Summary
Her introduserer vi en detaljert bløtleggingsmetode for RNA-interferens i Bursaphelenchus xylophilus for å lette studiet av genfunksjoner.
Abstract
Furuvednematoden, Bursaphelenchus xylophilus, er en av de mest ødeleggende invasive artene over hele verden, noe som forårsaker visning og til slutt død av furutrær. Til tross for anerkjennelsen av deres økonomiske og miljømessige betydning, har det hittil vært umulig å studere de detaljerte genfunksjonene til planteparasittiske nematoder (PPN) ved hjelp av konvensjonell fremovergenetikk og transgene metoder. Imidlertid, som en omvendt genetikkteknologi, letter RNA-interferens (RNAi) studiet av de funksjonelle gener av nematoder, inkludert B. xylophilus.
Dette papiret skisserer en ny protokoll for RNAi av ppm-1-genet i B. xylophilus, som har blitt rapportert å spille avgjørende roller i utvikling og reproduksjon av andre patogene nematoder. For RNAi ble T7-promotoren koblet til 5′-terminalen av målfragmentet ved polymerasekjedereaksjon (PCR), og dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ble syntetisert ved in vitro-transkripsjon . Deretter ble dsRNA-levering oppnådd ved å suge nematodene i en dsRNA-løsning blandet med syntetiske nevrostimulerende midler. Synkroniserte yngel av B. xylophilus (ca. 20 000 individer) ble vasket og dynket i dsRNA (0,8 μg/ml) i bløtbufferen i 24 timer i mørket ved 25 °C.
Den samme mengden nematoder ble plassert i en bløtleggingsbuffer uten dsRNA som en kontroll. I mellomtiden ble en annen identisk mengde nematoder plassert i en bløtbuffer med grønt fluorescerende protein (gfp) gen dsRNA som en kontroll. Etter bløtlegging ble ekspresjonsnivået til måltranskripsjonene bestemt ved hjelp av kvantitativ PCR i sanntid. Effektene av RNAi ble deretter bekreftet ved hjelp av mikroskopisk observasjon av fenotypene og en sammenligning av kroppsstørrelsen til de voksne blant gruppene. Den nåværende protokollen kan bidra til å fremme forskning for bedre å forstå funksjonene til genene til B. xylophilus og andre parasittiske nematoder mot å utvikle kontrollstrategier gjennom genteknologi.
Introduction
Planteparasittiske nematoder (PPN) er en vedvarende trussel mot matsikkerhet og skogøkosystemer. De forårsaker anslagsvis 100 milliarder dollar i økonomiske tap hvert år1, hvorav de mest problematiske er primært rotknute nematoder, cyste nematoder og furu nematoder. Furuvednematoden, Bursaphelenchus xylophilus, er en migrerende, endoparasittisk nematode, som er årsakspatogenet til furu vilje sykdom2. Det har forårsaket stor skade på furuskog over hele verden3. Ved å bruke terminologien til Van Megen et al.4, er B. xylophilus medlem av Parasitaphelenchidae og tilhører klade 10, mens de fleste andre store planteparasitter tilhører klade 12.
Som en uavhengig og nylig utviklet planteparasitt er B. xylophilus en attraktiv modell for komparative studier. Til dags dato har det vært betydelig forskning på rotknute nematoder og cyste nematoder som tilhører klade 12, som er obligate, stillesittende endoparasitter og er noen av de mest intenst studerte nematoder. Å utføre videre forskning på dette viktige området kommer imidlertid med en stor utfordring: funksjonen til parasittiske gener er en flaskehals i forskningen. Funksjonelle studier inkluderer generelt ektopisk uttrykk og knockdown / ut eksperimenter, men stole på effektive genetiske transformasjonsprotokoller for nematoden. Som et resultat er omvendt genetikk i PPN nesten utelukkende avhengig av geninaktivering av RNAi.
RNAi, en mekanisme som er mye tilstede i eukaryote celler, demper genuttrykk ved å introdusere dobbeltstrenget RNA (dsRNA)5. Til dags dato har den posttranskripsjonelle geninaktiveringsmekanismen indusert av dsRNA blitt funnet i alle studerte eukaryoter, og RNAi-teknologi, som et verktøy for funksjonell genomforskning og andre applikasjoner, har utviklet seg raskt i mange organismer. Siden oppdagelsen av RNAi-maskineriet i Caenorhabditis elegans i 19986, har RNAi-teknikker blitt effektive metoder for å identifisere genfunksjonen til nematoder og foreslås som en ny måte å effektivt kontrollere patogene nematoder7.
RNAi er teknisk lett-soaking ungdommene i dsRNA kan være tilstrekkelig; Effekten og reproduserbarheten av denne tilnærmingen varierer imidlertid mye med nematodearten og målgenet8. Silencing av 20 gener involvert i RNAi-banene til rotknute-nematoden, Meloidogyne incognita, ble undersøkt ved hjelp av lange dsRNA som utløsere, noe som resulterte i forskjellige responser, inkludert en økning og ingen endring i uttrykket av noen gener9. Disse resultatene viser at målgener kan reagere på RNAi-knockdown annerledes, noe som krever en uttømmende vurdering av deres egnethet som mål for nematodekontroll via RNAi. Imidlertid er det for tiden mangel på forskning på utviklings- og reproduksjonsbiologi av B. xylophilus.
Som en videreføring av tidligere arbeid10,11,12,13 beskriver vi her en protokoll for å anvende RNAi for å studere funksjonen til ppm-1-genet til B. xylophilus, inkludert syntese av dsRNA, syntetisk nevrostimulerende bløtlegging og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) deteksjon. Kunnskapen fra denne eksperimentelle tilnærmingen vil trolig bidra markant til å forstå grunnleggende biologiske systemer og forebygge furu vilje sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av rådet for dyreforsøk av Zhejiang Agricultural & Forestry University. B. xylophilus-isolatet NXY61 ble opprinnelig ekstrahert fra en syk Pinus massoniana i Ningbo-området i Zhejiang-provinsen, Kina11.
1. Genkloning
MERK: Se materialtabellen for detaljer om primerne som brukes i denne protokollen.
- Samle nematoder.
- Kultur B. xylophilus-stammen på mycelia av Botrytis cinerea på Potato Dextrose Agar (PDA) plater ved 25 ° C i 3-5 dager.
- Samle nematodene ved hjelp av Bellman-traktmetoden14.
- Plasser et klemmet gummirør under en trakt og legg to lag filterpapir i traktens munn. Overfør soppkulturene til trakten og tilsett vann for å fordype soppmatten. Vent i 2 timer, og samle deretter nematodene.
- Pakk ut det totale RNA fra nematodene ved hjelp av et totalt RNA-ekstraksjonsreagens (se materialtabellen)11 i henhold til følgende trinn.
- Tilsett 500 μL ekstraksjonsreagens og 100 μL magnetiske perler til et 2 ml sentrifugerør. Aspirer 20 μL av nematodene og overfør prøven til en kvern for sliping ved 9000 × g i 30 s. Inkuber i 5 minutter og sentrifuger deretter i 10 minutter ved 12 000 × g og 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør. Tilsett 100 μL kloroform, dekk røret og bland ved å snu røret flere ganger. Inkuber i 3 minutter og sentrifuger deretter i 10 minutter ved 12 000 × g ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør. Tilsett 250 μL isopropylalkohol og vortex kraftig. Sentrifuge på 12.000 × g i 10 min.
- Kast supernatanten. Tilsett 500 μL 75% etanol for å vaske RNA og deretter virvle prøven. Sentrifuge den i 5 minutter ved 12 000 × g og 4 °C.
- Lufttørk RNA-pelleten i 5 min.
- Resuspender pelleten i 30 μL RNase-fritt vann.
- Beregn RNA-konsentrasjonen ved hjelp av formelen: A260 × fortynning × 40 = μg RNA / ml. Beregn forholdet mellom A260 og A280.
MERK: Et forhold på ~ 2 regnes som rent.
- Utfør revers transkripsjon av RNA av god kvalitet for å oppnå cDNA-malen.
- Design og bruk et par spesifikke primere, ppm-1-F / R (se materialtabellen), for å forsterke den delvise kodesekvensen til Bx-ppm-1-genet i B. xylophilus (GenBank-tiltredelsesnummer QTZ96795).
- Klon ppm-1-gensekvensene til pGEM-Teasy-vektoren som inneholder T7-promotoren etter en standard kloningsprotokoll11.
- Sett opp PCR-reaksjonene som følger: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL av hver primer (10 pmol / l) og sterilt destillert vann til et endelig volum på 50 μL.
- Utfør forsterkningsprosedyren som følger: 5 min ved 94 °C; etterfulgt av 35 sykluser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 55 °C og 1 min ved 72 °C; og et siste forlengelsestrinn ved 72 °C i 5 min.
- Klon de forsterkede produktene til en pGEM-T Easy-vektor for sekvensering.
2. Syntese av dsRNA
- Forbered DNA-malen for dsRNA-syntese ved hjelp av PCR med primere designet for å legge til T7-promotorsteder i begge ender. Legg til T7-promotorsekvensen til 5'-enden av primerne.
- Bruk plasmidet som inneholder ppm-1-genfragmentet (894 bp) som mal for PCR og gjenopprett fragmentet som inneholder T7-promotoren11. Bruk PCR-prosedyren og systemet beskrevet ovenfor.
- Bruk et in vitro transkripsjonssett for å syntetisere dsRNA11.
- Tine de frosne reagensene på is.
- Tilsett 2 μL 10x reaksjonsbuffer, 2 μL enzymblanding og 1 μg DNA til et sentrifugerør. Tilsett nukleasefritt vann for å produsere en standard 4 μL-reaksjon. Bland deretter like store mengder av de fire ribonukleotidoppløsningene (ATP, CTP, GTP og UTP) sammen og tilsett 8 μL av blandingen til røret. Bland godt og inkuber ved 37 °C i 4 timer.
- Tilsett 1 μL DNase, bland godt og rug i 15 minutter ved 37 °C.
- Stopp reaksjonen og tilsett 30 μL nukleasefritt vann og 30 μL LiCl utfellingsløsning for å utfelle RNA. Bland godt. Inkuber ved -20 °C over natten.
- Sentrifuge i 15 minutter ved 12 000 × g og 4 °C. Kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml 75% etanol for å vaske RNA. Vortex prøven og sentrifuger den i 10 minutter ved 12 000 × g og 4 ° C.
- Lufttørk RNA-pelleten i 3 min.
- Resuspender pelleten i 30 μL RNase-fritt vann.
- Analyser kvaliteten på dsRNA ved hjelp av et spektrofotometer. Pipette 1 μL av dsRNA-prøven på målesokkelen og sett bølgelengden til 340 nm. Visualiser produktene på en 1,0% agarosegel.
3. RNAi ved bløtlegging
- Bland 4 μL 5x bløtbuffer (0,05% gelatin, 5,5 mM KH 2 PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermidin) med dsRNA og ddH2O for å produsere et totalt volum på 20 μL og en endelig RNA-konsentrasjon på0,8 μg / ml.
- Skaff J2 larver.
- Samle nematoder fra soppkulturer og overfør dem til et glass petriskål 6 cm i diameter. Tilsett 10 ml vann i parabolen for å sikre at nematodene kan svømme fritt. Hold nematodene i parabolen i 30 minutter og vent til eggene fester seg til bunnen.
- Fjern vannet og nematodene forsiktig, og pass på at eggene ikke forstyrres. Gjenta trinnene til alle larver og voksne er fjernet, og la bare eggene ligge i parabolen.
- Klekk de oppsamlede eggene i 24 timer i mørket ved 25 °C for å få J2-larver. Samle J2-larvene, legg dem i et rør og vask dem tre ganger med ddH2O for RNAi-eksperimentet15.
- Overfør J2-larvene til 2 ml røret som inneholder dsRNA-løsningen og tilsett resorcinoloppløsning (pakket inn i tinfoil og oppløst i vann) for å produsere en endelig konsentrasjon på 1,0%. Inkuber larvene med sentrifugering ved 15 × g på et ristebord i 24 timer ved 25 °C for å sikre at larvene effektivt absorberer dsRNA.
- Bløtlegg samme mengde nematoder i bløtbufferen uten dsRNA-sonden eller med en GFP dsRNA-sonde som en kontroll. Bruk GFP-genet (gfp, M62653.1) som en ikke-endogen kontroll og syntetisere dsRNA av gfp ved hjelp av genspesifikke primere T7-GFP-F / R.
4. qPCR-deteksjon
- Rengjør J2-larvene med ddH2O, inkludert de med målgeninterferens, GFP-geninterferens og den uforstyrrede kontrollgruppen. Trekk ut de totale RNA-ene fra hver gruppe ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor.
- Start qPCR.
- Design q-ppm-1-F/R-primerne ved hjelp av ønsket programvare (se materialtabellen).
- Sett opp qPCR-reaksjonen i 12 μL inneholdende 1 μL cDNA, 6 μL fluorescerende forblanding, 0,4 μL av hver primer (10 pmol / l) og sterilt destillert vann.
- Utfør qPCR som følger: 2 min ved 95 °C; etterfulgt av 40 sykluser på 10 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C og 1 min ved 72 °C.
- Bruk actb-genet (GenBank-tiltredelsesnummer EU100952) og tbb-2-genet (GenBank-tiltredelsesnummer MT769316), eller andre gener, som interne referansegener for å evaluere endringene i genuttrykksnivå etter RNAi15.
- I henhold til syklusterskelverdien (Ct) og oppløsningskurven, bruk 2-ΔΔCt-metoden for å estimere det relative ekspresjonsnivået til målgenet og verifisere interferenseffektiviteten.
- Trekk Ct-verdien av det interne referansegenet til hver prøve fra Ct-verdien til målgenet for å oppnå ΔCt-verdien. Trekk deretter ΔCt-verdien til interferensgruppen fra ΔCt-verdien til kontrollgruppen for å oppnå ΔΔCt-verdien.
MERK: En ΔΔCt-verdi større enn 0 indikerer at interferensen er effektiv.
- Trekk Ct-verdien av det interne referansegenet til hver prøve fra Ct-verdien til målgenet for å oppnå ΔCt-verdien. Trekk deretter ΔCt-verdien til interferensgruppen fra ΔCt-verdien til kontrollgruppen for å oppnå ΔΔCt-verdien.
5. Evaluer kroppslengden på nematode voksne etter RNAi
- Etter RNAi dyrker du J2-larvene til voksen alder på B. cinerea-plener i PDA-plater i 60 timer ved 25 °C15.
- Samle de voksne ved hjelp av Bellman-traktmetoden (se trinn 1.1.2.1)14.
- Skaff bilder av de voksne nematodene under et mikroskop og bruk ImageJ-programvare (eller annen måleprogramvare) for å måle kroppslengdene.
- Mål lengden ved hjelp av ImageJ ved å velge Analyser | Angi skala. Hvis avstanden er kjent, angir du lengdeverdien for den tegnede rette linjen. Angi lengdeenheten.
- Merk av for Global (bruk denne standarden for alle bilder), og klikk OK for å velge lengden som skal måles med en rett linje på bildet som skal måles.
- Bruk kommandoen CTRL+M (måling) til å vise resultatene og registrere dem i resultatvinduet .
- Ta målinger av 50 mannlige og 50 kvinnelige nematoder for statistisk analyse12.
- Analyser dataene ved å beregne gjennomsnitt og standardavvik for hver prøve. Sammenlign utvalgene fra de ulike gruppene ved hjelp av Student t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse av ppm-1 ekspresjon av B. xylophilus etter RNAi
Det relative ekspresjonsnivået for ppm-1-genet til B. xylophilus gjennomvåt med GFP dsRNA og det gjennomvåt med målgenet dsRNA var henholdsvis 0,92 og 0,52 (ppm-1-genuttrykksnivået i ddH2 O-behandlet kontrollgruppe ble satt til 1) (figur 1). Således har eksogen dsRNA ingen effekt på ppm-1-uttrykket av B. xylophilus; Imidlertid kan ppm-1 dsRNA effektivt hemme uttrykket av målgenet.
Effekt av ppm-1-uttrykk på vekst og utvikling av B. xylophilus
Etter RNAi ble størrelsen på de voksne markant redusert (figur 2), noe som resulterte i SMA (liten kroppsstørrelse) mutant fenotype. Selv om RNAi-behandlede individer utviklet seg til seksuell modenhet, var kroppslengden vesentlig mindre enn normale voksne. Spesielt etter RNAi i J2-stadium nematoder var gjennomsnittlig kroppslengde for kvinner og menn henholdsvis 544,61 μm og 526,24 μm. Til sammenligning var gjennomsnittlig kroppslengde for kvinner og menn i kontrollgruppen henholdsvis 971,86 μm og 912,31 μm (figur 3), noe som representerer signifikante forskjeller (P = 0,0322).
Figur 1: Ekspresjon av ppm-1-genet etter RNAi av Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Forkortelser: RNAi = RNA-interferens; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kroppslengdereduksjon av voksne etter interferens av ppm-1 i Bursaphelenchus xylophilus. Bilder av en voksen mann (A) og kvinne (C) av RNAi-gruppen. Bilder av en voksen mann (B) og kvinne (D) i kontrollgruppen. Skala barer = 50 μm. Forkortelse: RNAi = RNA-interferens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering og statistisk analyse av kroppslengden til voksne av Bursaphelenchus xylophilus etter RNAi av ppm-1-genet . (*P = 0,0322). Forkortelse: RNAi = RNA-interferens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om livshistorien og parasittmiljøet til B. xylophilus er forskjellig fra andre nematoder, har det vært begrenset forskning på molekylær patogenese av dette plantepatogenet. Til tross for store fremskritt i anvendelsen av CRISPR / Cas9 genomredigeringsteknologi i C. elegans og andre nematoder, har bare RNAi-teknologi anvendt på B. xylophilus blitt publisert til dags dato17. RNAi er et av de kraftigste verktøyene som er tilgjengelige for å studere genfunksjonen til nematoder og har blitt mye brukt i forskning som belyser B. xylophilus-genfunksjon, signaltransduksjonsveier og genterapi18,19,20. I motsetning til genknockout-tilnærmingene som brukes i virvelløse modeller, muliggjør RNAi-mediert knockdown av målgener i nematoder rask evaluering av genfunksjonen.
Det er tre måter å gjennomføre RNAi i C. elegans: injeksjon 6, soaking21 og fôring6. Fordi J2 larver bare mate etter infeksjon, er soaking metoden vanligvis brukes for RNAi av plante-parasittiske nematoder. Nøkkeltrinnet i bløtleggingsmetoden er å legge til et nervemiddel for å stimulere nematodene til å mate. Urwin brukte først blekksprut for å stimulere J2 av to orale cyste-nematodearter, Globodera pallida og Heterodera glyciner, noe som resulterte i opptak av dsRNA fra bløtleggingsløsningen22. Den samme metoden har blitt brukt til å indusere J2 av rotknute-nematoden Meloidogyne incognita for å absorbere dsRNA 23. Resorcinol kan også indusere opptak av dsRNA av J2 av M. incognita og kan være mer effektivt enn oktopamin for denne nematoden24. Videre forbedret tilsetningen av spermidin til bløtbufferen med en forlenget inkubasjonstid effektiviteten av RNAi i nematoder25. Etter 24 timers bløtlegging går dsRNA effektivt inn i B. xylophilus, og derved deaktiverer ppm-1-genet.
Denne protokollen gir derfor en referanse for den fremtidige studien av RNAi av andre planteparasittiske nematoder med fagocytoseadferd. I tillegg spiller suspensjonseffekten av ristingsbordet en viktig rolle for å maksimere fordelen med bløtleggingsmetoden. Denne metoden kan tillate samtidig behandling av et stort antall nematoder. RNAi er lettere å operere når man fokuserer på målgenene som mutanter ikke lett kan oppnås for, og for å evaluere effektene på forskjellige punkter i utviklingen fordi nematoder kan bli gjennomvåt i ethvert livsstadium. Dermed kan RNAi brukes til å studere funksjonen til et bestemt gen på et bestemt utviklingsstadium. Wang og medarbeidere analyserte innflytelsen fra MAPK på fecundity av B. xylophilus og dens viktige rolle i veksten og utviklingen av nematoder ved bruk av dsRNA-bløtlegging26. Qiu og medarbeidere fant at migrasjonshastigheten og fecundity av B. xylophilus i furutrær redusert etter nedregulering av Bxpel1-genet, noe som indikerer at dette genet er en viktig patogen faktor for B. xylophilus27.
Imidlertid virker ikke alle RNAi i nematoder gjennom dsRNA. Dulovic og Streit brukte små forstyrrende RNA (siRNA) i stedet for de lengre dsRNAene for å lykkes med å forstyrre Strongyloides ratti28. Begrensningen ved bruk av dsRNA for RNAi i Strongyloides kan være relatert til fraværet av gener som rsd-6, sid-1 eller sid-2 som er kjent for å være involvert i dsRNA-opptak. RNAi er også forbundet med ulempene med en posisjonseffekt og midlertidig og ufullstendig knockout og har begrenset effektivitet for noen gener og celletyper (som nevroner)29. Men inntil et gjennombrudd i den transgene teknologien til B. xylophilus oppnås, representerer RNAi en relativt effektiv forskningsstrategi.
RNAi har vist stort potensial for plantevern. Ved hjelp av RNAi-teknologi har transgene poteter som er i stand til å produsere dsRNA som retter seg mot rotknute-nematodegener, blitt avlet for å produsere fullstendig motstand mot rotknute-nematoder30. Ekspresjon av dsRNA som retter seg mot insektgener kan gi plantebeskyttelse i fravær av kjemiske insektmidler og gir den ekstra fordelen av å ikke produsere fremmede proteiner, med et nesten ubegrenset antall målgener31. Derfor vil akselerert forskning innen anvendt RNAi for skadedyrsbekjempelse gi bedre biosikkerhet for plantenematodekontroll enn transgene metoder eller andre kjemiske kontrollmetoder.
Avslutningsvis beskriver denne protokollen fremstillingen av dsRNA av ppm-1-genet for å oppnå RNAi ved direkte å suge larver av B. xylophilus i dsRNA-løsning. Interferenseffekten ble bekreftet basert på en signifikant reduksjon i larvens kroppsstørrelse etter at de utviklet seg til voksne sammenlignet med kontrollen, noe som viser at ppm-1-genet utøver effekter på vekst og utvikling av B. xylophilus. Denne studien gir et teoretisk grunnlag for ytterligere å avsløre funksjonen til ppm-1 med ytterligere praktisk verdi for å lede den biologiske kontrollen av denne planteparasitten. Det antas at med videre avsløring og forbedring av RNAi-teknologimekanismen, vil dens anvendelse innen B. xylophilus-kontroll ha brede utsikter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter ble erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) og finansiert i fellesskap av Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
