Summary
O objetivo deste manuscrito é descrever as etapas microcirúrgicas necessárias para a realização de um transplante laríngeo heterotópico em camundongos. As vantagens deste modelo de camundongo em comparação com outros modelos animais de transplante laríngeo são seu custo-efetividade e a disponibilidade de ensaios e dados imunológicos.
Abstract
O transplante heterotópico laríngeo, embora seja um procedimento tecnicamente desafiador, oferece mais análises científicas e benefícios de custo em comparação com outros modelos animais. Embora descrita pela primeira vez por Shipchandler et al. em 2009, essa técnica não é amplamente utilizada, possivelmente devido às dificuldades em aprender a técnica microcirúrgica e ao tempo necessário para dominá-la. Este artigo descreve detalhadamente as etapas cirúrgicas, bem como possíveis armadilhas a serem evitadas, a fim de incentivar o uso efetivo dessa técnica.
Neste modelo, as artérias carótidas bilaterais da laringe doadora são anastomosadas à artéria carótida receptora e à veia jugular externa, permitindo o fluxo sanguíneo através do enxerto. O fluxo sanguíneo pode ser confirmado no intraoperatório pela visualização do enchimento sanguíneo nas artérias carótidas bilaterais do enxerto, vermelhidão das glândulas tireoidianas do enxerto e sangramento dos microvasos do enxerto. Os elementos cruciais para o sucesso incluem a preservação delicada dos vasos do enxerto, a realização do tamanho correto da arteriotomia e venotomia e o uso do número adequado de suturas nas anastomoses arterial-arterial e arterial-venosa para fixar os vasos sem vazamento e prevenir a oclusão.
Qualquer pessoa pode se tornar proficiente nesse modelo com treinamento suficiente e realizar o procedimento em aproximadamente 3 h. Se realizado com sucesso, esse modelo permite que os estudos imunológicos sejam realizados com facilidade e baixo custo.
Introduction
Para pacientes que sofrem de dano laríngeo irreparável ou câncer de laringe, a laringectomia total é muitas vezes a única opção1. A laringectomia total deixa o paciente sem a capacidade de respirar e falar por conta própria, além de vivenciar sofrimento social e psicológico2. Pacientes com câncer de laringe que necessitam de laringectomia total são excelentes potenciais candidatos para o transplante laríngeo. Embora o transplante laríngeo humano no contexto de dano laríngeo irreparável tenha sido realizado, o alotransplante da laringe é atualmente evitado nesses pacientes devido ao medo de recorrência tumoral, à possibilidade de rejeição crônica e às infecções derivadas de doadores3. A imunossupressão é a principal causa dessas preocupações. A dramática perda do primeiro paciente transplantado laríngeo parcial devido à recidiva tumoral após o tratamento imunossupressor convencional é evidência de que um regime imunossupressor apropriado deve ser planejado antes que novas tentativas sejam feitas para transplante em pacientes com câncer de laringe 4,5.
Para melhor compreensão da resposta imune do hospedeiro a uma laringe transplantada, o primeiro modelo de transplante laríngeo em ratos foi desenvolvido em 1992 por Strome, e melhorias na técnica cirúrgica foram realizadas em 2002 6,7. Embora esse modelo seja eficaz para o estudo do transplante laríngeo, a falta de agentes imunológicos específicos para ratos e o maior custo associado aos modelos de ratos levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de camundongo para o estudo do transplante laríngeo em 20098.
A principal aplicação da técnica descrita é estudar diferentes regimes de drogas imunossupressoras no transplante laríngeo. Melhorar as terapias imunossupressoras atuais pode ampliar o pool de candidatos e levar a um transplante seguro em pacientes com câncer. Os benefícios deste modelo de rato são a sua relação custo-eficácia e a ampla disponibilidade de dados imunológicos e reagentes.
Equipes que trabalham em regimes de tratamento imunossupressor para transplante laríngeo podem usar esse método para coletar um grande volume de dados imunológicos, e diferentes regimes de drogas podem ser rapidamente testados e comparados. Outras modalidades de tratamento potenciais que podem modular a resposta imune ao transplante, como injeções de células-tronco, também podem ser testadas usando esse modelo. Finalmente, experimentos podem ser desenvolvidos para observar os efeitos sistêmicos a longo prazo do transplante laríngeo, estendendo o período de acompanhamento.
A técnica aqui descrita utiliza anastomoses extremo-a-lado para fornecer fluxo arterial e venoso a um enxerto de laringe heterotópico. O enxerto é um complexo laringotraqueoesofágico (LTE) que compreende a laringe, as glândulas tireoides, as glândulas paratireoides, a traqueia e o esôfago do doador, com artérias carótidas bilaterais e pedículos intactos. Uma artéria carótida doadora é anastomosada à artéria carótida receptora e fornece fluxo sanguíneo arterial, enquanto a outra artéria carótida doadora é anastomosada à veia jugular externa receptora e fornece fluxo sanguíneo venoso (Figura 1).
Várias modificações foram feitas na técnica cirúrgica do modelo de rato para garantir o sucesso no modelo de camundongo. Por exemplo, um agente anestésico inalado foi usado em vez de um agente injetável para aumentar o controle sobre a profundidade da anestesia e reduzir as complicações. A sutura contínua é utilizada na anastomose artério-arterial em ratos; no entanto, devido ao menor tamanho dos vasos do rato, isso é tecnicamente difícil e pode causar estreitamento do lúmen do vaso7. Como resultado, suturas interrompidas são usadas no modelo de camundongo e resultam em melhor patência do vaso. Além disso, no modelo de rato, o pedículo da artéria tireoidiana superior (IST) é dissecado e visualizado. Dado o menor tamanho do STA em camundongos, essa dissecção pode resultar em danos e até mesmo transecção do STA. Como resultado, ele não é dissecado no modelo do mouse. Em vez disso, a fáscia próxima é preservada para garantir que o STA seja mantido intacto.
As principais armadilhas potenciais desta técnica incluem danificar os pedículos do complexo LTE do doador, fazer uma arteriotomia ou venotomia de tamanho incorreto, oclusão de vasos nos locais de anastomose ou deixar lacunas nos locais de anastomose que podem causar sangramento. Para evitar esses erros, deve-se tomar cuidado ao adquirir o enxerto doador, deixando um manguito de tecido ao redor do pedículo do STA. A arteriotomia e a venotomia devem ser grandes o suficiente para permitir o fluxo sanguíneo, mas pequenas o suficiente para evitar vazamentos. Um número apropriado de suturas deve ser usado para que as anastomoses fechem quaisquer lacunas, mas não muitas para ocluir os vasos.
Se a familiaridade com as técnicas microcirúrgicas for obtida, este procedimento pode ser realizado em aproximadamente 3 h. Este modelo de transplante laríngeo pode ser realizado de forma confiável em camundongos e usado para estudar a resposta imune do hospedeiro após alotransplante composto vascularizado.
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Protocol
Esta pesquisa foi realizada em conformidade com o Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Camundongos BalbC (10-12 semanas de idade) foram usados como doadores e camundongos C57/BL6 (10-12 semanas de idade) foram usados como receptores porque seus principais complexos de histocompatibilidade, H-2Db e H-2Kb, respectivamente, são imunologicamente incompatíveis e, portanto, a resposta imune ao enxerto pode ser mais estudada. Todos os instrumentos utilizados durante a cirurgia foram esterilizados (ver Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2), e o campo cirúrgico foi mantido estéril durante todo o protocolo de acordo com as instruções da IACUC.
1. Cirurgia do doador e obtenção do enxerto
- Injetar o dador com buprenorfina de libertação prolongada (3,25 mg/kg de peso corporal por via subcutânea) 30 minutos antes de iniciar o procedimento. Coloque o rato na caixa de anestesia de roedores para indução anestésica a 3% de isoflurano administrado com fluxo de 1 L/min O2 . Após o animal estar totalmente anestesiado, transfira o camundongo para a área de barbear e administre isoflurano a 1,5% com fluxo O2 de 1 L/min para manutenção da anestesia. Confirme a profundidade da anestesia com uma pitada no dedo do pé.
- Raspe o peito e o pescoço do rato até a linha da mandíbula e aplique creme depilatório. Após 30 s, limpe o creme com uma gaze estéril molhada com água e transfira o rato para a área cirúrgica.
- Aplique lubrificante ocular nos olhos do rato. Coloque o rato numa almofada de aquecimento suplementar drapeada para garantir a temperatura corporal adequada.
- Imobilize o rato, prepare a área cirúrgica três vezes com iodopovidona e álcool e, em seguida, cubra o rato.
NOTA: Verifique a profundidade da anestesia por uma pitada de dedo do pé e mantenha a anestesia a 1,5% de isoflurano e 1 L/min de fluxo O2 através de uma máscara facial durante todo o procedimento. - Faça uma pequena incisão horizontal logo superior ao entalhe supraesternal. Usando uma tesoura fina, eleve a pele bilateralmente através dessa incisão até a mandíbula. Excisar um segmento cutâneo em forma de trapézio, resultando em exposição das glândulas salivares bilaterais, músculos esternomastoideos, músculos digástricos e aspecto superior do esterno (Figura 2A).
- Excisar as glândulas salivares bilaterais usando cauterização na parte superior, onde uma pequena veia que viaja através da glândula é visualizada (Figura 2A).
NOTA: Se não for tomado cuidado para cauterizar o vaso antes de remover a glândula, sangramento significativo pode ser encontrado nesta etapa. - Retraia suavemente os tecidos linfoide e adiposo lateralmente para expor os músculos esternomastoides e da cinta. Dissecar os músculos esternomastoides bilaterais dos tecidos circundantes e retraí-los lateralmente usando afastadores.
NOTA: Esta manobra irá expor totalmente o complexo LTE com músculos da cinta e proporcionar um espaço de trabalho confortável para a dissecção das artérias carótidas (Figura 2B). - Faça uma incisão na linha média entre os músculos da cinta e os extirpe bilateralmente, tomando cuidado para não danificar a glândula tireoide subjacente e deixando-a no complexo LTE.
NOTA: Após essa etapa, as artérias carótidas bilaterais devem estar visíveis (Figura 2C). - Dissecar circunferencialmente as artérias carótidas comuns ao nível da clavícula inferiormente e ao nível da bifurcação carotídea superiormente. Dissecar o nervo vago e a veia jugular interna das artérias carótidas. Não os inclua no enxerto adquirido.
NOTA: A artéria tireoidiana superior pode ser vista apenas superior à bifurcação que viaja medialmente. Deixe intacta a fáscia fina que envolve este vaso e não tente dissecá-la circunferencialmente. Este vaso fornece o fluxo sanguíneo para o complexo LTE e servirá como pedículo após o transplante. A preservação deste navio é de extrema importância. - Dissecar as artérias carótidas internas e externas o suficiente para poder ligar e dividir. Se houver dificuldade com a visualização dos vasos, use um afastador separado para retrair os músculos digástricos lateralmente.
NOTA: Evite dissecar a artéria carótida externa mais perto da bifurcação para evitar qualquer dano à artéria tireoidiana superior. Nesta etapa, a artéria occipital, que se ramifica da carótida externa e segue paralelamente à artéria carótida interna, pode ser encontrada e não deve ser confundida com a artéria carótida interna, que é maior e encontrada mais profunda (Figura 2D). - Usando 8-0 suturas de nylon, ligam as artérias carótidas internas 2 a 3 mm superiores à bifurcação carotídea. Ligue as artérias carótidas externas pelo menos 3 mm superiores ao ponto de ramificação da artéria tireoidiana superior.
NOTA: Após essas ligaduras, o complexo LTE será pediculado através das artérias tireoidianas superiores para as artérias carótidas bilaterais. - Ligue as artérias carótidas comuns ao nível do esterno e corte todos os vasos ligados bilateralmente. Mantenha os pedículos vasculares no topo do complexo LTE para evitar danos acidentais durante a dissecção adicional. Para evitar qualquer vazamento de gás ou perda inadvertida de anestesia, certifique-se de que o animal expirou antes de fazer qualquer corte nas vias aéreas.
- Divida os músculos infra-hióides ao nível do hioide. Criar uma faringotomia anterior apenas inferior ao hioide. Leve a incisão até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE superiormente.
- Transecte a traqueia abaixo do quinto anel traqueal e leve a incisão através do esôfago até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE inferiormente. Libere a traqueia e o esôfago da fáscia pré-vertebral subjacente de uma direção inferior a superior.
NOTA: Mantenha os pedículos vasculares no topo do complexo LTE para evitar danos acidentais durante a dissecção adicional. - Criar uma faringotomia anterior apenas inferior ao hioide. Leve a incisão até a fáscia pré-vertebral para liberar o complexo LTE superiormente. Divida quaisquer anexos linfoides ou de tecido conjuntivo restantes entre o complexo LTE e o tecido circundante. Remova o enxerto.
NOTA: O enxerto contém a laringe doadora, traqueia, glândulas tireoides, glândulas paratireoides, esôfago e músculos laríngeos como unidade composta (Figura 2E).
2. Preparação do enxerto
- Coloque o enxerto adquirido em uma placa de Petri estéril e lave-o com solução salina normal para se livrar de quaisquer coágulos sanguíneos. Usando micro pinça, leite suave o sangue e coágulos para fora das artérias carótidas bilaterais. Dilatar as artérias carótidas bilaterais usando microdilatadores de 1 mm.
- Usando uma agulha de ponta romba de 30 G, injete aproximadamente 2 mL de solução salina heparinizada em cada artéria carótida para lavar o enxerto.
NOTA: Sangue e solução salina podem ser vistos saindo da artéria carótida contralateral e pequenas extremidades de vasos livres, o que confirma artérias tireoidianas superiores intactas. - Exclua a adventícia para longe das extremidades arteriais para que elas tenham bordas limpas para anastomose.
NOTA: O enxerto pode ser deixado em solução salina heparinizada e uma pequena pausa pode ser feita por até 3 h antes de transplantá-lo para o receptor9.
3. Cirurgia do receptor e anastomose dos vasos
- Prepare o rato receptor da mesma forma descrita para o dador após as etapas de indução da anestesia, barbear e preparação cirúrgica. Injete o rato receptor com analgésico de libertação prolongada por via subcutânea 30 minutos antes do início da cirurgia.
- Usando um bisturi, faça uma incisão no pescoço da linha média que se estende da linha da mandíbula superiormente ao esterno inferiormente. Eleve a pele do lado esquerdo e recrai-a lateralmente.
- Excisar a glândula salivar esquerda, cauterizando os vasos superiores como descrito anteriormente. Extirpar o tecido adiposo e linfoide dividindo quaisquer vasos visíveis com cauterização a baixa temperatura, tomando cuidado para não danificar a veia jugular externa subjacente (Figura 3A).
- Dissecar a veia jugular externa circunferencialmente. Use pelo menos 5 mm de comprimento claro do vaso para anastomose. Use cauterização ou ligadura de baixa temperatura e divida quaisquer veias relativamente grandes que se ramificam da veia jugular.
- Dissecar o músculo esternomastóideo e retraí-lo lateralmente. Mantenha a veia dissecada protegida atrás do músculo para evitar o contato direto com o afastador.
- Excise os músculos da alça esquerda para obter acesso à artéria carótida receptora. Dissecar circunferencialmente a artéria carótida comum da clavícula inferiormente até a bifurcação carotídea superiormente (Figura 3B).
- Passe o material de fundo sob a veia jugular externa e aplique as braçadeiras de vaso V3 de aproximação dupla.
- Coloque uma sutura de nylon 10-0 através da parede anterior da veia jugular externa no local da venotomia desejada e use essa sutura para puxar anteriormente e entenda o vaso.
- Corte até a sutura com microtesouras profundas o suficiente para criar o tamanho adequado de venotomia de fenda única e garantir que o corte seja completamente através da parede venosa.
- Usando uma agulha de ponta contundente de 30 G, lave o interior da veia com solução salina heparinizada.
- Coloque o complexo LTE do doador entre a artéria carótida esquerda receptora e a veia jugular externa esquerda. Alinhar a extremidade livre da artéria carótida esquerda do doador em direção à veia jugular externa esquerda receptora e chanfrar as extremidades dos vasos com uma tesoura afiada.
- Usando quatro suturas interrompidas de nylon 10-0, anastomose a artéria carótida esquerda do doador e a veia jugular externa esquerda receptora de forma end-to-side.
- Deslize o material de fundo sob a artéria carótida comum receptora e coloque os grampos duplos aproximados do vaso A3 na artéria carótida comum receptora. Crie uma arteriotomia da mesma forma que a venotomia.
NOTA: Certifique-se de que a arteriotomia é do mesmo tamanho que o lúmen da artéria carótida doadora. Se for muito grande, o sangramento profuso ocorrerá depois que os grampos forem removidos. Se for muito pequeno, o fluxo sanguíneo para o enxerto será obstruído. - Anastomose a artéria carótida direita doadora para a artéria carótida esquerda receptora de forma end-to-side usando seis suturas interrompidas de nylon 10-0.
NOTA: A técnica microvascular correta deve ser respeitada em toda a anastomose do vaso. A passagem pela parede traseira resulta em um fluxo sanguíneo consideravelmente restrito, colocando em risco a sobrevivência do enxerto. Devido ao pequeno tamanho dos vasos, tentar refazer as suturas é muito difícil. - Remova os grampos no lado venoso. Se o sangramento for encontrado, aplique uma pressão suave com pontas de algodão.
- Remova os grampos na artéria e aplique imediatamente uma pressão suave com as pontas de algodão.
NOTA: Algum sangramento é esperado nesta etapa, que geralmente pára após 1 min com pressão suave. - Verifique a integridade do fluxo sanguíneo na artéria e na veia.
NOTA: Com o fluxo arterial intacto, a pulsação da artéria carótida doadora é geralmente vista, e a glândula tireoide doadora muda de sua cor transparente corada de volta para sua cor avermelhada original. A coloração vermelha dos pequenos vasos no complexo LTE também pode ser observada. - Irrigar o campo cirúrgico com solução salina heparinizada e fechar a incisão da pele com uma sutura de monofilamento 5-0 de forma corrida. Aplique pomada antibiótica ou um adesivo de pele na incisão.
- Injete 1 mL de solução salina quente por via subcutânea para explicar a perda de líquidos durante a cirurgia.
- Pare a anestesia e transfira o rato para uma gaiola de recuperação. Observe o mouse em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente acordado para evitar a hipotermia.
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Representative Results
Confirmação do sucesso do transplante
Utilizando o protocolo descrito acima, é possível avaliar o fluxo sanguíneo para o complexo LTE observando a pulsação da artéria carótida doadora após a remoção dos grampos dos vasos. A pulsação é tipicamente visível, e a coloração vermelha imediata da artéria doadora confirma o fluxo sanguíneo ativo (Figura 4A). Se a anastomose não for eficaz, a artéria não terá pulsação, parecerá parcialmente colapsada e será de cor pálida (Figura 4B).
Outra técnica para confirmar a patência arterial é procurar a mudança de cor na glândula tireoide do doador após a remoção dos grampos; A mudança de cor da glândula tireoide de pálida para vermelha é visível em poucos minutos. O lobo direito da glândula tireoide doadora também fica avermelhado com fluxo arterial. Em contraste com isso, o lobo esquerdo, que está mais longe do lado arterial, leva mais tempo para receber o fluxo adequado. O fluxo sanguíneo através de pequenas extremidades de vasos livres no complexo LTE do doador pode ser visto como confirmação adicional.
Captação do complexo laringotraqueal transplantado
Após 15 dias, os complexos LTE receptor e transplantado são colhidos. A perviedade da artéria anastomosada pode ser avaliada dissecando o complexo LTE livre do tecido receptor circundante e visualizando a anastomose término-a-lado (Figura 4A). O complexo LTE transplantado é geralmente encapsulado em uma camada de tecido fibrótico neste ponto de tempo. O aloenxerto incompatível excisado é geralmente maior em comparação com a laringe nativa devido à formação de cápsulas fibróticas (Figura 5A). No contexto de rejeição do aloenxerto, após 15 dias na ausência de imunossupressão, os receptores provavelmente apresentam fluxo sanguíneo ausente para o aloenxerto transplantado10.
Avaliação histológica da laringe transplantada
De acordo com o sistema de classificação de rejeição de transplante laríngeo de camundongo previamente desenvolvido, a rejeição completa de uma laringe transplantada na ausência de imunossupressão é tipicamente observada no dia 1510. As cartilagens laríngeas são em sua maioria degradadas com celularidade acentuadamente diminuída. A densidade de células nucleadas também é diminuída nos tecidos adiposos e musculares. A infiltração linfocítica pode ser vista claramente, enquanto os folículos tireoidianos estão ausentes no aloenxerto transplantado. A Figura S3 suplementar mostra histologia de laringe nativa recém-excisada em comparação com a laringe transplantada rejeitada no dia 15.
Figura 1: A laringe do doador é transplantada em conjunto com a laringe receptora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Anatomia do complexo laringotraqueal e etapas de aquisição . (A) Dissecção superficial do pescoço mostrando as glândulas salivares retraídas lateralmente e os músculos da cinta. (B) A retração dos músculos esternomastoides direitos proporciona fácil acesso aos músculos da cinta e ao complexo LTE subjacente. (C) Após a remoção dos músculos da cinta, a laringe, a traqueia, as glândulas tireoidianas bilaterais e as estruturas da bainha carotídea são visíveis. (D) A artéria occipital direita é vista originando-se da artéria carótida externa e viajando posteriormente. (E) Complexo LTE do doador excisado com laringe, traqueia, glândulas tireoides bilaterais, artérias carótidas e esôfago visíveis. Abreviaturas: CCA = artéria carótida comum; Di = músculo digástrico; ECA = artéria carótida externa; Eso = esôfago; Hy = osso hioide; ACI = artéria carótida interna; IJV = veia jugular interna; L = laringe; OA = artéria occipital; S = glândula salivar; Sm = músculo esternomastóideo; St = músculos da cinta; ATE = artéria tireoidiana superior; T = traqueia; Thy = glândula tireoide; V = vasos que viajam através da glândula salivar; Vg = nervo vago. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Anatomia do colo receptor e posição correta do transplante . (A) Veia jugular externa esquerda exposta após dissecção dos tecidos adiposo e linfoide. (B) A artéria carótida esquerda circunferencialmente dissecada é observada com o nervo vago e a veia jugular interna retraídos lateralmente. Abreviaturas: CCA = artéria carótida comum; EJV = veia jugular externa; IJV = veia jugular interna; L = laringe; S = glândula salivar; Sm = músculo esternomastóideo; St = músculos da cinta; T = traqueia; Vg = nervo vago. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados das anastomoses arterial e venosa. (A) Resultado positivo: Laringe doadora com anastomose arterial em funcionamento, coloração vermelha brilhante da artéria carótida comum do doador e sem colapso das paredes dos vasos (seta azul). (B) Resultado negativo: A artéria carótida comum, com anastomose arterial comprometida e sem fluxo sanguíneo, está pálida e parcialmente colapsada (seta azul). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Captação do complexo LTE transplantado . (A) Avaliação grosseira da anastomose end-to-side da artéria carótida esquerda doadora para a artéria carótida direita receptora, 15 dias após a cirurgia. Imagem da anastomose end-to-side visível no 15º dia pós-transplante (seta preta). A laringe transplantada também é visível ao lado do afastador cercado por uma cápsula fibrótica (seta azul). (B) Comparação grosseira do aloenxerto do complexo LTE transplantado com a laringe nativa. Do lado direito está a laringe transplantada na ausência de imunossupressão no dia 15 e do lado esquerdo está a laringe nativa do receptor. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Instrumentos cirúrgicos do doador. (1) 8-0 sutura de nylon. (2) Ponteiras de algodão estéril. (3) Retratores feitos de clipes de papel e esterilizados. (4) Placa de Petri estéril e descartável de 35 mm. (5) Ligaduras estéreis. (6) Almofadas de gaze estéreis. (7) Cauterização de ponta fina micro de baixa temperatura. (8) Pinça tecidual de Adon. (9) Tesoura fina. (10) Suporte de agulha. (11) Tesoura de padrão Vannas curva, aresta de corte de 7 mm. (12) Tesoura Adventitia reta, aresta de corte de 19 mm. (13) Tesoura de mola Vannas curva, aresta de corte de 3 mm. (14) Dilatador do vaso - 0,1 mm de diâmetro. (15) Micro pinça reta. (16) Micropinça angulada. (17) Placa dissecante estéril. (18) Agulha de deslizamento de precisão de 25 G. (19) Agulha contundente padrão de 30 G. (20) Seringa de ponta luer-lock de 3 mL. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Instrumentos cirúrgicos receptores. (1) Placa de Petri estéril e descartável de 35 mm. (2) Ponteiras de algodão estéril. (3) Braçadeira aproximadora microvascular - 0,4-1 mm de diâmetro do vaso. (4) Braçadeiras únicas do mini navio. (5) Mini cola de pele. (6) Cauterização de ponta fina micro de baixa temperatura. (7) Agulha contundente padrão de 30 G. (8) Seringa de ponta luer-lock de 3 mL. (9) Sutura monocril 5-0. (10) Sutura de nylon 10-0. (11) A parte necessária do material de fundo de visibilidade merciana é cortada. (12) Ligaduras estéreis. (13) Almofadas de gaze estéreis. (14) Retratores feitos de clipes de papel e esterilizados. (15) Pinça de DeBakey. (16) Suporte de agulhas. (17) Tesoura fina. (18) Braçadeira aplicando fórceps. (19)Pinça tecidual. (20) Tesoura de padrão Vannas curva, aresta de corte de 7 mm. (21) Tesoura Adventitia reta, aresta de corte de 19 mm. (22) Tesoura de mola Vannas curva, aresta de corte de 3 mm. (23) Micro pinça reta. (24) Dilatador do vaso - 0,3 mm de diâmetro. (25) Dilatador do vaso - 0,1 mm de diâmetro. (26) Micropinça angulada. (27) Placa dissecante estéril. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S3: Avaliação histológica das laringes doadora e receptora utilizando coloração H&E, 15 dias após a cirurgia. (A) Laringe nativa recém-excisada e (B) laringe pós-transplantada no dia 15 à direita. A cartilagem apresenta celularidade acentuadamente diminuída (setas azuis). As células musculares mostram perda de núcleos no transplante em comparação com os músculos nativos (setas vermelhas). Folículos tireoidianos facilmente visíveis no tecido nativo (seta verde) estão ausentes no tecido transplantado. A infiltração linfocítica acentuada ao redor dos tecidos transplantados é visível no lado direito (seta preta). Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A incidência e a prevalência de câncer de laringe aumentaram 12% e 24%, respectivamente, nas últimas três décadas, e muitos desses pacientes foram submetidos à laringectomia para tratamento10. Este procedimento piora significativamente a qualidade de vida de uma pessoa e, portanto, um tratamento alternativo é desejado. O alotransplante composto vascularizado da laringe pode melhorar a capacidade do paciente de respirar e falar; no entanto, a pesquisa ainda é necessária antes que essa técnica possa ser utilizada clinicamente para essa população de pacientes. Este trabalho oferece um modelo custo-efetivo de transplante laríngeo em camundongos que pode permitir a investigação de vários regimes imunossupressores.
Existem várias etapas críticas neste procedimento que podem ditar o sucesso da cirurgia. Para o doador, é importante manter a dissecção longe da artéria tireoidiana superior para evitar danificar o pedículo. Ao adquirir a laringe, também é crucial deixar um manguito de fáscia ao redor das artérias tireoidianas superiores para proteger os pedículos e evitar a torção dos vasos. A integridade dos pedículos deve ser verificada ao lavar o enxerto com solução salina. Se obtido corretamente, o sangue deve fluir para fora da artéria carótida contralateral e dos pequenos capilares que cobrem o enxerto.
Os próximos passos críticos são a criação da arteriotomia e venotomia. Ao passar a sutura através do vaso para entendar a parede do vaso, certifique-se de que ele entra e sai através do lúmen, não apenas da adventícia. Desta forma, a arteriotomia de fenda única e a venotomia irão expor o lúmen do vaso e permitir o fluxo sanguíneo. Ao fazer a arteriotomia e a venotomia, a abertura deve ser grande o suficiente para permitir o fluxo sanguíneo, mas pequena o suficiente para evitar vazamentos. Se a abertura for muito pequena, ela pode ser dilatada para corresponder ao tamanho do lúmen do vaso doador.
Finalmente, a realização das anastomoses arterial e venosa é a parte mais desafiadora, mas também a mais crítica da cirurgia. O aspecto mais importante é determinar o número adequado de suturas a serem colocadas. É melhor avaliar isso antes de colocar a primeira sutura para que até mesmo o espaçamento possa ser planejado de acordo. Colocar muitas suturas faz com que o fluxo sanguíneo seja obstruído, além de causar mais danos endoteliais. Colocar poucas suturas permite que o sangue vaze através de lacunas no lúmen. Para o tamanho dos camundongos utilizados neste estudo, geralmente quatro suturas funcionam bem para a veia e seis suturas funcionam bem para a artéria. A artéria requer mais suturas devido ao seu fluxo sanguíneo de pressão mais alta.
Várias modificações foram feitas ao longo do estudo para aperfeiçoar esta cirurgia. Inicialmente, foi utilizada anestesia injetável, o que resultou em maior taxa de mortalidade, provavelmente por overdose anestésica, e tempo de recuperação pós-operatória de aproximadamente 3 h. A mudança para anestesia inalatória reduziu muito a taxa de mortalidade e diminuiu o tempo de recuperação pós-operatória para aproximadamente 30 min. Outra melhora foi o uso de uma agulha contundente para lavar o enxerto. Originalmente, uma agulha chanfrada foi usada, o que levou a rupturas inadvertidas nas artérias carótidas doadoras, causando danos nos vasos e vazamento. Finalmente, o uso de um material de fundo contrastante foi introduzido neste protocolo. O uso de um material de fundo verde sob os vasos permitiu uma melhor visualização durante as anastomoses e ajudou a elevar os vasos e torná-los mais facilmente acessíveis.
A solução de problemas durante as cirurgias iniciais concentrou-se em resolver a questão da ausência de fluxo sanguíneo arterial para o enxerto. Levantamos a hipótese de que isso provavelmente se deveu à obstrução do fluxo no local da anastomose arterial. Para corrigir isso, um chanfro mais dramático foi feito na artéria carótida doadora para garantir que ela ficasse nivelada com a artéria carótida receptora. Ao suturar a anastomose, o menor número possível de suturas foi utilizado e nós quadrados foram confirmados para evitar que os vasos girassem sobre si mesmos.
Ao usar esse modelo, há algumas limitações técnicas a serem lembradas. Confirmar a pulsação das artérias ou observar o reenchimento inicial da tireoide após o transplante nem sempre garante que o complexo LTE terá fluxo sanguíneo contínuo. Para verificar a perviedade da anastomose em diferentes momentos, técnicas mais sofisticadas, como a ultrassonografia Doppler, devem ser usadas. Para melhor diferenciar entre a perda de fluxo sanguíneo devido à rejeição imunológica e a falha na técnica cirúrgica, ferramentas de monitoramento contínuo do fluxo sanguíneo poderiam ser implementadas em estudos futuros. Outra limitação a este protocolo é que ele deixa pouco espaço para erros. Se um dos vasos doadores ou receptores se romper, não há como concluir o procedimento com sucesso. Além disso, como um transplante heterotópico, a laringe do doador não é um órgão em pleno funcionamento. Este modelo é útil para estudar a resposta imune, mas como o enxerto não está realmente conectado à via aérea e nenhuma reinervação é feita, a avaliação funcional de uma laringe transplantada não pode ser realizada.
A contribuição mais significativa deste protocolo é a redução do custo e a melhoria da disponibilidade de ensaios imunológicos, anticorpos e dados. O transplante laríngeo foi previamente publicado em ratos, caninos e suínos; no entanto, esses animais são mais caros, havendo menos ensaios imunológicos e dados disponíveis11,12,13. A taxa de mortalidade em 30 dias desse procedimento em ratos foi de 41%11; em nossa experiência com camundongos, esse número reduziu para 5%. Por fim, o uso de anestésico inalatório para transplante laríngeo é exclusivo desse protocolo, pois a maioria dos modelos animais de transplante laríngeo publicados utiliza um anestésico injetável, como o pentobarbital 8,11,14. Um agente anestésico inalado diminui significativamente o tempo de recuperação e permite mais controle sobre a profundidade anestésica do que os anestésicos injetáveis. A máscara de entrega anestésica também ajuda no posicionamento correto, estendendo o pescoço.
Existem várias aplicações para este modelo de transplante. Os mais significativos são a capacidade de avaliar a resposta imune a um alotransplante composto vascularizado e de testar vários regimes de imunossupressão15,16,17. Além disso, esse modelo pode ser usado para estudar a vasculatura no contexto de uma anastomose arterial não funcional, anastomose venosa não funcional ou aterosclerose por rejeição. Este artigo descreve como transplantar heterotopicamente um complexo LTE de um rato para outro em ~ 3 h. Este modelo viável e de custo relativamente baixo oferece um potencial considerável no estudo do papel do sistema imunológico na rejeição do complexo LTE, oferecendo assim o potencial para novas terapias no transplante de órgãos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. As despesas de viagem e de vida de Egehan Salepci para pesquisa foram financiadas pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK).
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Randall Raish por sua excelente videografia e assistência de edição.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
