Summary
تمثل مزارع مولر الدبقية الأولية التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفأرية أداة قوية وموثوقة للغاية لدراسة التحويل الدبقي إلى خلايا سلف شبكية العين بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي. يمكن اختبار جزيئات أو تركيبات مفردة قبل تطبيقها اللاحق للنهج في الجسم الحي .
Abstract
دبقية مولر (MG) هي الدبقية السائدة في شبكية العين العصبية ويمكن أن تعمل كمصدر متجدد للخلايا العصبية الشبكية. في الفقاريات السفلى مثل الأسماك ، يحدث التجديد المدفوع ب MG بشكل طبيعي. ومع ذلك ، في الثدييات ، يلزم التحفيز بعوامل معينة أو التلاعب الوراثي / اللاجيني. نظرا لأن MG لا تشكل سوى 5٪ من عدد خلايا الشبكية ، فهناك حاجة إلى أنظمة نموذجية تسمح بدراسة مجموعة الخلايا هذه حصريا. أحد هذه الأنظمة النموذجية هو مزارع MG الأولية القابلة للتكرار ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك فحص وتحديد الجزيئات / العوامل ، واختبار المركبات أو العوامل ، ومراقبة الخلايا ، و / أو الاختبارات الوظيفية. يستخدم هذا النموذج لدراسة إمكانات الفئران MG للتحول إلى خلايا عصبية شبكية العين بعد مكملات أو تثبيط الحمض النووي الريبي الميكروي (miRNAs) عن طريق نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي أو مثبطاتها. أكد استخدام الفئران الصحفية الخاصة ب MG بالاقتران مع وضع العلامات المناعية الفلورية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أن 80٪ -90٪ من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG. باستخدام هذا النموذج ، تم اكتشاف أن miRNAs يمكنها إعادة برمجة MG إلى خلايا سلف شبكية العين (RPCs) ، والتي تتمايز لاحقا إلى خلايا تشبه الخلايا العصبية. مزايا هذه التقنية هي أنه يمكن اختبار مرشحي miRNA لكفاءتهم ونتائجهم قبل استخدامهم في تطبيقات الجسم الحي .
Introduction
دبقية مولر (MG) هي الدبقية السائدة في شبكية العين العصبية. لديهم وظائف مماثلة مقارنة بالدبقية الأخرى في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي مثل الحفاظ على توازن الماء والأيونات ، وتغذية الخلايا العصبية ، وحماية الأنسجة. تتمتع MG بميزة رائعة أخرى: على الرغم من أنها دبقية ناضجة ، إلا أنها لا تزال تعبر عن العديد من الجينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا السلفية للشبكية (RPCs) خلال التطور المتأخر 1,2. يفترض أن هذا التشابه هو السبب في التجديد العصبي القائم على MG الذي يحدث بشكل طبيعي في شبكية العين بعد تلف الشبكية 3,4. خلال هذه العملية ، تعيد MG الدخول في دورة الخلية وإلغاء التمايز إلى RPCs التي تتمايز بعد ذلك إلى جميع الأنواع الستة من الخلايا العصبية الشبكية. على الرغم من أن هذه الظاهرة تحدث بشكل طبيعي في الأسماك ، إلا أن الثدييات MG لا تتحول إلى خلايا عصبية 5,6. ومع ذلك، يمكن إعادة برمجتها. وقد ثبت أن مجموعة متنوعة من العوامل تعيد برمجة MG في RPCs / الخلايا العصبية. من بين هذه العوامل عامل النسخ الحلزوني الحلزوني الأساسي (bHLH) المتجانس 1 (Ascl1) الذي يشارك في تجديد الأسماك 7,8. في الفئران ، يتم التعبير عن Ascl1 فقط في RPCs أثناء تكوين الشبكية ولكنه غائب في MG الناضجة أو الخلايا العصبية الشبكية9.
إن إعادة برمجة الخلايا مباشرة في الجسم الحي ليست تحديا منهجيا فحسب ، بل تتطلب أيضا موافقة لجنة مؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. للحصول على الموافقة ، يلزم الحصول على بيانات أولية حول العامل (العوامل) المستخدمة أو المعدلة ، والتركيزات ، والآثار غير المستهدفة ، والآليات الأساسية ، والسمية ، والكفاءة. تسمح أنظمة زراعة الخلايا باختبار هذه المعايير قبل استخدامها في نماذج الجسم الحي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن MG لا تشكل سوى حوالي 5٪ من إجمالي عدد خلايا الشبكية 10 ، فإن مزارع MG تسمح بدراسة وظيفتها11 وكذلك سلوكها ، بما في ذلك الهجرة12,13 ، الانتشار14 ، رد فعل الإجهاد على الإصابة / التلف15,16 ، تفاعلها مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الدبقية الصغيرة17 أو خلايا العقدة الشبكية (RGCs)18 ، أو إمكاناتها العصبية19،20،21. يستخدم العديد من الباحثين خطوط الخلايا الخالدة لدراساتهم لأن لديهم إمكانات تكاثرية غير محدودة ويمكن الحفاظ عليها ونقلها بسهولة. ومع ذلك ، فإن الخلايا الأولية أفضل للفحوصات ذات الصلة بيولوجيا من الخلايا المخلدة لأنها تتمتع بخصائص خلية حقيقية (التعبير الجيني والبروتيني) ، والأهم من ذلك ، أنها تمثل مرحلة معينة من التطور وبالتالي لديها "عمر". يعد عمر الحيوان (وبالتالي الخلايا التي تم الحصول عليها من الحيوان) عاملا حاسما بشكل خاص في إعادة البرمجة الخلوية لأن لدونة الخلية تقل مع تقدم مرحلة التطور22.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إعادة برمجة MG الأساسي باستخدام miRNAs كطريقة حالية في المختبر لدراسة التجديد. تم إنشاء نموذج الاستزراع الأولي MG هذا في عام 2012 لتقييم خصائص تكاثر الخلايا من MG في الفئران الضربة القاضية P53 (trp53-/- الفئران)23. وقد تبين أن MG المستزرعة تحافظ على ميزاتها الدبقية (أي التعبير عن بروتينات S100β و Pax6 و Sox2 التي تم تقييمها عن طريق وضع العلامات المناعية الفلورية) ، وأنها تشبه في الجسم الحي MG (microarray من MG المنقى FACS)23. بعد ذلك بوقت قصير، تم التحقق من صحة الحمض النووي الريبوزي المرسال الدبقي والتعبير عن البروتين وتأكيدهما في نهج مختلف باستخدام النواقل الفيروسية20. بعد بضع سنوات ، تم التأكيد على أن الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG باستخدام Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl مراسل الفأر24 الخاص ب MG. وعلاوة على ذلك، أظهر التقدير الكمي لمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال في كل من MG المنقى من قبل FACS-و MG الأولي المستزرع أن مستويات MG miRNAs (mGLiomiRs) لا تختلف كثيرا في MG المستزرعة خلال مرحلة النمو. ومع ذلك ، فإن فترات الاستزراع الممدودة تسبب تغيرات في مستويات miRNA وبالتالي في مستويات mRNA والتعبير عن البروتين لأن miRNAs هي منظمات انتقالية25.
في عام 2013 ، تم استخدام نموذج ثقافة MG هذا لاختبار مجموعة متنوعة من عوامل النسخ فيما يتعلق بقدرتها على إعادة برمجة MG إلى خلايا عصبية شبكية20. تم العثور على Ascl1 ليكون عامل إعادة برمجة قوي جدا وموثوق به. الإفراط في التعبير عن Ascl1 عن طريق النواقل الفيروسية الناجمة عن التغيرات المورفولوجية ، والتعبير عن علامات الخلايا العصبية ، واكتساب الخصائص الكهروفسيولوجية العصبية. والأهم من ذلك، تم نقل الرؤى والنتائج التي تم الحصول عليها من هذه التجارب المختبرية الأولى بنجاح إلى التطبيقات في الجسم الحي22,26 مما يدل على أن مزارع MG الأولية تمثل أداة صلبة وموثوقة لفحص العوامل الأولية وتقييم الميزات الدبقية قبل التنفيذ في الجسم الحي.
قبل بضع سنوات ، تبين أن miRNA miR-124 المخصب بالدماغ ، والذي يتم التعبير عنه أيضا بشكل كبير في الخلايا العصبية الشبكية ، يمكن أن يحفز تعبير Ascl1 في MG21 المستزرعة. تم تصور تعبير Ascl1 في الخلايا الحية عبر ماوس مراسل Ascl1 (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). فأر المراسل هو فأر مهندس وراثيا يحتوي على جين مراسل مدرج في حمضه النووي. يشفر جين المراسل هذا لبروتين المراسل ، وهو في هذه الدراسة tdTomato، وهو بروتين فلورسنت أحمر. هذا البروتين المراسل تقارير التعبير عن جين من الاهتمام، في هذه الحالة، Ascl1. بمعنى آخر ، ستتحول الخلايا التي تعبر عن Ascl1 إلى اللون الأحمر. نظرا لأن Ascl1 يتم التعبير عنه فقط في RPCs9 ، فإن ماوس Ascl1 CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl يسمح بتتبع تحويل MG إلى Ascl1 يعبر عن RPCs ، مما يعني أن الخلايا المحولة ستعبر عن بروتين مراسل tdTomato الفلورسنت الأحمر. هذا هو وضع العلامات التي لا رجعة فيها منذ تغيير الحمض النووي لهذه الخلايا. وبالتالي ، سيتم تصور أي تمايز عصبي لاحق لأن تسمية tdTomato تبقى في الخلايا المتباينة. إذا كان Ascl1 الذي يعبر عن RPCs المشتقة من MG (مع تسمية tdTomato) يتمايز إلى خلايا عصبية ، فستظل هذه الخلايا العصبية تحمل علامتها الحمراء. وبالتالي ، فإن هذا الماوس لا يسمح فقط بوضع علامات على RPCs المشتقة من MG لتصوير الخلايا الحية ولكن يسمح أيضا برسم خرائط المصير وتتبع النسب لهذه RPCs المشتقة من MG (الحمراء). في الآونة الأخيرة ، تم تحديد مجموعة من miRNAs في RPCs وتم استخدام ثقافات MG من Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter الفئران لفحص واختبار تأثير هذه miRNAs على قدرة إعادة البرمجة والكفاءة27. تم العثور على مرشح واحد ، RPC-miRNA miR-25 ، قادر على إعادة برمجة MG المستزرعة في خلايا Ascl1 المعبرة (Ascl1-Tomato+). تعتمد هذه الخلايا المعاد برمجتها ميزات عصبية بمرور الوقت ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية (سوماتا صغيرة وإما عمليات دقيقة قصيرة أو طويلة) ، والتعبير عن النسخ العصبية التي تم قياسها عبر scRNA-Seq ، بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات العصبية التي تم التحقق منها عبر وضع العلامات المناعيةالفلورية 27.
هنا ، يوضح البروتوكول بالتفصيل كيفية زراعة ونقل MG من الفئران P12 المقتبسة من العمل السابق 21،24،27. تم اختيار miRNA miR-25 المذكور أعلاه لهذا البروتوكول ، وهو miRNA يتم التعبير عنه بشكل كبير في RPCs ، مع انخفاض مستويات التعبير في MG أو الخلايا العصبية الشبكية. من أجل المبالغة في التعبير عن miR-25 ، يحاكي miR-25 الفئران ، أي يتم استخدام جزيئات miRNA الاصطناعية. كعنصر تحكم ، يتم اختيار محاكاة miRNA من Caenorhabditis elegans ، والتي ليس لها وظيفة في خلايا الثدييات. تم إنجاز تصور تحويل MG إلى RPCs عبر ماوس مراسل RPC (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl) ، وهو ماوس ذو خلفية مختلطة (سلالات C57BL/6 و S129 و ICR). ومع ذلك ، يمكن إجراء هذه الثقافة مع جميع سلالات الفئران ، بما في ذلك السلالات البرية. في السنوات القليلة الماضية ، تم تعديل البروتوكول الأصلي لتقليل مدة مرحلة النمو وفترة الثقافة الشاملة وضمان حالة خلايا دبقية أكثر قوة وتقليل درجة التنكس الخلوي ، الذي يحدث في فترات الاستزراع الطويلة. كما تم تمديد النافذة الزمنية العادية للنقل من 3 ساعات إلى 2 أيام. كما ذكرنا من قبل ، على الرغم من أن البروتوكول الحالي يصف ثقافات MG كأداة لدراسات التجديد ، فإن الطريقة ليست مفيدة فقط لاختبار عوامل إعادة البرمجة ، ولكن يمكن أيضا تكييفها لتطبيقات أخرى ، بما في ذلك الدراسات حول السلوك المهاجر أو التكاثري MG ، والنماذج المتعلقة بالإصابة / تلف الخلايا ، و / أو تحديد الآليات والمسارات الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في كلية البصريات بجامعة ولاية نيويورك.
ملاحظة: يتكون بروتوكول الثقافة هذا من ثلاث مراحل: مرحلة النمو والنقل والتحويل. ويرد في الشكل 1 ملخص للبروتوكول العام مع الجدول الزمني.
1. إعداد وسائل الإعلام وجميع الكواشف المطلوبة
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة الأحيائية A2 أو B2 (BSC). خلال مرحلة النمو ، يتم استخدام وسط نمو عالي المصل يتكون من وسط عصبي قاعدي مكمل بعامل نمو البشرة (EGF). بالنسبة لمرحلة التحويل ، يتم استخدام وسط قاعدي عصبي فسيولوجي منخفض المصل مكمل بالمكملات العصبية لضمان تمايز الخلايا العصبية وبقائها.
- تحضير وسط النمو (يستخدم خلال مرحلة النمو) عن طريق استكمال 200 مل من الوسط العصبي القاعدي مع 20 مل من مصل البقر الجنيني (FBS ، 10٪) ، 1 مل من 200 mM L-glutamine (0.5٪) ، 2 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪) ، و 2 مل من ملحق N2 (1٪). إجراء الترشيح المعقم (وحدات مرشح بحجم مسام 0.22 ميكرومتر). قم بتسخين الوسط مسبقا في حمام من الخرز المعدني على درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- تحضير وسط عصبي (يستخدم أثناء مرحلة التحويل) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) عن طريق استكمال 100 مل من الوسط القاعدي العصبي الفسيولوجي الخالي من المصل مع 2 مل من الملحق العصبي B27 (2٪) ، 1 مل من ملحق N2 (1٪) ، 20 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF ، إعادة التشكيل في 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، التركيز النهائي 20 نانوغرام/مل)، 20 ميكرولتر من 100 نانوغرام/مل عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF، إعادة تشكيله في محلول الملح المتوازن المعقم من هانكس [HBSS]، التركيز النهائي 20 نانوغرام/مل)، 500 ميكرولتر من 100 ملغم/مل ديبوتيريل-كامب (إعادة تشكيله في DMSO)، 70 ميكرولتر من 50 نانوغرام/مل حمض الأسكوربيك (يعاد تشكيله في PBS معقم)، و 1.5 مل من البنسلين/الستربتومايسين. إجراء الترشيح المعقم (وحدات مرشح بحجم مسام 0.22 ميكرومتر). يسخن مسبقا في حمام من الخرز المعدني على درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين هذه الوسائط في 4 درجات مئوية ، لمدة 1 شهر. - أعد تشكيل كواشف Papain و DNase I و Ovomucoid اللازمة لتفكك الشبكية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. Aliquot 750 ميكرولتر من Papain في أنابيب معقمة 1.5 مل ، و 75 ميكرولتر من DNase I في أنابيب 0.6 مل معقمة ، و 750 ميكرولتر من مثبطات الأنزيم البروتيني Ovomucoid في أنابيب 2 مل. تجميد Papain و DNase I aliquots عند -20 درجة مئوية والحفاظ على الأليكوتات Ovomucoid عند 4 درجات مئوية لتجنب تدهور الكواشف. يذوب في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مباشرة.
ملاحظة: تم العثور على Papain و DNase I و Ovomucoid في مجموعة تسمى نظام تفكك Papain (انظر جدول المواد). - إعادة تشكيل بولي إل-أورنيثين (بولي-أو) ولامينين لطلاء الغطاء إذا تم وضع العلامات المناعية الفلورية باتباع تعليمات ورقة البيانات (بولي-O: 0.1 ملغم/مل في الماء المعقم; Laminin: تمييع 1.2 ملغ / مل في 1:50 في DMEM). Aliquot Poly-O و Laminin (2.5 مل) وتجميد aliquots عند -20 درجة مئوية. يذوب في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام مباشرة.
ملاحظة: الخطوة 1.4. مطلوب فقط إذا تم إجراء وضع العلامات على الفلورسنت المناعي والفحص المجهري بالليزر.
2. استخراج الفئران والأنسجة
ملاحظة: بالنسبة لدراسات إعادة البرمجة هذه، تم إنشاء ماوس Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl عن طريق عبور ماوس Ascl1 CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) بماوس tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). يحتوي هذا الماوس على خلفية مختلطة (سلالة C57BL/6 و S129 و ICR). يظهر النمط الوراثي لهذا الفأر في الشكل 1A. يمكن استخدام جميع السلالات لهذا البروتوكول.
- ارتد قفازات وقم بتعقيم مساحة العمل ، بما في ذلك مجهر التشريح وجميع الأدوات الدقيقة (Dumont # 5 fine و Dumont # 7 ملقط منحني ومقص ناعم ومقص Vannas) مع 70٪ من الإيثانول. قم بتعقيم طبق تشريح أسود مطلي بالسيليكون مقاس 10 سم عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
- إعداد الأطباق والأطباق لاستخراج الأنسجة
- قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا لجمع العين وفصل العينات (عينان لكل فأر في بئر واحد ، مع ملصقات معرفات الماوس) مع ~ 1 مل من HBSS البارد (4 درجات مئوية) لكل بئر. ضع الصفيحة المكونة من 24 بئرا على الجليد.
- املأ طبق بتري معقم مقاس 10 سم (للغسيل) وطبق التشريح المطهر المطلي بالسيليكون بعدة مل من HBSS البارد (4 درجات مئوية) لضمان تغطية الأنسجة بالكامل ب HBSS.
- تحضير أنبوب معقم 1.5 مل مع 1 مل من الإيثانول 70 ٪.
- قم بإعداد لوحة 12 بئر عن طريق وضع علامة على اللوحة برقم الثقافة والتاريخ والسلالة وجميع المعلومات المطلوبة.
- القتل الرحيم للفئران P12 باستخدام أي طريقة معتمدة.
- إزالة العين
- أمسك رأس الماوس برفق مع وضع إصبعي الإبهام والسبابة حول العين.
- باستخدام ملقط Dumont #7 المنحني ، انتقل بلطف خلف مقلة العين وقم بقص العصب البصري. خذ العين بعناية.
ملاحظة: إذا تم استخدام الفئران البالغة ، فلا تستخدم ملقط منحني ، ولا تسحب العين. بدلا من ذلك قطع بعناية حول الكرة الأرضية العين باستخدام مقص دقيق. قطع العصب البصري ولكن لا تقطع العين نفسها. استخدم الملقط لإزالة مقلة العين بعناية.
- تنظيف مقلة العين
- اغمس مقلة العين لفترة وجيزة في أنبوب يحتوي على الإيثانول لتجنب انتقال البكتيريا من الحيوان.
- اغسل مقلة العين لفترة وجيزة في طبق بتري 10 سم قبل وضعه في طبق البئر 24 على الثلج.
- كرر الخطوتين 2.4 و2.5 للعيون الأخرى. احتفظ بصفيحة البئر على الجليد أثناء العملية. ضع عينين من واحد في طبق التشريح الموضوع تحت مجهر التشريح مع مصدر ضوء.
- استخراج الشبكية
- قم بإصلاح مقلة عين واحدة عن طريق الإمساك بالعصب البصري والنسيج الضام المحيط حول الصلبة باستخدام ملقط Dumont #5 الناعم واضغط عليه بعناية ضد طبق التشريح (القرنية لأعلى).
- اصنع ثقبا في وسط القرنية باستخدام إبرة 30 جم للسماح بوصول أسهل لمقص فاناس.
- تشريح القرنية حول الجسم الهدبي باستخدام مقص فاناس وإزالة القرنية والعدسة والقزحية والجسم الزجاجي بعناية باستخدام ملقط Dumont #5 الدقيق. يوضح الشكل 2A كوب العين مع شبكية العين في الداخل.
- تشريح الصلبة باستخدام مقص فاناس حتى يتم الوصول إلى العصب البصري. قم بقص العصب البصري واستخرج شبكية العين بعناية باستخدام ملقط Dumont #5 الدقيق.
- استخدم زوجا ثانيا من ملقط Dumont #5 الناعم للضغط على شبكية العين والسماح بإزالة الجسم الزجاجي بالكامل. يوضح الشكل 2B اثنين من شبكية العين المستخرجة.
- نقل وغسل
- قطع حوالي 2.5 سم من طرف ماصة نقل معقمة لتكبير القطر. باستخدام هذه النصيحة ، التقط (امتص) شبكية العين بأكملها دون إتلاف الأنسجة.
- انقل الشبكية إلى طبق بتري معقم جديد مع HBSS البارد (4 درجات مئوية) وهز الطبق (ذهابا وإيابا ويسارا ويمينا).
- باستخدام طرف ماصة النقل، ادفع الشبكية بعناية لغسل الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية (RPE).
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إزالة شبكية العين بأكملها مع العدسة والجسم الزجاجي من كوب العين. بعد ذلك ، يمكن إزالة العدسة والجسم الزجاجي من شبكية العين المستخرجة. إذا تم تمزيق شبكية العين ، تأكد من جمع جميع القطع للانفصال ؛ خلاف ذلك ، سيكون هناك كميات غير كافية من الأنسجة لتنمو طبقات الخلايا الملتقية.
- ضع شبكية العين المعزولة على الفور في بئر جديد ونظيف من لوحة 24 بئرا مملوءة ب 1 مل من HBSS. احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا على الجليد أثناء عملية التشريح.
- كرر الخطوات من 2.7 إلى 2.9 لعزل شبكية العين الثانية.
3. انفصال الشبكية
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية (حتى حصاد الخلايا) في خزانة السلامة الأحيائية A2 أو B2 (BSC).
- تحضير خليط التفكيك Papain/DNase I على النحو التالي.
- بالنسبة لستة شبكية ، أضف 75 ميكرولتر من DNase I إلى الأنبوب الذي يحتوي على 750 ميكرولتر من الغراء (من الخطوة 1.3) واخلطه بعناية (خليط التفكك).
- لإعداد عينة فردية مطلوبة لهذا البروتوكول ، قسم الحجم الإجمالي البالغ 825 ميكرولتر إلى ثلاثة أليكوتات: 275 ميكرولتر من الخليط في أنبوب واحد 1.5 مل لكل فأر (شبكيتان). احسب الكميات المطلوبة من DNase I و Papain وفقا لذلك.
ملاحظة: يمكن فصل ما يصل إلى ستة شبكية العين في أنبوب واحد من خليط Papain/DNase I. ومع ذلك ، فإن إعداد العينات الفردية يؤدي إلى كتل أقل ونمو خلايا أفضل من العينات المدمجة.
- نقل اثنين من شبكية العين إلى خليط التفكك Papain / DNase I. استخدم ماصة نقل بقطر طرف موسع (الخطوة 2.8.1) ، والتقط الشبكية ، وانتظر حتى تستقر الشبكية في أسفل الطرف ، ثم حرر الشبكية دون HBSS مفرط في الأنبوب الذي يحتوي على خليط Papain / DNase I.
- ضعه على جوزة واحتضنها لمدة 10 دقائق في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
- قم بفصل الخلايا عن طريق السحب بعناية لأعلى ولأسفل (حوالي 20-30 مرة) باستخدام ماصة 1 مل. بعد انفصال الخلايا (أي ، مما يؤدي إلى محلول متجانس بدون قطع) ، أضف 275 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني Ovomucoid من مجموعة Papain Dissociation Kit لتحييد Papain. اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
ملاحظة: إذا تم فصل ستة شبكية العين في 825 ميكرولتر من خليط Papain/DNase I ، يلزم وجود 825 ميكرولتر من Ovomucoid. - الطرد المركزي للخليط في 300 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أضف عامل نمو البشرة (EGF ، 1 ميكرولتر لكل 1 مل من وسط النمو ، أعيد تشكيله عند 200 ميكروغرام / مل في PBS) إلى الحجم المحسوب لوسط النمو (1 مل لكل ماوس) الذي تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: اعتمادا على التصميم التجريبي ، يمكن إضافة علامة الانتشار 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، وكذلك 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) أو العوامل الأخرى المطلوبة في بداية فترة الثقافة. - قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي. لا تلمس الكريات في الجزء السفلي من الأنبوب.
- قم بإزالة supernatant بعناية وبشكل كامل. أعد تعليق بيليه الخلية مع 500 ميكرولتر من وسط النمو المكمل ب EGF.
- انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من اللوحة ذات ال 12 بئرا الموسومة (الشكل 2C). شطف الأنبوب مع 500 ميكرولتر أخرى من وسط النمو المكمل EGF وإضافته إلى البئر (الحجم الإجمالي 1 مل لكل بئر).
- كرر الخطوتين 3.8 و3.9 مع كافة العينات الأخرى.
- هز لوحة البئر ثلاث مرات بعناية (ذهابا وإيابا ؛ اليسار ، واليمين). ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، CO2).
ملاحظة: إذا تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا ، فقم بإجراء التنميط الجيني لكل حيوان (الشكل 2D). تحديد كري إعادة تأليف الفئران الإيجابية والسلبية وتسمية اللوحة وفقا لذلك. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام خلايا الفئران المراسلة الإيجابية Cre recombinase فقط للخطوات التالية. يتم تجميد خلايا العينات السلبية Cre واستخدامها في تطبيقات أخرى.
4. مرحلة النمو
ملاحظة: تبلغ مدة مرحلة النمو حوالي 4-5 أيام (الشكل 1B). لإضافة السوائل إلى الآبار التي تحتوي على خلايا ، تحتاج الماصة إلى الإشارة إلى جدار البئر ويجب إطلاق السائل ببطء لتجنب انفصال الخلايا. لا تقم بماصة مباشرة فوق الخلايا.
- بعد يوم واحد من الانفصال ، قم بإزالة الوسط وإضافة 1 مل من وسط النمو الطازج المكمل ب EGF.
- في اليوم 3 ، قم بإزالة الوسط وإضافة 1 مل من HBSS (درجة حرارة الغرفة) لإزالة حطام الخلية. صخرة بلطف ذهابا وإيابا من اليسار إلى اليمين. قم بإزالة HBSS ، وكرر خطوة الغسيل ، وأضف 1 مل من وسط النمو المكمل مسبقا EGF.
- راقب الخلايا كل يوم وقم بتقييم حالة نموها حتى تصل الخلايا إلى 90٪ -100٪ من التقاء. يوضح الشكل 3 مثالا على نمو MG الجيد بمرور الوقت. تحقق من وجود تلوث محتمل أو موت الخلايا (الشكل التكميلي 1). تخلص من الثقافات الملوثة.
ملاحظة: لمراقبة حالة الخلية وتسجيلها، التقط صورا بتكبيرات مختلفة باستخدام مجهر ضوئي مزود بكاميرا مرفقة وأهداف 4x أو 10x أو 20x. في هذه الدراسة ، يتم استخدام المجهر الفلوري.
5. إعداد أغطية مع بولي L-أورنيثين (بولي O) ومعطف Laminin
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا تم إجراء وضع العلامات المناعية الفلورية والمجهر المجهري للمسح بالليزر البؤري. يلزم وجود أغطية زجاجية مستديرة (قطرها 12 مم) للتصوير المناسب. يمكن أيضا العثور على بروتوكول الطلاء في ورقة بيانات الوسط العصبي (انظر جدول المواد).
- ضع الأغطية المعقمة بعناية في وسط كل بئر من صفيحة 24 بئرا باستخدام ملقط Dumont #2AP المعقم.
ملاحظة: ضع الأغطية في وسط البئر. سيؤدي وضع أغطية بالقرب من جدار البئر إلى حدوث مشكلات في التوتر السطحي للخطوات التالية. - قم بإذابة 2.5 مل من Poly-O aliquot في درجة حرارة الغرفة ووضع 100 ميكرولتر منه في وسط كل غطاء.
- احتضن لوحة البئر لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة Poly-O واغسل البئر باستخدام الغطاء ثلاث مرات باستخدام ~ 1 مل من الماء المعقم.
- دع طبق البئر يجف بين عشية وضحاها في BSC. ذوبان 2.5 مل من Laminin عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- في صباح اليوم التالي ، أضف 100 ميكرولتر من Laminin في وسط كل غطاء وحضانة لمدة 4 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة Laminin بعناية وبشكل كامل.
- حافظ على اللوحة عند 4 درجات مئوية إذا تعذر إجراء المرور على الفور.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالأغطية المطلية في الأطباق المعدة لبضعة أيام عند 4 درجات مئوية.
6. مرور الخلايا لإزالة الناجين من الخلايا العصبية
ملاحظة: مطلوب مرور الخلايا لإزالة الخلايا العصبية، وليس لزيادة عدد الخلايا. تنقسم الدبقية بضع مرات فقط ولن تنمو أكثر بعد المرور. لا تخفف من تعليق الخلايا. يمكن توزيع خلايا بئر واحد ملتق من صفيحة 12 بئرا على بئر واحد من صفيحة 12 بئرا أو بئرين من صفيحة 24 بئرا. عند استخدام الأغطية المطلية ، يتم طلاء حوالي ثلث الغطاء فقط. لذلك ، يمكن الحصول على ستة أغطية تجلس في صفيحة من 24 بئرا ، مع خلايا متقاربة (~ 80٪ -90٪) من بئر واحد من الخلايا المتلاقية للوحة من 12 بئرا. يمكن اختيار نسب أخرى أيضا لزيادة أو تقليل كثافة الخلايا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم استخدام ماوس مراسل Cre + واحد [تجربة واحدة ، علاجان: miR-25 أو control-miR ؛ النسخ المتماثل التقني n = 3 (ثلاثة أغطية لكل علاج) ، النسخ البيولوجي n = 1]. يمكن تعريف عدد النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية بشكل مختلف اعتمادا على التصميم التجريبي.
- تحقق مما إذا كانت الخلايا ملتقية بنسبة 90٪ -100٪ (أيضا على هامش البئر ؛ الشكل 3 هاء، واو).
- قم بإزالة الوسط وإضافة 1 مل من HBSS (درجة حرارة الغرفة) لغسلها. هز اللوحة بلطف (ذهابا وإيابا ، يسارا ويمينا). إزالة HBSS تماما.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على التربسين المسخن مسبقا (يتم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية في حمام خرز معدني) لفصل الخلايا عن البئر. صخرة بلطف (ذهابا وإيابا ، من اليسار إلى اليمين) واحتضنها لمدة 2 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
- انقل اللوحة من الحاضنة إلى BSC. أثناء الإمالة ، قم بشفط المحلول المحتوي على التربسين وتفريقه بعناية وببطء فوق البئر عدة مرات حتى تنفصل الخلايا تماما. أمسك اللوحة ضد الضوء وتأكد من عدم ترك أي خلايا في الأسفل.
- انقل هذا التعليق الخلوي إلى أنبوب معقم 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق إضافة 600 ميكرولتر (100 ميكرولتر لكل بئر ل 6 آبار / أغطية تغطية) من وسط النمو المسخن مسبقا (مكمل ب EGF ؛ 1: 1000). وسحب لأعلى ولأسفل ~ 30-40 مرة.
ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا في هذا الوقت عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل وإذابة الجليد باتباع البروتوكولات القياسية لإذابة خطوط الخلايا. إذا تم تجميد الخلايا ، فلن يتم إعادة تعليقها في وسط مكمل ب EGF (وسط النمو). سيتم إعادة تعليقها في الوسط الأساسي (بدون EGF) ومحلول التجميد (نسبة 1/1). تصف الخطوات من 6.1.1 إلى 6.6.2 خطوات تجميد الخلايا. إذا لم يتم تجميد أي خلايا، فتابع إلى الخطوة 6.7.- تحضير محلول التجميد عن طريق خلط 100 ميكرولتر من DMSO و 400 ميكرولتر من FBS (الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر لكل بئر / عينة).
- أعد تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من وسط النمو الذي تم تسخينه مسبقا. أضف تعليق الخلية إلى 500 ميكرولتر من محلول التجميد DMSO / FBS (الحجم الإجمالي 1 مل). احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى تتم معالجة جميع العينات. قم بتجميد الخلايا عند -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
- الخلايا البذرية عن طريق وضع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / الوسائط 600 ميكرولتر (الخطوة 6.6) في وسط ستة أغطية مغلفة (انظر الخطوة 5) من اللوحة المكونة من 24 بئرا. ضع اللوحة بعناية في الحاضنة واترك الخلايا تستقر.
ملاحظة: 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا 600 ميكرولتر (الذي يتم حصاده من بئر واحد من صفيحة 12 بئرا) سيؤدي إلى التقاء الخلية بنسبة 90٪ -100٪ ، وهو أمر مطلوب للنقل. - تحقق من الخلايا بعد 3 ساعات لمعرفة ما إذا كانت قد استقرت على الغطاء. أضف 400 ميكرولتر من وسط النمو المكمل ب EGF.
ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا جاهزة للنقل في اليوم التالي (الشكل 3G). إذا لم تكن ملتقية (90٪ -100٪) ، اتركها ليوم آخر. إذا لم تكن متقاربة ، فلا تستخدمها للنقل. إذا تم إجراء تطبيقات أخرى في المراحل النهائية ، مثل تنميط miRNA أو RNA-Seq أو RT-qPCR أو اللطخة الغربية ، فيجب تمرير الخلايا إلى ألواح 12 بئرا (نسبة 1: 1 ؛ لا حاجة إلى معالجة اللوحة) وحصادها لاستخراج الحمض النووي الريبي / البروتين.
7. النقل
ملاحظة: تتكون مرحلة النقل من مرحلة 3 ساعات في وسط النقل فقط (يتم وصف إجراءات النقل في دليل النقل الذي يأتي مع كاشف النقل) ومرحلة ممدودة لا يزال فيها كاشف النقل و miRNAs موجودين ، ولكن يتم إضافة وسط عصبي مع المكملات المطلوبة (المدة الإجمالية هي 2 أيام ؛ الشكل 1 ب). في هذا البروتوكول ، سيتم نقل ستة آبار: ستتلقى ثلاثة آبار إعادة برمجة miRNA miR-25 وستتلقى ثلاثة آبار miRNA التحكم.
- تحقق مما إذا كانت الخلايا قد وصلت إلى 90٪ من الالتقاء وسجل / صور الخلايا قبل النقل.
- قم بإزالة وسط النمو وإضافة 500 ميكرولتر من HBSS (درجة حرارة الغرفة) لغسل الخلايا.
- إزالة HBSS وإضافة 400 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض المستخدم في عمليات النقل. ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية.
- قم بإعداد خليط النقل باتباع تعليمات بروتوكول كاشف النقل الخاص بالشركة المصنعة. اصنع خليطين: مزيج كاشف النقل ومزيج miRNA (انظر الشكل 1B للتوضيح).
- تحضير خليط كاشف النقل: للحصول على صفيحة من 24 بئرا ، يلزم وجود 49 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض و 1 ميكرولتر من كاشف النقل لبئر واحد (50 ميكرولتر في المجموع). بالنسبة لستة آبار ، يتم دمج 294 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض و 6 ميكرولتر من كاشف النقل وخلطهما جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل.
- تحضير خليط miRNA المقلد: للحصول على طبق من 24 بئرا ، يلزم وجود حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر من خليط المحاكاة لبئر واحد. ستتلقى ثلاثة آبار الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) وسيتم التعامل مع الآبار الثلاثة الأخرى باستخدام miR-25. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم استخدام تركيز نهائي 200 نانومتر.
- لعلاج miR-25 (ثلاثة آبار) ، يتم الجمع بين 150 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض و 3 ميكرولتر من miR-25 يحاكي (محلول مخزون 100 ميكرومتر) ويخلط جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. احتضان لمدة 5 دقائق.
للتحكم يحاكي العلاج (ثلاثة آبار) ، يتم الجمع بين 150 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض و 3 ميكرولتر من محاكاة التحكم في الحمض النووي الريبوزي المرسال (محلول مخزون 100 ميكرومتر) وخلطها جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. احتضان لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يعتمد حجم miRNA المقلد على عامل التخفيف والتركيز اللازم (20-500 نانومتر). يمكن أيضا استخدام مثبطات miRNA (antagomiRs) ، أو جزيئات أخرى بما في ذلك البلازميدات ، كذلك. أيضا ، من الممكن نقل مجموعات من الجزيئات.
- لعلاج miR-25 (ثلاثة آبار) ، يتم الجمع بين 150 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض و 3 ميكرولتر من miR-25 يحاكي (محلول مخزون 100 ميكرومتر) ويخلط جيدا عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. احتضان لمدة 5 دقائق.
- الجمع بين miRNA تقليد خليط وخليط كاشف النقل. اخلطي بعناية عن طريق السحب ببطء وبدقة عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة).
- أضف خليط النقل أعلاه قطرة وببطء فوق الخلايا ، بالقرب من سطح الوسائط في البئر باستخدام ماصة 20 ميكرولتر. هز اللوحة بلطف (ذهابا وإيابا ، من اليسار إلى اليمين).
- احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- بعد 3 ساعات ، أضف وسيطا عصبيا إلى الآبار (500 ميكرولتر لكل بئر) مكملا ب 4-Hydroxytamoxifen (مخزون 5 mM أعيد تشكيله مع 2.58 مل من الإيثانول ، تركيز نهائي 250 نانومتر) لتنشيط Cre recombinase و 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU ، محلول مخزون 10 mM أعيد تشكيله مع 2 مل من DMSO ، تركيز نهائي 1 ميكرومتر) لتتبع انتشار الخلايا.
تحذير: من المعروف أن 4-هيدروكسي تاموكسيفين و EdU من المواد المسرطنة البشرية والمسخات والطفرات. اقرأ ورقة بيانات سلامة المواد قبل الاستخدام وارتد القفازات والنظارات الواقية ومعطف المختبر. إعادة تشكيل كلا الكاشفين وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. لا تستنشق المادة/الخليط. يغلق بإحكام بعد الاستخدام. يجب التخلص من النفايات وفقا للوائح الوطنية والمحلية. اغسل يديك ووجهك بعد العمل مع المادة. - احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة يومين (الشكل 1B).
8. تحويل الخلايا
ملاحظة: تستغرق مرحلة تحويل الخلايا حوالي 5-6 أيام (الشكل 1B) ، ولكن من الممكن حدوث فترات أطول.
- تحقق من الخلايا يوميا بحثا عن تحريض ناجح لتعبير tdTomato ، وموت الخلايا المحتمل ، و / أو التلوث. لا تتغير كثافة الخلايا (الشكل 4). يمكن ملاحظة أول خلايا حمراء باهتة تحمل علامة الفلورسنت بعد 1 يوم من علاج 4-Hydroxytamoxifen. مطلوب مجهر فلورسنت لمراقبة الخلايا وتصويرها.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام المجهر الفلوري للتصوير الحي. يتم التقاط الصور بأهداف 4x أو 10x أو 20x. - بعد يومين من النقل ، قم بإزالة الوسط وإضافة 500 ميكرولتر من الوسط العصبي المسخن مسبقا مع استكمال 4-Hydroxytamoxifen و EdU في كل بئر.
- استبدل الوسط بوسط طازج كل يومين حتى يتم حصاد الخلايا.
- التقط صورا حية لتقييم عدد خلايا الفلورسنت الأحمر (Ascl1 المعبرة) والتغيرات المورفولوجية (الشكل 4 والشكل 5A-C).
9. حصاد الخلايا: تثبيت لوضع العلامات على الفلورسنت المناعي
ملاحظة: يمكن حصاد الخلايا للتطبيقات النهائية الأخرى ، بما في ذلك الجزء الأكبر أو scRNA-Seq أو RT-qPCR أو اللطخة الغربية.
- قم بإزالة الوسط وإضافة 500 ميكرولتر من HBSS البارد (4 درجات مئوية) لكل بئر وهز اللوحة بلطف (ذهابا وإيابا ، من اليسار إلى اليمين). إزالة HBSS.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) وحضانت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إجراء وضع العلامات على الفلورسنت المناعي وفقا للبروتوكولات المعمول بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول كيفية زراعة MG من شبكية العين الفأرة P12 وكيفية إعادة برمجة هذه الخلايا مع miR-25 إلى خلايا عصبية شبكية العين باستخدام الماوس مراسل Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC. تم استخدام هذه الطريقة في تقارير العمل السابقة بالتفصيل عن miRNAs المناسبة الأخرى (تحاكي أو مثبطات ، كجزيئات مفردة أو مجتمعة) لإعادة برمجة MG في RPC التي تعتمد بعد ذلك خصائص الخلايا العصبية27. تم تعديل هذه الطريقة لزراعة الثقافات بشكل أسرع وبالتالي تقليل التغيرات الخلوية التي تسببها البيئة الاصطناعية بمرور الوقت 24،28،29.
تفكك الشبكية ومرحلة نمو مزارع MG الأولية
يمكن رصد أول MG في وقت مبكر من اليوم الأول في المختبر باستخدام المجهر الضوئي. MG لها شكل أنبوبي ممدود وأجسام خلايا رمادية فاتحة (الشكل 3A-D ، رؤوس الأسهم الحمراء). ومع ذلك ، فإن معظمها مغطى بالحطام الخلوي في هذه المراحل المبكرة. MG من اثنين من شبكية العين من فأر واحد ، نمت في بئر واحد من لوحة 12 بئر ، تصل إلى 90 ٪ -95 ٪ التقاء في غضون 4-5 أيام (الشكل 3E ، F). بمرور الوقت ، سيتم إزالة جميع الحطام العصبي ، وستكون هناك طبقة خلية كثيفة. الخلايا ليست جاهزة للمرور إذا لم يكن قاع البئر ملتقيا تماما. ومع ذلك ، لا ينبغي أن يتم المرور في وقت لاحق من 6 أيام في المختبر لأن الدبقية تفقد ميزاتها الدبقية في الثقافة بمرور الوقت. قبل النقل أو أي علاج آخر ، يجب فحص الخلايا للتأكد من كثافتها وحيويتها. يجب إجراء النقل فقط على 90٪ -95٪ من الخلايا المتقاربة (الشكل 3G). لوضع العلامات المناعية الفلورية وتحليل المجهر البؤري ، يجب أن تزرع الخلايا على أغطية مغلفة.
المرحلة المبكرة والمتأخرة من فترة تحويل الخلايا
في وقت مبكر من 15 ساعة بعد النقل وعلاج 4-Hydroxytamoxifen ، تبدأ الخلايا الأولى في التعبير عن التألق الأحمر الخافت ، أي بروتين مراسل الفلورسنت الأحمر tdTomato المدفوع تحت محرك Ascl1 (المنشط). يشار الآن إلى الخلايا المعبرة عن Ascl1 باسم خلايا Ascl1-Tom+. يمكن ملاحظة تعبير Ascl1-Tom أكثر قوة بعد يومين من النقل مع زيادة التألق الأحمر بمرور الوقت (الشكل 4). يصبح تأثير إعادة البرمجة مرئيا حوالي يومين في الثقافة مع العديد من خلايا Ascl1-Tom+ لكل حقل موجود في علاج miRNA لإعادة البرمجة: كما هو موضح هنا ل control-miR و miR-25 (الشكل 4B-B''' والشكل 4C-C''' ، على التوالي). في كلا العلاجين ، لا تزال خلايا Ascl1-Tom + مستديرة إلى حد ما وكبيرة نسبيا ، مع مورفولوجيا تشبه الخلايا الدبقية / السلفية. علاوة على ذلك ، فإن تحريض مراسل الفلورسنت الأحمر لا يؤثر على كثافة الخلايا في الثقافة (لا يزال 90٪ -95٪ ملتقى).
بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من النقل (الشكل 4A والشكل 5A) ، تصبح الزيادة في عدد خلايا Ascl1-Tom+ أكثر وضوحا في الآبار المعالجة miR-25 (الشكل 5B-D) التي تظهر زيادة بمقدار أربعة أضعاف في العدد بعد علاجات miR-25 مقارنة بالضوابط. علاوة على ذلك ، تصبح التغيرات المورفولوجية الأولى مرئية. وتشمل هذه التغييرات تقليل حجم سوما الخلية وتطوير العمليات الدقيقة. في حين أن الغالبية العظمى من الخلايا في ظروف التحكم كبيرة ومسطحة (تشبه الدبقية / السلف ، الشكل 5B-B'') ، تظهر العديد من الخلايا ذات النوى الصغيرة والعديد من العمليات الصغيرة التي تشبه الخلايا العصبية الشبكية في علاج miR-25 (الشكل - 5C-C''). تمثل هذه الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية حوالي 70٪ من إجمالي سكان Ascl1-Tom (15٪ في العلاج الضابط. الشكل 5 هاء). الخلايا أقل كثافة بسبب تحويل الخلايا (تتطلب الخلايا الأصغر مساحة أقل). ومن المثير للاهتمام أن هذه الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية تبدو وكأنها تشكل شبكات صغيرة (الشكل 5C''). في هذا الوقت ، يمكن حصاد الخلايا لوضع العلامات المناعية الفلورية لتأكيد الهوية العصبية.
تأكيد الهوية العصبية
يتم تصنيف الخلايا بأجسام مضادة ضد البروتين 2 المرتبط بالأنابيب الدقيقة (Map2) ، وهو علامة على البروتينات الخلوية الهيكلية الخاصة بالخلايا العصبية 30,31 ، وضد Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) للتحقق من صحة الهوية العصبية 32,33. تم استخدام كلا العلامتين أيضا في دراسات إعادة البرمجة السابقة21,27. Otx2 هو عامل نسخ موجود في RPCs 34,35,36 ، والخلايا ثنائية القطب الناضجة 34,35,37,38,39 ، والمستقبلات الضوئية 35,36,37,38,40 . يستخدم وضع العلامات النووية DAPI لمواجهة الثقافات. تظهر علامات الفلورسنت المناعي القليل إلى الغائب عن تعبير Map2 أو Otx2 في ظروف التحكم (الشكل 6A-A''',C). ومع ذلك ، تحتوي العينات المعالجة من miR-25 على العديد من خلايا Map2+ و Otx2+ (الشكل 6B-B'''). يظهر القياس الكمي للصور متحدة البؤرة أنه بعد الإفراط في التعبير عن miR-25 ، توجد حوالي 40 خلية عصبية لكل مجال مقارنة بخمس خلايا عصبية لكل مجال في الضوابط (الشكل 6C ، حجم الحقل: 630 ميكرومتر × 630 ميكرومتر). تم التقاط الصور بهدف 20x. تشكل هذه الخلايا العصبية حوالي 70٪ من إجمالي عدد خلايا Ascl1-Tom+ للعينات المعالجة miR-25 (التحكم ~ 20٪ ، الشكل 6D). كانت جميع الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية Ascl1-Tom+ هي Map2+ و Otx2+ ، مما يؤكد الهوية العصبية. علاوة على ذلك ، كان العدد المطلق لخلايا Otx2 + و Map2 + أعلى بعد علاجات miR-25 مقارنة بعلاج miRNA الضابطة (miR-25: 60 خلية لكل حقل ؛ control-miR: 10 خلايا لكل حقل; الشكل 6 هاء).
تظهر النتائج مجتمعة أنه يمكن زراعة مزارع MG وإعادة برمجتها باستخدام miRNAs. مكملات miR-25 تحفز تعبير Ascl1-Tom في MG الأولي. تتحول العديد من MG إلى RPCs التي تعتمد مورفولوجيا عصبية وتعبر عن العلامات العصبية Map2 و Otx2 بعد بضعة أيام.
الشكل 1: التصميم التجريبي والمسار الزمني لثقافة دبقية مولر الأولية. (أ) مخطط لفأر Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl ، وهو فأر مراسل سلف الشبكية يستخدم لتتبع تحويل دبقية مولر (MG) إلى خلايا سلف شبكية (RPCs). (ب) المسار الزمني لفترات الاستزراع التي تتكون من مرحلة النمو (الأزرق ، 0-4/5 أيام في المختبر ، div) ، مرحلة النقل (الأرجواني ، 5/6-7/8 div) ، ومرحلة تحويل MG (الأصفر ، تبدأ 7/8 div). مرحلة النمو: تزرع الشبكية المنفصلة (شبكيتان من فأر واحد) في بئر واحد من صفيحة 12 بئرا في وسط نمو. في حوالي اليوم 4/6 ، يتم تمرير الخلايا إلى صفيحة من 24 بئرا تحتوي على أغطية مغلفة. مرحلة النقل: يتم نقل خلايا 5-7 div (1 يوم بعد المرور) مع miRNAs لمدة 2 أيام في وسط النقل. يتم تنشيط Cre recombinase مع 4-هيدروكسي تاموكسيفين (4-OHT). يتم تتبع تكاثر الخلايا مع EdU. تبدأ مرحلة تحويل MG بعد يوم 1 من النقل. تزرع الخلايا الآن في الوسط العصبي حتى الحصاد (6-7 أيام بعد عمليات النقل ، dpTF). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تفكك الشبكية والتنميط الجيني. (أ) كوب العين مع القرنية والعدسة والقزحية والجسم الزجاجي الذي تمت إزالته. (ب) شبكية العين المعزولة؛ تتم إزالة الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية (RPE) بعد غسل شامل. (ج) صفيحة من 12 بئرا مع شبكية منفصلة (شبكتان لكل بئر). (د) قطع مثال صورة هلام التنميط الجيني. مطلوب التنميط الجيني لتحديد الفئران التي لديها تعبير Cre recombinase المدفوع ب Ascl1 وسيتم استخدامه لتتبع تحويل الخلايا. أشرطة الميزان: 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: دبقية مولر الأولية خلال مرحلة النمو. (أ) المسار الزمني لفترات الاستزراع خلال مرحلة النمو (0-4/5 أيام في المختبر (div)) مبرزة باللون الأزرق. (ب-ز) صور حية (مرحلة) لدبقية مولر (MG) خلال مرحلة النمو بعد 1 div (B) ، 2 div بعد التغيير المتوسط (C) ، 3 div (D) ، 4 div قبل المرور (E ، F) و 5 div ، 1 يوم بعد المرور وقبل النقل (G). يشار إلى أجسام خلايا MG بواسطة رؤوس الأسهم الحمراء. بعد 3 div ، تكون الثقافات ملتقية بنسبة 60٪ -80٪ (D) ، وبعد 4-5 div ، تكون الثقافات متقاربة بنسبة 90٪ -100٪ وجاهزة للمرور (E-F). بعد المرور على الأغطية ، يجب أن تكون مزارع الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ -90٪ للانتقال اللاحق (G). قضبان المقياس: 50 ميكرومتر (A-D) ، 100 ميكرومتر (E) ، 200 ميكرومتر (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المراحل المبكرة في مرحلة تحويل دبقية مولر. (أ) المسار الزمني لفترات الاستزراع خلال مرحلة التحويل المميزة باللون الأصفر (يبدأ 7/8 أيام في المختبر (div)). يشار إلى النقطة الزمنية للتحليل الموضحة في هذا الشكل بواسطة النجم الأحمر: 7 div ، 2 أيام بعد النقل (dpTF). (B-C''') صور حية لثقافات مولر الدبقية (MG) في المرحلة والتألق الأحمر ، التألق الأحمر المشترك أو المفرد. يصور التألق الأحمر Ascl1 الذي يعبر عن MG (tdTomato+ ، اختصارا Ascl1-Tom) ، بعد يومين من النقل إما مع محاكاة miRNA للتحكم (control-miR ، B-B''') أو miR-25 يحاكي (C-C'''). تظهر المناطق في B/B' و C/C' بتكبير أعلى في B''/B''' و C''/C'''. أشرطة المقياس 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المراحل النهائية في مرحلة تحويل دبقية مولر. (أ) المسار الزمني لفترات الاستزراع خلال مرحلة التحويل المميزة باللون الأصفر (تبدأ 7/8 أيام في المختبر (div)). يشار إلى النقطة الزمنية للتحليل الموضحة في هذا الشكل بواسطة النجم الأحمر: 10 div ، 5 أيام بعد النقل (dpTF). (B-C'') صور حية لثقافات مولر الدبقية (MG) في المرحلة والتألق الأحمر ، التألق الأحمر المشترك أو المفرد. يصور التألق الأحمر Ascl1 الذي يعبر عن MG (tdTomato+ ، المختصر Ascl1-Tom) ، بعد 5 أيام من النقل (pTF) مع محاكاة miRNA للتحكم (control-miR ، B-B'') أو miR-25 يحاكي (C-C''). تظهر الإدخالات في B'/C' بتكبير أعلى في B''/C''، على التوالي. (د) العدد المطلق لخلايا Ascl1-Tomato+ لكل حقل (10x؛ 1440 ميكرومتر × 1080 ميكرومتر) بعد معالجة الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA) أو miR-25 بعد 2 و 5 أيام من النقل (dpTF؛ n = 1، يتم حساب خمس صور لكل بئر؛ متوسط ± S.D). (ه) النسبة المئوية للخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية Ascl1-Tomato+ من إجمالي خلايا Ascl1-Tomato+ لكل حقل (10x؛ 1440 ميكرومتر × 1080 ميكرومتر) بعد علاج الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNA أو miR-25)، بعد 5 أيام من النقل (5dpTF، n = 1، متوسط ± S.D). أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تأكيد الهوية العصبية للخلايا المعاد برمجتها. (A-A'''; B-B'''') وضع العلامات المناعية الفلورية للفأر الأولي Müller glia (MG) بعد 5 أيام من النقل المعالج بمحاكاة miRNA للتحكم (control-miR ، A-A''') أو miR-25 يحاكي (B-B'''). تم إصلاح الخلايا بنسبة 2٪ من بارافورمالديهايد (PFA) وتم احتضانها بأجسام مضادة ضد RFP لتسمية tdTomato, Map2, and Otx2 لتسمية الخلايا العصبية. تم استخدام وضع العلامات النووية DAPI (الأزرق) لتلطيخ جميع نوى الخلايا. (ج-هاء) القياس الكمي (n = 1 ؛ يتم حساب خمس صور لكل غطاء ؛ متوسط ± S.D.) للعدد المطلق لخلايا Ascl1-Tom + Otx2 + Map2+ لكل حقل (C) ، والنسبة المئوية لخلايا Ascl1-Tom + Otx2 + Map2 + من إجمالي خلايا Ascl1-Tom + (D) ، والعدد المطلق لخلايا Otx2 + Map2 + لكل حقل (E). تظهر النتائج عددا أكبر من الخلايا العصبية في علاج miR-25 مقارنة بالضوابط. حجم الحقل: 630 ميكرومتر × 630 ميكرومتر. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: موت الخلايا والتلوث البكتيري. (أ-أ'') صور حية لمزارع مولر الدبقية (MG) 3 div الملوثة بالبكتيريا. يظهر الجزء الداخلي 1 في A بتكبير أعلى في A' ويعرض دبقية ضامرة ميتة. يظهر Inset 2 في A في A'' مع دبقية حية. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية نمو MG من شبكية العين الفأرية المنفصلة لإعادة برمجة الدراسات باستخدام miRNAs. كما هو موضح ومؤكد في مجموعة متنوعة من الدراسات السابقة ، فإن الغالبية العظمى (80٪ -90٪) من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG20,23,24. هذه الطريقة هي تقنية قوية وموثوقة للغاية ويمكن استنساخ النتائج بسهولة إذا تم اتباع البروتوكول بشكل صحيح21,27. ومع ذلك، فإن النمو الناجح وإعادة برمجة الكفاءة للثقافة يعتمدان على مجموعة متنوعة من العوامل.
أولا ، يلعب عمر الفأر دورا مهما في نمو الخلايا الناجح. لذلك ، إذا نمت مزارع MG من الفئران من النوع البري أو الفئران المعدلة وراثيا التي تشبه الأنواع البرية مثل الفئران الصحفية ، فإن أحدث عمر ينمو طبقات MG أحادية التقاء هو P12. في P12 ، يتم تمييز جميع الخلايا العصبية الشبكية و MG ، ولم تعد هناك RPCs موجودة في شبكية العين. MG اكسبرس علامات MG الناضجة مثل الجلوتامين synthetase أو الغلوتامات الأسبارتات الناقل (GLAST)20،23،41،42. لا يزال بإمكان P12 MG المستزرع العودة إلى دورة الخلية عند تعرضه ل EGF ، ولكن عدد الدورات محدود وإن كان كافيا لتشكيل طبقات خلية متقاربة في المختبر. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث أنه حتى P12 MG لا تنمو بشكل جيد لأن EGF أو المكونات في الوسط قد تتدهور. يمكن أن يؤدي التفكك غير الكامل (القطع) أيضا إلى نمو MG أقل أو تأخير. أحد الأسباب الرئيسية لعدم اكتمال التفكك هو تعطيل DNase الذي استخدمته لتفكك الشبكية عن طريق التعامل القاسي مع الإنزيم (السحب السريع ، الدوامة ، إلخ). حتى لو نمت الخلايا بشكل جيد حتى المرور ، يمكن أن تكون الخلايا أقل التقاء بعد المرور. يمكن أن تكون أسباب ذلك هي التعامل القاسي أثناء عملية المرور التي تؤدي إلى زيادة موت الخلايا أو لأن الخلايا كانت مبذرة بشكل ضئيل للغاية. نظرا لأن الدبقية لا تنمو كثيرا ، يجب طلاء الخلايا بنفس نسبة النمو ، وليس تخفيفها (على عكس إجراءات المرور لخطوط الخلايا الخالدة). تجدر الإشارة إلى أنه نظرا لأن مزارع MG تنمو من المركز إلى محيط البئر ، دائما العثور على كثافات خلايا أعلى في المركز. لذلك من الضروري التحقق من هوامش كل بئر قبل المرور للتأكد من أن البئر بأكمله مغطى بالخلايا. يجب إجراء قياسات تركيز الخلايا لضمان معالجة كميات كافية من الخلايا.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الثقافات الأولية التي تم الحصول عليها من الفئران في P6 أو أصغر لن تحتوي على أي MG ، لأن MG على وشك النضج في هذه المرحلة الزمنية. وقد ظهر ذلك من خلال تحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية43. كما أن وضع العلامات المناعية الفلورية مع علامات MG الناضجة في هذا العمر سيؤكد ذلك أيضا. ومع ذلك، فإن الجزء من RPCs كبير في P6. ولذلك، ينبغي تفسير النتائج بعناية. علاوة على ذلك ، فإن العلامات مثل علامات الخيوط الوسيطة vimentin و nestin ليست مناسبة لتحديد MG الأولية لأن هذه العلامات يتم التعبير عنها أيضا في الخلايا النجمية44,45,46 ، والخلايا الدبقية الصغيرة 47,48 ، والخلايا البطانية ، و pericytes49,50,51,52 ، وليست خاصة ب MG. GFAP ، المعبر عنه في الخلايا النجمية الشبكية ولكن ليس في MG من شبكية العين غير التالفة ، ليس علامة جيدة ل MG المستزرعة. على الرغم من أنه يتم تنظيمه في MG المنفصل بسبب التلف الميكانيكي أثناء التفكك ، إلا أنه يتم تنظيمه بعد 3 أيام في الثقافة28.
نظرا لأن MG تشترك في العديد من علامات RPC ، فإن الإجراء الأكثر أمانا لضمان ثقافة MG قوية هو استخدام الفئران في P12 أو الفئران الأكبر سنا. على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف الثقافات التي تم الحصول عليها من P12 mouse MG ، إلا أنه يمكن استزراع الماوس البالغ MG وإعادة برمجته27. ومع ذلك ، يجب طلاء المزيد من الأنسجة لكل بئر (أربعة إلى ستة شبكية العين). وذلك لأن الدبقية البالغة لا تنقسم كثيرا ، حتى لو تعرضت ل EGF ومصل 10٪. سيؤدي انخفاض اتصالات الخلايا إلى موت الخلايا وانحطاط الخلايا (الخلايا الممتدة ، الخلايا الموسعة). تعد الدبقية البالغة أداة رائعة لنماذج الزراعة المشتركة18 وقد لا تكون كثافة الخلايا مهمة كثيرا في هذه التطبيقات. بالنسبة للتطبيقات النهائية مثل النقل أو النقل ، ومع ذلك ، فإن طبقات الخلايا المتقاربة هي شرط.
إلى جانب ضعف النمو ، يمكن أن يحدث موت الخلايا. إذا حدث موت الخلايا دون أي علامات واضحة ، فيجب النظر في تلوث الميكوبلازما (حجم الميكوبلازما 0.1-0.3 ميكرومتر) ويجب استخدام مجموعة أدوات الكشف عن الميكوبلازما. إن إبقاء كل عينة منفصلة (وليس تجميع العينات) يمكن أن يقلل أيضا من خطر التلوث المتبادل. ومع ذلك ، يمكن أيضا نقل البكتيريا الأكبر من الحيوان ويمكن أن تسبب التلوث على الرغم من أن جميع الأعمال تتم في بيئة نظيفة ومعقمة. يوصى بغمس مقلة العين لفترة وجيزة في 70٪ من الإيثانول وغسلها جيدا في طبق بتري إضافي بطول 10 سم قبل تشريح العين. لتحقيق ثقافة ناجحة ، من الضروري العمل في ظل ظروف معقمة لأن التلوث يمكن أن يحدث بسرعة. بمجرد العثور على البكتيريا أو الخميرة أو العفن / الفطريات في طبق ، حتى لو لم تتأثر جميع الآبار ، يتم فقدان الثقافة. وستؤدي الملوثات إلى موت الخلايا (الشكل التكميلي 1) وستؤثر على الخلايا، مما يؤدي إلى بيانات غير تمثيلية.
يمكن أن يحدث موت الخلايا أيضا بسبب الكواشف المطلوبة للتطبيقات النهائية مثل Poly-O (أو Poly-D-Lysine) المستخدمة في تغطية أغطية الغطاء. هذه المواد سامة ويلزم غسلها جيدا قبل استخدام Laminin. يجب أن تلتصق الأغطية بقاع البئر ، ولا تطفو داخل البئر. يجب تجنب فقاعات الهواء. علاوة على ذلك ، فإن الطلاء الكامل ب Laminin أمر بالغ الأهمية لضمان التصاق الخلايا بالغطاء الزجاجي. سيؤدي نقص اللامينين أيضا إلى انخفاض كثافة الخلايا و / أو موت الخلايا.
لتحديد الدبقية الحقيقية المعاد برمجتها ، يجب استخدام الفئران الصحفية وعلامات تكاثر الخلايا التي تسمح بتتبع الخلايا ، مثل EdU أو BrdU. نظرا لأن شبكية العين بأكملها مطلية ، فإن الناجين من الخلايا العصبية موجودون في جميع الثقافات. ومع ذلك ، تتم إزالتها بالكامل تقريبا بعد المرور في معظم الحالات. ومع ذلك ، يجب إجراء وضع العلامات على EdU (أو BrdU) للتحقق من أن الخلايا العصبية نشأت من تكاثر MG / RPCs وليست ناجية من الخلايا العصبية (ما بعد الميتوتيك). الأعداد الصغيرة من الخلايا العصبية الموجودة في الضوابط المستخدمة هنا هي الناجين من الخلايا العصبية.
ومن المثير للاهتمام ، أن عددا قليلا من خلايا Ascl1-Tom + موجودة أيضا في العلاج الرقابي بأعداد متزايدة قليلا بمرور الوقت. يمكن أن تكون هذه الخلايا بعض MG Express Ascl1 غير الناضجة إلى حد ما عند عزلها وزراعتها. ومع ذلك ، فإن جزء من مجموعة خلايا Ascl1-Tom + هذه صغير. علاوة على ذلك ، فإن معظم خلايا Ascl1-Tom + الموجودة في علاج التحكم لا تعبر عن Otx2 و / أو Map2 وتحافظ على شكل خلية مسطحة إلى حد ما. لا يبدو أن أي تمايز عصبي يحدث في ظل ظروف السيطرة. يتم العثور على الخلايا العصبية الحساسة جدا التي يبدو أنها تشكل شبكات فقط بعد علاج miR-25.
تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا في دراسات سابقة لاختبار miRNAs لإعادة برمجة MG 21,27 وتم تعديله قليلا في السنوات الماضية فيما يتعلق بألواح الآبار لزراعة الدبقية. تزرع الآن في لوحات 12 بئر ، بدلا من لوحات 6 آبار. يمكن الحصول على طبقات أحادية التقاء في لوحات 12 بئرا بعد 4/5 أيام (مقابل 6/8 أيام مع لوحات 6 آبار) ، وبالتالي ، يتم تقليل فترة الثقافة الإجمالية التي تؤدي إلى تغيير / انحطاط الخلايا. كما أن النافذة الزمنية للنقل ممدودة. بروتوكولات النقل المنتظم لها مدة نقل 3 ساعات وبعد ذلك يجب إجراء تغيير متوسط كامل لضمان بقاء الخلية. تتم إزالة جميع الجزيئات بعد هذا التغيير المتوسط. في البروتوكول الحالي ، تم تمديد النافذة الزمنية وسمح بالتعرض لفترة أطول ل miRNAs عن طريق إضافة 50٪ من الوسط العصبي (مع استكمال العوامل المطلوبة لتحريض Cre وتتبع تكاثر الخلايا) إلى وسط كاشف النقل. كانت الخلايا صحية ولم تواجه أي مشاكل مع هذا التعديل. ويبدو أن نتائج النقل تكون أفضل مع وقت النقل الممدود، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من البيانات لتأكيد تلك الملاحظة.
علاوة على ذلك ، يتم وصف جميع الخطوات المطلوبة لوضع العلامات على الفلورسنت المناعي لإجراء الفحص المجهري بالليزر البؤري هنا. وبالتالي ، يجب تمرير MG على أغطية زجاجية. نظرا لأن الأغطية أصغر من مساحة 24 صفيحة بئر ، فإن حوالي ثلث الخلايا التي تغطي بئرا كاملا من صفيحة 24 بئرا فقط تتناسب مع الغطاء المطلي. بالنسبة للتطبيقات الأخرى مثل qPCR أو RNA-Seq أو البقع الغربية ، يتم تمرير الخلايا بنسبة 1: 1 ومعالجتها وحصادها في النقطة الزمنية المطلوبة.
كما ذكرنا من قبل ، يمكن أيضا استخدام نظام الاستزراع هذا لتطبيقات أخرى ، على سبيل المثال ، لدراسة السلوك الدبقي ، بما في ذلك آليات الحماية العصبية ، و / أو الدبقية و / أو لتحديد ملامح الحمض النووي الريبوزي المرسال ، أو miRNA ، أو بروتينات الدبقية المستزرعة على غرار الدراسات التي استخدمت نماذج أو أنواع استزراع مختلفة قليلا11،28،29،54 . لن تتطلب هذه التطبيقات وسيطا عصبيا لضمان بقاء الخلايا العصبية بعد إعادة البرمجة ، ولا إضافة EdU لتصور انتشار الخلايا. يجب استخدام وسط مصل منخفض بدون مكملات عصبية بدلا من ذلك.
على الرغم من أن هذه الطريقة قوية وموثوقة ، على غرار جميع أنظمة الثقافة الأولية ، إلا أن لها قيودا ؛ هذه هي العمر الافتراضي المحدود للخلايا ، وانحطاط الخلايا التدريجي بمرور الوقت28 ، وحقيقة أنه نظام ثقافة اصطناعي ثنائي الأبعاد لا يمكنه محاكاة السياق الفسيولوجي فيما يتعلق بكل من أنواع خلايا الشبكية الأخرى والمصفوفة خارج الخلية. لذلك ، بعد تحديد أفضل المرشحين وتركيزاتهم الأكثر كفاءة في الثقافات الأولية MG ، يجب إجراء ثقافات الشبكية الخارجية ، وهي نظام استزراع ثلاثي الأبعاد يشبه أنسجة الشبكية. كما أن مزارع Explant لديها فترات استزراع محدودة والخلايا في explants تتدهور أيضا بمرور الوقت. ومع ذلك ، فإنها تسمح بدراسة MG في بيئتها الطبيعية ثلاثية الأبعاد ويمكن إجراؤها في مختلف الأعمار مما يعكس مرحلة نمو الحيوان23،32،55،56.
مجتمعة ، تقدم هذه الدراسة تقارير عن مزارع MG المستخدمة لمراقبة إمكانات RPC miRNA miR-25 لإعادة برمجة MG إلى خلايا تشبه الخلايا العصبية ، والتي تم التحقق من صحتها من خلال وضع العلامات المناعية الفلورية. تم استخدام هذا البروتوكول في الأعمال السابقة 21،24،27 وهو طريقة حالية في المختبر لدراسة الإمكانات التجديدية ل MG. بشكل عام ، تعد الثقافات الأولية MG تقنية قوية وتسمح بنتائج قابلة للتكرار20,21. على الرغم من أن التعبير المفرط عن الحمض النووي الريبوزي المرسال لإعادة برمجة MG موصوف هنا بشكل حصري ، إلا أنه يمكن استخدام / اختبار عوامل أخرى مثل الجزيئات الصغيرة أو الحمض النووي (إما البلازميدات أو معبأة في ناقلات فيروسية) أو الأجسام المضادة لتثبيط البروتين32 أو مركبات محددة في مزارع MG الأولية. هناك أيضا مجموعة واسعة من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك تنميط miRNA 24 أو scRNA-seq 27 أو RT-qPCR 20,21 أو البقع الغربية 20. علاوة على ذلك ، تسمح مزارع MG الأولية بالمراقبة اليومية ومراقبة الخلايا. يمكن أن يكون هذا ميزة كبيرة لتحديد النقاط الزمنية ، على سبيل المثال ، لبداية ومدة و / أو نهاية تفاعل معين أو استجابة خلوية. يمكن دراسة وتحليل السلوك المهاجر أو التكاثري وكذلك النماذج المتعلقة بالإصابات / تلف الخلايا (على سبيل المثال ، حذف الحمض النووي الريبوزي المرسال العالمي في مزارع MG)32 في ثقافات MG الأولية لتحديد الآليات والمسارات الأساسية. لذلك ، تعد مزارع MG أداة قوية جدا لدراسة MG على المستويات الجزيئية والخلوية قبل التنفيذ في الأنظمة الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم تقديم براءة اختراع تتضمن بعض النتائج الواردة في هذا التقرير من قبل جامعة واشنطن مع المخترعين نيكولاس جورستاد وستيفاني جي وول وتوماس أ. ريه. وتحمل براءة الاختراع عنوان "طرق وتركيبات لتحفيز تجديد الشبكية.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتورة آن بيتون وجميع أعضاء المختبر على مدخلاتهم في المخطوطة. نتوجه بشكر خاص إلى الدكاترة توم ريه وجوليا بولاك وروس تايلور على تقديم ثقافات MG الأولية كأداة فحص ل S.G.W. خلال تدريب ما بعد الدكتوراه في جامعة واشنطن في سياتل. تم تمويل الدراسة من خلال منحة برنامج Empire Innovation Program (EIP) إلى S.G.W. وصناديق بدء التشغيل من SUNY Optometry إلى S.G.W. ، بالإضافة إلى جائزة R01EY032532 من المعهد الوطني للعيون (NEI) إلى S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
