Summary
Het doel van dit manuscript is om de microchirurgische stappen te beschrijven die nodig zijn om een heterotope larynxtransplantatie bij muizen uit te voeren. De voordelen van dit muismodel ten opzichte van andere diermodellen van larynxtransplantatie zijn de kosteneffectiviteit en de beschikbaarheid van immunologische testen en gegevens.
Abstract
Larynx heterotopische transplantatie, hoewel een technisch uitdagende procedure, biedt meer wetenschappelijke analyse en kostenvoordelen in vergelijking met andere diermodellen. Hoewel voor het eerst beschreven door Shipchandler et al. in 2009, wordt deze techniek niet veel gebruikt, mogelijk vanwege de moeilijkheden bij het leren van de microchirurgische techniek en de tijd die nodig is om het onder de knie te krijgen. Dit artikel beschrijft de chirurgische stappen in detail, evenals mogelijke valkuilen om te vermijden, om effectief gebruik van deze techniek aan te moedigen.
In dit model worden de bilaterale halsslagaders van het strottenhoofd van de donor geanastomoseerd naar de ontvangende halsslagader en de externe halsader, waardoor bloed door het transplantaat kan stromen. De bloedstroom kan intraoperatief worden bevestigd door de visualisatie van bloed dat de bilaterale halsslagaders van het transplantaat vult, roodheid van de schildklieren van het transplantaat en bloedingen uit microvaten in het transplantaat. De cruciale elementen voor succes omvatten delicate conservering van de transplantaatvaten, het maken van de juiste grootte arteriotomie en venotomie, en het gebruik van het juiste aantal hechtingen op de arteriële-arteriële en arteriële-veneuze anastomosen om bloedvaten te beveiligen zonder lekkage en occlusie te voorkomen.
Iedereen kan zich met voldoende training bekwamen in dit model en de procedure in ongeveer 3 uur uitvoeren. Indien met succes uitgevoerd, maakt dit model het mogelijk om immunologische studies gemakkelijk en tegen lage kosten uit te voeren.
Introduction
Voor patiënten die lijden aan onherstelbare larynxschade of strottenhoofdkanker is een totale laryngectomie vaak de enige optie1. Totale laryngectomie laat patiënten achter zonder het vermogen om zelfstandig te ademen en te spreken, naast het ervaren van sociale en psychologische nood2. Patiënten met strottenhoofdkanker die een totale laryngectomie nodig hebben, zijn uitstekende potentiële kandidaten voor larynxtransplantatie. Terwijl menselijke larynxtransplantatie in de setting van onherstelbare larynxschade is uitgevoerd, wordt allotransplantatie van het strottenhoofd momenteel vermeden bij deze patiënten vanwege de angst voor tumorrecidief, de mogelijkheid van chronische afstoting en van donoren afgeleide infecties3. Immunosuppressie is de primaire oorzaak van deze zorgen. Het dramatische verlies van de eerste gedeeltelijke larynxtransplantatiepatiënt als gevolg van tumorrecidief na conventionele immunosuppressieve behandeling is het bewijs dat een geschikt immunosuppressief regime moet worden bedacht voordat verdere pogingen tot transplantatie bij larynxkankerpatiënten worden gedaan 4,5.
Om de immuunrespons van de gastheer op een getransplanteerd strottenhoofd beter te begrijpen, werd het eerste larynxtransplantatiemodel bij ratten in 1992 ontwikkeld door Strome en werden in 2002 verbeteringen aan de chirurgische techniek aangebracht 6,7. Hoewel dit model effectief is voor het bestuderen van larynxtransplantatie, leidde het gebrek aan ratspecifieke immunologische middelen en de hogere kosten in verband met rattenmodellen tot de ontwikkeling van een nieuw muismodel voor het bestuderen van larynxtransplantatie in 20098.
De belangrijkste toepassing van de beschreven techniek is het bestuderen van verschillende immunosuppressieve medicijnregimes bij larynxtransplantatie. Het verbeteren van de huidige immunosuppressieve therapieën kan de kandidatenpool verbreden en leiden tot veilige transplantatie bij kankerpatiënten. De voordelen van dit muismodel zijn de kosteneffectiviteit en de brede beschikbaarheid van immunologische gegevens en reagentia.
Teams die werken aan immunosuppressieve behandelingsregimes voor larynxtransplantatie kunnen deze methode gebruiken om een groot volume immunologische gegevens te verzamelen en verschillende medicijnregimes kunnen snel worden getest en vergeleken. Andere potentiële behandelingsmodaliteiten die de immuunrespons op de transplantatie kunnen moduleren, zoals stamcelinjecties, kunnen ook worden getest met behulp van dit model. Ten slotte kunnen experimenten worden bedacht om systemische langetermijneffecten van larynxtransplantatie te observeren door de follow-upperiode te verlengen.
De hier beschreven techniek maakt gebruik van end-to-side anastomosen om arteriële en veneuze stroom naar een heterotopisch strottenhoofdtransplantaat te bieden. Het transplantaat is een laryngotracheoesophageal (LTE) complex bestaande uit het strottenhoofd, de schildklier, de bijschildklieren, de luchtpijp en de slokdarm van de donor, met bilaterale halsslagaders en pedikels intact. Eén donorcarotisslagader wordt geanostomoseerd naar de ontvangende halsslagader en zorgt voor arteriële bloedstroom, terwijl de andere donorcarotisslagader wordt geanostomoseerd naar de ontvangende externe halsader en zorgt voor veneuze bloedstroom (figuur 1).
Verschillende wijzigingen werden aangebracht in de chirurgische techniek van het rattenmodel om succes in het muismodel te garanderen. Er werd bijvoorbeeld een geïnhaleerd anestheticum gebruikt in plaats van een injecteerbaar middel om de controle over de diepte van de anesthesie te vergroten en complicaties te verminderen. Continue hechting wordt gebruikt bij de arteriële-arteriële anastomose bij ratten; vanwege de kleinere omvang van muisvaten is dit echter technisch moeilijk en kan dit leiden tot vernauwing van het vaatlumen7. Als gevolg hiervan worden onderbroken hechtingen gebruikt in het muismodel en resulteren in een verbeterde doorgankelijkheid van het vat. Bovendien wordt in het rattenmodel de superieure schildklierslagader (STA) pedikel ontleed en gevisualiseerd. Gezien de kleinere omvang van de STA bij muizen, kan deze dissectie leiden tot schade aan en zelfs transsectie van de STA. Als gevolg hiervan wordt het niet ontleed in het muismodel. In plaats daarvan wordt de nabijgelegen fascia bewaard om ervoor te zorgen dat de STA intact blijft.
De belangrijkste potentiële valkuilen van deze techniek zijn het beschadigen van de cellulaire pedikels van het donor LTE-complex, het maken van een arteriotomie of venotomie van een verkeerde grootte, vaatocclusie op de anastomoseplaatsen of het achterlaten van gaten op de anastomoseplaatsen die bloedingen kunnen veroorzaken. Om deze misstappen te voorkomen, moet voorzichtigheid worden betracht bij het verkrijgen van het donortransplantaat door een manchet van weefsel rond de STA-pedikel achter te laten. De arteriotomie en venotomie moeten groot genoeg zijn om de bloedstroom mogelijk te maken, maar klein genoeg om lekkage te voorkomen. Een passend aantal hechtingen moet worden gebruikt voor de anastomosen om eventuele openingen te dichten, maar niet te veel om de vaten af te sluiten.
Als bekendheid met de microchirurgische technieken wordt verkregen, kan deze procedure in ongeveer 3 uur worden uitgevoerd. Dit larynxtransplantatiemodel kan betrouwbaar worden uitgevoerd bij muizen en worden gebruikt om de immuunrespons van de gastheer te bestuderen na gevasculariseerde samengestelde allotransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). BalbC-muizen (10-12 weken oud) werden gebruikt als donoren en C57 / BL6-muizen (10-12 weken oud) werden gebruikt als ontvangers omdat hun belangrijkste histocompatibiliteitscomplexen, respectievelijk H-2Db en H-2Kb, immunologisch onverenigbaar zijn, en daarom kan de immuunrespons op het transplantaat verder worden bestudeerd. Alle instrumenten die tijdens de operatie werden gebruikt, werden gesteriliseerd (zie aanvullende figuur S1 en aanvullende figuur S2) en het chirurgische veld werd steriel gehouden gedurende het hele protocol volgens de IACUC-instructies.
1. Donorchirurgie en verkrijging van transplantaten
- Injecteer de donor met buprenorfine met verlengde afgifte (3,25 mg/kg lichaamsgewicht subcutaan) 30 minuten voordat de procedure wordt gestart. Plaats de muis in de anesthesiedoos van knaagdieren voor anesthesie-inductie bij 3% isofluraan geleverd met 1 L/min O2-stroom . Nadat het dier volledig is verdoofd, brengt u de muis over naar het scheergebied en dient u 1,5% isofluraan toe met een 1 L/min O2-stroom voor onderhoud van de anesthesie. Bevestig de diepte van de anesthesie met een teenknijper.
- Scheer de borst en nek van de muis tot aan de kaaklijn en breng ontharingscrème aan. Veeg na 30 s de crème af met een steriel gaasje bevochtigd met water en breng de muis over naar het operatiegebied.
- Breng oogsmeermiddel aan op de ogen van de muis. Plaats de muis op een gedrapeerd extra verwarmingskussen om de juiste lichaamstemperatuur te garanderen.
- Immobiliseer de muis, bereid het chirurgische gebied driemaal voor met povidonjodium en alcohol en drapeer vervolgens de muis.
OPMERKING: Controleer de diepte van de anesthesie door een teenknufje en handhaaf de anesthesie op 1,5% isofluraan en 1 L / min O2 stroom via een gezichtsmasker gedurende de hele procedure. - Maak een kleine horizontale incisie net superieur aan de suprasternale inkeping. Gebruik een fijne schaar om de huid bilateraal via die incisie tot aan de onderkaak te verheffen. Snijd een trapeziumvormig huidsegment weg dat resulteert in blootstelling van de bilaterale speekselklieren, sternomastoïde spieren, digastrische spieren en het superieure aspect van het borstbeen (figuur 2A).
- Snijd de bilaterale speekselklieren weg met behulp van cauterie op het superieure deel waar een kleine ader die door de klier reist wordt gevisualiseerd (figuur 2A).
OPMERKING: Als er niet voor wordt gezorgd dat het vat dichtschroeit voordat de klier wordt verwijderd, kan bij deze stap een aanzienlijke bloeding optreden. - Trek de lymfoïde en vetweefsels zijdelings in om de sternomastoïde en riemspieren bloot te leggen. Ontleed de bilaterale sternomastoïde spieren uit de omliggende weefsels en trek ze zijdelings in met behulp van retractors.
OPMERKING: Deze manoeuvre zal het LTE-complex volledig blootstellen met riemspieren en een comfortabele werkruimte bieden voor dissectie van de halsslagaders (figuur 2B). - Maak een middenlijnincisie tussen de riemspieren en snijd ze bilateraal weg, zorg ervoor dat de onderliggende schildklier niet wordt beschadigd en laat deze op het LTE-complex achter.
OPMERKING: Na deze stap moeten de bilaterale halsslagaders zichtbaar zijn (figuur 2C). - Ontleed de gemeenschappelijke halsslagaders inferieur tot het niveau van het sleutelbeen en tot het niveau van de halsslagader bifurcatie superieur. Ontleed de nervus vagus en de interne halsader uit de halsslagaders. Neem ze niet op in het verkregen transplantaat.
OPMERKING: De superieure schildklierslagader kan net superieur worden gezien aan de bifurcatie die mediaal reist. Laat de dunne fascia rond dit vat intact en probeer het niet omtrek te ontleden. Dit vat levert de bloedtoevoer naar het LTE-complex en zal dienen als de pedikel na transplantatie. Behoud van dit schip is van het grootste belang. - Ontleed de interne en externe halsslagaders ver genoeg om te kunnen ligateeren en verdelen. Als er problemen zijn met de visualisatie van de bloedvaten, gebruik dan een apart retractor om de digastrische spieren zijdelings in te trekken.
OPMERKING: Vermijd het ontleden van de externe halsslagader dichter bij de bifurcatie om schade aan de superieure schildklierslagader te voorkomen. Bij deze stap kan de occipitale slagader, die zich vertakt van de externe halsslagader en parallel aan de interne halsslagader volgt, worden aangetroffen en moet niet worden verward met de interne halsslagader, die groter is en dieper wordt gevonden (figuur 2D). - 8-0 gebruiken nylon hechtingen, ligate de interne halsslagaders 2 tot 3 mm superieur aan de halsslagader bifurcatie. Ligaat de externe halsslagaders ten minste 3 mm superieur aan het vertakkingspunt van de superieure schildklierslagader.
OPMERKING: Na deze ligaties zal het LTE-complex via de superieure schildklierslagaders naar de bilaterale halsslagaders worden gepromoveerd. - Ligaat de gemeenschappelijke halsslagaders ter hoogte van het borstbeen en snijd alle ligatievaten bilateraal door. Houd de vasculaire pedikels bovenop het LTE-complex om onbedoelde schade tijdens verdere dissectie te voorkomen. Om gaslekkage of onbedoeld verlies van anesthesie te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat het dier is verlopen voordat u luchtwegsneden maakt.
- Verdeel de infrahyoïde spieren ter hoogte van het tongbeen. Creëer een anterieure faryngotomie die net inferieur is aan het tongbeen. Draag de incisie naar de voorwervel fascia om het LTE-complex superieur te bevrijden.
- Transect de luchtpijp onder de vijfde tracheale ring en draag de incisie door de slokdarm naar de prevertebrale fascia om het LTE-complex inferieur te bevrijden. Bevrijd de luchtpijp en slokdarm van de onderliggende prevertebrale fascia van een inferieure naar superieure richting.
OPMERKING: Houd de vasculaire pedikels bovenop het LTE-complex om onbedoelde schade tijdens verdere dissectie te voorkomen. - Creëer een anterieure faryngotomie die net inferieur is aan het tongbeen. Draag de incisie naar de voorwervel fascia om het LTE-complex superieur te bevrijden. Verdeel eventuele resterende lymfoïde of bindweefselaanhechtingen tussen het LTE-complex en het omliggende weefsel. Verwijder het transplantaat.
OPMERKING: Het transplantaat bevat het strottenhoofd, de luchtpijp, de schildklier, de bijschildklieren, de slokdarm en de larynxspieren als een samengestelde eenheid (figuur 2E).
2. Entvoorbereiding
- Plaats het verkregen transplantaat in een steriele petrischaal en was het met een normale zoutoplossing om eventuele bloedstolsels te verwijderen. Melk met behulp van een microtang voorzichtig het bloed en de stolsels uit de bilaterale halsslagaders. Verwijd de bilaterale halsslagaders met behulp van 1 mm microdilatoren.
- Injecteer met behulp van een naald met een stompe punt van 30 G ongeveer 2 ml gehepariniseerde zoutoplossing in elke halsslagader om het transplantaat te spoelen.
OPMERKING: Bloed en zoutoplossing kunnen worden gezien spoelen uit de contralaterale halsslagader en kleine vrije vaatuiteinden, die intacte superieure schildklierslagaders bevestigen. - Snijd de adventitia weg van de arteriële uiteinden, zodat ze schone randen hebben voor anastomose.
OPMERKING: Het transplantaat kan worden achtergelaten in heparinized zoutoplossing en een korte pauze kan tot 3 uur worden genomen voordat het in de ontvanger wordt getransplanteerd9.
3. Operatie van de ontvanger en anastomose van de bloedvaten
- Bereid de ontvangende muis voor op dezelfde manier als beschreven voor de donor na de inductie-, scheer- en chirurgische voorbereidingsstappen van de anesthesie. Injecteer de ontvangende muis met analgeticum met verlengde afgifte subcutaan 30 minuten voor aanvang van de operatie.
- Maak met behulp van een scalpel een middenlijnhalsincisie die zich uitstrekt van de kaaklijn superieur tot het borstbeen inferieur. Til de huid aan de linkerkant op en trek deze zijdelings in.
- Snijd de linker speekselklier weg en dichtschroei de superieure vaten zoals eerder beschreven. Snijd het vet- en lymfoïde weefsel weg door alle zichtbare vaten met cautery bij lage temperatuur te delen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de onderliggende externe halsader niet wordt beschadigd (figuur 3A).
- Ontleed de uitwendige halsader omtrek. Gebruik ten minste 5 mm vrije lengte van het vat voor anastomose. Gebruik cautery bij lage temperatuur of ligaat en verdeel relatief grote aderen die zich vertakken van de halsader.
- Ontleed de sternomastoïde spier en trek deze zijdelings in. Houd de ontlede ader beschermd achter de spier om direct contact met het oprolmechanisme te voorkomen.
- Snijd de linkerbandspieren weg om toegang te krijgen tot de ontvanger halsslagader. Ontleed de gemeenschappelijke halsslagader van het sleutelbeen inferieur tot aan de halsslagader bifurcatie superieur (figuur 3B).
- Plaats het achtergrondmateriaal onder de externe halsader en breng de dubbele V3-vatklemmen aan.
- Plaats een 10-0 nylon hechtdraad door de voorste wand van de externe halsader op de plaats van de gewenste venotomie en gebruik deze hechting om het vat anterieur te trekken en te tenten.
- Snijd op de hechtdraad met microscissors net diep genoeg om de juiste grootte single-spleet venotomie te creëren en ervoor te zorgen dat de snede volledig door de veneuze wand is.
- Spoel met een naald met een stompe punt van 30 G de binnenkant van de ader met gehepariniseerde zoutoplossing.
- Plaats het LTE-complex van de donor tussen de linker halsslagader van de ontvanger en de linker externe halsader. Lijn het vrije uiteinde van de linker halsslagader van de donor uit naar de linker jugulaire ader van de ontvanger en beschuin de uiteinden van de vaten met een scherpe schaar.
- Met behulp van vier 10-0 nylon onderbroken hechtingen, anastomose de donor verliet halsslagader en ontvanger verliet externe halsader op een end-to-side manier.
- Schuif het achtergrondmateriaal onder de gemeenschappelijke halsslagader van de ontvanger en plaats de dubbele benaderende A3-vatklemmen op de gemeenschappelijke halsslagader van de ontvanger. Maak een arteriotomie op dezelfde manier als de venotomie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de arteriotomie even groot is als het lumen van de donorslagader. Als het te groot is, zal overvloedige bloeding optreden nadat de klemmen zijn verwijderd. Als het te klein is, wordt de bloedtoevoer naar het transplantaat belemmerd. - Anastomoseer de rechter halsslagader van de donor naar de linker halsslagader van de ontvanger op een end-to-side manier met behulp van zes 10-0 nylon onderbroken hechtingen.
OPMERKING: De juiste microvasculaire techniek moet worden gerespecteerd in de hele vaatanastomose. Het passeren van de achterwand resulteert in een aanzienlijk vernauwde bloedstroom, waardoor de overleving van het transplantaat in gevaar komt. Vanwege het kleine formaat van de vaten is het erg moeilijk om de hechtingen opnieuw te maken. - Verwijder de klemmen aan de veneuze kant. Als er bloedingen optreden, oefen dan zachte druk uit met katoenen tips.
- Verwijder de klemmen op de slagader en oefen onmiddellijk zachte druk uit met katoenen uiteinden.
OPMERKING: Er wordt enige bloeding verwacht bij deze stap, die meestal stopt na 1 minuut met zachte druk. - Controleer de integriteit van de bloedstroom in de slagader en de ader.
OPMERKING: Met intacte arteriële stroom wordt meestal pulsatie van de donorslagader gezien en verandert de donor schildklier van zijn gespoelde transparante kleur terug naar zijn oorspronkelijke roodachtige kleur. Rode kleuring van de kleine vaten op het LTE-complex kan ook worden waargenomen. - Irrigeer het chirurgische veld met gehepariniseerde zoutoplossing en sluit de huidincisie met een 5-0 monofilament hechting op een lopende manier. Breng antibiotische zalf of een huidlijm aan op de incisie.
- Injecteer 1 ml warme zoutoplossing subcutaan om rekening te houden met vochtverlies tijdens de operatie.
- Stop de anesthesie en breng de muis over naar een herstelkooi. Observeer de muis op een verwarmingskussen totdat deze volledig wakker is om onderkoeling te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bevestiging van succesvolle transplantatie
Met behulp van het hierboven beschreven protocol is het mogelijk om de bloedtoevoer naar het LTE-complex te beoordelen door de pulsatie van de donorslagader te observeren na het verwijderen van de vaatklemmen. Pulsatie is meestal zichtbaar en onmiddellijke rode kleuring van de donorslagader bevestigt de actieve bloedstroom (figuur 4A). Als de anastomose niet effectief is, zal de slagader geen pulsatie hebben, er gedeeltelijk ingeklapt uitzien en bleek van kleur zijn (figuur 4B).
Een andere techniek om arteriële doorgankelijkheid te bevestigen, is om te zoeken naar kleurverandering op de donorroïdklier nadat de klemmen zijn verwijderd; kleurverandering van de schildklier van bleek naar rood is binnen enkele minuten zichtbaar. De rechterkwab van de donor schildklier roodt ook met arteriële stroom. In tegenstelling hiermee doet de linkerkwab, die verder van de arteriële kant verwijderd is, er langer over om een goede doorstroming te ontvangen. Bloedstroom door kleine vrije bloedvaten eindigt op het LTE-complex van de donor kan worden gezien als een aanvullende bevestiging.
Verkrijging van getransplanteerd laryngotracheaal complex
Na 15 dagen worden de ontvanger en getransplanteerde LTE-complexen geoogst. De doorgankelijkheid van de anastomosed slagader kan worden beoordeeld door het LTE-complex vrij van het omliggende ontvangende weefsel te ontleden en de end-to-side anastomose te visualiseren (figuur 4A). Het getransplanteerde LTE-complex is op dit moment over het algemeen ingekapseld in een laag fibrotisch weefsel. Het weggesneden niet-overeenkomende allograft is meestal groter in vergelijking met het inheemse strottenhoofd als gevolg van fibrotische capsulevorming (figuur 5A). In de setting van allograftafstoting, na 15 dagen in afwezigheid van immunosuppressie, hebben ontvangers waarschijnlijk een afwezige bloedtoevoer naar het getransplanteerde allograft10.
Histologische beoordeling van het getransplanteerde strottenhoofd
Volgens het eerder ontwikkelde muis larynx transplantatie afstotingssysteem, wordt volledige afstoting van een getransplanteerd strottenhoofd in afwezigheid van immunosuppressie meestal waargenomen op dag 1510. Larynx kraakbeen wordt meestal afgebroken met een duidelijk verminderde cellulariteit. Nucleated celdichtheid is ook verminderd in vet- en spierweefsels. Lymfocytische infiltratie kan duidelijk worden gezien, terwijl schildklierfollikels afwezig zijn in het getransplanteerde allograft. Aanvullende figuur S3 toont vers weggesneden inheemse larynx histologie in vergelijking met het afgekeurde getransplanteerde strottenhoofd op dag 15.
Figuur 1: Donor larynx wordt getransplanteerd in combinatie met het strottenhoofd van de ontvanger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Laryngotracheale complexe anatomie en verkrijgingsstappen. (A) Oppervlakkige nekdissectie met de speekselklieren die zijdelings zijn ingetrokken en riemspieren. (B) Terugtrekking van de rechter sternomastoïde spieren biedt gemakkelijke toegang tot riemspieren en het onderliggende LTE-complex. (C) Na verwijdering van de riemspieren zijn het strottenhoofd, de luchtpijp, de bilaterale schildklieren en de halsslagaders zichtbaar. (D) De rechter achterhoofdsslagader is afkomstig van de uitwendige halsslagader en reist naar achteren. (E) Weggesneden donor LTE-complex met het strottenhoofd, de luchtpijp, de bilaterale schildklier, de halsslagaders en de slokdarm zichtbaar. Afkortingen: CCA = gemeenschappelijke halsslagader; Di = digastrische spier; ERK = uitwendige halsslagader; Eso = slokdarm; Hy = tongbeen; ICA = interne halsslagader; IJV = interne halsader; L = strottenhoofd; OA = occipitale slagader; S = speekselklier; Sm = sternomastoïde spier; St = band spieren; STA = superieure schildklierslagader; T = luchtpijp; Thy = schildklier; V = vaten die door de speekselklier reizen; Vg = nervus vagus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Anatomie van de hals van de ontvanger en juiste positie van de transplantatie. (A) Blootgestelde linker uitwendige halsader na dissectie van het vetweefsel en lymfoïde weefsels. (B) Omtrek van de linker halsslagader wordt gezien met de nervus vagus en de interne halsader zijdelings ingetrokken. Afkortingen: CCA = gemeenschappelijke halsslagader; EJV = externe halsader; IJV = interne halsader; L = strottenhoofd; S = speekselklier; Sm = sternomastoïde spier; St = band spieren; T = luchtpijp; Vg = nervus vagus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Resultaten van arteriële en veneuze anastomosen. (A) Positief resultaat: Het strottenhoofd van de donor met een werkende arteriële anastomose, felrode kleuring van de gemeenschappelijke halsslagader van de donor en geen instorting van de vaatwanden (blauwe pijl). (B) Negatief resultaat: De gemeenschappelijke halsslagader, met een gecompromitteerde arteriële anastomose en geen bloedstroom, is bleek en gedeeltelijk ingeklapt (blauwe pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verkrijging van het getransplanteerde LTE-complex. (A) Brutobeoordeling van end-to-side anastomose van de linker halsslagader van de donor naar de rechter halsslagader van de ontvanger, 15 dagen na de operatie. Afbeelding van de end-to-side anastomose zichtbaar op dag 15 na de transplantatie (zwarte pijl). Getransplanteerd strottenhoofd is ook zichtbaar naast het retractor omgeven door een fibrotische capsule (blauwe pijl). (B) Bruto vergelijking van het getransplanteerde LTE-complex allograft met het inheemse strottenhoofd. Aan de rechterkant bevindt zich het getransplanteerde strottenhoofd bij afwezigheid van immunosuppressie op dag 15 en aan de linkerkant bevindt zich het inheemse strottenhoofd van de ontvanger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Chirurgische donorinstrumenten. (1) 8-0 nylon hechting. (2) Steriele katoenen tips. (3) Retractors gemaakt van paperclips en gesteriliseerd. (4) 35 mm steriele, wegwerp petrischaal. (5) Steriele verbanden. (6) Steriele gaasjes. (7) Lage temperatuur micro fijne tip cautery. (8) Adson weefseltang. (9) Fijne schaar. (10) Naaldhouder. (11) Vannas patroon schaar-gebogen, 7 mm snijkant. (12) Adventitia schaar-recht, 19 mm snijkant. (13) Vannas veerschaargebogen, 3 mm snijkant. (14) Vatverwijder-0,1 mm diameter. (15) Rechte microtang. (16) Schuine microtang. (17) Steriele ontleedplaat. (18) 25 G precisie glijnaald. (19) Standaard stompe naald van 30 G. (20) 3 ml luer-lock tip spuit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Chirurgische instrumenten van de ontvanger. (1) 35 mm steriele petrischaal voor eenmalig gebruik. (2) Steriele katoenen tips. (3) Microvasculaire approximatorklem-0,4-1 mm vatdiameter. (4) Enkele minivatklemmen. (5) Mini huidlijm. (6) Lage temperatuur micro fijne tip cautery. (7) 30 G standaard stompe naald. (8) 3 ml luer-lock tip spuit. (9) 5-0 monocryl hechting. (10) 10-0 nylon hechtdraad. (11) Het gedeelte van het mercian zichtbaarheidsachtergrondmateriaal dat nodig is, wordt gesneden. (12) Steriele verbanden. (13) Steriele gaasjes. (14) Retractors gemaakt van paperclips en gesteriliseerd. (15) DeBakey-tang. (16) Naaldhouder. (17) Fijne schaar. (18) Klem die een tang aanbrengt. (19)Weefseltang. (20) Vannas patroonschaar-gebogen, 7 mm snijkant. (21) Adventitia schaar-recht, 19 mm snijkant. (22) Vannas veerschaar gebogen, 3 mm snijkant. (23) Rechte microtang. (24) Vatverwijder-0,3 mm diameter. (25) Vatverwijder-0,1 mm diameter. (26) Schuine microtang. (27) Steriele ontleedplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Histologische beoordeling van de strottenhoofden van de donor en ontvanger met behulp van H&E-kleuring, 15 dagen na de operatie. (A) Inheems vers weggesneden strottenhoofd en (B) na het getransplanteerde strottenhoofd op dag 15 aan de rechterkant. Kraakbeen vertoont een duidelijk verminderde cellulariteit (blauwe pijlen). Spiercellen vertonen verlies van kernen in de transplantatie in vergelijking met de inheemse spieren (rode pijlen). Schildklierfollikels die gemakkelijk zichtbaar zijn op het inheemse weefsel (groene pijl) zijn afwezig in het getransplanteerde weefsel. Duidelijke lymfatische infiltratie rond de getransplanteerde weefsels is zichtbaar aan de rechterkant (zwarte pijl). Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De incidentie en prevalentie van strottenhoofdkanker zijn de afgelopen drie decennia met respectievelijk 12% en 24% toegenomen en veel van deze patiënten ondergaan een laryngectomie voor behandeling10. Deze procedure verslechtert de kwaliteit van leven van een persoon aanzienlijk en daarom is een alternatieve behandeling gewenst. Gevasculariseerde composiet allotransplantatie van het strottenhoofd kan het vermogen van een patiënt om te ademen en te spreken verbeteren; er is echter nog onderzoek nodig voordat deze techniek klinisch kan worden gebruikt voor deze patiëntenpopulatie. Dit artikel biedt een kosteneffectief muismodel van larynxtransplantatie dat het onderzoek van verschillende immunosuppressieve regimes mogelijk kan maken.
Er zijn verschillende kritieke stappen in deze procedure die het succes van de operatie kunnen dicteren. Voor de donor is het belangrijk om de dissectie uit de buurt van de superieure schildklierslagader te houden om beschadiging van de pedikel te voorkomen. Bij het verkrijgen van het strottenhoofd is het ook cruciaal om een manchet van fascia rond de superieure schildklierslagaders te laten om de pedikels te beschermen en verdraaiing van de bloedvaten te voorkomen. De integriteit van de pedikels moet worden gecontroleerd bij het spoelen van het transplantaat met zoutoplossing. Indien correct verkregen, moet het bloed uit de contralaterale halsslagader en de kleine haarvaten die het transplantaat bedekken, stromen.
De volgende kritieke stappen zijn het creëren van de arteriotomie en venotomie. Wanneer u de hechting door het vat naar de vaatwand brengt, moet u ervoor zorgen dat deze door het lumen in en uit gaat, niet alleen de adventitia. Op deze manier zullen de enkele spleet arteriotomie en venotomie het lumen van het vat blootleggen en de bloedstroom mogelijk maken. Bij het maken van de arteriotomie en venotomie moet de opening groot genoeg zijn om de bloedstroom mogelijk te maken, maar klein genoeg om lekkage te voorkomen. Als de opening te klein is, kan deze worden verwijd om overeen te komen met de grootte van het lumen van het donorvat.
Ten slotte is het uitvoeren van de arteriële en veneuze anastomosen het meest uitdagende maar ook het meest kritieke deel van de operatie. Het belangrijkste aspect is het bepalen van het juiste aantal hechtingen om te plaatsen. Het is het beste om dit te beoordelen voordat u de eerste hechting plaatst, zodat zelfs de afstand dienovereenkomstig kan worden gepland. Het plaatsen van te veel hechtingen zorgt ervoor dat de bloedstroom wordt belemmerd, naast het veroorzaken van meer endotheelschade. Door te weinig hechtingen te plaatsen, kan bloed door openingen in het lumen naar buiten lekken. Voor de grootte van de muizen die in deze studie worden gebruikt, werken over het algemeen vier hechtingen goed voor de ader en zes hechtingen werken goed voor de slagader. De slagader heeft meer hechtingen nodig vanwege de hogere bloeddrukbloedstroom.
Tijdens het onderzoek werden verschillende wijzigingen aangebracht om deze operatie te perfectioneren. Aanvankelijk werd een injecteerbare anesthesie gebruikt, wat resulteerde in een hoger sterftecijfer, waarschijnlijk als gevolg van een overdosis anestheticum, en een postoperatieve hersteltijd van ongeveer 3 uur. Overschakelen op geïnhaleerde anesthesie verminderde het sterftecijfer aanzienlijk en verminderde de postoperatieve hersteltijd tot ongeveer 30 minuten. Een andere verbetering was het gebruik van een stompe naald voor het spoelen van het transplantaat. Oorspronkelijk werd een afgeschuinde naald gebruikt, wat leidde tot onbedoelde scheuren in de halsslagaders van de donor, waardoor vaatschade en lekkage ontstonden. Tot slot is in dit protocol het gebruik van een contrasterend achtergrondmateriaal geïntroduceerd. Het gebruik van een groen achtergrondmateriaal onder de vaten zorgde voor een betere visualisatie tijdens de anastomosen en hielp de vaten te verheffen en gemakkelijker toegankelijk te maken.
Probleemoplossing tijdens de eerste operaties gericht op het oplossen van het probleem van geen arteriële bloedtoevoer naar het transplantaat. We veronderstellen dat dit waarschijnlijk te wijten was aan stroomobstructie op de arteriële anastomoseplaats. Om dit op te lossen, werd een meer dramatische schuine kant op de donorslagader gemaakt om ervoor te zorgen dat deze vlak met de ontvangende halsslagader lag. Bij het hechten van de anastomose werden zo min mogelijk hechtingen gebruikt en werden vierkante knopen bevestigd om te voorkomen dat de vaten op zichzelf draaiden.
Bij het gebruik van dit model zijn er een paar technische beperkingen om in gedachten te houden. Het bevestigen van pulsatie van de slagaders of het observeren van de eerste vulling van de schildklier na de transplantatie garandeert niet altijd dat het LTE-complex een continue bloedstroom zal hebben. Om te controleren op anastomose doorgankelijkheid op verschillende tijdstippen, moeten meer geavanceerde technieken zoals Doppler-echografie worden gebruikt. Om beter onderscheid te maken tussen bloedstroomverlies als gevolg van immuunafstoting en mislukte chirurgische techniek, kunnen hulpmiddelen voor continue bloedstroommonitoring worden geïmplementeerd in verdere studies. Een andere beperking van dit protocol is dat het weinig ruimte laat voor fouten. Als een van de donor- of ontvangervaten scheurt, is er geen manier om de procedure met succes te voltooien. Verder is het donorlattenhoofd als heterotope transplantatie geen volledig functionerend orgaan. Dit model is nuttig voor het bestuderen van de immuunrespons, maar omdat het transplantaat niet daadwerkelijk verbonden is met de luchtwegen en er geen hernervatie wordt uitgevoerd, kan een functionele beoordeling van een getransplanteerd strottenhoofd niet worden uitgevoerd.
De belangrijkste bijdrage van dit protocol is de verlaging van de kosten en de verbeterde beschikbaarheid van immunologische testen, antilichamen en gegevens. Larynxtransplantatie is eerder gepubliceerd bij ratten, honden en varkens; deze dieren zijn echter duurder en er zijn minder immunologische testen en gegevens beschikbaar 11,12,13. Het 30-daagse sterftecijfer van deze procedure bij ratten bleek 41% 11 te zijn; in onze ervaring met muizen is dit aantal gedaald tot 5%. Ten slotte is het gebruik van geïnhaleerd anestheticum voor larynxtransplantatie uniek voor dit protocol, omdat de meeste gepubliceerde larynxtransplantatiediermodellen een injecteerbaar anestheticum gebruiken, zoals pentobarbital 8,11,14. Een geïnhaleerd anestheticum vermindert de hersteltijd aanzienlijk en zorgt voor meer controle over de diepte van de verdoving dan injecteerbare anesthetica. Het verdovingsmasker helpt ook bij de juiste positionering door de nek te strekken.
Er zijn verschillende toepassingen voor dit transplantatiemodel. De belangrijkste zijn het vermogen om de immuunrespons op een gevasculariseerde samengestelde allotransplant te beoordelen en om verschillende immunosuppressieregimes te testen 15,16,17. Bovendien kan dit model worden gebruikt om vasculatuur te bestuderen in de setting van een niet-werkende arteriële anastomose, niet-werkende aderanastomose of atherosclerose vanwege afstoting. Dit artikel schetst hoe u een LTE-complex heterotopisch van de ene muis naar de andere kunt transplanteren in ~ 3 uur. Dit haalbare en relatief goedkope model biedt een aanzienlijk potentieel bij het bestuderen van de rol van het immuunsysteem bij de afwijzing van het LTE-complex, waardoor het potentieel voor nieuwe therapieën bij orgaantransplantatie wordt geboden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben. Egehan Salepci's reis- en levensonderhoudkosten voor onderzoek werden gefinancierd door de Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK).
Acknowledgments
We willen Randall Raish bedanken voor zijn uitstekende hulp bij videografie en bewerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
