Summary
Qui, introduciamo un metodo dettagliato di ammollo dell'interferenza dell'RNA in Bursaphelenchus xylophilus per facilitare lo studio delle funzioni geniche.
Abstract
Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è una delle specie invasive più distruttive in tutto il mondo, causando l'avvizzimento e la morte finale dei pini. Nonostante il riconoscimento della loro importanza economica e ambientale, è stato finora impossibile studiare le funzioni genetiche dettagliate dei nematodi parassiti delle piante (PPN) utilizzando la genetica convenzionale e i metodi transgenici. Tuttavia, come tecnologia di genetica inversa, l'interferenza dell'RNA (RNAi) facilita lo studio dei geni funzionali dei nematodi, incluso B. xylophilus.
Questo articolo delinea un nuovo protocollo per l'RNAi del gene ppm-1 in B. xylophilus, che è stato segnalato per svolgere ruoli cruciali nello sviluppo e nella riproduzione di altri nematodi patogeni. Per l'RNAi, il promotore T7 è stato collegato al 5′-terminale del frammento bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'RNA a doppio filamento (dsRNA) è stato sintetizzato mediante trascrizione in vitro . Successivamente, la consegna del dsRNA è stata realizzata immergendo i nematodi in una soluzione di dsRNA mescolata con neurostimolanti sintetici. I giovani sincronizzati di B. xylophilus (circa 20.000 individui) sono stati lavati e immersi in dsRNA (0,8 μg/ml) nel tampone di ammollo per 24 ore al buio a 25 °C.
La stessa quantità di nematodi è stata posta in un tampone di ammollo senza dsRNA come controllo. Nel frattempo, un'altra quantità identica di nematodi è stata posta in un tampone di ammollo con il gene della proteina fluorescente verde (gfp) dsRNA come controllo. Dopo l'immersione, il livello di espressione delle trascrizioni target è stato determinato utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale. Gli effetti dell'RNAi sono stati poi confermati utilizzando l'osservazione microscopica dei fenotipi e un confronto delle dimensioni corporee degli adulti tra i gruppi. L'attuale protocollo può aiutare a far progredire la ricerca per comprendere meglio le funzioni dei geni di B. xylophilus e di altri nematodi parassiti verso lo sviluppo di strategie di controllo attraverso l'ingegneria genetica.
Introduction
I nematodi parassiti delle piante (PPN) sono una minaccia continua per la sicurezza alimentare e gli ecosistemi forestali. Causano circa 100 miliardi di dollari di perdite economiche ogni anno1, i più problematici dei quali sono principalmente i nematodi a nodo radicale, i nematodi a cisti e i nematodi di pino. Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è un nematode endoparassitario migratore, che è l'agente patogeno causale della malattia dell'avvizzimento del pino2. Ha causato gravi danni alle foreste di pini in tutto il mondo3. Usando la terminologia di Van Megen et al.4, B. xylophilus è un membro dei Parasitaphelenchidae e appartiene al clade 10, mentre la maggior parte degli altri principali parassiti delle piante appartengono al clade 12.
Come parassita vegetale indipendente e recentemente evoluto, B. xylophilus è un modello attraente per studi comparativi. Ad oggi, ci sono state ricerche sostanziali sui nematodi a nodo radicale e sui nematodi a cisti appartenenti al clade 12, che sono endoparassiti sedentari obbligati e sono alcuni dei nematodi più intensamente studiati. Tuttavia, condurre ulteriori ricerche in questo importante settore comporta una grande sfida: la funzione dei geni del parassitismo è un collo di bottiglia della ricerca. Gli studi funzionali generalmente includono esperimenti di espressione ectopica e knockdown / out, ma si basano su protocolli di trasformazione genetica efficaci per il nematode. Di conseguenza, la genetica inversa nei PPN si basa quasi esclusivamente sul silenziamento genico da parte dell'RNAi.
L'RNAi, un meccanismo ampiamente presente nelle cellule eucariotiche, silenzia l'espressione genica introducendo RNA a doppio filamento (dsRNA)5. Ad oggi, il meccanismo di silenziamento genico posttrascrizionale indotto dal dsRNA è stato trovato in tutti gli eucarioti studiati e la tecnologia RNAi, come strumento di ricerca sulla genomica funzionale e altre applicazioni, si è sviluppata rapidamente in molti organismi. Dalla scoperta del meccanismo RNAi in Caenorhabditis elegans nel 19986, le tecniche RNAi sono diventate metodi efficaci per identificare la funzione genica dei nematodi e sono proposte come un nuovo modo per controllare efficacemente i nematodi patogeni7.
L'RNAi è tecnicamente facile: può essere sufficiente immergere i giovani nel dsRNA; Tuttavia, l'efficacia e la riproducibilità di questo approccio variano ampiamente con le specie di nematodi e il gene bersaglio8. Il silenziamento di 20 geni coinvolti nelle vie RNAi del nematode nodo radicale, Meloidogyne incognita, è stato studiato utilizzando lunghi dsRNA come trigger, con conseguente risposte diverse, tra cui un aumento e nessun cambiamento nell'espressione di alcuni geni9. Questi risultati mostrano che i geni bersaglio possono rispondere al knockdown dell'RNAi in modo diverso, rendendo necessaria una valutazione esaustiva della loro idoneità come bersagli per il controllo dei nematodi tramite RNAi. Tuttavia, c'è attualmente una scarsità di ricerca sulla biologia dello sviluppo e della riproduzione di B. xylophilus.
Come continuazione del precedente lavoro10,11,12,13, descriviamo qui un protocollo per applicare RNAi per studiare la funzione del gene ppm-1 di B. xylophilus, compresa la sintesi di dsRNA, l'ammollo neurostimolante sintetico e il rilevamento della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Le conoscenze acquisite da questo approccio sperimentale contribuiranno probabilmente notevolmente alla comprensione dei sistemi biologici di base e alla prevenzione della malattia dell'avvizzimento del pino.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dal consiglio per la sperimentazione animale della Zhejiang Agricultural & Forestry University. L'isolato di B. xylophilus NXY61 è stato originariamente estratto da un Pinus massoniana malato nell'area di Ningbo della provincia di Zhejiang, Cina11.
1. Clonazione genica
NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sui primer utilizzati in questo protocollo.
- Raccogli i nematodi.
- Coltura del ceppo di B. xylophilus sul micelio di Botrytis cinerea su piastre di destrosio di patate (PDA) a 25 °C per 3-5 giorni.
- Raccogliere i nematodi utilizzando il metodo dell'imbuto di Bellman14.
- Posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e posizionare due strati di carta da filtro nella bocca dell'imbuto. Trasferire le colture fungine nell'imbuto e aggiungere acqua per immergere il tappeto fungino. Attendere 2 ore, quindi raccogliere i nematodi.
- Estrarre l'RNA totale dai nematodi utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA totale (vedere la Tabella dei materiali)11 secondo i seguenti passaggi.
- Aggiungere 500 μL di reagente di estrazione e 100 μL di sfere magnetiche in una provetta da centrifuga da 2 ml. Aspirare 20 μL dei nematodi e trasferire il campione in una smerigliatrice per macinare a 9.000 × g per 30 s. Incubare per 5 minuti e quindi centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g e 4 °C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 100 μL di cloroformio, tappare il tubo e mescolare capovolgendo il tubo più volte. Incubare per 3 minuti e quindi centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Aggiungere 250 μL di alcool isopropilico e vortice vigorosamente. Centrifugare a 12.000 × g per 10 min.
- Scartare il surnatante. Aggiungere 500 μL di etanolo al 75% per lavare l'RNA e quindi vortice il campione. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 × g e 4 °C.
- Asciugare all'aria il pellet di RNA per 5 minuti.
- Risospendere il pellet in 30 μL di acqua priva di RNasi.
- Calcolare la concentrazione di RNA usando la formula: A260 × diluizione × 40 = μg RNA/mL. Calcolare il rapporto A260/A280.
NOTA: un rapporto di ~ 2 è considerato puro.
- Eseguire la trascrizione inversa di RNA di buona qualità per ottenere il modello di cDNA.
- Progettare e utilizzare una coppia di primer specifici, ppm-1-F/R (vedere la Tabella dei Materiali), per amplificare la sequenza codificante parziale del gene Bx-ppm-1 in B. xylophilus (GenBank accession number QTZ96795).
- Clonare le sequenze geniche ppm-1 nel vettore pGEM-Teasy contenente il promotore T7 seguendo un protocollo di clonazione standard11.
- Impostare le reazioni PCR come segue: 2 μL di cDNA, 25 μL di 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL di ciascun primer (10 pmol/l) e acqua distillata sterile fino a un volume finale di 50 μL.
- Eseguire la procedura di amplificazione come segue: 5 min a 94 °C; seguiti da 35 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C; e una fase di estensione finale a 72 °C per 5 min.
- Clonare i prodotti amplificati in un vettore pGEM-T Easy per il sequenziamento.
2. Sintesi di dsRNA
- Preparare il modello di DNA per la sintesi di dsRNA utilizzando PCR con primer progettati per aggiungere siti di promotori T7 ad entrambe le estremità. Aggiungere la sequenza del promotore T7 all'estremità 5' dei primer.
- Utilizzare il plasmide contenente il frammento del gene ppm-1 (894 bp) come modello per la PCR e recuperare il frammento contenente il promotore T711. Utilizzare la procedura e il sistema PCR descritti sopra.
- Utilizzare un kit di trascrizione in vitro per sintetizzare dsRNA11.
- Scongelare i reagenti congelati sul ghiaccio.
- Aggiungere 2 μL di tampone di reazione 10x, 2 μL di miscela enzimatica e 1 μg di DNA in una provetta da centrifuga. Aggiungere acqua priva di nucleasi per produrre una reazione standard di 4 μL. Quindi, mescolare volumi uguali delle quattro soluzioni di ribonucleotide (ATP, CTP, GTP e UTP) insieme e aggiungere 8 μL della miscela al tubo. Mescolare accuratamente e incubare a 37 °C per 4 ore.
- Aggiungere 1 μL di DNasi, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 37 °C.
- Interrompere la reazione e aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi e 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl per precipitare l'RNA. Mescolare accuratamente. Incubare a -20 °C durante la notte.
- Centrifugare per 15 minuti a 12.000 × g e 4 °C. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 75% per lavare l'RNA. Vortice il campione e centrifugarlo per 10 minuti a 12.000 × g e 4 °C.
- Asciugare all'aria il pellet di RNA per 3 minuti.
- Risospendere il pellet in 30 μL di acqua priva di RNasi.
- Analizzare la qualità del dsRNA utilizzando uno spettrofotometro. Pipettare 1 μL del campione di dsRNA sul piedistallo di misurazione e impostare la lunghezza d'onda su 340 nm. Visualizza i prodotti su un gel di agarosio all'1,0%.
3. RNAi mediante ammollo
- Mescolare 4 μL di tampone di ammollo 5x (0,05% gelatina, 5,5 mM KH 2 PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4 Cl, 3 mM spermidina) con dsRNA eddH2O per produrre un volume totale di 20 μLe una concentrazione finale di RNA di 0,8 μg/ml.
- Acquisire larve J2.
- Raccogliere i nematodi dalle colture fungine e trasferirli in una capsula di Petri di vetro di 6 cm di diametro. Aggiungere 10 ml di acqua al piatto per assicurarsi che i nematodi possano nuotare liberamente. Tenere i nematodi nel piatto per 30 minuti e attendere che le uova aderiscano al fondo.
- Rimuovere con cura l'acqua e i nematodi, facendo attenzione a non disturbare le uova. Ripeti i passaggi fino a quando tutte le larve e gli adulti vengono rimossi, lasciando solo le uova nel piatto.
- Covare le uova raccolte per 24 ore al buio a 25 °C per ottenere larve J2. Raccogliere le larve J2, metterle in un tubo e lavarle tre volte con ddH2O per l'esperimento RNAi15.
- Trasferire le larve J2 nel tubo da 2 mL contenente la soluzione di dsRNA e aggiungere la soluzione di resorcinolo (avvolta in carta stagnola e sciolta in acqua) per produrre una concentrazione finale dell'1,0%. Incubare le larve con centrifugazione a 15 × g su tavola vibrante per 24 ore a 25 °C per garantire che le larve assorbano efficacemente il dsRNA.
- Immergere la stessa quantità di nematodi nel tampone di ammollo senza la sonda dsRNA o con una sonda dsRNA GFP come controllo. Utilizzare il gene GFP (gfp, M62653.1) come controllo non endogeno e sintetizzare il dsRNA di gfp usando primer gene-specifici T7-GFP-F/R.
4. Rilevamento qPCR
- Pulire le larve J2 con ddH2O, comprese quelle con interferenza genica bersaglio, interferenza genica GFP e gruppo di controllo indisturbato. Estrarre gli RNA totali da ciascun gruppo utilizzando il metodo sopra descritto.
- Avviare la qPCR.
- Progettare i primer q-ppm-1-F/R utilizzando il software desiderato (vedere la tabella dei materiali).
- Impostare la reazione qPCR in 12 μL contenenti 1 μL di cDNA, 6 μL di premiscela fluorescente, 0,4 μL di ciascun primer (10 pmol/l) e acqua distillata sterile.
- Eseguire la qPCR come segue: 2 min a 95 °C; seguiti da 40 cicli di 10 s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 1 min a 72 °C.
- Utilizzare il gene actb (GenBank accession number EU100952) e il gene tbb-2 (GenBank accession number MT769316), o altri geni, come geni di riferimento interni per valutare i cambiamenti nel livello di espressione genica dopo RNAi15.
- In base al valore della soglia del ciclo (Ct) e alla curva di dissoluzione, utilizzare il metodo 2-ΔΔCt per stimare il livello di espressione relativa del gene bersaglio e verificare l'efficienza di interferenza.
- Sottrarre il valore Ct del gene di riferimento interno di ciascun campione dal valore Ct del gene bersaglio per ottenere il valore ΔCt. Quindi, sottrarre il valore ΔCt del gruppo di interferenza dal valore ΔCt del gruppo di controllo per ottenere il valore ΔΔCt.
NOTA: un valore ΔΔCt maggiore di 0 indica che l'interferenza è efficace.
- Sottrarre il valore Ct del gene di riferimento interno di ciascun campione dal valore Ct del gene bersaglio per ottenere il valore ΔCt. Quindi, sottrarre il valore ΔCt del gruppo di interferenza dal valore ΔCt del gruppo di controllo per ottenere il valore ΔΔCt.
5. Valutare la lunghezza corporea degli adulti nematodi dopo RNAi
- Dopo RNAi, coltivare le larve J2 fino all'età adulta su prati di B. cinerea in piastre PDA per 60 ore a 25 °C15.
- Raccogliere gli adulti usando il metodo dell'imbuto di Bellman (vedi passo 1.1.2.1)14.
- Acquisire immagini dei nematodi adulti al microscopio e utilizzare il software ImageJ (o altro software di misurazione) per misurare le lunghezze corporee.
- Misurare la lunghezza utilizzando ImageJ selezionando Analizza | Imposta scala. Se la distanza è nota, immettere il valore di lunghezza della linea retta disegnata. Immettere l'unità di lunghezza.
- Selezionare la casella di controllo Globale (utilizzare questo standard per tutte le immagini) e fare clic su OK per selezionare la lunghezza da misurare con una linea retta sull'immagine da misurare.
- Utilizzare il comando Ctrl+M (misurazione) per visualizzare i risultati e registrarli nella finestra dei risultati .
- Effettuare misurazioni di 50 nematodi maschi e 50 femmine per analisi statistiche12.
- Analizzare i dati calcolando la media e la deviazione standard per ciascun campione. Confronta le medie dei campioni dei diversi gruppi usando il t-test dello studente.
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Representative Results
Analisi dell'espressione ppm-1 di B. xylophilus dopo RNAi
Il livello di espressione relativa del gene ppm-1 di B. xylophilus imbevuto di dsRNA GFP e di quello imbevuto di dsRNA del gene bersaglio era rispettivamente 0,92 e 0,52 (il livello di espressione genica ppm-1 del gruppo di controllo trattato con ddH2O era impostato su 1) (Figura 1). Pertanto, il dsRNA esogeno non ha alcun effetto sull'espressione ppm-1 di B. xylophilus; tuttavia, il dsRNA ppm-1 può inibire efficacemente l'espressione del gene bersaglio.
Effetto dell'espressione di ppm-1 sulla crescita e lo sviluppo di B. xylophilus
Dopo RNAi, le dimensioni degli adulti sono notevolmente diminuite (Figura 2), determinando il fenotipo mutante SMA (small body size). Sebbene gli individui trattati con RNAi abbiano raggiunto la maturità sessuale, la loro lunghezza corporea era sostanzialmente inferiore rispetto agli adulti normali. In particolare, dopo RNAi nei nematodi in stadio J2, la lunghezza corporea media delle femmine e dei maschi era rispettivamente di 544,61 μm e 526,24 μm. Al contrario, la lunghezza corporea media delle femmine e dei maschi nel gruppo di controllo era rispettivamente di 971,86 μm e 912,31 μm (Figura 3), che rappresentano differenze significative (P = 0,0322).
Figura 1: Espressione del gene ppm-1 dopo RNAi di Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Abbreviazioni: RNAi = RNA interference; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Riduzione della lunghezza corporea degli adulti dopo l'interferenza di ppm-1 in Bursaphelenchus xylophilus. Immagini di un maschio adulto (A) e di una femmina (C) del gruppo RNAi. Immagini di un maschio adulto (B) e una femmina (D) del gruppo di controllo. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazione: RNAi = RNA interference. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione e analisi statistica della lunghezza corporea degli adulti di Bursaphelenchus xylophilus dopo RNAi del gene ppm-1 . (*P = 0,0322). Abbreviazione: RNAi = RNA interference. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Sebbene la storia della vita e l'ambiente parassitario di B. xylophilus siano diversi da quelli di altri nematodi, c'è stata una ricerca limitata sulla patogenesi molecolare di questo patogeno vegetale. Nonostante i grandi progressi compiuti nell'applicazione della tecnologia di modifica del genoma CRISPR / Cas9 in C. elegans e altri nematodi, solo la tecnologia RNAi applicata a B. xylophilus è stata pubblicata fino ad oggi17. RNAi è uno degli strumenti più potenti disponibili per studiare la funzione genica dei nematodi ed è stato ampiamente utilizzato nella ricerca per chiarire la funzione del gene B. xylophilus, le vie di trasduzione del segnale e la terapia genica18,19,20. In contrasto con gli approcci di knockout genico utilizzati nei modelli di invertebrati, il knockdown mediato da RNAi dei geni bersaglio nei nematodi consente la rapida valutazione della funzione genica.
Esistono tre modi per condurre l'RNAi in C. elegans: iniezione 6, ammollo21 e alimentazione6. Poiché le larve J2 si nutrono solo dopo l'infezione, il metodo di ammollo viene tipicamente utilizzato per l'RNAi dei nematodi parassiti delle piante. Il passo chiave nel metodo di ammollo è aggiungere un agente nervino per stimolare i nematodi a nutrirsi. Urwin ha usato per la prima volta l'octopamina per stimolare il J2 di due specie di nematodi a cisti orali, Globodera pallida e Heterodera glycines, con conseguente assorbimento di dsRNA dalla soluzione di ammollo22. Lo stesso metodo è stato utilizzato con successo per indurre J2 del nematode nodo radicale Meloidogyne incognita ad assorbire dsRNA 23. Il resorcinolo può anche indurre l'assorbimento di dsRNA da parte di J2 di M. incognita e può essere più efficace dell'octopamina per questo nematode24. Inoltre, l'aggiunta di spermidina al tampone di ammollo con un tempo di incubazione prolungato ha migliorato l'efficienza dell'RNAi nei nematodi25. Dopo 24 ore di immersione, il dsRNA entra efficacemente in B. xylophilus, silenziando così il gene ppm-1.
Questo protocollo, quindi, fornisce un riferimento per lo studio futuro dell'RNAi di altri nematodi parassitari vegetali con comportamento fagocitosi. Inoltre, l'effetto di sospensione della tavola vibrante svolge un ruolo importante nel massimizzare il vantaggio del metodo di ammollo. Questo metodo può consentire il trattamento simultaneo di un gran numero di nematodi. L'RNAi è più facile da usare quando focalizzato sui geni bersaglio per i quali i mutanti non possono essere facilmente ottenuti e per valutare gli effetti in diversi punti dello sviluppo perché i nematodi possono essere immersi in qualsiasi fase della vita. Pertanto, l'RNAi può essere utilizzato per studiare la funzione di un gene specifico in una specifica fase di sviluppo. Wang et al. hanno analizzato l'influenza di MAPK sulla fecondità di B. xylophilus e il suo importante ruolo nella crescita e nello sviluppo dei nematodi utilizzando l'ammollo di dsRNA26. Qiu et al. hanno scoperto che la velocità di migrazione e la fecondità di B. xylophilus nei pini sono diminuite dopo la downregulation del gene Bxpel1, il che indica che questo gene è un importante fattore patogeno di B. xylophilus27.
Tuttavia, non tutto l'RNAi nei nematodi funziona attraverso il dsRNA. Dulovic e Streit hanno applicato piccoli RNA interferenti (siRNA) piuttosto che i dsRNA più lunghi per interferire con successo con Strongyloides ratti28. La limitazione dell'uso di dsRNA per RNAi in Strongyloides può essere correlata all'assenza di geni come rsd-6, sid-1 o sid-2 che sono noti per essere coinvolti nell'assorbimento di dsRNA. L'RNAi è anche associato agli svantaggi di un effetto posizionale e di un knockout temporaneo e incompleto e ha un'efficacia limitata per alcuni geni e tipi di cellule (come i neuroni)29. Tuttavia, fino a quando non si raggiunge una svolta nella tecnologia transgenica di B. xylophilus , l'RNAi rappresenta una strategia di ricerca relativamente efficace.
L'RNAi ha mostrato un grande potenziale per la protezione delle colture. Utilizzando la tecnologia RNAi, sono state allevate patate transgeniche in grado di produrre dsRNA che colpiscono i geni dei nematodi del nodo radicale per produrre una resistenza completa ai nematodi del nodo radicale30. L'espressione di dsRNA che colpiscono i geni degli insetti può fornire protezione alle colture in assenza di insetticidi chimici e offre l'ulteriore vantaggio di non produrre proteine estranee, con un numero quasi illimitato di geni bersaglio31. Pertanto, la ricerca accelerata nel campo dell'RNAi applicato per il controllo dei parassiti fornirà una migliore biosicurezza per il controllo dei nematodi vegetali rispetto ai metodi transgenici o ad altri metodi di controllo chimico.
In conclusione, questo protocollo descrive la preparazione del dsRNA del gene ppm-1 per ottenere RNAi immergendo direttamente le larve di B. xylophilus in soluzione di dsRNA. L'effetto di interferenza è stato confermato sulla base di una significativa riduzione delle dimensioni corporee delle larve dopo che si sono sviluppate in adulti rispetto a quella del controllo, dimostrando che il gene ppm-1 esercita effetti sulla crescita e sullo sviluppo di B. xylophilus. Questo studio fornisce una base teorica per rivelare ulteriormente la funzione di ppm-1 con un ulteriore valore pratico nel guidare il controllo biologico di questo parassita vegetale. Si ritiene che con l'ulteriore divulgazione e miglioramento del meccanismo della tecnologia RNAi, la sua applicazione nel campo del controllo di B. xylophilus avrà ampie prospettive.
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Disclosures
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) e finanziata congiuntamente dal Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
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