Summary
Hier introduceren we een gedetailleerde soaking-methode van RNA-interferentie in Bursaphelenchus xylophilus om de studie van genfuncties te vergemakkelijken.
Abstract
De dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus, is een van de meest destructieve invasieve soorten ter wereld en veroorzaakt het verwelken en uiteindelijk sterven van pijnbomen. Ondanks de erkenning van hun economische en ecologische betekenis, is het tot nu toe onmogelijk geweest om de gedetailleerde genfuncties van plantparasitaire nematoden (PPN's) te bestuderen met behulp van conventionele voorwaartse genetica en transgene methoden. Als omgekeerde geneticatechnologie vergemakkelijkt RNA-interferentie (RNAi) echter de studie van de functionele genen van nematoden, waaronder B. xylophilus.
Dit artikel schetst een nieuw protocol voor RNAi van het ppm-1-gen in B. xylophilus, waarvan is gemeld dat het een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling en reproductie van andere pathogene nematoden. Voor RNAi was de T7-promotor gekoppeld aan de 5′-terminal van het doelfragment door polymerasekettingreactie (PCR) en dubbelstrengs RNA (dsRNA) werd gesynthetiseerd door in vitro transcriptie. Vervolgens werd dsRNA-afgifte bereikt door de nematoden te weken in een dsRNA-oplossing gemengd met synthetische neurostimulantia. Gesynchroniseerde juvenielen van B. xylophilus (ongeveer 20.000 personen) werden gewassen en gedrenkt in dsRNA (0,8 μg / ml) in de weekbuffer gedurende 24 uur in het donker bij 25 °C.
Dezelfde hoeveelheid nematoden werd in een weekbuffer geplaatst zonder dsRNA als controle. Ondertussen werd een andere identieke hoeveelheid nematoden in een weekbuffer geplaatst met groen fluorescerend eiwit (gfp) gen dsRNA als controle. Na het weken werd het expressieniveau van de doeltranscripten bepaald met behulp van real-time kwantitatieve PCR. De effecten van RNAi werden vervolgens bevestigd met behulp van microscopische observatie van de fenotypen en een vergelijking van de lichaamsgrootte van de volwassenen tussen de groepen. Het huidige protocol kan helpen bij het bevorderen van onderzoek om de functies van de genen van B. xylophilus en andere parasitaire nematoden beter te begrijpen in de richting van het ontwikkelen van controlestrategieën door middel van genetische manipulatie.
Introduction
Plantparasitaire nematoden (PPN's) vormen een voortdurende bedreiging voor de voedselzekerheid en bosecosystemen. Ze veroorzaken naar schatting 100 miljard USD aan economische verliezen per jaar1, waarvan de meest problematische voornamelijk wortelknoopnematoden, cystenematoden en dennenhoutnematoden zijn. De dennenaaltje Bursaphelenchus xylophilus is een migrerende, endoparasitaire nematode, de oorzakelijke ziekteverwekker van dennenverwelkingsziekte2. Het heeft wereldwijd grote schade toegebracht aan dennenbossen3. In de terminologie van Van Megen et al.4 is B. xylophilus een lid van de Parasitaphelenchidae en behoort tot clade 10, terwijl de meeste andere belangrijke plantenparasieten tot clade 12 behoren.
Als onafhankelijke en recent geëvolueerde plantenparasiet is B. xylophilus een aantrekkelijk model voor vergelijkende studies. Tot op heden is er substantieel onderzoek gedaan naar wortelknoopnematoden en cystenematoden die behoren tot clade 12, die obligate, sedentaire endoparasieten zijn en enkele van de meest intensief bestudeerde nematoden zijn. Het uitvoeren van verder onderzoek op dit belangrijke gebied brengt echter een grote uitdaging met zich mee: de functie van parasitismegenen is een onderzoeksknelpunt. Functionele studies omvatten over het algemeen ectopische expressie en knockdown / out-experimenten, maar vertrouwen op effectieve genetische transformatieprotocollen voor de nematode. Als gevolg hiervan is omgekeerde genetica in PPN's bijna uitsluitend afhankelijk van gen-uitschakeling door RNAi.
RNAi, een mechanisme dat op grote schaal aanwezig is in eukaryote cellen, legt genexpressie stil door dubbelstrengs RNA (dsRNA) te introduceren5. Tot op heden is het posttranscriptionele gen-uitschakelingsmechanisme geïnduceerd door dsRNA gevonden in alle bestudeerde eukaryoten, en RNAi-technologie, als een hulpmiddel voor functioneel genomica-onderzoek en andere toepassingen, heeft zich snel ontwikkeld in veel organismen. Sinds de ontdekking van de RNAi-machinerie in Caenorhabditis elegans in 19986 zijn RNAi-technieken effectieve methoden geworden voor het identificeren van de genfunctie van nematoden en worden ze voorgesteld als een nieuwe manier om pathogene nematoden effectief te bestrijden7.
RNAi is technisch gezien gemakkelijk te weken de juvenielen in dsRNA kan volstaan; de werkzaamheid en reproduceerbaarheid van deze aanpak lopen echter sterk uiteen met de aaltjessoorten en het doelgen8. Het uitschakelen van 20 genen die betrokken zijn bij de RNAi-routes van de wortelknoopnematode, Meloidogyne incognita, werd onderzocht met behulp van lange dsRNA's als triggers, wat resulteerde in verschillende reacties, waaronder een toename en geen verandering in de expressie van sommige genen9. Deze resultaten tonen aan dat doelgenen anders kunnen reageren op RNAi knockdown, waardoor een uitputtende beoordeling van hun geschiktheid als doelwit voor nematodencontrole via RNAi noodzakelijk is. Er is momenteel echter een gebrek aan onderzoek naar de ontwikkelings- en voortplantingsbiologie van B. xylophilus.
Als voortzetting van eerder werk 10,11,12,13 beschrijven we hier een protocol voor het toepassen van RNAi om de functie van het ppm-1 gen van B. xylophilus te bestuderen, inclusief de synthese van dsRNA, synthetische neurostimulant soaking en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) detectie. De kennis die is opgedaan met deze experimentele aanpak zal waarschijnlijk aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van fundamentele biologische systemen en het voorkomen van dennenverwelkingsziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de raad voor dierproeven van zhejiang Agricultural &Forestry University. Het B. xylophilus isolaat NXY61 werd oorspronkelijk geëxtraheerd uit een zieke Pinus massoniana in het Ningbo-gebied van de provincie Zhejiang, China11.
1. Klonen van genen
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de primers die in dit protocol worden gebruikt.
- Verzamel nematoden.
- Kweek de B. xylophilus-stam op de mycelia van Botrytis cinerea op Potato Dextrose Agar (PDA) -platen bij 25 °C gedurende 3-5 dagen.
- Verzamel de aaltjes met behulp van de Bellman trechtermethode14.
- Plaats een geklemde rubberen buis onder een trechter en plaats twee lagen filterpapier in de mond van de trechter. Breng de schimmelculturen over in de trechter en voeg water toe om de schimmelmat onder te dompelen. Wacht 2 uur en verzamel dan de aaltjes.
- Extraheer het totale RNA uit de nematoden met behulp van een totaal RNA-extractiereagens (zie de tabel met materialen)11 volgens de volgende stappen.
- Voeg 500 μL extractiereagens en 100 μL magnetische kralen toe aan een centrifugebuis van 2 ml. Giet 20 μL van de aaltjes aan en breng het monster over naar een molen om gedurende 30 s met 9.000 × g te malen. Incubeer gedurende 5 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 12.000 × g en 4 °C.
- Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis. Voeg 100 μL chloroform toe, dop de buis en meng door de buis meerdere keren om te keren. Incubeer gedurende 3 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C.
- Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis. Voeg 250 μL isopropylalcohol en vortex krachtig toe. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 10 min.
- Gooi het supernatant weg. Voeg 500 μL 75% ethanol toe om het RNA te wassen en vortex het monster. Centrifugeer het gedurende 5 minuten bij 12.000 × g en 4 °C.
- Droog de RNA-pellet gedurende 5 minuten aan de lucht.
- Resuspendeer de pellet in 30 μL RNase-vrij water.
- Bereken de RNA-concentratie met behulp van de formule: A260 × verdunning × 40 = μg RNA/ml. Bereken de verhouding A260/A280.
OPMERKING: Een verhouding van ~ 2 wordt als zuiver beschouwd.
- Voer reverse transcriptie van RNA van goede kwaliteit uit om de cDNA-sjabloon te verkrijgen.
- Ontwerp en gebruik een paar specifieke primers, ppm-1-F/R (zie de tabel met materialen), om de partiële coderingssequentie van het Bx-ppm-1-gen in B. xylophilus (GenBank-toetredingsnummer QTZ96795) te versterken.
- Kloon de ppm-1 gensequenties in de pGEM-Teasy vector die de T7 promotor bevat volgens een standaard kloonprotocol11.
- Stel de PCR-reacties als volgt in: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL van elke primer (10 pmol/l) en steriel gedestilleerd water tot een eindvolume van 50 μL.
- Voer de versterkingsprocedure als volgt uit: 5 min bij 94 °C; gevolgd door 35 cycli van 30 s bij 94 °C, 30 s bij 55 °C en 1 min bij 72 °C; en een laatste verlengingsstap bij 72 °C gedurende 5 minuten.
- Kloon de versterkte producten tot een pGEM-T Easy vector voor sequencing.
2. Synthese van dsRNA
- Bereid de DNA-sjabloon voor op dsRNA-synthese met behulp van PCR met primers die zijn ontworpen om T7-promotorsites aan beide uiteinden toe te voegen. Voeg de T7-promotorreeks toe aan het 5'-uiteinde van de primers.
- Gebruik het plasmide dat het ppm-1 genfragment (894 bp) bevat als sjabloon voor PCR en herstel het fragment dat de T7-promotorbevat 11. Gebruik de hierboven beschreven PCR-procedure en -systeem.
- Gebruik een in vitro transcriptiekit om dsRNA11 te synthetiseren.
- Ontdooi de bevroren reagentia op ijs.
- Voeg 2 μL 10x reactiebuffer, 2 μL enzymmengsel en 1 μg DNA toe aan een centrifugebuis. Voeg nucleasevrij water toe om een standaardreactie van 4 μL te produceren. Meng vervolgens gelijke volumes van de vier ribonucleotide-oplossingen (ATP, CTP, GTP en UTP) samen en voeg 8 μL van het mengsel toe aan de buis. Meng grondig en incubeer bij 37 °C gedurende 4 uur.
- Voeg 1 μL DNase toe, meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Stop de reactie en voeg 30 μL nucleasevrij water en 30 μL LiCl-precipitatieoplossing toe om het RNA neer te slaan. Meng. Incubeer bij -20 °C 's nachts.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 × g en 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 ml 75% ethanol toe om het RNA te wassen. Vortex het monster en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 12.000 × g en 4 °C.
- Droog de RNA-pellet gedurende 3 minuten aan de lucht.
- Resuspendeer de pellet in 30 μL RNase-vrij water.
- Analyseer de kwaliteit van het dsRNA met behulp van een spectrofotometer. Pipetteer 1 μL van het dsRNA-monster op het meetonderstel en stel de golflengte in op 340 nm. Visualiseer de producten op een 1,0% agarose gel.
3. RNAi door weken
- Meng 4 μL 5x weekbuffer (0,05% gelatine, 5,5 mM KH2PO4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermidine) met het dsRNA en ddH2O om een totaal volume van 20 μL en een uiteindelijke RNA-concentratie van 0,8 μg/ml te produceren.
- Verkrijg J2-larven.
- Verzamel de aaltjes uit de schimmelculturen en breng ze over in een glazen petrischaaltje met een diameter van 6 cm. Voeg 10 ml water toe aan de schaal om ervoor te zorgen dat de nematoden vrij kunnen zwemmen. Bewaar de aaltjes 30 minuten in de schaal en wacht tot de eieren zich aan de bodem hechten.
- Verwijder het water en de nematoden voorzichtig en zorg ervoor dat de eieren niet worden verstoord. Herhaal de stappen totdat alle larven en volwassenen zijn verwijderd, waarbij alleen de eieren in het gerecht achterblijven.
- Broed de verzamelde eieren gedurende 24 uur in het donker bij 25 °C uit om J2-larven te verkrijgen. Verzamel de J2-larven, plaats ze in een buis en was ze drie keer met ddH2O voor het RNAi-experiment15.
- Breng de J2-larven over naar de buis van 2 ml met de dsRNA-oplossing en voeg resorcinoloplossing (gewikkeld in tinfoil en opgelost in water) toe om een eindconcentratie van 1,0% te produceren. Incubeer de larven met centrifugatie bij 15 × g op een schudtafel gedurende 24 uur bij 25 °C om ervoor te zorgen dat de larven het dsRNA effectief absorberen.
- Week dezelfde hoeveelheid nematoden in de weekbuffer zonder de dsRNA-sonde of met een GFP dsRNA-sonde als controle. Gebruik het GFP-gen (gfp, M62653.1) als een niet-endogene controle en synthetiseer het dsRNA van gfp met behulp van genspecifieke primers T7-GFP-F / R.
4. qPCR detectie
- Reinig de J2-larven met ddH2O, inclusief die met doelgeninterferentie, GFP-geninterferentie en de ongestoorde controlegroep. Extraheer de totale RNA's uit elke groep met behulp van de hierboven beschreven methode.
- Start de qPCR.
- Ontwerp de q-ppm-1-F/R primers met behulp van de gewenste software (zie de materiaaltabel).
- Stel de qPCR-reactie in op 12 μL met 1 μL cDNA, 6 μL fluorescerend premix, 0,4 μL van elke primer (10 pmol/l) en steriel gedestilleerd water.
- Voer qPCR als volgt uit: 2 min bij 95 °C; gevolgd door 40 cycli van 10 s bij 95 °C, 30 s bij 55 °C en 1 min bij 72 °C.
- Gebruik het actb-gen (GenBank-toetredingsnummer EU100952) en het tbb-2-gen (GenBank-toetredingsnummer MT769316), of andere genen, als interne referentiegenen om de veranderingen in genexpressieniveau na RNAi15 te evalueren.
- Gebruik volgens de cyclusdrempel (Ct)-waarde en de oplossingscurve de 2-ΔΔCt-methode om het relatieve expressieniveau van het doelgen te schatten en de interferentie-efficiëntie te verifiëren.
- Trek de Ct-waarde van het interne referentiegen van elk monster af van de Ct-waarde van het doelgen om de ΔCt-waarde te verkrijgen. Trek vervolgens de ΔCt-waarde van de interferentiegroep af van de ΔCt-waarde van de controlegroep om de ΔΔCt-waarde te verkrijgen.
OPMERKING: Een ΔΔCt-waarde groter dan 0 geeft aan dat de interferentie effectief is.
- Trek de Ct-waarde van het interne referentiegen van elk monster af van de Ct-waarde van het doelgen om de ΔCt-waarde te verkrijgen. Trek vervolgens de ΔCt-waarde van de interferentiegroep af van de ΔCt-waarde van de controlegroep om de ΔΔCt-waarde te verkrijgen.
5. Evalueer de lichaamslengte van nematoden volwassenen na RNAi
- Kweek na RNAi de J2-larven tot de volwassenheid op B. cinerea-gazons in PDA-platen gedurende 60 uur bij 25 °C15.
- Verzamel de volwassenen met behulp van de Bellman-trechtermethode (zie stap 1.1.2.1)14.
- Verkrijg beelden van de volwassen nematoden onder een microscoop en gebruik ImageJ-software (of andere meetsoftware) om de lichaamslengtes te meten.
- Meet de lengte met ImageJ door Analyseren | te selecteren Weegschaal instellen. Als de afstand bekend is, voert u de lengtewaarde van de getekende rechte lijn in. Voer de lengte-eenheid in.
- Schakel het selectievakje Algemeen in (gebruik deze standaard voor alle afbeeldingen) en klik op OK om de lengte te selecteren die moet worden gemeten met een rechte lijn op de te meten afbeelding.
- Gebruik de opdracht Ctrl+M (meting) om de resultaten weer te geven en vast te leggen in het resultatenvenster .
- Neem metingen van 50 mannelijke en 50 vrouwelijke nematoden voor statistische analyse12.
- Analyseer de gegevens door het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk monster te berekenen. Vergelijk de middelen van de monsters uit de verschillende groepen met behulp van de Student's t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse van ppm-1 expressie van B. xylophilus na RNAi
Het relatieve expressieniveau van het ppm-1-gen van B. xylophilus gedrenkt met GFP dsRNA en dat gedrenkt met doelgen dsRNA was respectievelijk 0,92 en 0,52 (het ppm-1 genexpressieniveau van de ddH2O-behandelde controlegroep was ingesteld op 1) (figuur 1). Exogene dsRNA heeft dus geen effect op de ppm-1 expressie van B. xylophilus; ppm-1 dsRNA kan echter effectief de expressie van het doelgen remmen.
Effect van ppm-1 expressie op groei en ontwikkeling van B. xylophilus
Na RNAi nam de grootte van de volwassenen aanzienlijk af (figuur 2), wat resulteerde in het SMA (small body size) mutant fenotype. Hoewel RNAi-behandelde personen zich ontwikkelden tot geslachtsrijpheid, was hun lichaamslengte aanzienlijk kleiner dan normale volwassenen. Specifiek, na RNAi in J2-stadium nematoden, was de gemiddelde lichaamslengte van vrouwen en mannen respectievelijk 544,61 μm en 526,24 μm. Daarentegen was de gemiddelde lichaamslengte van vrouwen en mannen in de controlegroep respectievelijk 971,86 μm en 912,31 μm (figuur 3), wat significante verschillen vertegenwoordigt (P = 0,0322).
Figuur 1: Expressie van het ppm-1 gen na RNAi van Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Afkortingen: RNAi = RNA-interferentie; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vermindering van de lichaamslengte van volwassenen na de interferentie van ppm-1 in Bursaphelenchus xylophilus. Afbeeldingen van een volwassen mannetje (A) en vrouwtje (C) van de RNAi-groep. Afbeeldingen van een volwassen mannetje (B) en vrouwtje (D) van de controlegroep. Schaalstaven = 50 μm. Afkorting: RNAi = RNA interferentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering en statistische analyse van de lichaamslengte van volwassenen van Bursaphelenchus xylophilus na RNAi van het ppm-1 gen . (*P = 0,0322). Afkorting: RNAi = RNA interferentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de levensgeschiedenis en parasitaire omgeving van B. xylophilus verschillen van die van andere nematoden, is er beperkt onderzoek gedaan naar de moleculaire pathogenese van deze plantpathogeen. Ondanks grote vooruitgang bij de toepassing van CRISPR/Cas9-genoombewerkingstechnologie in C. elegans en andere nematoden, is tot op heden alleen RNAi-technologie gepubliceerd die is toegepast op B. xylophilus 17. RNAi is een van de krachtigste hulpmiddelen die beschikbaar zijn om de genfunctie van nematoden te bestuderen en is op grote schaal gebruikt in onderzoek naar de B. xylophilus-genfunctie, signaaltransductieroutes en gentherapie 18,19,20. In tegenstelling tot de gen knock-out benaderingen die worden gebruikt in ongewervelde modellen, maakt RNAi-gemedieerde knockdown van doelgenen in nematoden de snelle evaluatie van de genfunctie mogelijk.
Er zijn drie manieren om RNAi uit te voeren bij C. elegans: injectie6,21 weken en6 voeden. Omdat J2-larven zich pas voeden na infectie, wordt de weekmethode meestal gebruikt voor de RNAi van plantparasitaire nematoden. De belangrijkste stap in de weekmethode is het toevoegen van een zenuwgas om de nematoden te stimuleren om te voeden. Urwin gebruikte eerst octopamine om de J2 van twee orale cystenematodensoorten, Globodera pallida en Heterodera-glycines, te stimuleren, wat resulteerde in de opname van dsRNA uit de weekoplossing22. Dezelfde methode is met succes gebruikt om J2 van de wortelknoopnematode Meloidogyne incognita te induceren om dsRNA 23 te absorberen. Resorcinol kan ook de opname van dsRNA door J2 van M. incognita induceren en kan effectiever zijn dan octopamine voor dit nematode24. Bovendien verbeterde de toevoeging van spermidine aan de weekbuffer met een verlengde incubatietijd de efficiëntie van RNAi in nematoden25. Na 24 uur weken komt dsRNA effectief B. xylophilus binnen, waardoor het ppm-1-gen wordt uitgeschakeld.
Dit protocol biedt daarom een referentie voor de toekomstige studie van de RNAi van andere plantparasitaire nematoden met fagocytosegedrag. Daarnaast speelt het ophangingseffect van de schudtafel een belangrijke rol bij het maximaliseren van het voordeel van de weekmethode. Deze methode kan de gelijktijdige behandeling van een groot aantal nematoden mogelijk maken. RNAi is gemakkelijker te bedienen wanneer het gericht is op de doelgenen waarvoor mutanten niet gemakkelijk kunnen worden verkregen en voor het evalueren van de effecten op verschillende punten in de ontwikkeling, omdat nematoden in elke levensfase kunnen worden geweekt. Zo kan RNAi worden gebruikt om de functie van een specifiek gen in een specifiek ontwikkelingsstadium te bestuderen. Wang et al. analyseerden de invloed van MAPK op de vruchtbaarheid van B. xylophilus en zijn belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van nematoden met behulp van dsRNA-weken26. Qiu et al. vonden dat de migratiesnelheid en vruchtbaarheid van B. xylophilus in pijnbomen afnam na downregulatie van het Bxpel1-gen , wat aangeeft dat dit gen een belangrijke pathogene factor is van B. xylophilus27.
Niet alle RNAi in nematoden werkt echter via dsRNA. Dulovic en Streit pasten kleine interfererende RNA's (siRNA's) toe in plaats van de langere dsRNA's om met succes te interfereren met Strongyloides ratti28. De beperking van het gebruik van dsRNA voor RNAi in Strongyloides kan verband houden met de afwezigheid van genen zoals rsd-6, sid-1 of sid-2 waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij dsRNA-opname. RNAi wordt ook geassocieerd met de nadelen van een positioneel effect en tijdelijke en onvolledige knock-out en heeft beperkte effectiviteit voor sommige genen en celtypen (zoals neuronen)29. Totdat echter een doorbraak in de transgene technologie van B. xylophilus is bereikt, vertegenwoordigt RNAi een relatief effectieve onderzoeksstrategie.
RNAi heeft een groot potentieel voor gewasbescherming laten zien. Met behulp van RNAi-technologie zijn transgene aardappelen die in staat zijn om dsRNA te produceren dat zich richt op wortelknoopnematodengenen gefokt om volledige resistentie tegen wortelknoopnematoden te produceren30. Expressie van dsRNA's die zich richten op insectengenen kan gewasbescherming bieden in afwezigheid van chemische insecticiden en biedt het extra voordeel dat er geen vreemde eiwitten worden geproduceerd, met een bijna onbeperkt aantal doelgenen31. Daarom zal versneld onderzoek op het gebied van toegepaste RNAi voor ongediertebestrijding een betere bioveiligheid bieden voor de bestrijding van plantenaaltjes dan transgene methoden of andere chemische bestrijdingsmethoden.
Concluderend beschrijft dit protocol de bereiding van dsRNA van het ppm-1-gen om RNAi te bereiken door de larven van B. xylophilus direct in dsRNA-oplossing te weken. Het interferentie-effect werd bevestigd op basis van een significante vermindering van de lichaamsgrootte van de larven nadat ze zich tot volwassenen hadden ontwikkeld in vergelijking met die van de controle, wat aantoont dat het ppm-1-gen effecten uitoefent op de groei en ontwikkeling van B. xylophilus. Deze studie biedt een theoretische basis voor het verder onthullen van de functie van ppm-1 met extra praktische waarde in het begeleiden van de biologische bestrijding van deze plantparasiet. Er wordt aangenomen dat met de verdere openbaarmaking en verbetering van het RNAi-technologiemechanisme, de toepassing ervan op het gebied van B. xylophilus-controle brede vooruitzichten zal hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten gemeld.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) en gezamenlijk gefinancierd door het Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
