Summary
Syftet med detta manuskript är att beskriva de mikrokirurgiska steg som krävs för att utföra en heterotopisk larynxtransplantation hos möss. Fördelarna med denna musmodell jämfört med andra djurmodeller av larynxtransplantation är dess kostnadseffektivitet och tillgången till immunologiska analyser och data.
Abstract
Larynx heterotopisk transplantation, även om det är ett tekniskt utmanande förfarande, erbjuder mer vetenskaplig analys och kostnadsfördelar jämfört med andra djurmodeller. Även om den först beskrevs av Shipchandler et al. 2009, används denna teknik inte i stor utsträckning, möjligen på grund av svårigheterna att lära sig den mikrokirurgiska tekniken och den tid som krävs för att behärska den. Detta dokument beskriver de kirurgiska stegen i detalj, liksom potentiella fallgropar att undvika, för att uppmuntra effektiv användning av denna teknik.
I denna modell anastomoseras de bilaterala halspulsådrorna i donatorstruphuvudet till mottagarens halspulsåder och yttre halsven, vilket möjliggör blodflöde genom transplantatet. Blodflödet kan bekräftas intraoperativt genom visualisering av blodfyllning i transplantatets bilaterala halspulsåder, rodnad av sköldkörteln i transplantatet och blödning från mikrokärl i transplantatet. De avgörande elementen för framgång inkluderar känslig bevarande av transplantatkärlen, vilket gör rätt storlek arteriotomi och venotomi och använder lämpligt antal suturer på arteriella-arteriella och arteriella-venösa anastomoser för att säkra kärl utan läckage och förhindra ocklusion.
Vem som helst kan bli skicklig i denna modell med tillräcklig träning och utföra proceduren på cirka 3 timmar. Om den utförs framgångsrikt möjliggör denna modell att immunologiska studier utförs med lätthet och till låg kostnad.
Introduction
För patienter som lider av irreparabel larynxskada eller larynxcancer är en total laryngektomi ofta det enda alternativet1. Total laryngektomi lämnar patienter utan förmåga att andas och tala på egen hand, förutom att uppleva social och psykisk nöd2. Patienter med larynxcancer som behöver en total laryngektomi är utmärkta potentiella kandidater för larynxtransplantation. Medan human larynxtransplantation vid inställning av irreparabel larynxskada har utförts, undviks allotransplantation av struphuvudet för närvarande hos dessa patienter på grund av rädslan för tumöråterfall, möjligheten till kronisk avstötning och donator-härledda infektioner3. Immunsuppression är den främsta orsaken till dessa problem. Den dramatiska förlusten av den första partiella larynxtransplanterade patienten på grund av tumöråterfall efter konventionell immunsuppressiv behandling är bevis på att en lämplig immunsuppressiv regim bör utformas innan ytterligare försök görs för transplantation hos larynxcancerpatienter 4,5.
För att bättre förstå värdens immunsvar mot ett transplanterat struphuvud utvecklades den första larynxtransplantationsmodellen hos råttor 1992 av Strome, och förbättringar av den kirurgiska tekniken gjordes 2002 6,7. Även om denna modell är effektiv för att studera larynxtransplantation, ledde bristen på råttspecifika immunologiska medel och de högre kostnaderna för råttmodeller till utvecklingen av en ny musmodell för att studera larynxtransplantation 20098.
Huvudtillämpningen av den beskrivna tekniken är att studera olika immunsuppressiva läkemedelsregimer vid larynxtransplantation. Förbättring av nuvarande immunsuppressiva behandlingar kan bredda kandidatpoolen och leda till säker transplantation hos cancerpatienter. Fördelarna med denna musmodell är dess kostnadseffektivitet och den breda tillgängligheten av immunologiska data och reagenser.
Team som arbetar med immunsuppressiva behandlingsregimer för larynxtransplantation kan använda denna metod för att samla in en stor mängd immunologiska data, och olika läkemedelsregimer kan snabbt testas och jämföras. Andra potentiella behandlingsmetoder som kan modulera immunsvaret mot transplantationen, såsom stamcellsinjektioner, kan också testas med denna modell. Slutligen kan experiment utformas för att observera långsiktiga systemiska effekter av larynxtransplantation genom att förlänga uppföljningsperioden.
Tekniken som beskrivs här använder end-to-side anastomoser för att ge arteriellt och venöst flöde till ett heterotopiskt struphuvudtransplantat. Transplantatet är ett laryngotracheoesofageal (LTE) komplex som består av struphuvudet, sköldkörteln, bisköldkörtlarna, luftstrupen och matstrupen hos givaren, med bilaterala halspulsåder och pediklar intakta. En donator halspulsåder anastomoseras till mottagaren halspulsåder och ger arteriellt blodflöde, medan den andra givarhalspulsådern anastomoseras till mottagarens yttre halsven och ger venöst blodflöde (figur 1).
Flera modifieringar gjordes av råttmodellens kirurgiska teknik för att säkerställa framgång i musmodellen. Till exempel användes ett inhalerat bedövningsmedel istället för ett injicerbart medel för att öka kontrollen över anestesidjupet och minska komplikationerna. Kontinuerlig suturering används i arteriell-arteriell anastomos hos råttor; På grund av den mindre storleken på muskärl är detta dock tekniskt svårt och kan orsaka förträngning av fartyget Lumen7. Som ett resultat används avbrutna suturer i musmodellen och resulterar i förbättrad kärlpatency. Dessutom, i råttmodellen, dissekeras den överlägsna sköldkörtelartären (STA) pedikeln ut och visualiseras. Med tanke på den mindre storleken på STA hos möss kan denna dissektion leda till skador på och till och med transsektion av STA. Som ett resultat dissekeras det inte i musmodellen. Istället bevaras närliggande fascia för att säkerställa att STA hålls intakt.
De viktigaste potentiella fallgroparna med denna teknik inkluderar att skada donatorns LTE-komplexa pediklar, göra en felaktigt stor arteriotomi eller venotomi, kärlocklusion vid anastomosplatserna eller lämna luckor vid anastomosplatserna som kan orsaka blödning. För att undvika dessa felsteg måste man vara försiktig när man skaffar donatortransplantatet genom att lämna en manschett av vävnad runt STA-pedikeln. Artariotomi och venotomi bör vara tillräckligt stor för att tillåta blodflöde men tillräckligt liten för att förhindra läckage. Ett lämpligt antal suturer bör användas för anastomoserna för att stänga eventuella luckor, men inte för många för att ockludera kärlen.
Om förtrogenhet med de mikrokirurgiska teknikerna erhålls kan denna procedur utföras på cirka 3 timmar. Denna larynxtransplantationsmodell kan utföras tillförlitligt hos möss och användas för att studera värdens immunsvar efter vaskulariserad sammansatt allotransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning utfördes i enlighet med Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). BalbC-möss (10-12 veckor gamla) användes som givare och C57/BL6-möss (10-12 veckor gamla) användes som mottagare eftersom deras stora histokompatibilitetskomplex, H-2Db respektive H-2Kb, är immunologiskt inkompatibla, och därför kan immunsvaret mot transplantatet studeras ytterligare. Alla instrument som användes under operationen steriliserades (se kompletterande figur S1 och kompletterande figur S2), och det kirurgiska fältet hölls sterilt under hela protokollet enligt IACUC-instruktioner.
1. Donatorkirurgi och transplantatupphandling
- Injicera givaren med buprenorfin med förlängd frisättning (3,25 mg/kg kroppsvikt subkutant) 30 minuter innan proceduren påbörjas. Placera musen i anestesiboxen för anestesiinduktion vid 3% isofluran levererad med 1 L/min O2 flöde. När djuret är helt bedövat, överför musen till rakområdet och administrera 1,5% isofluran med 1 L/min O2 flöde för underhåll av anestesi. Bekräfta anestesidjupet med en tåklämma.
- Raka bröstet och halsen på musen upp till käklinjen och applicera hårborttagningskräm. Efter 30 s, torka av grädden med en steril gasväv fuktad med vatten och överför musen till det kirurgiska området.
- Applicera ögonsmörjmedel på musens ögon. Placera musen på en draperad extra värmedyna för att säkerställa korrekt kroppstemperatur.
- Immobilisera musen, förbered det kirurgiska området tre gånger med povidonjod och alkohol och drapera sedan musen.
OBS: Kontrollera anestesidjupet med en tåknippe och behåll anestesin vid 1,5% isofluran och 1 L/min O2 flöde via en ansiktsmask under hela proceduren. - Gör ett litet horisontellt snitt bara överlägset det suprasternala hacket. Använd en fin sax och lyft huden bilateralt genom det snittet upp till underkäken. Skär ut ett trapetsformat hudsegment som resulterar i exponering av de bilaterala spottkörtlarna, sternomastoidmusklerna, digastriska musklerna och den överlägsna aspekten av bröstbenet (figur 2A).
- Skär ut de bilaterala spottkörtlarna med hjälp av cautery vid den överlägsna delen där en liten ven som färdas genom körteln visualiseras (figur 2A).
OBS: Om man inte är försiktig med att cauterize kärlet innan man tar bort körteln, kan betydande blödning uppstå i detta steg. - Dra försiktigt tillbaka lymfoid- och fettvävnaderna i sidled för att exponera sternomastoid- och remmusklerna. Dissekera de bilaterala sternomastoidmusklerna från de omgivande vävnaderna och dra tillbaka dem i sidled med hjälp av retraktorer.
OBS: Denna manöver kommer att exponera LTE-komplexet helt med remmuskler och ge ett bekvämt arbetsutrymme för dissektion av halspulsådrorna (figur 2B). - Gör ett snitt i mittlinjen mellan remmusklerna och punktskatt dem bilateralt, var försiktig så att du inte skadar den underliggande sköldkörteln och lämnar den på LTE-komplexet.
OBS: Efter detta steg bör de bilaterala halspulsådrorna vara synliga (figur 2C). - Omkrets dissekera de gemensamma halspulsådrorna till nyckelbenets nivå sämre och till nivån av karotisbifurkationen överlägset. Dissekera vagusnerven och den inre halsvenen från halspulsåderna. Ta inte med dem i det anskaffade transplantatet.
OBS: Den överlägsna sköldkörtelartären kan ses precis överlägsen bifurkationen som reser medialt. Lämna den tunna fascian som omger detta kärl intakt och försök inte dissekera det omkretsvis. Detta kärl levererar blodflödet till LTE-komplexet och kommer att fungera som pedikeln efter transplantation. Bevarande av detta fartyg är av yttersta vikt. - Dissekera de inre och yttre halspulsådrorna tillräckligt långt för att kunna ligera och dela sig. Om det är svårt med visualisering av kärlen, använd en separat retraktor för att dra tillbaka de digastriska musklerna i sidled.
OBS: Undvik att dissekera den yttre halspulsådern närmare bifurkationen för att förhindra skador på den överlägsna sköldkörtelartären. Vid detta steg kan den occipitala artären, som grenar från den yttre halspulsådern och följer parallellt med den inre halspulsådern, påträffas och bör inte förväxlas med den inre halspulsådern, som är större och finns djupare (Figur 2D). - Använda 8-0 Nylonsuturer, ligat de inre halspulsådrorna 2 till 3 mm överlägsna karotisbifurkationen. Ligatera de yttre halspulsådrorna minst 3 mm överlägsen förgreningspunkten för den överlägsna sköldkörtelartären.
OBS: Efter dessa ligeringar kommer LTE-komplexet att pedikuleras via de överlägsna sköldkörtelartärerna till de bilaterala halspulsåderna. - Ligate de gemensamma halspulsådrorna vid bröstbenets nivå och skär alla ligerade kärl bilateralt. Håll de vaskulära pediklerna ovanpå LTE-komplexet för att undvika oavsiktlig skada under ytterligare dissektion. För att förhindra gasläckage eller oavsiktlig förlust av anestesi, se till att djuret har gått ut innan du gör några luftvägsskärningar.
- Dela de infrahyoida musklerna på hyoidens nivå. Skapa en främre faryngotomi som är sämre än hyoiden. Bär snittet ner till prevertebral fascia för att frigöra LTE-komplexet överlägset.
- Transect luftstrupen under den femte trakealringen och bär snittet genom matstrupen ner till prevertebral fascia för att frigöra LTE-komplexet sämre. Frigör luftstrupen och matstrupen från den underliggande prevertebrala fascian från en sämre till överlägsen riktning.
OBS: Håll de vaskulära pediklerna ovanpå LTE-komplexet för att undvika oavsiktlig skada under ytterligare dissektion. - Skapa en främre faryngotomi som är sämre än hyoiden. Bär snittet ner till prevertebral fascia för att frigöra LTE-komplexet överlägset. Dela eventuella återstående lymfoida eller bindvävsfästen mellan LTE-komplexet och den omgivande vävnaden. Ta bort transplantatet.
OBS: Transplantatet innehåller donatorstruphuvudet, luftstrupen, sköldkörteln, bisköldkörtlarna, matstrupen och larynxmusklerna som en sammansatt enhet (figur 2E).
2. Beredning av transplantat
- Placera det anskaffade transplantatet i en steril petriskål och tvätta den med normal saltlösning för att bli av med blodproppar. Använd mikrotång, mjölka försiktigt blodet och blodpropparna ur de bilaterala halspulsåderna. Utvidga de bilaterala halspulsåderna med hjälp av 1 mm mikrodilatatorer.
- Använd en 30 G trubbspetsad nål och injicera cirka 2 ml hepariniserad saltlösning i varje halspulsåder för att spola transplantatet.
OBS: Blod och saltlösning kan ses spola ut ur den kontralaterala halspulsådern och små fria kärländar, vilket bekräftar intakta överlägsna sköldkörtelartärer. - Skär adventitia bort från artärändarna så att de har rena kanter för anastomos.
OBS: Transplantatet kan lämnas i hepariniserad saltlösning och en kort paus kan tas i upp till 3 timmar innan det transplanteras till mottagaren9.
3. Mottagarkirurgi och anastomos av kärlen
- Förbered mottagarmusen på samma sätt som beskrivs för givaren efter anestesiinduktion, rakning och kirurgisk förberedelse. Injicera mottagarmusen med smärtstillande medel med förlängd frisättning subkutant 30 minuter före operationens början.
- Använd en skalpell, gör ett snitt i mittlinjen som sträcker sig från käklinjen överlägset till bröstbenet sämre. Lyft upp huden på vänster sida och dra tillbaka den i sidled.
- Skär ut den vänstra spottkörteln och cauterizing de överlägsna kärlen som tidigare beskrivits. Skär ut fettet och lymfoidvävnaden genom att dela upp synliga kärl med lågtemperaturkauteri, var noga med att inte skada den underliggande yttre halsvenen (figur 3A).
- Dissekera den yttre halsvenens omkrets. Använd minst 5 mm klar längd på kärlet för anastomos. Använd lågtemperatur cautery eller ligate och dela alla relativt stora vener som förgrenar sig från halsvenen.
- Dissekera sternomastoidmuskeln och dra tillbaka den i sidled. Håll den dissekerade venen skyddad bakom muskeln för att undvika direktkontakt med retraktorn.
- Skär ut de vänstra remmusklerna för att få tillgång till mottagarens halspulsåder. Omkretsdissekera den gemensamma halspulsådern från nyckelbenet underlägset upp till halspulsåderförgreningen överlägset (figur 3B).
- För bakgrundsmaterialet under den yttre halsvenen och applicera de dubbla approximerande V3-kärlklämmorna.
- Placera en 10-0 nylon sutur genom den främre väggen i den yttre halsvenen på platsen för önskad venotomi och använd denna sutur för att dra framåt och tälta kärlet.
- Skär till suturen med mikroscissorer precis tillräckligt djupt för att skapa rätt storlek på venotomi med en slits och se till att snittet är helt genom venös vägg.
- Använd en 30 G trubbig nål, spola insidan av venen med hepariniserad saltlösning.
- Placera donatorns LTE-komplex mellan mottagarens vänstra halspulsåder och den vänstra yttre halsvenen. Rikta in den fria änden av givarens vänstra halspulsåder mot mottagarens vänstra yttre halsven och fasa kärlens ändar med vass sax.
- Med hjälp av fyra 10-0 nylonavbrutna suturer lämnade givaren halspulsådern och mottagaren lämnade yttre halsven på ett end-to-side-sätt.
- Skjut bakgrundsmaterialet under mottagarens gemensamma halspulsåder och placera de dubbla approximerande A3-kärlklämmorna på mottagarens gemensamma halspulsåder. Skapa en arteriotomi på samma sätt som venotomin.
OBS: Se till att arteriotomin är lika stor som lumen i donatorhalspulsådern. Om den är för stor kommer kraftig blödning att inträffa efter att klämmorna har tagits bort. Om det är för litet kommer blodflödet till transplantatet att hindras. - Anastomos givarens högra halspulsåder till mottagarens vänstra halspulsåder på ett end-to-side-sätt med sex 10-0 nylonavbrutna suturer.
OBS: Korrekt mikrovaskulär teknik bör respekteras i hela kärlanastomosen. Att passera genom bakväggen resulterar i avsevärt förträngt blodflöde, vilket äventyrar transplantatets överlevnad. På grund av fartygens lilla storlek är det mycket svårt att försöka göra om suturerna. - Ta bort klämmorna på venös sida. Om blödning uppstår, applicera försiktigt tryck med bomullsspetsar.
- Ta bort klämmorna på artären och applicera omedelbart försiktigt tryck med bomullsspetsar.
OBS: Viss blödning förväntas vid detta steg, som vanligtvis slutar efter 1 min med försiktigt tryck. - Kontrollera blodflödets integritet i artären och venen.
OBS: Med intakt arteriellt flöde ses vanligtvis pulsering av donatorhalspulsådern, och givarens sköldkörtel ändras från sin spolade transparenta färg tillbaka till sin ursprungliga rödaktiga färg. Röd färgning av de små kärlen på LTE-komplexet kan också observeras. - Bevattna det kirurgiska fältet med hepariniserad saltlösning och stäng hudsnittet med en 5-0 monofilament sutur på ett löpande sätt. Applicera antibiotisk salva eller ett hudlim på snittet.
- Injicera 1 ml varm saltlösning subkutant för att ta hänsyn till vätskeförlust under operationen.
- Stoppa anestesin och överför musen till en återhämtningsbur. Observera musen på en värmedyna tills den är helt vaken för att undvika hypotermi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bekräftelse av framgångsrik transplantation
Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan är det möjligt att bedöma blodflödet till LTE-komplexet genom att observera pulseringen av givarhalspulsådern efter avlägsnande av kärlklämmorna. Pulsering är vanligtvis synlig, och omedelbar röd färgning av donatorartären bekräftar aktivt blodflöde (figur 4A). Om anastomosen inte är effektiv kommer artären inte att ha pulsering, se delvis kollapsad ut och vara blek i färg (Figur 4B).
En annan teknik för att bekräfta arteriell patency är att leta efter färgförändring på donatorns sköldkörtel efter att klämmorna har tagits bort; färgförändring av sköldkörteln från blek till röd är synlig inom några minuter. Den högra loben i donatorsköldkörteln rodnar också med arteriellt flöde. I motsats till detta tar den vänstra loben, som ligger längre bort från artärsidan, längre tid att få rätt flöde. Blodflödet genom små fria kärländar på donatorns LTE-komplex kan ses som ytterligare bekräftelse.
Upphandling av transplanterat laryngotrakealkomplex
Efter 15 dagar skördas mottagaren och transplanterade LTE-komplex. Patency av den anastomoserade artären kan bedömas genom att dissekera LTE-komplexet fritt från den omgivande mottagarvävnaden och visualisera anastomosen från slut till sida (Figur 4A). Det transplanterade LTE-komplexet är i allmänhet inkapslat i ett lager av fibrotisk vävnad vid denna tidpunkt. Den utskurna felaktiga allograften är vanligtvis större jämfört med det ursprungliga struphuvudet på grund av fibrotisk kapselbildning (figur 5A). Vid inställningen av allograftavstötning, efter 15 dagar i frånvaro av immunsuppression, har mottagarna sannolikt frånvarande blodflöde till den transplanterade allograften10.
Histologisk bedömning av det transplanterade struphuvudet
Enligt det tidigare utvecklade klassificeringssystemet för muslarynxtransplantation observeras vanligtvis fullständig avstötning av ett transplanterat struphuvud i frånvaro av immunsuppression vid dag 1510. Larynxbrosk bryts oftast ned med markant minskad cellularitet. Kärnad celltäthet minskar också i fett- och muskelvävnader. Lymfocytisk infiltration kan ses tydligt, Medan sköldkörtelfolliklar är frånvarande i den transplanterade allograften. Kompletterande figur S3 visar nyligen utskuren inhemsk struphuvudhistologi jämfört med det avvisade transplanterade struphuvudet vid dag 15.
Figur 1: Donatorstruphuvudet transplanteras tillsammans med mottagarstruphuvudet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Laryngotracheal komplex anatomi och upphandlingssteg . (A) Ytlig nackdissektion som visar spottkörtlarna indragna i sidled och remmuskler. (B) Indragning av de högra sternomastoidmusklerna ger enkel åtkomst till remmuskler och underliggande LTE-komplex. (C) Efter avlägsnande av remmusklerna är struphuvudet, luftstrupen, bilaterala sköldkörteln och halspulsådrorna synliga. (D) Den högra occipitala artären ses som härrör från den yttre halspulsådern och färdas bakåt. (E) Utskuren donator LTE-komplex med struphuvudet, luftstrupen, bilaterala sköldkörteln, halspulsåder och matstrupen synliga. Förkortningar: CCA = vanlig halspulsåder; Di = digastrisk muskel; ECA = yttre halspulsåder; Eso = matstrupe; Hy = hyoid ben; ICA = inre halspulsåder; IJV = inre halsven; L = struphuvud; OA = occipital artär; S = spottkörtel; Sm = sternomastoid muskel; St = rem muskler; STA = överlägsen sköldkörtelartär; T = luftstrupen; Thy = sköldkörteln; V = kärl som färdas genom spottkörteln; Vg = vagusnerv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mottagarens halsanatomi och transplantationens korrekta position . (A) Exponerad vänster yttre halsven efter dissektion av fett och lymfoida vävnader. (B) Omkretsdissekerad vänster halspulsåder ses med vagusnerven och den inre halsvenen indragen i sidled. Förkortningar: CCA = vanlig halspulsåder; EJV = yttre halsven; IJV = inre halsven; L = struphuvud; S = spottkörtel; Sm = sternomastoid muskel; St = rem muskler; T = luftstrupen; Vg = vagusnerv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Resultat av arteriella och venösa anastomoser. (A) Positivt resultat: Donatorstruphuvudet med en fungerande arteriell anastomos, ljusröd färgning av donatorns gemensamma halspulsåder och ingen kollaps av kärlväggarna (blå pil). (B) Negativt resultat: Den gemensamma halspulsådern, med en komprometterad arteriell anastomos och inget blodflöde, är blek och delvis kollapsad (blå pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Tillvaratagande av det transplanterade LTE-komplexet . (A) Grov bedömning av end-to-side anastomos från donatorns vänstra halspulsåder till mottagarens högra halspulsåder, 15 dagar efter operationen. Bild av anastomosen från ände till sida synlig vid dag 15 efter transplantation (svart pil). Transplanterat struphuvud är också synligt bredvid retraktorn omgiven av en fibrotisk kapsel (blå pil). (B) Bruttojämförelse mellan det transplanterade LTE-komplexet allograft och det ursprungliga struphuvudet. På höger sida är den transplanterade struphuvudet i frånvaro av immunosuppression vid dag 15 och på vänster sida är mottagarens inbyggda struphuvud. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Donatorkirurgiska instrument. (1) 8-0 Nylonsutur. (2) Sterila bomullsspetsar. (3) Upprullningsdon gjorda av gem och steriliserade. (4) 35 mm sterilt petriskål för engångsbruk. (5) Sterila bandage. (6) Sterila gasbindor. (7) Lågtemperatur mikro fin spets cautery. (8) Adson vävnad pincett. (9) Fin sax. (10) Nålhållare. (11) Vannas mönster saxböjd, 7 mm skäregg. (12) Adventitia sax rak, 19 mm skäregg. (13) Vannas fjäder saxböjd, 3 mm skäregg. (14) Kärlvidgare-0,1 mm diameter. (15) Raka mikrotångar. (16) Vinklade mikrotångar. (17) Steril dissekeringsbräda. (18) 25 G precisionsglidnål. (19) 30 G standard trubbig nål. (20) 3 ml luerlåsspetsspruta. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Mottagare kirurgiska instrument. (1) 35 mm sterilt petriskål för engångsbruk. (2) Sterila bomullsspetsar. (3) Mikrovaskulär approximatorklämma-0,4-1 mm kärldiameter. (4) Enstaka minifartygsklämmor. (5) Mini hud lim. (6) Lågtemperatur mikro fin spets cautery. (7) 30 G standard trubbig nål. (8) 3 ml luerlåsspetsspruta. (9) 5-0 monokrylsuture. (10) 10-0 nylonsutur. (11) Mercian synlighet bakgrundsmaterial som krävs för att minska skärs. (12) Sterila bandage. (13) Sterila gasbindor. (14) Upprullningsdon tillverkade av gem och steriliserade. (15) DeBakey tång. (16) Nålhållare. (17) Fina saxar. (18) Klämma applicera pincett. (19)Tång av vävnad. (20) Vannas mönster sax-böjd, 7 mm skäregg. (21) Adventitia sax rak, 19 mm skäregg. (22) Vannas fjäder saxböjd, 3 mm skäregg. (23) Raka mikrotångar. (24) Kärlvidgare - 0,3 mm diameter. (25) Kärlvidgare med en diameter på 0,1 mm. (26) Vinklade mikrotångar. (27) Steril dissekeringsbräda. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Histologisk bedömning av donator- och mottagarlaryngerna med H&E-färgning, 15 dagar efter operationen. (A) Inhemskt nyskuret struphuvud och (B) efter transplanterat struphuvud vid dag 15 till höger. Brosk visar markant minskad cellularitet (blå pilar). Muskelceller visar förlust av kärnor i transplantationen jämfört med de inhemska musklerna (röda pilar). Sköldkörtelfolliklar som är lätt synliga på den ursprungliga vävnaden (grön pil) är frånvarande i den transplanterade vävnaden. Markerad lymfocytisk infiltration runt de transplanterade vävnaderna är synlig på höger sida (svart pil). Skalstänger = 500 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förekomsten och prevalensen av larynxcancer har ökat med 12% respektive 24% under de senaste tre decennierna, och många av dessa patienter genomgår en laryngektomi för behandling10. Denna procedur försämrar en persons livskvalitet avsevärt, och därför önskas en alternativ behandling. Vaskulariserad sammansatt allotransplantation av struphuvudet kan förbättra patientens förmåga att andas och tala; Emellertid, forskning krävs fortfarande innan denna teknik kan användas kliniskt för denna patientpopulation. Detta dokument erbjuder en kostnadseffektiv musmodell av larynxtransplantation som kan möjliggöra undersökning av olika immunsuppressiva regimer.
Det finns flera kritiska steg i denna procedur som kan diktera operationens framgång. För givaren är det viktigt att hålla dissektionen borta från den överlägsna sköldkörtelartären för att undvika att skada pedikeln. När du skaffar struphuvudet är det också viktigt att lämna en manschett av fascia runt de överlägsna sköldkörtelartärerna för att skydda pediklerna och undvika vridning av kärlen. Pediklarnas integritet bör kontrolleras vid spolning av transplantatet med saltlösning. Om det anskaffas korrekt ska blod strömma ut ur den kontralaterala halspulsådern och de små kapillärerna som täcker transplantatet.
Nästa kritiska steg är att skapa arteriotomi och venotomi. När du passerar suturen genom kärlet för att tälta kärlväggen, se till att den går in och ut genom lumen, inte bara adventitia. På så sätt kommer den enda slitsartariotomi och venotomi att exponera kärlets lumen och tillåta blodflöde. När du gör arteriotomi och venotomi bör öppningen vara tillräckligt stor för att tillåta blodflöde men tillräckligt liten för att förhindra läckage. Om öppningen är för liten kan den utvidgas för att matcha storleken på givarkärlets lumen.
Slutligen är det mest utmanande men också den mest kritiska delen av operationen att utföra de arteriella och venösa anastomoserna. Den viktigaste aspekten är att bestämma lämpligt antal suturer att placera. Det är bäst att bedöma detta innan du placerar den första suturen så att jämnt avstånd kan planeras i enlighet därmed. Att placera för många suturer gör att blodflödet hindras, förutom att det orsakar mer endotelskador. Att placera för få suturer gör att blod kan läcka ut genom luckor i lumen. För storleken på mössen som används i denna studie fungerar i allmänhet fyra suturer bra för venen och sex suturer fungerar bra för artären. Artären kräver fler suturer på grund av dess blodflöde med högre tryck.
Flera modifieringar gjordes under hela studien för att göra denna operation perfekt. Inledningsvis användes en injicerbar anestesi, vilket resulterade i en högre dödlighet, sannolikt på grund av överdosering av bedövningsmedel, och en postoperativ återhämtningstid på cirka 3 timmar. Byte till inhalerad anestesi minskade dödligheten kraftigt och minskade den postoperativa återhämtningstiden till cirka 30 minuter. En annan förbättring var användningen av en trubbig nål för att spola transplantatet. Ursprungligen användes en avfasad nål, vilket ledde till oavsiktliga tårar i donatorhalspulsåderna, vilket orsakade kärlskador och läckage. Slutligen introducerades användningen av ett kontrasterande bakgrundsmaterial i detta protokoll. Att använda ett grönt bakgrundsmaterial under kärlen möjliggjorde bättre visualisering under anastomoserna och hjälpte till att höja kärlen och göra dem mer lättillgängliga.
Felsökning under de första operationerna fokuserade på att lösa problemet med inget arteriellt blodflöde i transplantatet. Vi antar att detta sannolikt berodde på flödesobstruktion vid artäranastomosplatsen. För att åtgärda detta gjordes en mer dramatisk avfasning på donatorhalspulsådern för att säkerställa att den låg i jämnhöjd med mottagarens halspulsåder. Vid suturering av anastomosen användes så få suturer som möjligt och fyrkantiga knutar bekräftades för att hindra kärlen från att rotera på sig själva.
När du använder den här modellen finns det några tekniska begränsningar att tänka på. Att bekräfta pulsering av artärerna eller observera initial påfyllning av sköldkörteln efter transplantationen garanterar inte alltid att LTE-komplexet kommer att ha kontinuerligt blodflöde. För att kontrollera om anastomos patency vid olika tidpunkter bör mer sofistikerade tekniker som Doppler ultraljud, användas. För att bättre skilja mellan blodflödesförlust på grund av immunavstötning och misslyckad kirurgisk teknik kan kontinuerliga verktyg för blodflödesövervakning implementeras i ytterligare studier. En annan begränsning för detta protokoll är att det lämnar lite utrymme för fel. Om en av givar- eller mottagarkärlen tårar, finns det inget sätt att slutföra proceduren framgångsrikt. Vidare, som en heterotopisk transplantation, är donatorstruphuvudet inte ett fullt fungerande organ. Denna modell är användbar för att studera immunsvar, men eftersom transplantatet faktiskt inte är kopplat till luftvägarna och ingen reinnervation görs, kan funktionell bedömning av ett transplanterat struphuvud inte utföras.
Det viktigaste bidraget från detta protokoll är minskningen av kostnaderna och förbättrad tillgänglighet av immunologiska analyser, antikroppar och data. Larynxtransplantation har tidigare publicerats hos råttor, hundar och grisar; Dessa djur är dock dyrare, och det finns färre immunologiska analyser och data tillgängliga11,12,13. 30 dagars dödlighet för denna procedur hos råttor befanns vara 41%11; Enligt vår erfarenhet av möss har detta antal minskat till 5%. Slutligen är användningen av inhalerat bedövningsmedel för larynxtransplantation unik för detta protokoll, eftersom de flesta publicerade larynxtransplantationsdjurmodeller använder ett injicerbart bedövningsmedel, såsom pentobarbital 8,11,14. Ett inhalerat bedövningsmedel minskar återhämtningstiden avsevärt och möjliggör mer kontroll över anestesidjupet än injicerbara anestetika. Narkosleveransmasken hjälper också till med korrekt positionering genom att förlänga nacken.
Det finns flera applikationer för denna transplantationsmodell. De viktigaste är förmågan att bedöma immunsvaret mot en vaskulariserad sammansatt allotransplant och att testa olika immunsuppressionsregimer15,16,17. Dessutom kan denna modell användas för att studera vaskulatur vid inställningen av en icke-fungerande arteriell anastomos, icke-fungerande venanastomos eller ateroskleros på grund av avstötning. Detta dokument beskriver hur man heterotopiskt transplanterar ett LTE-komplex från en mus till en annan på ~ 3 timmar. Denna genomförbara och relativt billiga modell erbjuder stor potential för att studera immunsystemets roll i avstötningen av LTE-komplexet, vilket ger potential för nya terapier vid organtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Egehan Salepcis rese- och levnadskostnader för forskning finansierades av Turkiets vetenskapliga och tekniska forskningsråd (TUBITAK).
Acknowledgments
Vi vill tacka Randall Raish för hans utmärkta videografi och redigeringshjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R.
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
