Summary
El objetivo de este manuscrito es describir los pasos microquirúrgicos necesarios para realizar un trasplante de laringe heterotópico en ratones. Las ventajas de este modelo de ratón en comparación con otros modelos animales de trasplante de laringe son su costo-efectividad y la disponibilidad de ensayos y datos inmunológicos.
Abstract
El trasplante heterotópico laríngeo, aunque es un procedimiento técnicamente desafiante, ofrece más análisis científicos y beneficios de costos en comparación con otros modelos animales. Aunque fue descrita por primera vez por Shipchandler et al. en 2009, esta técnica no es ampliamente utilizada, posiblemente debido a las dificultades para aprender la técnica microquirúrgica y el tiempo requerido para dominarla. Este documento describe los pasos quirúrgicos en detalle, así como las posibles trampas a evitar, con el fin de fomentar el uso eficaz de esta técnica.
En este modelo, las arterias carótidas bilaterales de la laringe del donante se anastomosan a la arteria carótida receptora y a la vena yugular externa, lo que permite el flujo sanguíneo a través del injerto. El flujo sanguíneo se puede confirmar intraoperatoriamente mediante la visualización del llenado de sangre en las arterias carótidas bilaterales del injerto, el enrojecimiento de las glándulas tiroides del injerto y el sangrado de los microvasos en el injerto. Los elementos cruciales para el éxito incluyen la delicada preservación de los vasos del injerto, la realización del tamaño correcto de arteriotomía y venotomía, y el uso del número apropiado de suturas en las anastomosis arterial-arterial y arterial-venosa para asegurar los vasos sin fugas y evitar la oclusión.
Cualquier persona puede dominar este modelo con suficiente capacitación y realizar el procedimiento en aproximadamente 3 h. Si se realiza con éxito, este modelo permite realizar estudios inmunológicos con facilidad y a bajo costo.
Introduction
Para los pacientes que sufren de daño laríngeo irreparable o cáncer de laringe, una laringectomía total es a menudo la única opción1. La laringectomía total deja a los pacientes sin la capacidad de respirar y hablar por sí mismos, además de experimentar angustia social y psicológica2. Los pacientes con cáncer de laringe que necesitan una laringectomía total son excelentes candidatos potenciales para el trasplante de laringe. Mientras que el trasplante laríngeo humano en el contexto de daño laríngeo irreparable ha sido realizado, el alotrasplante de la laringe se evita actualmente en estos pacientes debido al temor a la recurrencia tumoral, la posibilidad de rechazo crónico y las infecciones derivadas del donante3. La inmunosupresión es la causa principal de estas preocupaciones. La pérdida dramática del primer paciente con trasplante laríngeo parcial debido a la recidiva tumoral después del tratamiento inmunosupresor convencional es evidencia de que se debe diseñar un régimen inmunosupresor apropiado antes de realizar nuevos intentos de trasplante en pacientes con cáncer de laringe 4,5.
Para comprender mejor la respuesta inmune del huésped a una laringe trasplantada, el primer modelo de trasplante laríngeo en ratas fue desarrollado en 1992 por Strome, y las mejoras en la técnica quirúrgica se realizaron en 2002 6,7. Aunque este modelo es efectivo para estudiar el trasplante laríngeo, la falta de agentes inmunológicos específicos para ratas y el mayor costo asociado con los modelos de ratas llevaron al desarrollo de un nuevo modelo de ratón para estudiar el trasplante laríngeo en 20098.
La principal aplicación de la técnica descrita es estudiar diferentes regímenes farmacorrectores inmunosupresores en el trasplante laríngeo. La mejora de las terapias inmunosupresoras actuales puede ampliar el grupo de candidatos y dar lugar a un trasplante seguro en pacientes con cáncer. Los beneficios de este modelo de ratón son su rentabilidad y la amplia disponibilidad de datos inmunológicos y reactivos.
Los equipos que trabajan en regímenes de tratamiento inmunosupresores para el trasplante de laringe pueden usar este método para recopilar un gran volumen de datos inmunológicos, y se pueden probar y comparar rápidamente diferentes regímenes farmacológicos. Otras posibles modalidades de tratamiento que pueden modular la respuesta inmune al trasplante, como las inyecciones de células madre, también se pueden probar utilizando este modelo. Finalmente, se pueden diseñar experimentos para observar los efectos sistémicos a largo plazo del trasplante de laringe mediante la extensión del período de seguimiento.
La técnica descrita aquí utiliza anastomosis de extremo a lado para proporcionar flujo arterial y venoso a un injerto de laringe heterotópico. El injerto es un complejo laringotraqueoesofágico (LTE) que comprende la laringe, las glándulas tiroides, las glándulas paratiroides, la tráquea y el esófago del donante, con arterias carótidas bilaterales y pedículos intactos. Una arteria carótida del donante se anastomosa a la arteria carótida receptora y proporciona flujo sanguíneo arterial, mientras que la otra arteria carótida del donante se anastomosa a la vena yugular externa receptora y proporciona flujo sanguíneo venoso (Figura 1).
Se realizaron varias modificaciones a la técnica quirúrgica del modelo de rata para asegurar el éxito en el modelo de ratón. Por ejemplo, se utilizó un agente anestésico inhalado en lugar de un agente inyectable para aumentar el control sobre la profundidad de la anestesia y reducir las complicaciones. La sutura continua se utiliza en la anastomosis arterial-arterial en ratas; Sin embargo, debido al tamaño más pequeño de los vasos de ratón, esto es técnicamente difícil y puede causar estrechamiento de la luz del vaso7. Como resultado, las suturas interrumpidas se utilizan en el modelo de ratón y dan como resultado una mejor permeabilidad de los vasos. Además, en el modelo de rata, el pedículo de la arteria tiroidea superior (STA) se disecciona y visualiza. Dado el tamaño más pequeño del STA en ratones, esta disección podría resultar en daño e incluso transección del STA. Como resultado, no se disecciona en el modelo de ratón. En cambio, la fascia cercana se conserva para garantizar que el STA se mantenga intacto.
Las principales dificultades potenciales de esta técnica incluyen dañar los pedículos del complejo LTE del donante, hacer una arteriotomía o venotomía de tamaño incorrecto, oclusión de vasos en los sitios de anastomosis o dejar huecos en los sitios de anastomosis que pueden causar sangrado. Para evitar estos errores, se debe tener cuidado al obtener el injerto del donante dejando un manguito de tejido alrededor del pedículo STA. La arteriotomía y la venotomía deben ser lo suficientemente grandes como para permitir el flujo sanguíneo, pero lo suficientemente pequeñas como para evitar fugas. Se debe usar un número apropiado de suturas para que las anastomosis cierren cualquier brecha, pero no demasiadas para ocluir los vasos.
Si se obtiene familiaridad con las técnicas microquirúrgicas, este procedimiento se puede realizar en aproximadamente 3 h. Este modelo de trasplante laríngeo se puede realizar de forma fiable en ratones y utilizarse para estudiar la respuesta inmune del huésped después del alotrasplante compuesto vascularizado.
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Protocol
Esta investigación se realizó de conformidad con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones BalbC (10-12 semanas de edad) se utilizaron como donantes y los ratones C57 / BL6 (10-12 semanas de edad) se utilizaron como receptores porque sus principales complejos de histocompatibilidad, H-2Db y H-2Kb, respectivamente, son inmunológicamente incompatibles y, por lo tanto, la respuesta inmune al injerto puede estudiarse más a fondo. Todos los instrumentos utilizados durante la cirugía fueron esterilizados (ver Figura Suplementaria S1 y Figura Suplementaria S2), y el campo quirúrgico se mantuvo estéril durante todo el protocolo según las instrucciones de IACUC.
1. Cirugía de donantes y obtención de injertos
- Inyecte al donante buprenorfina de liberación prolongada (3,25 mg/kg de peso corporal por vía subcutánea) 30 min antes de comenzar el procedimiento. Coloque el ratón en la caja de anestesia para roedores para la inducción de anestesia al 3% de isoflurano administrado con 1 L / min O2 flujo. Después de que el animal esté completamente anestesiado, transfiera el ratón al área de afeitado y administre isoflurano al 1,5% con 1 L / min O2 de flujo para el mantenimiento de la anestesia. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
- Afeite el pecho y el cuello del ratón hasta la línea de la mandíbula y aplica crema depilatoria. Después de 30 s, limpie la crema con una gasa estéril humedecida con agua y transfiera el ratón al área quirúrgica.
- Aplique lubricante para los ojos del ratón. Coloque el mouse en una almohadilla térmica suplementaria para garantizar una temperatura corporal adecuada.
- Inmovilice al ratón, prepare el área quirúrgica tres veces con povidona yodada y alcohol, y luego cubra el ratón.
NOTA: Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie y mantenga la anestesia al 1,5% de isoflurano y 1 L / min de flujo deO2 a través de una máscara facial durante todo el procedimiento. - Haga una pequeña incisión horizontal justo superior a la muesca supraesternal. Usando tijeras finas, eleve la piel bilateralmente a través de esa incisión hasta la mandíbula. Extirpar un segmento de piel de forma trapezoidal que resulta en la exposición de las glándulas salivales bilaterales, los músculos esternomastoides, los músculos digástricos y el aspecto superior del esternón (Figura 2A).
- Extirpar las glándulas salivales bilaterales usando cauterio en la parte superior donde se visualiza una pequeña vena que viaja a través de la glándula (Figura 2A).
NOTA: Si no se tiene cuidado de cauterizar el vaso antes de extirpar la glándula, se puede encontrar un sangrado significativo en este paso. - Retraiga suavemente los tejidos linfoides y adiposos lateralmente para exponer los músculos esternomatoides y de correa. Diseccionar los músculos esternotastoides bilaterales de los tejidos circundantes y retraerlos lateralmente usando retractores.
NOTA: Esta maniobra expondrá completamente el complejo LTE con los músculos de la correa y proporcionará un espacio de trabajo cómodo para la disección de las arterias carótidas (Figura 2B). - Haga una incisión en la línea media entre los músculos de la correa y escúbralos bilateralmente, teniendo cuidado de no dañar la glándula tiroides subyacente y dejándola en el complejo LTE.
NOTA: Después de este paso, las arterias carótidas bilaterales deben ser visibles (Figura 2C). - Diseccionar circunferencialmente las arterias carótidas comunes al nivel de la clavícula inferiormente y al nivel de la bifurcación carotídea superiormente. Diseccionar el nervio vago y la vena yugular interna de las arterias carótidas. No los incluya en el injerto adquirido.
NOTA: La arteria tiroidea superior se puede ver justo superior a la bifurcación que viaja medialmente. Deje intacta la delgada fascia que rodea este vaso y no intente diseccionarlo circunferencialmente. Este vaso suministra el flujo sanguíneo al complejo LTE y servirá como pedículo después del trasplante. La preservación de este recipiente es de suma importancia. - Diseccionar las arterias carótidas internas y externas lo suficientemente superior como para poder ligar y dividir. Si hay dificultad con la visualización de los vasos, use un retractor separado para retraer los músculos digásgricos lateralmente.
NOTA: Evite diseccionar la arteria carótida externa más cerca de la bifurcación para evitar cualquier daño a la arteria tiroidea superior. En este paso, la arteria occipital, que se ramifica desde la carótida externa y sigue paralela a la arteria carótida interna, se puede encontrar y no debe confundirse con la arteria carótida interna, que es más grande y se encuentra más profunda (Figura 2D). - Uso de 8-0 suturas de nylon, ligan las arterias carótidas internas de 2 a 3 mm superiores a la bifurcación carotídea. Ligate las arterias carótidas externas al menos 3 mm superiores al punto de ramificación de la arteria tiroidea superior.
NOTA: Después de estas ligaduras, el complejo LTE se pediculizará a través de las arterias tiroideas superiores a las arterias carótidas bilaterales. - Ligate las arterias carótidas comunes a nivel del esternón y corta todos los vasos ligados bilateralmente. Mantenga los pedículos vasculares en la parte superior del complejo LTE para evitar daños accidentales durante la disección adicional. Para evitar cualquier fuga de gas o pérdida inadvertida de anestesia, asegúrese de que el animal haya expirado antes de hacer cualquier corte de las vías respiratorias.
- Dividir los músculos infrahioideos a nivel del hioides. Crear una faringotomía anterior justo inferior al hioides. Lleve la incisión hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE superiormente.
- Transecto la tráquea por debajo del quinto anillo traqueal y lleve la incisión a través del esófago hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE inferiormente. Libere la tráquea y el esófago de la fascia prevertebral subyacente de una dirección inferior a superior.
NOTA: Mantenga los pedículos vasculares en la parte superior del complejo LTE para evitar daños accidentales durante una disección adicional. - Crear una faringotomía anterior justo inferior al hioides. Lleve la incisión hasta la fascia prevertebral para liberar el complejo LTE superiormente. Divida cualquier unión de tejido linfoide o conectivo restante entre el complejo LTE y el tejido circundante. Retire el injerto.
NOTA: El injerto contiene la laringe, tráquea, glándulas tiroides, glándulas paratiroides, esófago y músculos laríngeos del donante como una unidad compuesta (Figura 2E).
2. Preparación del injerto
- Coloque el injerto obtenido en una placa de Petri estéril y lávelo con solución salina normal para eliminar cualquier coágulo de sangre. Usando micro fórceps, ordeña suavemente la sangre y los coágulos de las arterias carótidas bilaterales. Dilatar las arterias carótidas bilaterales utilizando microdilatadores de 1 mm.
- Con una aguja roma de 30 G, inyecte aproximadamente 2 ml de solución salina heparinizada en cada arteria carótida para enjuagar el injerto.
NOTA: Se puede ver sangre y solución salina saliendo de la arteria carótida contralateral y los pequeños extremos de los vasos libres, lo que confirma las arterias tiroideas superiores intactas. - Extirpe la adventicia lejos de los extremos arteriales para que tengan bordes limpios para la anastomosis.
NOTA: El injerto se puede dejar en solución salina heparinizada y se puede tomar un breve descanso de hasta 3 h antes de trasplantarlo al receptor9.
3. Cirugía del receptor y anastomosis de los vasos
- Prepare el ratón receptor de la misma manera que se describe para el donante después de los pasos de inducción de anestesia, afeitado y preparación quirúrgica. Inyecte al ratón receptor analgésico de liberación prolongada por vía subcutánea 30 min antes del inicio de la cirugía.
- Usando un bisturí, haga una incisión en la línea media del cuello que se extienda desde la línea de la mandíbula superiormente hasta el esternón inferiormente. Eleve la piel del lado izquierdo y retírela lateralmente.
- Extirpar la glándula salival izquierda, cauterizando los vasos superiores como se describió anteriormente. Extirpar el tejido adiposo y linfoide dividiendo cualquier vaso visible con cauterización a baja temperatura, teniendo cuidado de no dañar la vena yugular externa subyacente (Figura 3A).
- Diseccionar la vena yugular externa circunferencialmente. Use al menos 5 mm de longitud clara del vaso para la anastomosis. Use cauterización a baja temperatura o ligar y divida cualquier vena relativamente grande que se ramifique de la vena yugular.
- Diseccionar el músculo esternomatoideo y retraerlo lateralmente. Mantenga la vena diseccionada protegida detrás del músculo para evitar el contacto directo con el retractor.
- Extirpe los músculos de la correa izquierda para obtener acceso a la arteria carótida receptora. Diseccionar circunferencialmente la arteria carótida común desde la clavícula hacia abajo hasta la bifurcación carotídea superiormente (Figura 3B).
- Pase el material de fondo por debajo de la vena yugular externa y aplique las abrazaderas de vaso V3 de doble aproximación.
- Coloque una sutura de nylon 10-0 a través de la pared anterior de la vena yugular externa en la ubicación de la venotomía deseada y use esta sutura para tirar anteriormente y colocar el vaso.
- Corte la sutura con microtijeras lo suficientemente profundas como para crear la venotomía de una sola hendidura del tamaño adecuado y asegurarse de que el corte sea completamente a través de la pared venosa.
- Con una aguja roma de 30 G, enjuague el interior de la vena con solución salina heparinizada.
- Coloque el complejo LTE del donante entre la arteria carótida izquierda del receptor y la vena yugular externa izquierda. Alinee el extremo libre de la arteria carótida izquierda del donante hacia la vena yugular externa izquierda receptora y biselle los extremos de los vasos con tijeras afiladas.
- Usando cuatro suturas interrumpidas de nylon 10-0, anastomosar la arteria carótida izquierda del donante y la vena yugular externa izquierda del receptor de manera integral a lateral.
- Deslice el material de fondo debajo de la arteria carótida común receptora y coloque las pinzas de doble aproximación del vaso A3 en la arteria carótida común receptora. Crear una arteriotomía de la misma manera que la venotomía.
NOTA: Asegúrese de que la arteriotomía sea del mismo tamaño que la luz de la arteria carótida del donante. Si es demasiado grande, se producirá sangrado profuso después de que se retiren las pinzas. Si es demasiado pequeño, se obstruirá el flujo sanguíneo al injerto. - Anastomosar la arteria carótida derecha del donante a la arteria carótida izquierda receptora de manera integral a lateral utilizando seis suturas interrumpidas de nylon 10-0.
NOTA: Se debe respetar la técnica microvascular correcta durante toda la anastomosis vascular. Pasar a través de la pared posterior resulta en un flujo sanguíneo considerablemente restringido, poniendo en peligro la supervivencia del injerto. Debido al pequeño tamaño de los vasos, tratar de rehacer las suturas es muy difícil. - Retire las pinzas del lado venoso. Si se encuentra sangrado, aplique una presión suave con puntas de algodón.
- Retire las pinzas de la arteria e inmediatamente aplique una presión suave con puntas de algodón.
NOTA: Se espera algo de sangrado en este paso, que generalmente se detiene después de 1 minuto con una presión suave. - Verifique la integridad del flujo sanguíneo en la arteria y la vena.
NOTA: Con el flujo arterial intacto, generalmente se observa pulsación de la arteria carótida del donante, y la glándula tiroides del donante cambia de su color transparente enrojecido a su color rojizo original. También se puede observar la coloración roja de los pequeños recipientes en el complejo LTE. - Irrigar el campo quirúrgico con solución salina heparinizada y cerrar la incisión de la piel con una sutura de monofilamento 5-0 en forma de correr. Aplique ungüento antibiótico o un adhesivo para la piel en la incisión.
- Inyecte 1 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para tener en cuenta la pérdida de líquido durante la cirugía.
- Detenga la anestesia y transfiera el ratón a una jaula de recuperación. Observe el ratón en una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto para evitar la hipotermia.
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Representative Results
Confirmación del éxito del trasplante
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, es posible evaluar el flujo sanguíneo al complejo LTE observando la pulsación de la arteria carótida del donante después de retirar las pinzas de los vasos. La pulsación es típicamente visible, y la coloración roja inmediata de la arteria donante confirma el flujo sanguíneo activo (Figura 4A). Si la anastomosis no es efectiva, la arteria no tendrá pulsación, se verá parcialmente colapsada y será de color pálido (Figura 4B).
Otra técnica para confirmar la permeabilidad arterial es buscar cambios de color en la glándula tiroides del donante después de que se retiren las pinzas; El cambio de color de la glándula tiroides de pálido a rojo es visible en cuestión de minutos. El lóbulo derecho de la glándula tiroides del donante también se enrojece con el flujo arterial. En contraste con esto, el lóbulo izquierdo, que está más lejos del lado arterial, tarda más en recibir un flujo adecuado. El flujo sanguíneo a través de pequeños extremos de vasos libres en el complejo LTE del donante puede verse como una confirmación adicional.
Obtención del complejo laringotraqueal trasplantado
Después de 15 días, se cosechan los complejos LTE receptores y trasplantados. La permeabilidad de la arteria anastomosada se puede evaluar diseccionando el complejo LTE libre del tejido receptor circundante y visualizando la anastomosis de extremo a lado (Figura 4A). El complejo LTE trasplantado generalmente se encapsula en una capa de tejido fibrótico en este punto de tiempo. El aloinjerto extirpado no coincidente suele ser más grande en comparación con la laringe nativa debido a la formación de cápsulas fibróticas (Figura 5A). En el contexto del rechazo del aloinjerto, después de 15 días en ausencia de inmunosupresión, los receptores probablemente tienen flujo sanguíneo ausente al aloinjerto trasplantado10.
Evaluación histológica de la laringe trasplantada
De acuerdo con el sistema de clasificación de rechazo de trasplante laríngeo de ratón previamente desarrollado, el rechazo completo de una laringe trasplantada en ausencia de inmunosupresión se observa típicamente en el día 1510. Los cartílagos laríngeos se degradan en su mayoría con una celularidad marcadamente disminuida. La densidad celular nucleada también disminuye en la grasa y los tejidos musculares. La infiltración linfocítica se puede ver claramente, mientras que los folículos tiroideos están ausentes en el aloinjerto trasplantado. La figura suplementaria S3 muestra la histología de la laringe nativa recién extirpada en comparación con la laringe trasplantada rechazada en el día 15.
Figura 1: La laringe del donante se trasplanta en conjunto con la laringe receptora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Anatomía compleja laringotraqueal y etapas de adquisición . (A) Disección superficial del cuello que muestra las glándulas salivales retraídas lateralmente y los músculos de la correa. (B) La retracción de los músculos esternotastoides derechos proporciona un fácil acceso a los músculos de la correa y al complejo LTE subyacente. (C) Después de la extracción de los músculos de la correa, la laringe, la tráquea, las glándulas tiroides bilaterales y las estructuras de la vaina carotídea son visibles. (D) La arteria occipital derecha se ve originada en la arteria carótida externa y viajando posteriormente. (E) Complejo LTE del donante extirpado con laringe, tráquea, glándulas tiroides bilaterales, arterias carótidas y esófago visibles. Abreviaturas: CCA = arteria carótida común; Di = músculo digástrico; ECA = arteria carótida externa; Eso = esófago; Hy = hueso hioides; ICA = arteria carótida interna; VJ = vena yugular interna; L = laringe; OA = arteria occipital; S = glándula salival; Sm = músculo esternomastoideo; St = músculos de la correa; STA = arteria tiroidea superior; T = tráquea; Tu = glándula tiroides; V = vasos que viajan a través de la glándula salival; Vg = nervio vago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Anatomía del cuello receptor y posición correcta del trasplante . (A) Vena yugular externa izquierda expuesta después de la disección de los tejidos adiposo y linfoide. (B) La arteria carótida izquierda circunferencialmente diseccionada se observa con el nervio vago y la vena yugular interna retraída lateralmente. Abreviaturas: CCA = arteria carótida común; EJV = vena yugular externa; VJ = vena yugular interna; L = laringe; S = glándula salival; Sm = músculo esternomastoideo; St = músculos de la correa; T = tráquea; Vg = nervio vago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados de las anastomosis arteriales y venosas. (A) Resultado positivo: La laringe del donante con una anastomosis arterial funcional, coloración roja brillante de la arteria carótida común del donante y sin colapso de las paredes de los vasos (flecha azul). (B) Resultado negativo: La arteria carótida común, con una anastomosis arterial comprometida y sin flujo sanguíneo, está pálida y parcialmente colapsada (flecha azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Obtención del complejo LTE trasplantado . (A) Evaluación macroscópica de la anastomosis de extremo a lado desde la arteria carótida izquierda del donante hasta la arteria carótida derecha receptora, 15 días después de la cirugía. Imagen de la anastomosis de extremo a lado visible en el día 15 después del trasplante (flecha negra). La laringe trasplantada también es visible junto al retractor rodeado por una cápsula fibrótica (flecha azul). (B) Comparación macroscópica del aloinjerto complejo LTE trasplantado con la laringe nativa. En el lado derecho está la laringe trasplantada en ausencia de inmunosupresión en el día 15 y en el lado izquierdo está la laringe nativa del receptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Instrumentos quirúrgicos de donantes. (1) 8-0 sutura de nylon. (2) Puntas de algodón estériles. (3) Retractores hechos de clips y esterilizados. (4) Placa de Petri estéril y desechable de 35 mm. (5) Vendajes estériles. (6) Gasas estériles. (7) Cauterización de punta fina micro a baja temperatura. (8) Pinzas de tejido Adson. (9) Tijeras finas. (10) Soporte de aguja. (11) Tijeras de patrón Vannas curvadas, filo cortante de 7 mm. (12) Tijeras Adventitia-rectas, filo cortante de 19 mm. (13) Tijeras de resorte Vannas curvadas, filo cortante de 3 mm. (14) Dilatador de vasos-0,1 mm de diámetro. (15) Microfórceps rectas. (16) Microfórceps en ángulo. (17) Tablero de disección estéril. (18) Aguja de deslizamiento de precisión de 25 G. (19) Aguja roma estándar de 30 G. (20) Jeringa de punta luer-lock de 3 ml. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Instrumentos quirúrgicos receptores. (1) Placa de Petri estéril y desechable de 35 mm. (2) Puntas de algodón estériles. (3) Pinza de aproximación microvascular-0.4-1 mm diámetro del vaso. (4) Abrazaderas de mini recipiente individuales. (5) Mini pegamento para la piel. (6) Cauterio de punta fina micro a baja temperatura. (7) Aguja roma estándar de 30 G. (8) Jeringa de punta luer-lock de 3 ml. (9) Sutura monocril 5-0. (10) Sutura de nylon 10-0. (11) Se corta la porción requerida de material de fondo de visibilidad de Mercian. (12) Vendajes estériles. (13) Gasas estériles. (14) Retractores hechos de clips y esterilizados. (15) Pinzas DeBakey. (16) Soporte para agujas. (17) Tijeras finas. (18) Pinza aplicando fórceps. (19)Pinzas tisulares. (20) Tijeras patrón Vannas curvadas, filo cortante de 7 mm. (21) Tijeras Adventitia-rectas, filo cortante de 19 mm. (22) Tijeras de muelle Vannas curvadas, filo cortante de 3 mm. (23) Microfórceps rectos. (24) Dilatador de vasos-0,3 mm de diámetro. (25) Vaso dilatador-0,1 mm de diámetro. (26) Microfórceps en ángulo. (27) Tablero de disección estéril. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Evaluación histológica de las laringes donante y receptora mediante tinción H&E, 15 días después de la cirugía. (A) Laringe nativa recién extirpada y (B) laringe posttrasplantada en el día 15 a la derecha. El cartílago muestra una marcada disminución de la celularidad (flechas azules). Las células musculares muestran pérdida de núcleos en el trasplante en comparación con los músculos nativos (flechas rojas). Los folículos tiroideos fácilmente visibles en el tejido nativo (flecha verde) están ausentes en el tejido trasplantado. La marcada infiltración linfocítica alrededor de los tejidos trasplantados es visible en el lado derecho (flecha negra). Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La incidencia y prevalencia de cáncer de laringe han aumentado en 12% y 24%, respectivamente, durante las últimas tres décadas, y muchos de estos pacientes se someten a una laringectomía para el tratamiento10. Este procedimiento empeora significativamente la calidad de vida de una persona y, por lo tanto, se desea un tratamiento alternativo. El alotrasplante compuesto vascularizado de la laringe puede mejorar la capacidad del paciente para respirar y hablar; Sin embargo, todavía se requiere investigación antes de que esta técnica pueda ser utilizada clínicamente para esta población de pacientes. Este documento ofrece un modelo de ratón rentable de trasplante laríngeo que puede permitir la investigación de varios regímenes inmunosupresores.
Hay varios pasos críticos en este procedimiento que pueden dictar el éxito de la cirugía. Para el donante, es importante mantener la disección alejada de la arteria tiroidea superior para evitar dañar el pedículo. Al procurar la laringe, también es crucial dejar un manguito de fascia alrededor de las arterias tiroideas superiores para proteger los pedículos y evitar la torsión de los vasos. La integridad de los pedículos debe verificarse al enjuagar el injerto con solución salina. Si se obtiene correctamente, la sangre debe fluir fuera de la arteria carótida contralateral y los pequeños capilares que cubren el injerto.
Los siguientes pasos críticos son crear la arteriotomía y la venotomía. Al pasar la sutura a través del vaso para colocar la pared del vaso, asegúrese de que entre y salga a través de la luz, no solo de la adventicia. De esta manera, la arteriotomía de una sola hendidura y la venotomía expondrán la luz del vaso y permitirán el flujo sanguíneo. Al hacer la arteriotomía y la venotomía, la abertura debe ser lo suficientemente grande como para permitir el flujo sanguíneo, pero lo suficientemente pequeña como para evitar fugas. Si la abertura es demasiado pequeña, se puede dilatar para que coincida con el tamaño de la luz del vaso donante.
Finalmente, realizar las anastomosis arteriales y venosas es la parte más desafiante pero también la más crítica de la cirugía. El aspecto más importante es determinar el número adecuado de suturas a colocar. Es mejor evaluar esto antes de colocar la primera sutura para que se pueda planificar un espaciamiento uniforme en consecuencia. Colocar demasiadas suturas hace que el flujo sanguíneo se obstruya, además de causar más daño endotelial. La colocación de muy pocas suturas permite que la sangre se filtre a través de los huecos en la luz. Para el tamaño de los ratones utilizados en este estudio, generalmente cuatro suturas funcionan bien para la vena y seis suturas funcionan bien para la arteria. La arteria requiere más suturas debido a su flujo sanguíneo de mayor presión.
Se hicieron varias modificaciones a lo largo del estudio para perfeccionar esta cirugía. Inicialmente, se utilizó anestesia inyectable, lo que resultó en una mayor tasa de mortalidad, probablemente debido a la sobredosis de anestesia, y un tiempo de recuperación postoperatoria de aproximadamente 3 h. El cambio a anestesia inhalada redujo en gran medida la tasa de mortalidad y disminuyó el tiempo de recuperación postoperatoria a aproximadamente 30 min. Otra mejora fue el uso de una aguja roma para enjuagar el injerto. Originalmente, se utilizó una aguja biselado, lo que provocó desgarros inadvertidos en las arterias carótidas del donante, lo que causó daños en los vasos y fugas. Finalmente, se introdujo el uso de un material de fondo contrastante en este protocolo. El uso de un material de fondo verde debajo de los recipientes permitió una mejor visualización durante las anastomosis y ayudó a elevar los recipientes y hacerlos más fácilmente accesibles.
La solución de problemas durante las cirugías iniciales se centró en resolver el problema de la falta de flujo sanguíneo arterial en el injerto. Nuestra hipótesis es que esto probablemente se debió a la obstrucción del flujo en el sitio de la anastomosis arterial. Para solucionar esto, se hizo un bisel más dramático en la arteria carótida del donante para garantizar que quedara al ras de la arteria carótida receptora. Al suturar la anastomosis, se utilizaron la menor cantidad posible de suturas y se confirmaron nudos cuadrados para evitar que los vasos giraran sobre sí mismos.
Al usar este modelo, hay algunas limitaciones técnicas a tener en cuenta. Confirmar la pulsación de las arterias u observar el relleno inicial de la tiroides después del trasplante no siempre garantiza que el complejo LTE tenga un flujo sanguíneo continuo. Para verificar la permeabilidad de la anastomosis en diferentes puntos temporales, se deben usar técnicas más sofisticadas como la ecografía Doppler. Para diferenciar mejor entre la pérdida de flujo sanguíneo debido al rechazo inmune y la técnica quirúrgica fallida, se podrían implementar herramientas de monitoreo continuo del flujo sanguíneo en estudios adicionales. Otra limitación de este protocolo es que deja poco margen de error. Si uno de los vasos donantes o receptores se rompe, no hay manera de completar el procedimiento con éxito. Además, como trasplante heterotópico, la laringe del donante no es un órgano completamente funcional. Este modelo es útil para estudiar la respuesta inmune, pero dado que el injerto no está realmente conectado a la vía aérea y no se realiza reinervación, no se puede realizar una evaluación funcional de una laringe trasplantada.
La contribución más significativa de este protocolo es la reducción del costo y la mejora de la disponibilidad de ensayos inmunológicos, anticuerpos y datos. El trasplante de laringe se ha publicado previamente en ratas, caninos y cerdos; Sin embargo, estos animales son más caros y hay menos ensayos inmunológicos y datos disponibles11,12,13. La tasa de mortalidad a los 30 días de este procedimiento en ratas fue del 41%11; En nuestra experiencia con ratones, este número se ha reducido al 5%. Finalmente, el uso de anestésico inhalado para el trasplante de laringe es exclusivo de este protocolo, ya que la mayoría de los modelos animales de trasplante laríngeo publicados utilizan un anestésico inyectable, como el pentobarbital 8,11,14. Un agente anestésico inhalado disminuye significativamente el tiempo de recuperación y permite un mayor control sobre la profundidad de la anestesia que los anestésicos inyectables. La máscara de administración anestésica también ayuda con el posicionamiento correcto al extender el cuello.
Hay varias aplicaciones para este modelo de trasplante. Los más significativos son la capacidad de evaluar la respuesta inmune a un alotrasplante compuesto vascularizado y probar diversos regímenes de inmunosupresión15,16,17. Además, este modelo se puede utilizar para estudiar la vasculatura en el contexto de una anastomosis arterial que no funciona, una anastomosis venosa que no funciona o aterosclerosis debido al rechazo. Este documento describe cómo trasplantar heterotópicamente un complejo LTE de un ratón a otro en ~ 3 h. Este modelo factible y de costo relativamente bajo ofrece un potencial considerable en el estudio del papel del sistema inmune en el rechazo del complejo LTE, ofreciendo así el potencial para nuevas terapias en el trasplante de órganos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. Los gastos de viaje y manutención de Egehan Salepci para la investigación fueron financiados por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK).
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Randall Raish por su excelente videografía y asistencia de edición.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
