Summary
Formålet med dette manuskript er at beskrive de mikrokirurgiske trin, der kræves for at udføre en heterotopisk larynxtransplantation hos mus. Fordelene ved denne musemodel sammenlignet med andre dyremodeller af larynxtransplantation er dens omkostningseffektivitet og tilgængeligheden af immunologiske assays og data.
Abstract
Larynx heterotopisk transplantation, selvom det er en teknisk udfordrende procedure, giver mere videnskabelig analyse og omkostningsfordele sammenlignet med andre dyremodeller. Selvom den først blev beskrevet af Shipchandler et al. i 2009, er denne teknik ikke meget udbredt, muligvis på grund af vanskelighederne med at lære den mikrokirurgiske teknik og tid, der kræves for at mestre den. Dette papir beskriver de kirurgiske trin i detaljer samt potentielle faldgruber, der skal undgås, for at tilskynde til effektiv brug af denne teknik.
I denne model anastomoseres de bilaterale halspulsårer i donorstrubehovedet til modtagerens halspulsåre og ydre jugularvene, hvilket giver mulighed for blodgennemstrømning gennem transplantatet. Blodgennemstrømningen kan bekræftes intraoperativt ved visualisering af blodfyldning i graft bilaterale halspulsårer, rødme af skjoldbruskkirtlerne i transplantatet og blødning fra mikrokar i transplantatet. De afgørende elementer for succes omfatter delikat bevarelse af graftkarrene, hvilket gør den korrekte størrelse arteriotomi og venotomi og ved hjælp af det passende antal suturer på arterielle-arterielle og arterielle-venøse anastomoser for at sikre kar uden lækage og forhindre okklusion.
Enhver kan blive dygtig i denne model med tilstrækkelig træning og udføre proceduren på cirka 3 timer. Hvis den udføres med succes, giver denne model mulighed for, at immunologiske undersøgelser kan udføres med lethed og til lave omkostninger.
Introduction
For patienter, der lider af uoprettelig larynxskade eller larynxcancer, er en total laryngektomi ofte den eneste mulighed1. Total laryngektomi efterlader patienter uden evnen til at trække vejret og tale alene, ud over at opleve social og psykisk lidelse2. Patienter med larynxcancer, der har brug for en total laryngektomi, er fremragende potentielle kandidater til larynxtransplantation. Mens human larynxtransplantation i forbindelse med uoprettelig larynxskade er blevet udført, undgås allotransplantation af strubehovedet i øjeblikket hos disse patienter på grund af frygten for tumorgentagelse, muligheden for kronisk afvisning og donorafledte infektioner3. Immunsuppression er den primære årsag til disse bekymringer. Det dramatiske tab af den første delvise larynxtransplantationspatient på grund af tumorgentagelse efter konventionel immunsuppressiv behandling er tegn på, at der bør udtænkes et passende immunsuppressivt regime, før der gøres yderligere forsøg på transplantation hos larynxcancerpatienter 4,5.
For bedre at forstå værtsimmunresponset på et transplanteret strubehoved blev den første larynxtransplantationsmodel hos rotter udviklet i 1992 af Strome, og forbedringer af den kirurgiske teknik blev foretaget i 2002 6,7. Selv om denne model er effektiv til at studere larynxtransplantation, førte manglen på rottespecifikke immunologiske midler og de højere omkostninger forbundet med rottemodeller til udviklingen af en ny musemodel til undersøgelse af larynxtransplantation i 20098.
Hovedanvendelsen af den beskrevne teknik er at studere forskellige immunsuppressive lægemiddelregimer i larynxtransplantation. Forbedring af de nuværende immunsuppressive behandlinger kan udvide kandidatpuljen og føre til sikker transplantation hos kræftpatienter. Fordelene ved denne musemodel er dens omkostningseffektivitet og den brede tilgængelighed af immunologiske data og reagenser.
Teams, der arbejder med immunsuppressive behandlingsregimer til larynxtransplantation, kan bruge denne metode til at indsamle en stor mængde immunologiske data, og forskellige lægemiddelregimer kan hurtigt testes og sammenlignes. Andre potentielle behandlingsmetoder, der kan modulere immunresponset på transplantationen, såsom stamcelleinjektioner, kan også testes ved hjælp af denne model. Endelig kan der udtænkes forsøg for at observere langsigtede systemiske virkninger af larynxtransplantation ved at forlænge opfølgningsperioden.
Teknikken beskrevet her bruger ende-til-side anastomoser til at give arteriel og venøs strømning til et heterotopisk strubehovedtransplantat. Transplantatet er et laryngotracheoesophageal (LTE) kompleks bestående af strubehovedet, skjoldbruskkirtlerne, biskjoldbruskkirtlerne, luftrøret og spiserøret hos donoren med bilaterale halspulsårer og pedikler intakte. Den ene donorhalspulsåre anastomoseres til modtagerens halspulsåre og giver arteriel blodgennemstrømning, mens den anden donorhalspulsåre anastomoseres til modtagerens ydre halsvene og giver venøs blodgennemstrømning (figur 1).
Der blev foretaget flere ændringer i rottemodellens kirurgiske teknik for at sikre succes i musemodellen. For eksempel blev et inhaleret bedøvelsesmiddel brugt i stedet for et injicerbart middel til at øge kontrollen over dybden af anæstesi og reducere komplikationer. Kontinuerlig suturering anvendes i arteriel-arteriel anastomose hos rotter; På grund af musefartøjernes mindre størrelse er dette imidlertid teknisk vanskeligt og kan forårsage indsnævring af fartøjets lumen7. Som et resultat anvendes afbrudte suturer i musemodellen og resulterer i forbedret fartøjspatency. Derudover dissekeres og visualiseres den overlegne skjoldbruskkirtelarterie (STA) pedicle i rottemodellen. I betragtning af den mindre størrelse af STA hos mus kan denne dissektion resultere i skade på og endda transsektion af STA. Som følge heraf dissekeres det ikke i musemodellen. I stedet bevares nærliggende fascia for at sikre, at STA holdes intakt.
De største potentielle faldgruber ved denne teknik inkluderer beskadigelse af donor LTE-komplekse pedikler, fremstilling af en forkert størrelse arteriotomi eller venotomi, karokklusion på anastomosestederne eller efterlader huller på anastomosestederne, som kan forårsage blødning. For at undgå disse fejltrin skal man være forsigtig, når man skaffer donortransplantatet ved at efterlade en manchet af væv omkring STA-pedicleen. Arteriotomi og venotomi skal være stor nok til at tillade blodgennemstrømning, men lille nok til at forhindre lækage. Et passende antal suturer bør anvendes til anastomoserne for at lukke huller, men ikke for mange til at okkludere karrene.
Hvis der opnås kendskab til de mikrokirurgiske teknikker, kan denne procedure udføres på ca. 3 timer. Denne larynxtransplantationsmodel kan udføres pålideligt i mus og bruges til at studere værtsimmunresponset efter vaskulariseret sammensat allotransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskning blev udført i overensstemmelse med Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). BalbC-mus (10-12 uger gamle) blev brugt som donorer, og C57/BL6-mus (10-12 uger gamle) blev brugt som modtagere, fordi deres vigtigste histokompatibilitetskomplekser, henholdsvis H-2Db og H-2Kb, er immunologisk inkompatible, og derfor kan immunresponset på transplantatet undersøges yderligere. Alle instrumenter, der blev brugt under operationen, blev steriliseret (se supplerende figur S1 og supplerende figur S2), og det kirurgiske felt blev holdt sterilt i hele protokollen i henhold til IACUC-instruktioner.
1. Donorkirurgi og podning indkøb
- Injicer donoren med buprenorphin med forlænget frigivelse (3,25 mg/kg legemsvægt subkutant) 30 minutter før proceduren påbegyndes. Placer musen i gnaverbedøvelsesboksen til anæstesiinduktion ved 3% isofluran leveret med 1 L/min O2 flow. Når dyret er fuldt bedøvet, overføres musen til barberingsområdet og 1,5% isofluran med 1 L/min O2-flow til opretholdelse af anæstesi. Bekræft dybden af anæstesi med en tåspids.
- Barber musens bryst og hals op til kæbelinjen og påfør hårfjerningscreme. Efter 30 s tørres cremen af med en steril gasbind, der er fugtet med vand, og overfører musen til det kirurgiske område.
- Påfør øjensmøremiddel på musens øjne. Placer musen på en draperet supplerende varmepude for at sikre korrekt kropstemperatur.
- Immobiliser musen, forbered det kirurgiske område tre gange med povidonjod og alkohol, og draperer derefter musen.
BEMÆRK: Kontroller anæstesidybden ved en tåspids og oprethold anæstesi ved 1,5% isofluran og 1 L / min O2 flow via en ansigtsmaske under hele proceduren. - Lav et lille vandret snit lige bedre end det suprasternale hak. Brug en fin saks til at løfte huden bilateralt gennem snittet op til underkæben. Punktafgift et trapezformet hudsegment, der resulterer i eksponering af de bilaterale spytkirtler, sternomastoidmuskler, digastriske muskler og overlegen aspekt af brystbenet (figur 2A).
- Skær de bilaterale spytkirtler ved hjælp af cautery i den overlegne del, hvor en lille vene, der rejser gennem kirtlen, visualiseres (figur 2A).
BEMÆRK: Hvis man ikke sørger for at cauterize fartøjet, før kirtlen fjernes, kan der opstå betydelig blødning på dette trin. - Træk forsigtigt lymfoidet og fedtvævet tilbage sideværts for at udsætte sternomastoid- og remmusklerne. Disseker de bilaterale sternomastoidmuskler fra det omgivende væv og træk dem tilbage sideværts ved hjælp af retraktorer.
BEMÆRK: Denne manøvre vil fuldt ud udsætte LTE-komplekset med remmuskler og give et behageligt arbejdsområde til dissektion af halspulsårerne (figur 2B). - Lav et midterlinjesnit mellem remmusklerne og fjern dem bilateralt, pas på ikke at beskadige den underliggende skjoldbruskkirtel og lad den være på LTE-komplekset.
BEMÆRK: Efter dette trin skal de bilaterale halspulsårer være synlige (figur 2C). - Circumferentially dissekere de fælles carotisarterier til niveauet af kravebenet ringere og til niveauet af carotis bifurcation overlegent. Dissekere vagusnerven og den indre jugular vene fra halspulsårerne. Medtag dem ikke i det indkøbte transplantat.
BEMÆRK: Den overlegne skjoldbruskkirtelarterie kan ses lige bedre end bifurcationen, der rejser medialt. Lad den tynde fascia omkring dette fartøj være intakt, og forsøg ikke at dissekere det omkreds. Dette fartøj leverer blodgennemstrømningen til LTE-komplekset og vil tjene som pedicle efter transplantation. Bevarelse af dette fartøj er af største betydning. - Disseker de indre og eksterne halspulsårer langt nok overlegent til at kunne ligere og opdele. Hvis der er problemer med visualisering af karrene, skal du bruge en separat retraktor til at trække de digastriske muskler sideværts tilbage.
BEMÆRK: Undgå at dissekere den ydre halspulsåre tættere på bifurcationen for at forhindre skade på den overlegne skjoldbruskkirtelarterie. På dette trin kan occipitalarterien, som forgrener sig fra den ydre carotis og følger parallelt med den indre halspulsåre, opstå og bør ikke forveksles med den indre halspulsåre, som er større og findes dybere (figur 2D). - Brug af 8-0 nylon suturer, ligate de indre halspulsårer 2 til 3 mm bedre end carotis bifurcation. Læg de ydre halspulsårer mindst 3 mm bedre end forgreningspunktet for den overlegne skjoldbruskkirtelarterie.
BEMÆRK: Efter disse ligeringer vil LTE-komplekset blive pedicled via de overlegne skjoldbruskkirtelarterier til de bilaterale halspulsårer. - Ligate de fælles carotisarterier på brystbenet og skære alle ligerede kar bilateralt. Hold de vaskulære pedikler oven på LTE-komplekset for at undgå utilsigtet skade under yderligere dissektion. For at forhindre gaslækage eller utilsigtet tab af anæstesi skal du sørge for, at dyret er udløbet, før du foretager luftvejsskæringer.
- Opdel infrahyoidmusklerne på niveau med hyoid. Opret en forreste pharyngotomi bare ringere end hyoid. Bær snittet ned til den prævertebrale fascia for at frigøre LTE-komplekset overlegent.
- Transect luftrøret under den femte tracheal ring og bære snittet gennem spiserøret ned til prevertebral fascia for at frigøre LTE-komplekset ringere. Frigør luftrøret og spiserøret fra den underliggende prevertebrale fascia fra en ringere end overlegen retning.
BEMÆRK: Hold de vaskulære pedikler oven på LTE-komplekset for at undgå utilsigtet skade under yderligere dissektion. - Opret en forreste pharyngotomi bare ringere end hyoid. Bær snittet ned til den prævertebrale fascia for at frigøre LTE-komplekset overlegent. Opdel eventuelle resterende lymfoide eller bindevævsbindinger mellem LTE-komplekset og det omgivende væv. Fjern transplantatet.
BEMÆRK: Transplantatet indeholder donorstrubehovedet, luftrøret, skjoldbruskkirtlerne, biskjoldbruskkirtlerne, spiserøret og larynxmusklerne som en sammensat enhed (figur 2E).
2. Forberedelse af transplantat
- Anbring det indkøbte transplantat i en steril petriskål og vask det med normal saltvand for at slippe af med eventuelle blodpropper. Brug mikrotang til forsigtigt at malke blodet og blodpropper ud af de bilaterale halspulsårer. Udvide de bilaterale halspulsårer ved hjælp af 1 mm mikrodilatatorer.
- Brug en 30 G stumpspidsnål til at injicere ca. 2 ml hepariniseret saltvand i hver halspulsåre for at skylle transplantatet.
BEMÆRK: Blod og saltvand kan ses skylle ud af den kontralaterale halspulsåre og små frie karender, hvilket bekræfter intakte overlegne skjoldbruskkirtelarterier. - Fjern adventitia væk fra arterielårene, så de har rene kanter til anastomose.
BEMÆRK: Transplantatet kan efterlades i hepariniseret saltvand, og en kort pause kan tages i op til 3 timer, før den transplanteres i modtageren9.
3. Recipientkirurgi og anastomose af karrene
- Forbered modtagermusen på samme måde som beskrevet for donoren efter anæstesiinduktion, barbering og kirurgisk forberedelsestrin. Injicer modtagermusen med smertestillende middel med forlænget frigivelse subkutant 30 minutter før operationens start.
- Brug en skalpel til at lave et midterlinjehalssnit, der strækker sig fra kæbelinjen overlegent til brystbenet ringere. Løft huden på venstre side og træk den tilbage sideværts.
- Skær den venstre spytkirtel, cauterizing de overordnede fartøjer som tidligere beskrevet. Skær fedt- og lymfoidvævet ud ved at dele eventuelle synlige kar med lavtemperaturcautery, idet du sørger for ikke at beskadige den underliggende ydre halsvene (figur 3A).
- Disseker den ydre jugular vene omkreds. Brug mindst 5 mm klar længde af beholderen til anastomose. Brug lavtemperatur cautery eller ligat og opdel eventuelle relativt store vener, der forgrener sig fra jugularvenen.
- Disseker sternomastoidmusklen og træk den tilbage sideværts. Hold den dissekerede vene beskyttet bag musklen for at undgå direkte kontakt med retraktoren.
- Skær venstre remmuskler for at få adgang til modtagerens halspulsåre. Circumferentially dissekere den fælles halspulsåre fra kravebenet ringere op til carotis bifurcation overlegent (figur 3B).
- Før baggrundsmaterialet under den ydre jugular vene, og påfør de dobbelte tilnærmede V3-beholderklemmer.
- Placer en 10-0 nylonsutur gennem den forreste væg i den ydre jugular vene på stedet for den ønskede venotomi, og brug denne sutur til at trække anteriort og telte fartøjet.
- Skær til suturen med mikrosaks lige dybt nok til at skabe den rigtige størrelse enkeltspaltede venotomi og sikre, at snittet er helt gennem den venøse væg.
- Brug en 30 G stumpspidset nål til at skylle indersiden af venen med hepariniseret saltvand.
- Placer donor LTE-komplekset mellem modtagerens venstre halspulsåre og den venstre ydre jugular vene. Juster den frie ende af donorens venstre halspulsåre mod modtagerens venstre ydre jugular vene og skrå enderne af karrene med skarp saks.
- Ved hjælp af fire 10-0 nylonafbrudte suturer forlod donoren halspulsåren og modtageren forlod ekstern jugular vene på en ende-til-side måde.
- Skub baggrundsmaterialet ind under modtagerens fælles halspulsåre, og placer de dobbelte A3-karklemmer på modtagerens fælles halspulsåre. Opret en arteriotomi på samme måde som venotomien.
BEMÆRK: Sørg for, at arteriotomi er af samme størrelse som lumen i donorhalspulsåren. Hvis det er for stort, vil der opstå kraftig blødning, efter at klemmerne er fjernet. Hvis det er for lille, vil blodgennemstrømningen til transplantatet blive blokeret. - Anastomose donor højre halspulsåre til modtageren venstre halspulsåre i en ende-til-side måde ved hjælp af seks 10-0 nylon afbrudte suturer.
BEMÆRK: Korrekt mikrovaskulær teknik skal respekteres i hele fartøjets anastomose. Passerer gennem bagvæggen resulterer i betydeligt indsnævret blodgennemstrømning, hvilket bringer transplantatets overlevelse i fare. På grund af fartøjernes lille størrelse er det meget vanskeligt at forsøge at gentage suturerne. - Fjern klemmerne på den venøse side. Hvis der opstår blødning, skal du anvende et let tryk med bomuldsspidser.
- Fjern klemmerne på arterien, og påfør straks et let tryk med bomuldsspidser.
BEMÆRK: Der forventes en vis blødning på dette trin, som normalt stopper efter 1 minut med let tryk. - Kontroller integriteten af blodgennemstrømningen i arterien og venen.
BEMÆRK: Med intakt arteriel strømning ses pulsering af donorhalspulsåren normalt, og donorens skjoldbruskkirtel ændres fra sin skyllede gennemsigtige farve tilbage til sin oprindelige rødlige farve. Rød farve af de små fartøjer på LTE-komplekset kan også observeres. - Skyl det kirurgiske felt med hepariniseret saltvand og luk hudsnittet med en 5-0 monofilamentsutur på en løbende måde. Påfør antibiotisk salve eller et hudklæbemiddel på snittet.
- Injicer 1 ml varmt saltvand subkutant for at tage højde for væsketab under operationen.
- Stop anæstesien og overfør musen til et genopretningsbur. Overhold musen på en varmepude, indtil den er helt vågen for at undgå hypotermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bekræftelse af vellykket transplantation
Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol er det muligt at vurdere blodgennemstrømningen til LTE-komplekset ved at observere pulseringen af donorhalspulsåren efter fjernelse af karklemmerne. Pulsering er typisk synlig, og øjeblikkelig rød farve af donorarterien bekræfter aktiv blodgennemstrømning (figur 4A). Hvis anastomosen ikke er effektiv, vil arterien ikke have pulsering, se delvist kollapset ud og være bleg i farve (figur 4B).
En anden teknik til at bekræfte arteriel patency er at kigge efter farveændring på donorens skjoldbruskkirtel, efter at klemmerne er fjernet; Farveændring af skjoldbruskkirtlen fra bleg til rød er synlig inden for få minutter. Den højre lap af donor skjoldbruskkirtlen rødmer også med arteriel strømning. I modsætning hertil tager venstre lap, som er længere væk fra arteriesiden, længere tid at modtage korrekt strømning. Blodgennemstrømning gennem små frie karender på donor LTE-komplekset kan ses som yderligere bekræftelse.
Indkøb af transplanteret laryngotracheal kompleks
Efter 15 dage høstes modtageren og transplanterede LTE-komplekser. Patency af den anastomoserede arterie kan vurderes ved at dissekere LTE-komplekset fri for det omgivende modtagervæv og visualisere end-to-side anastomose (figur 4A). Det transplanterede LTE-kompleks er generelt indkapslet i et lag af fibrotisk væv på dette tidspunkt. Den udskårne uoverensstemmende allograft er normalt større sammenlignet med det indfødte strubehoved på grund af fibrotisk kapseldannelse (figur 5A). I indstillingen af allograftafstødning, efter 15 dage i fravær af immunsuppression, har modtagere sandsynligvis fraværende blodgennemstrømning til den transplanterede allograft10.
Histologisk vurdering af det transplanterede strubehoved
Ifølge det tidligere udviklede muselarynxtransplantationsafvisningsklassificeringssystem observeres typisk fuldstændig afvisning af et transplanteret strubehoved i fravær af immunsuppression på dag 1510. Larynxbrusk nedbrydes for det meste med markant nedsat cellularitet. Nukleeret celletæthed er også nedsat i fedt og muskelvæv. Lymfocytisk infiltration kan ses tydeligt, Mens skjoldbruskkirtlen follikler er fraværende i den transplanterede allograft. Supplerende figur S3 viser frisk udskåret indfødt strubehovshistologi sammenlignet med det afviste transplanterede strubehoved på dag 15.
Figur 1: Donorstrubehoved transplanteres sammen med modtagerstrubehovedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Laryngotracheal kompleks anatomi og indkøbstrin . (A) Overfladisk halsdissektion, der viser spytkirtlerne trukket tilbage sideværts og remmuskler. (B) Tilbagetrækning af de højre sternomastoidmuskler giver nem adgang til remmuskler og underliggende LTE-kompleks. (C) Efter fjernelse af remmusklerne er strubehovedet, luftrøret, de bilaterale skjoldbruskkirtler og halsbægeret synlige. (D) Den højre occipitale arterie ses stamme fra den ydre halspulsåre og bevæger sig bagud. (E) Udskåret donor LTE-kompleks med strubehovedet, luftrøret, bilaterale skjoldbruskkirtler, halspulsårer og spiserør synlige. Forkortelser: CCA = almindelig halspulsåre; Di = digastrisk muskel; ECA = ekstern halspulsåre; Eso = spiserør; Hy = hyoid knogle; ICA = indre halspulsåre; IJV = intern jugular vene; L = strubehoved; OA = occipital arterie; S = spytkirtel; Sm = sternomastoid muskel; St = rem muskler; STA = overlegen skjoldbruskkirtelarterie; T = luftrør; Thy = skjoldbruskkirtlen; V = fartøjer, der rejser gennem spytkirtlen Vg = vagus nerve. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Modtagerhalsens anatomi og korrekt placering af transplantationen . (A) Eksponeret venstre ydre jugular vene efter dissektion af fedt og lymfoidvæv. (B) Circumferentielt dissekeret venstre halspulsåre ses med vagusnerven og den indre jugular vene trukket tilbage sideværts. Forkortelser: CCA = almindelig halspulsåre; EJV = ekstern jugular vene; IJV = intern jugular vene; L = strubehoved; S = spytkirtel; Sm = sternomastoid muskel; St = rem muskler; T = luftrør; Vg = vagus nerve. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Resultater af arterielle og venøse anastomoser. (A) Positivt resultat: Donorstrubehovedet med en fungerende arteriel anastomose, lys rød farve af donorens fælles halspulsåre og ingen sammenbrud af karvæggene (blå pil). (B) Negativt resultat: Den fælles halspulsåre med en kompromitteret arteriel anastomose og ingen blodgennemstrømning er bleg og delvist kollapset (blå pil). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Indkøb af det transplanterede LTE-kompleks . (A) Bruttovurdering af end-to-side anastomose fra donorens venstre halspulsåre til modtagerens højre halspulsåre 15 dage efter operationen. Billede af ende-til-side anastomose synlig på dag 15 efter transplantation (sort pil). Transplanteret strubehoved er også synlig ved siden af retraktoren omgivet af en fibrotisk kapsel (blå pil). (B) Brutto sammenligning af den transplanterede LTE komplekse allograft med den indfødte strubehoved. På højre side er det transplanterede strubehoved i fravær af immunsuppression på dag 15 og på venstre side er modtagerens indfødte strubehoved. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Donorkirurgiske instrumenter. (1) 8-0 nylon sutur. (2) Sterile bomuldsspidser. (3) Retraktorer fremstillet af papirclips og steriliseret. (4) 35 mm steril petriskål til engangsbrug. (5) Sterile bandager. (6) Sterile gazebind. (7) Lavtemperatur mikro fine tip cautery. (8) Adson vævstang. (9) Fin saks. (10) Nåleholder. (11) Vannas mønster saksbuet, 7 mm skærkant. (12) Adventitia saks-lige, 19 mm skærkant. (13) Vannas fjeder saks-buet, 3 mm skærkant. (14) Fartøjsdilatator-0,1 mm diameter. (15) Lige mikrotang. (16) Vinklet mikrotang. (17) Sterilt dissekeringsbræt. (18) 25 G præcisionsglidenål. (19) 30 G standard stump nål. (20) 3 ml luer-lock spidssprøjte. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Modtagerkirurgiske instrumenter. (1) 35 mm steril petriskål til engangsbrug. (2) Sterile bomuldsspidser. (3) Mikrovaskulær approksimatorklemme-0,4-1 mm beholderdiameter. (4) Enkelt minifartøjsklemmer. (5) Mini hudlim. (6) Lavtemperatur mikro fin spids cautery. (7) 30 G standard stump nål. (8) 3 ml luer-lock spids sprøjte. (9) 5-0 monokryl sutur. (10) 10-0 nylonsutur. (11) Mercian synlighed baggrundsmateriale krævet del skæres. (12) Sterile bandager. (13) Sterile gazebind. (14) Retraktorer fremstillet af papirclips og steriliseret. (15) DeBakey tang. (16) Nåleholder. (17) Fin saks. (18) Klemme påføring af tang. (19)Vævstang. (20) Vannas mønster saksbuet, 7 mm skærkant. (21) Adventitia saks - lige, 19 mm skærkant. (22) Vannas fjeder saks-buet, 3 mm skærkant. (23) Lige mikrotang. (24) Fartøjsdilatator-0,3 mm diameter. (25) Fartøjsdilatator-0,1 mm diameter. (26) Vinklet mikrotang. (27) Sterilt dissekeringsbræt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Histologisk vurdering af donor- og recipientstrubehoveder ved hjælp af H&E-farvning 15 dage efter operationen. (A) Indfødt frisk udskåret strubehoved og (B) posttransplanteret strubehoved på dag 15 til højre. Brusk viser markant nedsat cellularitet (blå pile). Muskelceller viser tab af kerner i transplantationen sammenlignet med de indfødte muskler (røde pile). Skjoldbruskkirtlen follikler let synlige på det indfødte væv (grøn pil) er fraværende i det transplanterede væv. Markeret lymfocytisk infiltration omkring det transplanterede væv er synligt på højre side (sort pil). Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forekomsten og forekomsten af larynxcancer er steget med henholdsvis 12% og 24% i løbet af de sidste tre årtier, og mange af disse patienter gennemgår en laryngektomi til behandling10. Denne procedure forværrer en persons livskvalitet betydeligt, og derfor ønskes en alternativ behandling. Vaskulariseret sammensat allotransplantation af strubehovedet kan forbedre patientens evne til at trække vejret og tale; Der kræves dog stadig forskning, før denne teknik kan anvendes klinisk til denne patientpopulation. Dette papir tilbyder en omkostningseffektiv musemodel af larynxtransplantation, der kan muliggøre undersøgelse af forskellige immunsuppressive regimer.
Der er flere kritiske trin i denne procedure, der kan diktere operationens succes. For donoren er det vigtigt at holde dissektionen væk fra den overlegne skjoldbruskkirtelarterie for at undgå at beskadige pediklen. Når du køber strubehovedet, er det også afgørende at efterlade en manchet af fascia omkring de overlegne skjoldbruskkirtelarterier for at beskytte pediklerne og undgå vridning af karrene. Pediklernes integritet skal kontrolleres, når transplantatet skylles med saltvand. Hvis det er anskaffet korrekt, skal blod strømme ud af den kontralaterale halspulsåre og de små kapillærer, der dækker transplantatet.
De næste kritiske trin er at skabe arteriotomi og venotomi. Når du fører suturen gennem fartøjet for at telte fartøjsvæggen, skal du sørge for, at den går ind og ud gennem lumen, ikke kun adventitia. På denne måde vil den enkelte slidsede arteriotomi og venotomi udsætte karrets lumen og tillade blodgennemstrømning. Ved fremstilling af arteriotomi og venotomi skal åbningen være stor nok til at tillade blodgennemstrømning, men lille nok til at forhindre lækage. Hvis åbningen er for lille, kan den udvides til at matche størrelsen på donorbeholderens lumen.
Endelig er udførelse af arterielle og venøse anastomoser den mest udfordrende, men også den mest kritiske del af operationen. Det vigtigste aspekt er at bestemme det passende antal suturer, der skal placeres. Det er bedst at vurdere dette, inden du placerer den første sutur, så selv afstand kan planlægges i overensstemmelse hermed. Placering af for mange suturer får blodgennemstrømningen til at blive blokeret, ud over at forårsage mere endotelskader. Placering af for få suturer gør det muligt for blod at lække ud gennem huller i lumen. For størrelsen af de mus, der anvendes i denne undersøgelse, fungerer generelt fire suturer godt for venen, og seks suturer fungerer godt for arterien. Arterien kræver flere suturer på grund af dets blodgennemstrømning med højere tryk.
Flere ændringer blev foretaget i hele undersøgelsen for at perfektionere denne operation. Oprindeligt blev der anvendt en injicerbar anæstesi, hvilket resulterede i en højere dødelighed, sandsynligvis på grund af anæstetisk overdosis og en postoperativ restitutionstid på ca. 3 timer. Skift til inhaleret anæstesi reducerede dødeligheden kraftigt og reducerede den postoperative restitutionstid til ca. 30 min. En anden forbedring var brugen af en stump nål til skylning af transplantatet. Oprindeligt blev der brugt en skrå nål, hvilket førte til utilsigtede tårer i donorhalspulsårerne, hvilket forårsagede karskader og lækage. Endelig blev brugen af et kontrasterende baggrundsmateriale introduceret i denne protokol. Brug af et grønt baggrundsmateriale under skibene muliggjorde bedre visualisering under anastomoserne og hjalp med at hæve skibene og gøre dem lettere tilgængelige.
Fejlfinding under de indledende operationer fokuserede på at løse problemet med ingen arteriel blodgennemstrømning i transplantatet. Vi antager, at dette sandsynligvis skyldtes strømningsobstruktion på det arterielle anastomosested. For at løse dette blev der lavet en mere dramatisk skråning på donorhalspulsåren for at sikre, at den lå flush med modtagerens halspulsåre. Ved suturering af anastomose blev der brugt så få suturer som muligt, og firkantede knuder blev bekræftet for at forhindre skibene i at rotere på sig selv.
Når du bruger denne model, er der et par tekniske begrænsninger, du skal huske på. Bekræftelse af pulsering af arterierne eller observation af indledende genopfyldning af skjoldbruskkirtlen efter transplantationen garanterer ikke altid, at LTE-komplekset vil have kontinuerlig blodgennemstrømning. For at kontrollere for anastomosepatency på forskellige tidspunkter, mere sofistikerede teknikker såsom Doppler ultralyd, bør anvendes. For bedre at skelne mellem blodgennemstrømningstab på grund af immunafstødning og mislykket kirurgisk teknik kan kontinuerlige blodgennemstrømningsovervågningsværktøjer implementeres i yderligere undersøgelser. En anden begrænsning for denne protokol er, at den ikke giver meget plads til fejl. Hvis et af donor- eller modtagerfartøjerne rives, er der ingen måde at afslutte proceduren med succes. Som en heterotopisk transplantation er donorstrubehovedet ikke et fuldt fungerende organ. Denne model er nyttig til at studere immunrespons, men da transplantatet faktisk ikke er forbundet med luftvejene, og der ikke foretages nogen reinnervation, kan funktionel vurdering af et transplanteret strubehoved ikke udføres.
Det væsentligste bidrag fra denne protokol er reduktionen i omkostninger og forbedret tilgængelighed af immunologiske assays, antistoffer og data. Larynxtransplantation er tidligere blevet offentliggjort hos rotter, hjørnetænder og svin; disse dyr er imidlertid dyrere, og der er færre immunologiske assays og data tilgængelige11,12,13. 30 dages dødeligheden af denne procedure hos rotter viste sig at være 41%11; I vores erfaring med mus er dette tal reduceret til 5%. Endelig er brugen af inhaleret bedøvelsesmiddel til larynxtransplantation unik for denne protokol, da de fleste offentliggjorte larynxtransplantationsdyremodeller bruger et injicerbart bedøvelsesmiddel, såsom pentobarbital 8,11,14. Et inhaleret bedøvelsesmiddel reducerer restitutionstiden betydeligt og giver mulighed for mere kontrol over bedøvelsesdybden end injicerbare anæstetika. Den bedøvelsesmaske hjælper også med korrekt positionering ved at strække nakken.
Der er flere applikationer til denne transplantationsmodel. De mest signifikante er evnen til at vurdere immunresponset på en vaskulariseret sammensat allotransplant og til at teste forskellige immunsuppressionsregimer15,16,17. Derudover kan denne model bruges til at studere vaskulatur i indstillingen af en ikke-fungerende arteriel anastomose, ikke-arbejdende veneanastomose eller aterosklerose på grund af afvisning. Dette papir skitserer, hvordan man heterotopisk transplanterer et LTE-kompleks fra en mus til en anden på ~ 3 timer. Denne gennemførlige og relativt billige model giver et betydeligt potentiale til at studere immunsystemets rolle i afvisning af LTE-komplekset og derved tilbyde potentialet for nye terapier inden for organtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser. Egehan Salepcis rejse- og leveomkostninger til forskning blev finansieret af Tyrkiets videnskabelige og teknologiske forskningsråd (TUBITAK).
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Randall Raish for hans fremragende videografi og redigeringsassistance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
