrol standardı, ardından bilinmeyen numuneler.
NOT: Standart çözümler ICPMS'de sayım/sn olarak ölçülür ve doğrusal bir regresyon, 0,999 > göreceli standart sapma (RSD) ile standartlara uyar. Bilinmeyenler ayrıca sayım / s olarak ölçülür ve kalibrasyon eğrisinin doğrusal regresyonu kullanılarak ppb'deki konsantrasyon için çözülür, y = mx + b. Veri işleme, referans verilen yazılım kullanılarak da tamamlanabilir. - Her 5-10 numuneye 0,5 ppb kalite kontrol standardı ekleyerek cihaz sapmalarını ve numune tekrarlanabilirliğini izleyin.
NOT: Uygun kalite kontrol standartları, kalibrasyon eğrisinde kullanılan standarttan farklı, sertifikalı bir standart referans malzeme olmalıdır.
| Watt | Güç | Tutanak |
| 300 | 50% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
| 300 | 0% | 5 |
| 300 | 75% | 5 |
Tablo 1: Larva doku kütlesi için mikrodalga sindirim protokolü. Zebra balığı larva örnekleri 0.25 mL nitrik asit içinde sindirildi. Bu tablo 24'ten değiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sonuçlar daha önceyayınlanmıştı 24. Doku alım çalışmaları, sisplatinin su kaynaklı maruziyetleri ve yeni bir Ru bazlı antikanser bileşiği olan PMC79 ile gerçekleştirildi. Öldürücülük ve gecikmiş kuluçka, sisplatin 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ve 60 mg / L sisplatinin nominal konsantrasyonları için değerlendirildi. Organizma dokusunda Pt birikimi ICPMS analizi ile belirlendi ve organizma dokusu organizma başına 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ve 461.9 ng (Pt) dozlarını içeriyordu (Şekil 3). Sisplatin için nominal konsantrasyonların analitik olarak belirlenmesi, sisplatinin bilinen stabilitesi göz önüne alındığında değerlendirilmemiştir.
Tüm sisplatin konsantrasyonlarında gecikmiş kuluçka gözlendi. Manuel dekoryonasyonlu ve dekoryonsuz Pt konsantrasyonları için ek deneyler yapılmıştır. Dekoryonasyon sonrası koryonlar toplandı ve Pt için ayrı ayrı analiz edildi. Dekoryonasyon çalışmaları için kullanılan ölümcül olmayan sisplatin dozları, toplam verilen sisplatin dozunun% 93-96'sının larva dokusunda kalan dozla birlikte koryonda biriktiğini belirlemiştir (Şekil 4).
Zebra balığı larvaları 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L PMC79'a maruz kaldı. Bu dozlar, daha önce açıklandığı gibi bir IC50'nin türevlerini belirleyerek seçildi16. Bu konsantrasyonların analitik olarak 0, 0.17, 0.44, 0.66 ve 0.76 mg / L Ru içerdiği belirlenmiştir. Sisplatin doz-yanıt eğrisinin aksine, PMC79'a maruz kalan larvalarda gecikmiş kuluçka gözlenmedi. Koryonlar, larva toplanmasından önce doğal olarak parçalandıkları için Rutenyum analizine dahil edilmedi. Araştırmacılar, 24 dpf'de koryonları dekoryonlaştırarak ve toplayarak gecikmeli kuluçka olmadan koryon analizini içerebilir. Her konsantrasyonda analiz edilen larva dokuları içindeki metal kütlesi larva başına 0.19, 0.41 ve 0.68 ng (Ru) idi (Şekil 5). Popülasyonun% 50'si için ölümcül konsantrasyonlar ve / veya dozlar (LC 50 / LD 50), popülasyonların% 50'si için etkili konsantrasyonlar veya dozlar (EC 50 / ED 50) ve gözlenen en düşük yan etki seviyesi (LOAEL) dahil olmak üzere toksikolojik sonlanım noktalarının bir özeti Tablo 3'te bulunabilir.
| Cisplatin | PMC79 Serisi | |||||
| Nominal (mg/L) | μM | Pt (ng) / organizma | Analitik Ru (mg/L) | μM | Ru (ng) / organizma | |
| LC 50/LD50 | 31 (%95 GA: 20.5-34.0) | 158 (%95 CI: 105-174) | 193 (± 130) | 0.79 (%95 CI: 0.43-1.20) | 7.8 (%95 GA: 4.2-11.8) | NA |
| EC50 Serisi | 4.6 | 12.5 | NA | NA | NA | NA |
| ARJANTIN | 3.75 | 15.3 | 8.7 (± 4) | 0.17 | 1.7 | 0.19 (± 0.05) |
Tablo 3: Toksikolojik sonlanım noktaları ile ilişkili çözelti ve metallodrug alımının belirlenmesi. LD50, sisplatin ve PMC79 için sırasıyla Pt ve Ru'nun metal eşdeğeri analizi ile belirlendi. PMC79 için LC50 konsantrasyonları analitik olarak belirlendi. Bununla birlikte, nominal sisplatin konsantrasyonlarının analitik olarak belirlenmesi yapılmamıştır; Sisplatinin çözeltideki bilinen stabilitesi göz önüne alındığında, çözeltideki nominal ve ölçülen konsantrasyonların eşdeğer olacağı varsayılıyordu. Sisplatin maruziyeti için gecikmiş kuluçka bitiş noktası ED50 ve LOAEL açısından değerlendirildi. PMC79'un LOAEL konsantrasyonları analitik olarak belirlendi. LOAEL, kaudal ven ve kuyruk arteri boyunca kanama, spinal eğrilik ve yumurta sarısı kesesi ödemi gibi lezyonları içeriyordu. Tüm %95 güven aralıkları Litchfield Wilcoxon yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır. Bu tablo 24'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: CI = güven aralığı; LC50 = Nüfusun% 50'si için Ölümcül Konsantrasyon; LD50 = Nüfusun% 50'si için Ölümcül Doz; EC50 = Nüfusun %50'si için Etkili Konsantrasyon; LOAEL = gözlenen en düşük yan etki seviyesi.
Şekil 1: Zebra balığı doz-yanıt protokolü. Bu protokol, OECD FET'den uyarlanmış değiştirilmiş bir yaklaşım kullanır. Biorender ile üretilmiştir. Kısaltma: OECD = Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü; FET = balık embriyosu akut toksisitesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doku sindirimi ve ICPMS değerlendirmesi. Sindirim protokolü, zebra balığı larvalarının kompozit bir örneğini sindirmek için etkilidir. Kısaltma: ICPMS = endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi. Biorender ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Cisplatin doz-yanıtı . (A) 5 dpf'de ortalama gecikmiş kuluçka yüzdesi, organizma başına belirlenen ortalama Pt eşdeğerleri ile korelasyon göstermiştir. (B) 5 dpf'deki ortalama öldürücülük yüzdesi, organizma başına ortalama Pt eşdeğerleri ile korelasyon göstermiştir. Yüzde anlamı: N = doz başına 40. Organizma başına Pt (ng): Doz başına >4 kompozit numune. Aralıkları görüntülenen iki deneysel kopya gerçekleştirildi. Bu rakam 24'ten değiştirilmiştir. Kısaltma: dpf = döllenmeden sonraki günler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 7.5 veya 15 mg / L'ye maruz kaldıktan sonra larva ve koryonda bulunan Pt (ng) 'nin karşılaştırılması. Kompozit >3 larva veya koryon; soldan sağa N = 13, 10, 10 ve 11. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Mann-Whitney rank-sum testi P, her iki doz için larva ve koryon arasında 0.001 <. Bu rakam 24'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PMC79 doz-yanıtı . (A) Ortalama öldürücülük yüzdesi, çözeltideki analitik olarak belirlenen ortalama Ru eşdeğerleri (mg / L) ile korelasyon gösterdi. (B) Aynı deneyden döllenmeden 5 gün sonra ortalama öldürücülük yüzdesi, larva başına ortalama Ru eşdeğerleri ile ilişkiliydi. Öldürücülük: N = doz başına 40. Ru (mg / L): N = doz başına 6 kompozit numune. Larva başına Ru (ng) > doz başına 4 kompozit örnek. Aralıkları görüntülenen iki deneysel kopya gerçekleştirildi. Bu rakam 24'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tepe Başına Bekleme Süresi | 4 ms |
| Anahtar Gecikmesi / Tepe Noktası (x10micros) | 2 |
| Süpürme Sayısı | 350 |
| Döngü Sayısı | 1 |
| Cihaz Çözünürlüğü | 300 |
| Algılama Modu | Zayıflatılmış, Deflektör Atlama |
| Park Kütlesi | 98.90594 |
| Element (izotoplar) | Pt (192, 194, 195, 196), Ru (99, 100, 101, 102) Sr (84) |
Tablo 2: ICPMS yöntem parametreleri. Sırasıyla sisplatin ve PMC79'un doku konsantrasyonlarını belirlemek için Pt ve Ru izotoplarının analizi için parametreler. Tank suyu bileşimi ile ilişkili izobarik girişimleri izlemek için Sr dahil edildi. Bu tablo 24'ten değiştirilmiştir. ICPMS = endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, Pt veya Ru içeren metal bazlı antikanser ilaçların verilmesini ve alımını belirlemek için uygulanmıştır. Bu yöntemler daha önce yayınlanmış olmasına rağmen, bu protokol, bu metodolojiyi bir dizi bileşiğe uyarlamak için önemli hususları ve ayrıntıları tartışmaktadır. OECD protokolü, doku sindirimi ve ICPMS analizi ile birleştiğinde, PMC79'un sisplatinden daha güçlü olduğunu ve farklı mekanizmalar öneren farklı doku birikimine neden olduğunu belirlememize izin verdi. Ayrıca, verilen sisplatin dozu ölçüldüğü için, doz-yanıt sonuçları hasta popülasyonlarına ekstrapolasyon yapıldı. Subletal dozlar (örneğin, LOAEL),24 yaşındaki hastalarda intravenöz doz konsantrasyonları ile karşılaştırılabilirdi.
Bu yöntem geniş bir metal ve metal bazlı bileşik spektrumuna uygulanabilse de, analitin fizikokimyasal özelliklerinin dikkatli bir şekilde araştırılması dikkate alınmalıdır. Metal bazlı bileşiklerin çözülmesi çok zor olabilir ve bunu önlemek için çeşitli araçlar kullanılabilir. DMSO gibi araç konsantrasyonlarının OECD protokolünde önerilenden daha yüksek konsantrasyonlarda olması gerekebilir. Bu nedenle, kontrollerin gelişimini yakından izleyerek toksik olmayan bir dozun korunması önemlidir; Maruziyet sırasında embriyoların sürekli sallanması yağışı azaltır. Ek olarak, organometalik bileşikler sulu çözeltide stabil olmayabilir. Bozunma süreci bilinmiyorsa, 24 saatlik çözelti yenilenmesini içeren çalışmalar düşünülebilir veya yenilenmeyen doz-yanıt eğrileriyle karşılaştırılabilir.
OECD Balık Akut Embriyo Toksisite Testi (FET) Numarası 23621'e uyulması önerilir. Ancak, belirli amaçlara uyacak şekilde değişiklikler yapılabilir. Cam kaplar, plastik ve plastikleştiriciler gibi kafa karıştırıcı toksikolojik değişkenlerden kaçınır ve metalleri yumurta suyundan analitleri uzaklaştıracak kadar güçlü bir şekilde adsorbe etmez. Cisplatin gibi fotodegrade olan bileşikler için, pozlamayı ışık döngüsü olmadan yapmak faydalı olabilir.
Zebra balığı doz-yanıt çalışmalarında dekoryonasyon ihtiyacı ile ilgili literatürde çok fazla tartışma vardır25,26,27. 24 hpf'de dekoryonasyon argümanları, koryonun bileşiklerin geçirgenliğini sınırladığını, böylece yanlış negatif sonuçlar veya artırılmış doz-yanıt eğrileri ürettiğini göstermektedir. Bu noktaların değeri olmasına rağmen, dekoryonasyon olmadan çalışmalar yapmak mekanik içgörü sağlayabilir. Bu çalışmalar, sisplatinin alkilleyici aktivitesi nedeniyle embriyoların koryonunda biriktiğini göstermektedir (Şekil 2). Ortaya çıkan adducts yapıyı güçlendirir ve gecikmeli kuluçka ile sonuçlanır. Bununla birlikte, PMC79 ve diğer Ru bazlı antikanser ilaçları bu fenomene neden olmadı27. Birçok kemoterapötik, antikanser aktivitelerini alkilasyon yoluyla yürürlüğe koysa da, PMC79 maruziyeti sonrası gecikmiş kuluçka eksikliği, farklı bir mekanizmaya işaret etmiştir. Dekoryonasyonlu veya dekoryonsuz çalışmalar dikkatlice düşünülmeli veya paralel olarak yürütülmelidir.
Aşağı akış doku sindirimi ve ICPMS analizi sürekli olarak dikkate alınmalıdır. İzobarik girişimlere neden olabilecek reaktiflerin kullanılmasından kaçınılması ve alternatif yöntemlerin uygulanması önerilmektedir. Doz-yanıt çalışmaları sırasında kullanılan reaktifler, nitrik asidi ve oksitleyici potansiyelini etkileyebilir veya reaksiyona sokabilir veya izobarik parazitlere katkıda bulunabilir. Yumurta suyu yapmak için kullanılan tuz çözeltisinin, Ru24'ün spesifik bir izotopu ile örtüşen stronsiyum (Sr) oksitler ürettiği keşfedildi. Tuz konsantrasyonlarının düşürülmesi veya larvaların dikkatlice temizlenmesi bu sorunu iyileştirebilir. Bu nedenlerden dolayı, antimikrobiyal metilen mavisi veya ötenazi maddesi trikainden kaçınılması önerilir. Bunun yerine, mikropları uzaklaştırmak veya larvaları hızlı soğutarak ötenazi yapmak için yumurta suyunu otoklav yapın ve daha sonra havalandırın. Bu adımda, ilgilenilen analit için minimum izobarik girişim ile doğrusal izotopik standart eğriler elde etmek önemlidir.
Bu protokoldeki önemli bir sınırlama, organometalik bileşiklerin sadece metal kalacak şekilde oksitlenmesidir. Bu nedenle metabolizma çalışmaları yapılamaz. Protokol orta verim olarak kabul edilebilse de, doz-yanıt kısmı otomatik kimyasal dağıtım sistemleri ve görüntüleme yardımı ile hızlandırılabilir. Bu protokol, farmakokratik ve toksikokinetik çalışmalar için geniş bir metal ve metal bazlı bileşik spektrumu için modifiye edilebilen ve rafine edilebilen yeni bir metodolojidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbiri tarafından açıklanacak çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Finansman: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Eğitim Hibe T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Ek olarak, Brittany Karas, NINDS, NIH'den T32NS115700 eğitim hibesi ile desteklenmektedir. Yazarlar Andreia Valente ve Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı'nı (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) PMC79 tedariki için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB Strain Zebrafish (Danio reri) | Zebrafish International Resource Center | Wild-Type AB | Wild-Type AB Zebrafish |
| ACS Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | BDH3130-2.5LP | Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes |
| Aquatox Fish Diet (Flake) | Zeigler Bros, Inc. | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed | |
| Artemia cysts, brine shrimp | PentairAES | BS90 | Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed |
| ASX-510 Autosampler for ICPMS | Teledyne CETAC | Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses. | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | CL 2 | Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention |
| Centrifuge tubes | VWR | 21008-105 | Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom |
| Class A Clear Glass Threaded Vials | Fisherbrand | 03-339-25B | Individual glass vials for exposure containment |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | Solvent or vehicle for hydrophobic compounds |
| Fixed Speed Vortex Mixer | VWR | 10153-834 | Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution |
| High Purity Hydrogen Peroxide | Merk KGaA, EDM Millipore | 1.07298.0250 | Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion |
| High Purity Nitric Acid | EDM Millipore | NX0408-2 | Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands, Inc. | Instant Ocean® Sea Salt | Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml |
| Mars X Microwave Digestion System | CEM, Matthews, NC | Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). | |
| Multi-element Solution 3 | SPEX CertiPREP | CLMS-3 | Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses |
| Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS) | Nu Instruments/Amatek | Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. | |
| Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140 | National Institute of Standards and Technology | 3140 | Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses |
| Platinum (Pt) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100040-2 | Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl |
| Ruthenium (Ru) standard solution, single-element | High Purity Standards | 100046-2 | Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl |
| TetraMin Tropical Flakes | Tetra | 77101 | Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed |
| Trace Metal Grade Nitric Acid | VWR BDH Chemicals | 87003-261 | Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler |
| Ultrasonic water bath | VWR | B2500A-DTH | Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion |
References
- Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
- Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
- Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
- Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
- Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
- Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B.
- Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
- Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
- Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
- Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G.
- Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
- Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D.
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
- EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
- Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
- Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).
