Summary
この原稿の目的は、マウスで異所性喉頭移植を行うために必要な顕微手術ステップを説明することです。喉頭移植の他の動物モデルと比較したこのマウスモデルの利点は、その費用対効果と免疫学的アッセイとデータの入手可能性です。
Abstract
喉頭異所性移植は、技術的に困難な手順ですが、他の動物モデルと比較して、より多くの科学的分析と費用便益を提供します。2009年にShipchandlerらによって最初に記述されましたが、この技術は、おそらく顕微手術技術の習得の難しさとそれを習得するために必要な時間のために、広く使用されていません。このホワイトペーパーでは、この技術の効果的な使用を促進するために、外科的ステップと回避すべき潜在的な落とし穴について詳しく説明します。
このモデルでは、ドナー喉頭の両側頸動脈がレシピエント頸動脈と外頸静脈に吻合され、移植片を通る血流が可能になります。移植片両側頸動脈の血液充満、移植片の甲状腺の発赤、移植片の微小血管からの出血を可視化することで術中に血流を確認することができます。成功のための重要な要素には、移植血管の繊細な保存、正しいサイズの動脈切開と静脈切開の作成、動脈-動脈および動脈-静脈吻合に適切な数の縫合糸を使用して、漏れのない血管を確保し、閉塞を防ぐことが含まれます。
十分なトレーニングを受ければ、誰でもこのモデルに習熟し、約3時間で手順を実行できます。このモデルが正常に実行されれば、免疫学的研究を簡単かつ低コストで実施することができます。
Introduction
回復不能な喉頭損傷または喉頭癌に苦しむ患者にとって、喉頭全摘出術が唯一の選択肢であることがよくあります1。喉頭全摘出術は、社会的および心理的苦痛を経験することに加えて、患者を自分で呼吸して話す能力を失わせます2。喉頭全摘出術を必要とする喉頭がん患者は、喉頭移植の優れた潜在的候補です。回復不能な喉頭損傷の設定でのヒト喉頭移植が行われてきましたが、腫瘍再発の恐れ、慢性拒絶反応の可能性、およびドナー由来の感染症のために、喉頭の同種移植は現在避けられています3。免疫抑制は、これらの懸念の主な原因です。従来の免疫抑制治療後の腫瘍再発による最初の部分喉頭移植患者の劇的な喪失は、喉頭癌患者への移植をさらに試みる前に、適切な免疫抑制レジメンを考案する必要があるという証拠です4,5。
移植された喉頭に対する宿主免疫応答をよりよく理解するために、ラットにおける最初の喉頭移植モデルは1992年にStromeによって開発され、2002年に外科的技術の改良が加えられた6,7。このモデルは喉頭移植の研究に有効であるが、ラット特異的免疫剤の欠如とラットモデルに関連する高コストは、2009年に喉頭移植を研究するための新しいマウスモデルの開発につながった8。
記載された技術の主な用途は、喉頭移植における異なる免疫抑制薬レジメンを研究することである。現在の免疫抑制療法を改善することで、候補プールが広がり、がん患者の安全な移植につながる可能性があります。このマウスモデルの利点は、その費用対効果と免疫学的データと試薬の幅広い入手可能性です。
喉頭移植の免疫抑制治療レジメンに取り組んでいるチームは、この方法を使用して大量の免疫学的データを収集でき、さまざまな薬物レジメンを迅速にテストして比較できます。幹細胞注射など、移植に対する免疫応答を調節できる他の潜在的な治療法も、このモデルを使用してテストできます。最後に、追跡期間を延長することにより、喉頭移植の長期的な全身効果を観察するための実験を考案することができます。
ここで説明する技術は、端から側への吻合を使用して、異所性喉頭移植片に動脈および静脈の流れを提供します。移植片は、ドナーの喉頭、甲状腺、副甲状腺、気管、食道を含む喉頭気管食道(LTE)複合体であり、両側頸動脈と茎は無傷です。一方のドナー頸動脈はレシピエントの頸動脈に吻合されて動脈血流を提供し、もう一方のドナー頸動脈はレシピエントの外頸静脈に吻合され、静脈血流を提供します(図1)。
マウスモデルでの成功を確実にするために、ラットモデルの外科的技術にいくつかの変更が加えられました。たとえば、麻酔の深さの制御を強化し、合併症を減らすために、注射剤の代わりに吸入麻酔薬が使用されました。連続縫合は、ラットの動脈 - 動脈吻合に使用される。しかしながら、マウス血管のサイズが小さいため、これは技術的に困難であり、血管内腔の狭窄を引き起こす可能性がある7。その結果、中断された縫合糸がマウスモデルで使用され、血管の開存性が改善されます。さらに、ラットモデルでは、上甲状腺動脈(STA)茎を解剖し、視覚化します。マウスのSTAのサイズが小さいことを考えると、この解剖はSTAの損傷、さらには切断をもたらす可能性があります。その結果、マウスモデルでは解剖されない。代わりに、STAが無傷に保たれるように、近くの筋膜が保存されます。
この技術の主な潜在的な落とし穴には、ドナーLTE複雑な茎の損傷、誤ったサイズの動脈切開または静脈切開、吻合部位での血管閉塞、または出血を引き起こす可能性のある吻合部位のギャップの残しが含まれます。これらの失敗を避けるために、STA茎の周りに組織のカフを残してドナー移植片を調達するときは注意が必要です。動脈切開術と静脈切開術は、血流を可能にするのに十分な大きさである必要がありますが、漏れを防ぐのに十分小さい必要があります。吻合部が隙間を埋めるために適切な数の縫合糸を使用する必要がありますが、血管を閉塞するには多すぎないでください。
顕微手術技術に精通している場合、この手順は約3時間で実行できます。この喉頭移植モデルは、マウスで確実に実施することができ、血管新生複合同種移植後の宿主免疫応答の研究に使用できます。
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Protocol
この研究は、メイヨークリニックの施設動物管理および使用委員会(IACUC)に準拠して実施されました。BalbCマウス(10-12週齢)をドナーとして使用し、C57/BL6マウス(10-12週齢)をレシピエントとして使用したのは、それらの主要な組織適合遺伝子複合体であるH-2DbおよびH-2Kbがそれぞれ免疫学的に不適合であり、したがって移植片に対する免疫応答をさらに研究することができるためである。手術中に使用されたすべての器具は滅菌され(補足図 S1 および 補足図S2を参照)、IACUCの指示に従ってプロトコル全体を通して手術野を無菌状態に保ちました。
1.ドナー手術と移植片調達
- 手順を開始する前に、徐放性ブプレノルフィン(3.25 mg / kg体重を皮下投与)をドナーに注射します。.マウスをげっ歯類の麻酔ボックスに入れて、1 L / minO2 フローで送達される3%イソフルランで麻酔導入します。動物が完全に麻酔された後、マウスをシェービング領域に移し、麻酔の維持のために1 L / minO2 フローで1.5%イソフルランを投与します。つま先ピンチで麻酔の深さを確認します。
- マウスの胸と首を顎のラインまで剃り、脱毛クリームを塗ります。30秒後、水で濡らした滅菌ガーゼパッドでクリームを拭き取り、マウスを手術領域に移します。
- マウスの目に目の潤滑剤を塗ります。適切な体温を確保するために、ドレープされた補助加熱パッドにマウスを置きます。
- マウスを固定し、ポビドンヨードとアルコールで手術部位を3回準備してから、マウスをドレープします。
注:つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、手順全体を通してフェイスマスクを介して1.5%イソフルランと1 L / minO2の流れで麻酔を維持します。 - 胸骨上ノッチのすぐ上に小さな水平切開を行います。細かいハサミを使用して、その切開部を通して下顎骨まで皮膚を両側に持ち上げます。台形の皮膚部分を切除し、両側唾液腺、胸骨乳突筋、二腹筋、および胸骨の優れた側面を露出させます(図2A)。
- 両側唾液腺を切除し、腺を通る小さな静脈が視覚化される上部で焼灼を使用します(図2A)。
注意: 腺を取り除く前に血管を焼灼するように注意しないと、このステップで重大な出血が発生する可能性があります。 - リンパ組織と脂肪組織を横方向に静かに引っ込めて、胸骨乳突起とストラップの筋肉を露出させます。両側の胸骨乳突筋を周囲の組織から解剖し、開創器を使用して横方向に引っ込めます。
注意: この操作により、ストラップの筋肉を備えたLTE複合体が完全に露出し、頸動脈を解剖するための快適な作業スペースが提供されます(図2B)。 - ストラップの筋肉の間に正中線を切開し、両側に切除し、下にある甲状腺を傷つけないように注意し、LTE複合体に残します。
注意: このステップの後、両側頸動脈が見えるはずです(図2C)。 - 総頸動脈を下鎖骨のレベルまで、頸動脈分岐部を上方に円周方向に解剖する。頸動脈から迷走神経と内頸静脈を解剖します。調達した移植片にそれらを含めないでください。
注:上甲状腺動脈は、内側に移動する分岐点よりもすぐ上に見えます。この血管を囲む薄い筋膜はそのままにして、円周方向に解剖しようとしないでください。この血管はLTE複合体に血流を供給し、移植後に茎として機能します。この船の保存は最も重要です。 - 内頸動脈と外頸動脈を結紮して分裂させることができるほど十分に高く解剖します。血管の視覚化が困難な場合は、別のリトラクターを使用して顎二腹筋を横方向に引っ込めます。
注意: 上甲状腺動脈への損傷を防ぐために、分岐部に近い外頸動脈を解剖することは避けてください。このステップでは、外頸動脈から分岐し、内頸動脈と平行に続く後頭動脈に遭遇する可能性があり、より大きく、より深く見られる内頸動脈と混同しないでください(図2D)。 - 8-0を使うナイロン縫合糸は、頸動脈分岐部より2〜3mm優れた内頸動脈を結紮する。上甲状腺動脈の分岐点より少なくとも3 mm上の外頸動脈を結睭にします。
注:これらの結紮後、LTE複合体は上甲状腺動脈 を介して 両側頸動脈に足を取られます。 - 総頸動脈を胸骨の高さで結紮し、結紮された血管をすべて両側に切断します。さらなる解剖中の偶発的な損傷を避けるために、血管茎をLTE複合体の上に保ちます。ガス漏れや不注意による麻酔の喪失を防ぐために、気道を切る前に動物の有効期限が切れていることを確認してください。
- 舌骨下筋を舌骨のレベルで分割します。舌骨のすぐ下の前咽頭切開術を作成します。切開部を椎前筋膜まで運び、LTE複合体を上手に解放します。
- 第5気管リングの下の気管を横断し、切開部を食道を通って椎前筋膜まで運び、LTE複合体を下方に解放します。気管と食道を下の椎骨前筋膜から下方向から上方向へと解放します。
注意: さらなる解剖中の偶発的な損傷を避けるために、血管茎をLTE複合体の上に保ちます。 - 舌骨のすぐ下の前咽頭切開術を作成します。切開部を椎前筋膜まで運び、LTE複合体を上手に解放します。LTE複合体と周囲の組織の間で残りのリンパ系または結合組織の付着物を分割します。移植片を取り除きます。
注意: 移植片には、ドナーの喉頭、気管、甲状腺、副甲状腺、食道、および喉頭筋が複合ユニットとして含まれています(図2E)。
2.グラフトの準備
- 調達した移植片を滅菌ペトリ皿に入れ、通常の生理食塩水で洗って血栓を取り除きます。マイクロ鉗子を使用して、両側頸動脈から血液と血栓をやさしく搾乳します。1mmのマイクロ拡張器を使用して両側頸動脈を拡張します。
- 30 Gの鈍い先端の針を使用して、各頸動脈に約2 mLのヘパリン化生理食塩水を注入し、移植片を洗い流します。
注:血液と生理食塩水が対側頸動脈と小さな自由血管の端から洗い流されているのが見られ、無傷の上甲状腺動脈が確認されます。 - 外膜を動脈端から切り取って、吻合のためにきれいな縁を作ります。
注:移植片はヘパリン処理生理食塩水に残すことができ、レシピエントに移植する前に最大3時間短い休憩を取ることができます9。
3.レシピエント手術と血管の吻合
- 麻酔導入、剃毛、および外科的準備ステップに続くドナーについて説明したのと同じ方法でレシピエントマウスを準備する。手術開始の30分前に、レシピエントマウスに徐放性鎮痛剤を皮下注射します。
- メスを使用して、顎のラインから下にある胸骨まで伸びる正中線の首の切開を行います。左側の皮膚を持ち上げ、横方向に引っ込めます。
- 左唾液腺を切除し、前述のように上血管を焼灼する。目に見える血管を低温焼灼で分割し、下にある外頸静脈を傷つけないように注意して、脂肪組織とリンパ組織を切除します(図3A)。
- 外頸静脈を円周方向に解剖します。吻合のために血管の少なくとも5mmの明確な長さを使用してください。低温焼灼または結紮液を使用して、頸静脈から分岐する比較的大きな静脈を分割します。
- 胸骨乳突筋を解剖し、横方向に引っ込めます。解剖した静脈を筋肉の後ろで保護して、開創器との直接接触を避けてください。
- 左ストラップの筋肉を切除して、レシピエント頸動脈にアクセスします。鎖骨から頸動脈分岐部まで総頸動脈を円周方向に解剖する(図3B)。
- 背景資料を外頸静脈の下に通し、二重近似V3血管クランプを適用します。
- 目的の静脈切開の位置に外頸静脈の前壁に10-0ナイロン縫合糸を置き、この縫合糸を使用して前方に引っ張り、血管をテント張ります。
- 適切なサイズのシングルスリット静脈切開を作成するのに十分な深さのマイクロハサミで縫合糸にカットし、カットが静脈壁を完全に貫通していることを確認します。
- 30 Gの先端が鈍い針を使用して、静脈の内側をヘパリン化生理食塩水で洗い流します。
- ドナーLTE複合体をレシピエントの左頸動脈と左外頸静脈の間に配置します。ドナー左頸動脈の自由端をレシピエントの左外頸静脈に合わせ、鋭いハサミで血管の端を面取りします。
- 4本の10-0ナイロン中断縫合糸を用いて、ドナーは頸動脈を左に、レシピエントは外頸静脈を端から左右に吻合した。
- 背景物質をレシピエントの共通頸動脈の下にスライドさせ、二重近似A3血管クランプをレシピエントの共通頸動脈に配置します。静脈切開と同じ方法で動脈切開を作成します。
注意: 動脈切開術がドナー頸動脈の内腔と同じサイズであることを確認してください。大きすぎると、クランプを取り外した後に大量の出血が発生します。小さすぎると、移植片への血流が妨げられます。 - ドナー右頚動脈をレシピエント左頚動脈に吻合し、6本の10−0ナイロン中断縫合糸を用いて端から左右にした。
注:正しい微小血管技術は、血管吻合全体を通して尊重されるべきです。後壁を通過すると、血流がかなり収縮し、移植片の生存が危険にさらされます。血管のサイズが小さいため、縫合糸をやり直そうとすることは非常に困難です。 - 静脈側のクランプを取り外します。出血が発生した場合は、綿の先端で穏やかな圧力をかけてください。
- 動脈のクランプを外し、すぐに綿の先端で穏やかな圧力をかけます。
注:このステップでは出血が予想され、通常は穏やかな圧力で1分後に止まります。 - 動脈と静脈の血流の完全性を確認してください。
注:無傷の動脈流では、ドナー頸動脈の脈動が通常見られ、ドナー甲状腺は紅潮した透明な色から元の赤みがかった色に戻ります。LTE複合体上の小血管の赤い着色も観察することができます。 - ヘパリン化生理食塩水で手術野を洗浄し、5-0モノフィラメント縫合糸で皮膚切開部をランニング方式で閉じます。切開部に抗生物質軟膏または皮膚接着剤を塗布します。
- 手術中の体液損失を考慮して、1mLの温かい生理食塩水を皮下注射します。
- 麻酔を停止し、マウスを回復ケージに移します。低体温症を避けるために、完全に目覚めるまで加熱パッドでマウスを観察します。
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Representative Results
移植成功の確認
上記のプロトコルを使用して、血管クランプを取り外した後のドナー頸動脈の脈動を観察することによってLTE複合体への血流を評価することができる。脈動は通常目に見え、ドナー動脈の即時の赤い着色は活発な血流を確認します(図4A)。吻合が効果的でない場合、動脈は脈動がなく、部分的につぶれているように見え、色が薄くなります(図4B)。
動脈開存性を確認する別の技術は、クランプが取り外された後のドナー甲状腺の色の変化を探すことです。甲状腺の色の変化は数分以内に現れます。ドナー甲状腺の右葉も動脈の流れで赤くなります。これとは対照的に、動脈側から遠く離れた左葉は、適切な流れを受けるのに時間がかかります。ドナーLTE複合体上の小さな自由血管端部を通る血流は、追加の確認と見なすことができる。
移植喉頭気管複合体の調達
15日後、レシピエントと移植されたLTE複合体を収穫します。吻合動脈の開存性は、周囲のレシピエント組織から遊離したLTE複合体を解剖し、端から側への吻合を視覚化することによって評価することができる(図4A)。移植されたLTE複合体は、一般に、この時点で線維性組織の層に封入される。切除されたミスマッチ同種移植片は、通常、線維性被膜形成のために天然の喉頭と比較して大きくなります(図5A)。同種移植片拒絶反応の設定では、免疫抑制の非存在下で15日後に、レシピエントは移植された同種移植片10への血流を欠如している可能性が高い。
移植喉頭の組織学的評価
以前に開発されたマウス喉頭移植拒絶反応等級付けシステムによれば、免疫抑制の非存在下での移植喉頭の完全な拒絶反応は、典型的には15日目から10日目に観察される。喉頭軟骨は主に分解され、細胞性が著しく低下します。有核細胞密度は、脂肪および筋肉組織においても減少する。リンパ球浸潤ははっきりと見ることができます, 甲状腺卵胞は移植された同種移植片に存在しませんが. 補足図S3 は、15日目に拒絶された移植喉頭と比較した摘出したばかりの天然喉頭組織像を示す。
図1:ドナー喉頭はレシピエント喉頭と並行して移植されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:喉頭気管の複雑な解剖学的構造と調達ステップ 。 (A)唾液腺が横方向に引っ込められ、筋肉が縛られていることを示す表在性頸部郭清。(B)右胸骨乳突筋の収縮により、ストラップ筋とその下にあるLTE複合体に簡単にアクセスできます。(C)ストラップの筋肉を取り外した後、喉頭、気管、両側甲状腺、および頸動脈鞘構造が見えます。 (D)右後頭動脈は外頸動脈から起点し、後方に移動するのが見られます。(E)喉頭、気管、両側甲状腺、頸動脈、食道が見える切除ドナーLTE複合体。略語:CCA =総頸動脈;Di =二腹筋;ECA =外頸動脈;エソ=食道;Hy =舌骨;ICA =内頸動脈;IJV =内頸静脈;L =喉頭;OA=後頭動脈;S =唾液腺;Sm =胸骨乳突筋;St =ストラップの筋肉。STA =上甲状腺動脈;T =気管;あなたの=甲状腺;V =唾液腺を通過する血管。Vg =迷走神経。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:レシピエントの首の解剖学的構造と移植の正しい位置 。 (A)脂肪およびリンパ組織の解剖後に露出した左外頸静脈。(B)円周方向に解離した左頸動脈が見られ、迷走神経と内頸静脈が横方向に引っ込められています。略語:CCA =総頸動脈;EJV =外頸静脈;IJV =内頸静脈;L =喉頭;S =唾液腺;Sm =胸骨乳突筋;St =ストラップの筋肉。T =気管;Vg =迷走神経。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:動脈および静脈吻合の結果。 (A)陽性結果:動脈吻合が機能し、ドナー総頸動脈の真っ赤な発色、および血管壁の崩壊がないドナー喉頭(青い矢印)。(B)陰性結果:総頸動脈は、動脈吻合が損なわれ、血流がなく、青白く、部分的に虚脱している(青い矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:移植されたLTE複合体の調達 。 (A)術後15日目のドナー左頸動脈からレシピエント右頸動脈への端部から側方への吻合の肉眼的評価。移植後15日目に見える端から側への吻合の画像(黒い矢印)。移植された喉頭は、線維性カプセル(青い矢印)に囲まれた開創器の隣にも見えます。(B)移植されたLTE複合体同種移植片と天然喉頭の肉眼的比較。右側は15日目に免疫抑制がない場合に移植された喉頭であり、左側はレシピエントのネイティブ喉頭です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:ドナー手術器具。 (1)8-0ナイロン縫合糸。(2)滅菌綿の先端。(3)ペーパークリップから作られ、滅菌されたリトラクター。(4)35mmの滅菌済み使い捨てペトリ皿。(5)滅菌包帯。(6)滅菌ガーゼパッド。(7)低温マイクロ微細先端焼灼。(8)アドソン組織鉗子。(9)細かいはさみ。(10)ニードルホルダー。(11)バンナパターンはさみ湾曲、7mmの刃先。(12)外膜はさみストレート、19mmの刃先。(13)バンナスプリングはさみ湾曲、3mmの刃先。(14)容器拡張器-直径0.1mm。(15)ストレートマイクロ鉗子。(16)角度付きマイクロ鉗子。(17)滅菌解剖板。(18)25Gの精密グライドニードル。(19)30Gの標準的な鈍い針。(20)3mLルアーロックチップシリンジ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:レシピエント手術器具。 (1)35mmの滅菌済み使い捨てペトリ皿。(2)滅菌綿の先端。(3)微小血管近似器クランプ-0.4-1mm血管直径。 (4)シングルミニベッタンクランプ。(5)ミニスキン接着剤。(6)低温マイクロ微細先端焼灼。(7)30Gの標準的な鈍い針。(8)3mLルアーロックチップシリンジ。(9)5-0モノクリル縫合糸。(10)10-0ナイロン縫合糸。(11)メルシャン視認性背景材・必要箇所がカットされる。(12)滅菌包帯。(13)滅菌ガーゼパッド。(14)ペーパークリップから作られ、滅菌されたリトラクター。(15)デベイキー鉗子。(16)ニードルホルダー。(17)細かいはさみ。(18)鉗子を適用するクランプ。(19)組織鉗子(20)バンナパターンはさみ湾曲、7mmの刃先。(21)外膜はさみストレート、刃先19mm。(22)バンナスプリングはさみ湾曲、3mmの刃先。(23)ストレートマイクロ鉗子。(24)容器拡張器-直径0.3mm。(25)容器拡張器-直径0.1mm。(26)角度の付いたマイクロ鉗子。(27)滅菌解剖板。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:手術後15日目のH&E染色を使用したドナーとレシピエントの喉頭の組織学的評価。 (A)右の15日目に在来の切除されたばかりの喉頭および(B)移植後の喉頭。軟骨は著しく減少した細胞性を示す(青い矢印)。筋細胞は、天然の筋肉(赤い矢印)と比較して、移植で核の喪失を示します。天然組織(緑色の矢印)で容易に見える甲状腺卵胞は、移植組織には存在しない。移植組織の周りの顕著なリンパ球浸潤が右側に見えます(黒い矢印)。スケールバー = 500 μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
喉頭がんの発生率と有病率は、過去30年間でそれぞれ12%と24%増加しており、これらの患者の多くは治療のために喉頭切除術を受けています10。この手順は人の生活の質を著しく悪化させるため、代替治療が望まれます。喉頭の血管化複合同種移植は、患者の呼吸能力および発話能力を改善することができる。ただし、この技術をこの患者集団に臨床的に利用する前に、まだ研究が必要です。この論文は、さまざまな免疫抑制レジメンの調査を可能にする喉頭移植の費用効果の高いマウスモデルを提供します。
この手順には、手術の成功を左右する可能性のあるいくつかの重要なステップがあります。ドナーにとって、茎の損傷を避けるために、解剖を上甲状腺動脈から遠ざけることが重要です。喉頭を調達するときは、茎を保護し、血管のねじれを避けるために、上甲状腺動脈の周りに筋膜のカフを残すことも重要です。移植片を生理食塩水で洗い流すときは、茎の完全性を確認する必要があります。正しく調達されていれば、血液は反対側の頸動脈と移植片を覆う小さな毛細血管から流れ出るはずです。
次の重要なステップは、動脈切開と静脈切開の作成です。縫合糸を血管に通して血管壁にテントを張るときは、外膜だけでなく内腔に出入りするようにしてください。このようにして、単一のスリット動脈切開術と静脈切開術は血管の内腔を露出させ、血流を可能にします。動脈切開と静脈切開を行う場合、開口部は血流を可能にするのに十分な大きさである必要がありますが、漏れを防ぐのに十分な大きさである必要があります。開口部が小さすぎる場合は、ドナー血管内腔のサイズに合わせて拡張することができます。
最後に、動脈と静脈の吻合を行うことは、最も困難ですが、手術の最も重要な部分でもあります。最も重要な側面は、配置する縫合糸の適切な数を決定することです。最初の縫合糸を配置する前にこれを評価して、それに応じて均一な間隔を計画できるようにするのが最善です。縫合糸を配置しすぎると、血流が妨げられ、内皮の損傷が大きくなります。縫合糸の配置が少なすぎると、内腔の隙間から血液が漏れる可能性があります。この研究で使用したマウスのサイズでは、一般的に4本の縫合糸が静脈によく機能し、6本の縫合糸が動脈にうまく機能します。動脈は、その高圧血流のためにより多くの縫合糸を必要とする。
この手術を完成させるために、研究を通していくつかの変更が加えられました。当初、注射可能な麻酔が使用され、おそらく麻酔薬の過剰摂取による死亡率が高くなり、術後の回復時間は約3時間でした。吸入麻酔に切り替えると、死亡率が大幅に低下し、術後回復時間は約30分に短縮されました。別の改善は、移植片を洗い流すための鈍い針の使用でした。もともと、斜めの針が使用されていたため、ドナー頸動脈に不注意な裂傷が生じ、血管の損傷や漏れを引き起こしていました。最後に、対照的な背景素材の使用がこのプロトコルで導入されました。血管の下に緑色の背景素材を使用すると、吻合中の視覚化が向上し、血管を持ち上げてアクセスしやすくなりました。
最初の手術中のトラブルシューティングは、移植片への動脈血流がないという問題の解決に焦点を当てていました。これは動脈吻合部位の流れの閉塞による可能性が高いと仮定します。これを修正するために、ドナー頸動脈にもっと劇的な斜角を作り、レシピエント頸動脈と同じ高さになるようにしました。吻合を縫合する際は、縫合糸をできるだけ少なくし、血管が自転しないように四角い結び目を確認した。
このモデルを使用する場合、留意すべきいくつかの技術的な制限があります。動脈の脈動を確認したり、移植後の甲状腺の初期補充を観察したりしても、LTE複合体が継続的な血流を持つことを常に保証するわけではありません。さまざまな時点で吻合開存性を確認するには、ドップラー超音波検査などのより高度な技術を使用する必要があります。免疫拒絶反応による血流喪失と失敗した手術技術をよりよく区別するために、継続的な血流モニタリングツールをさらなる研究で実装することができます。このプロトコルのもう一つの制限は、エラーの余地がほとんどないことです。ドナーまたはレシピエントの血管の1つが裂けた場合、手順を正常に完了する方法はありません。さらに、異所性移植として、ドナー喉頭は完全に機能する器官ではない。このモデルは免疫応答の研究に役立ちますが、移植片は実際には気道に接続されておらず、再神経支配が行われていないため、移植された喉頭の機能評価を行うことはできません。
このプロトコルの最も重要な貢献は、免疫学的アッセイ、抗体、およびデータのコスト削減と可用性の向上です。喉頭移植は、ラット、イヌ、およびブタで以前に発表されています。しかし、これらの動物はより高価であり、利用可能な免疫学的アッセイおよびデータは少ない11、12、13。ラットにおけるこの手順の30日間の死亡率は41%であることがわかりました11;マウスの経験では、この数は5%に減少しました。最後に、喉頭移植のための吸入麻酔薬の使用は、ほとんどの公開された喉頭移植動物モデルがペントバルビタール8,11,14などの注射可能な麻酔薬を使用しているため、このプロトコルに固有です。吸入麻酔薬は回復時間を大幅に短縮し、注射可能な麻酔薬よりも麻酔薬の深さをより細かく制御できます。麻酔薬デリバリーマスクは、首を伸ばすことで正しいポジショニングにも役立ちます。
この移植モデルにはいくつかの用途があります。最も重要なのは、血管新生複合同種移植に対する免疫応答を評価し、さまざまな免疫抑制レジメンをテストする能力です15、16、17。さらに、このモデルは、非機能動脈吻合、非機能静脈吻合、または拒絶反応によるアテローム性動脈硬化症の設定で血管系を研究するために使用できます。この論文では、LTE複合体をあるマウスから別のマウスに~3時間で異所的に移植する方法を概説します。この実現可能で比較的低コストのモデルは、LTE複合体の拒絶における免疫系の役割を研究する上でかなりの可能性を提供し、それによって臓器移植における新しい治療法の可能性を提供します。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。エゲハン・サレプチの研究のための旅費と生活費は、トルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)によって資金提供されました。
Acknowledgments
ランドール・レイシュの優れたビデオ撮影と編集支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
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