Summary
תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .
Abstract
Müller glia (MG) הם הגליה השולטת ברשתית העצבית ויכולים לתפקד כמקור רגנרטיבי לנוירונים ברשתית. אצל בעלי חוליות נמוכים יותר כגון דגים, התחדשות מונעת MG מתרחשת באופן טבעי; ביונקים, לעומת זאת, נדרש גירוי עם גורמים מסוימים או מניפולציה גנטית/אפיגנטית. מכיוון ש-MG מהווה רק 5% מאוכלוסיית תאי הרשתית, יש צורך במערכות מודל המאפשרות לחקור את אוכלוסיית התאים הזו באופן בלעדי. אחת ממערכות המודל הללו היא תרביות MG ראשוניות הניתנות לשחזור וניתן להשתמש בהן למגוון יישומים, כולל סינון וזיהוי של מולקולות/גורמים, בדיקת תרכובות או גורמים, ניטור תאים ו/או בדיקות פונקציונליות. מודל זה משמש לחקר הפוטנציאל של מורין MG להמיר לנוירונים ברשתית לאחר תוספת או עיכוב של מיקרו-רנ"א (miRNA) באמצעות טרנספקציה של miRNA מלאכותיים או מעכביהם. השימוש בעכברי דיווח ספציפיים ל-MG בשילוב עם תיוג אימונופלואורסצנטי וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) אישר כי 80%-90% מהתאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG. באמצעות מודל זה, התגלה כי miRNAs יכולים לתכנת מחדש את MG לתאי אב רשתית (RPCs), אשר לאחר מכן מתמיינים לתאים דמויי נוירונים. היתרונות של טכניקה זו הם שניתן לבחון מועמדים ל-miRNA על יעילותם ותוצאתם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo .
Introduction
גליה מולר (באנגלית: Müller glia) היא הגליה השולטת ברשתית העצבית. יש להם תפקודים דומים בהשוואה לגליה אחרים בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון שמירה על הומאוסטזיס של מים ויונים, הזנת נוירונים והגנה על הרקמה. ל-MG יש תכונה מרתקת נוספת: למרות שהם גליה בוגרים, הם עדיין מבטאים גנים רבים המתבטאים בתאי אב רשתית (RPCs) במהלך התפתחות מאוחרת 1,2. ההנחה היא שדמיון זה הוא הסיבה להתחדשות העצבית הטבעית המבוססת על MG ברשתית הדגים לאחר נזק לרשתית 3,4. במהלך תהליך זה, MG נכנסת מחדש למחזור התאים ומתמיינת מחדש ל-RPCs שלאחר מכן מתמיינים לכל ששת הסוגים של נוירוני הרשתית. למרות שתופעה זו מתרחשת באופן טבעי בדגים, יונקים MG אינם ממירים לנוירונים 5,6. עם זאת, ניתן לתכנת אותם מחדש. הודגם כי מגוון גורמים מתכנתים מחדש את MG ל-RPCs/נוירונים; בין גורמים אלה נמצא גורם השעתוק הבסיסי סליל-לולאה-סליל (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) המעורב בהתחדשות דגים 7,8. בעכברים, Ascl1 מתבטא רק ב-RPCs במהלך רטינוגנזה, אך הוא נעדר ב-MG בוגר או בתאי עצב ברשתית9.
תכנות מחדש של תאים ישירות in vivo הוא לא רק מאתגר מבחינה מתודולוגית, אלא גם דורש אישור מוועדה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. כדי לקבל אישור, נדרשים נתונים ראשוניים על הגורמים שבהם נעשה שימוש או שינוי, ריכוזים, השפעות מחוץ למטרה, מנגנונים בסיסיים, רעילות ויעילות. מערכות תרביות תאים מאפשרות בדיקה של קריטריונים אלה לפני השימוש במודלים in vivo. יתר על כן, מכיוון ש-MG מהווים רק כ-5% מכלל אוכלוסיית תאי הרשתית10, תרביות MG מאפשרות לחקור את תפקודן11 וכן את התנהגותן, כולל נדידה12,13, התפשטות14, תגובת עקה לפציעה/נזק15,16, האינטראקציה שלהן עם סוגי תאים אחרים כגון מיקרוגליה17 או תאי גנגליון רשתית (RGCs)18, או הפוטנציאל הנוירוגני שלהם 19,20,21. חוקרים רבים משתמשים בקווי תאים מונצחים לצורך המחקרים שלהם מכיוון שיש להם פוטנציאל התפשטות בלתי מוגבל וניתן לתחזק אותם בקלות ולתמר אותם. תאים ראשוניים, לעומת זאת, עדיפים על מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית מאשר תאים מונצחים, שכן יש להם מאפייני תאים אמיתיים (ביטוי גנים וחלבונים), וחשוב מכך, הם מייצגים שלב מסוים בהתפתחות ולכן יש להם "גיל". גילו של בעל חיים (וכתוצאה מכך של התאים המתקבלים מבעל חיים) הוא גורם מכריע במיוחד בתכנות מחדש של התאים, שכן הפלסטיות של התאים פוחתת עם התקדמות שלב ההתפתחות22.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתכנת מחדש MG ראשוני עם miRNAs כשיטת מבחנה נוכחית לחקר התחדשות. מודל תרבית ראשוני זה של MG הוקם בשנת 2012 כדי להעריך את מאפייני התפשטות התאים של MG בעכברי נוק-אאוט P53 (trp53-/- עכברים)23. הודגם כי MG מתורבתים שומרים על תכונות הגליה שלהם (כלומר, ביטוי של חלבוני S100β, Pax6 ו-Sox2 שהוערכו באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי), וכי הם דומים ל-in vivo MG (מיקרו-מערך של MG מטוהר FACS)23. זמן קצר לאחר מכן, mRNA גליאלי וביטוי חלבונים אומתו ואושרו בגישה שונה באמצעות וקטורים נגיפיים20. כמה שנים לאחר מכן, אושר כי הרוב המכריע של התאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG על ידי שימוש בעכבר Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter24 הספציפי ל-MG. יתר על כן, כימות של קבוצת ה-miRNAs הן ב-MG המטוהר ב-FACS והן ב-MG ראשי מתורבת הראה כי הרמות של MG miRNAs (mGLiomiRs) אינן משתנות הרבה ב-MG מתורבת במהלך שלב הצמיחה. עם זאת, תקופות תרבית מוארכות גורמות לשינויים ברמות ה-miRNA וכתוצאה מכך ברמות ה-mRNA ובביטוי החלבון, שכן miRNA הם מווסתים תרגומיים25.
בשנת 2013, מודל תרבית MG זה שימש לבדיקת מגוון גורמי שעתוק ביחס ליכולתם לתכנת מחדש את MG לנוירונים ברשתית20. Ascl1 נמצא כגורם תכנות מחדש חזק ואמין מאוד. ביטוי יתר של Ascl1 באמצעות וקטורים ויראליים גרם לשינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמנים עצביים ורכישת תכונות אלקטרופיזיולוגיות עצביות. חשוב מכך, התובנות והתוצאות שהתקבלו מניסויים ראשונים אלה במבחנה הועברו בהצלחה ליישומי in vivo 22,26, מה שמדגים כי תרבויות MG ראשוניות מייצגות כלי מוצק ואמין להקרנות גורמים ראשוניות ולהערכה של תכונות גליה לפני יישום in vivo.
לפני מספר שנים, הוכח כי miRNA miR-124 המועשר במוח, אשר מתבטא מאוד גם בתאי עצב ברשתית, יכול לגרום לביטוי Ascl1 בתרבית MG21. ביטוי Ascl1 בתאים חיים הודגם באמצעות עכבר כתב Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). עכבר עיתונאי הוא עכבר מהונדס גנטית שיש לו גן עיתונאי המוחדר לדנ"א שלו. גן מדווח זה מקודד לחלבון עיתונאי, שנמצא במחקר זה tdTomato, חלבון פלואורסצנטי אדום. חלבון כתב זה מדווח על ביטוי של גן בעל עניין, במקרה זה, Ascl1. במילים אחרות, תאים המבטאים Ascl1 יהפכו לאדומים. מכיוון ש- Ascl1 מתבטא רק ב- RPCs9, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl זה מאפשר מעקב אחר המרת MG ל- Ascl1 המבטאת RPCs, כלומר המרת תאים תבטא חלבון כתב tdTomato פלואורסצנטי אדום. זהו תיוג בלתי הפיך מכיוון שהדנ"א של תאים אלה משתנה. כתוצאה מכך, כל התמיינות עצבית עוקבת תודגם מכיוון שהתווית tdTomato נשארת בתאים מתמיינים. אם Ascl1 מבטא RPCs שמקורם ב-MG (עם תווית tdTomato) מתמיינים לנוירונים, נוירונים אלה עדיין יהיו בעלי התווית האדומה שלהם. עכבר זה, אם כן, מאפשר לא רק תיוג של RPCs שמקורם ב-MG להדמיית תאים חיים, אלא גם מאפשר מיפוי גורל ומעקב אחר שושלת של RPCs אלה שמקורם ב-MG (אדום). לאחרונה זוהתה קבוצת miRNA ב-RPCs ותרביות MG של Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter עכברים שימשו לסינון ובדיקת ההשפעה של miRNA אלה על יכולת התכנות מחדש והיעילות27. מועמד אחד, ה-RPC-miRNA miR-25, נמצא מסוגל לתכנת מחדש את MG בתרבית לתאים המבטאים Ascl1 (Ascl1-Tomato+). תאים מתוכנתים מחדש אלה מאמצים תכונות עצביות לאורך זמן, כולל מורפולוגיה עצבית (סומטה קטנה ותהליכים עדינים קצרים או ארוכים), ביטוי של תעתיקים עצביים הנמדדים באמצעות scRNA-Seq, כמו גם ביטוי של חלבונים עצביים המאומתים באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי27.
כאן, הפרוטוקול מפרט כיצד לגדל ולהחליף MG מעכברי P12 שהותאמו מהעבודה הקודמת 21,24,27. נבחר לפרוטוקול זה הוא miRNA miR-25 הנ"ל, miRNA המבוטא מאוד ב-RPCs, עם רמות ביטוי נמוכות ב-MG או בתאי עצב ברשתית. על מנת לבטא יתר על המידה miR-25, מורין miR-25 מחקה, כלומר, מולקולות miRNA מלאכותיות משמשות. כבקרה, נבחרים חיקויים של miRNA מ- Caenorhabditis elegans, שאין להם שום תפקיד בתאי יונקים. ההדמיה של ההמרה של MG ל-RPCs נעשתה באמצעות עכבר הכתב RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), עכבר עם רקע מעורב (זני C57BL/6, S129 ו-ICR). עם זאת, תרבות זו יכולה להתבצע עם כל זני העכברים, כולל זנים מסוג בר. בשנים האחרונות, הפרוטוקול המקורי שונה כדי לקצר את משך שלב הגדילה ואת תקופת התרבית הכוללת ולהבטיח מצב חזק יותר של תאי גליה ולמזער את מידת הניוון התאי, המתרחשת בתקופות תרבית ממושכות. חלון הזמן הרגיל של הטרנספקציה הוארך גם הוא מ-3 שעות ליומיים. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהפרוטוקול הנוכחי מתאר תרביות MG ככלי למחקרי התחדשות, השיטה לא רק שימושית לבדיקת גורמי תכנות מחדש, אלא יכולה להיות מותאמת גם ליישומים אחרים, כולל מחקרים על התנהגות נודדת או התפשטות של MG, פרדיגמות הקשורות לפציעה/נזק לתאים, ו/או זיהוי מנגנונים ומסלולים בסיסיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים הנוגעים לנבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת SUNY לאופטומטריה.
הערה: פרוטוקול תרבות זה מורכב משלושה שלבים: גדילה, טרנספקציה ושלב המרה. סיכום של הפרוטוקול הכולל עם ציר הזמן ניתן באיור 1.
1. הכנת מדיה וכל הריאגנטים הנדרשים
הערה: כל השלבים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית A2 או B2 (BSC). במהלך שלב הגדילה, נעשה שימוש במדיום גדילה גבוה בסרום המורכב ממדיום עצבי בסיסי בתוספת גורם גדילה אפידרמלי (EGF). עבור שלב ההמרה, נעשה שימוש במדיום בסיסי נוירופיזיולוגי נמוך בסרום בתוספת תוספי תזונה עצביים כדי להבטיח התמיינות עצבית והישרדות.
- הכן מדיום גדילה (המשמש בשלב הגדילה) על ידי תוספת של 200 מ"ל של תווך עצבי בסיסי עם 20 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS, 10%), 1 מ"ל של 200 mM L-גלוטמין (0.5%), 2 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (1%) ו -2 מ"ל של תוסף N2 (1%). בצע סינון סטרילי (יחידות סינון עם גודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר). מחממים מראש את המדיום באמבט חרוזי מתכת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- הכינו את המדיום העצבי (שנעשה בו שימוש בשלב ההמרה) בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים) על ידי הוספת 100 מ"ל של תווך בסיסי נוירופיזיולוגי ללא סרום עם 2 מ"ל של תוסף נוירונים B27 (2%), 1 מ"ל של תוסף N2 (1%), 20 μL של 100 ננוגרם/מ"ל של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF), משוחזר ב-0.1% אלבומין סרום בקר (BSA) במי מלח מוחץ פוספט (PBS, ריכוז סופי של 20 ננוגרם/מ"ל), 20 μL של 100 ננוגרם/מ"ל גרם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF, משוחזר בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס הסטרילית [HBSS], ריכוז סופי של 20 ננוגרם/מ"ל), 500 μL של 100 מ"ג/מ"ל דיבוטיריל-cAMP (משוחזר ב-DMSO), 70 μL של חומצה אסקורבית של 50 ng/mL (משוחזר ב-PBS סטרילי), ו-1.5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין. בצע סינון סטרילי (יחידות סינון עם גודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר). מדיום חם מראש באמבט חרוזי מתכת של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
הערה: ניתן לאחסן מדיה זו בטמפרטורה של 4 °C (7 °F), למשך חודש אחד. - ריאגנטים משוחזרים של Papain, DNase I ו-Ovomucoid הנדרשים לדיסוציאציה של הרשתית בעקבות פרוטוקול היצרן. Aliquot 750 μL של Papain בצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל, 75 μL של DNase I בצינורות סטריליים של 0.6 מ"ל, ו-750 μL של מעכב פרוטאז אובומוקואידי בצינורות 2 מ"ל. הקפיאו את ההקפאין ואת DNase I aliquots בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ושמרו על אליקוטים אובומוקואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה של הריאגנטים. להפשיר בטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש.
הערה: פפאין, DNase I ואובומוקואיד נמצאים בערכה הנקראת מערכת דיסוציאציה של פפאין (ראו טבלת חומרים). - משחזרים פולי-L-אורניתין (Poly-O) ולמינין לציפוי כיסוי אם התווית immunofluorescent מבוצעת בהתאם להוראות גיליון הנתונים (Poly-O: 0.1 מ"ג/מ"ל במים סטריליים; למינין: לדלל 1.2 מ"ג/מ"ל בשעה 1:50 ב-DMEM). Aliquot Poly-O ו- Laminin (2.5 מ"ל) ולהקפיא אליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. להפשיר בטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש.
הערה: שלב 1.4. נדרש רק אם מתבצעת התוויה אימונופלואורסנטית ומיקרוסקופיה לסריקת לייזר.
2. מיצוי עכברים ורקמות
הערה: עבור מחקרי תכנות מחדש אלה, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl נוצר על ידי חציית עכבר Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) עם עכבר tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). לעכבר זה יש רקע מעורב (C57BL/6, S129 וזן ICR). הגנוטיפ של העכבר הזה מוצג באיור 1A. ניתן להשתמש בכל הזנים לפרוטוקול זה.
- לבשו כפפות וחטאו את סביבת העבודה, כולל מיקרוסקופ דיסקציה וכל הכלים העדינים (Dumont #5 fine ו-Dumont #7 מלקחיים מעוקלים, מספריים עדינים ומספריים של Vannas) עם 70% אתנול. יש לחטא צלחת כריתה שחורה מצופה סיליקון בקוטר 10 ס"מ על ידי חשיפתה לאור UV למשך 20 דקות.
- הכנת כלים וצלחות למיצוי רקמות
- הכינו צלחת של 24 בארות לאיסוף עיניים והפרדת דגימות (שתי עיניים לכל עכבר בבאר אחת, עם תווית של מזהי עכבר) עם כ-1 מ"ל של HBSS קר (4 מעלות צלזיוס) לבאר. הניחו את צלחת 24 הבאר על הקרח.
- מלאו צלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ (לשטיפה) ואת צלחת הכריתה המצופה בסיליקון מחוטא בכמה מ"ל של HBSS קר (4 מעלות צלזיוס) כדי להבטיח שהרקמה מכוסה במלואה ב-HBSS.
- הכינו צינור סטרילי 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 70% אתנול.
- הכינו צלחת תרבית של 12 בארות על ידי תיוג הצלחת במספר תרבית, תאריך, זן וכל המידע הנדרש.
- המתת חסד עכברי P12 בכל שיטה מאושרת.
- הסרת עיניים
- החזק בעדינות את ראש העכבר עם האגודל והאצבע המורה סביב העין.
- באמצעות מלקחיים מעוקלים של Dumont #7, כנסו בעדינות אל מאחורי גלגל העין וחתכו את עצב הראייה. בזהירות תוציאו את העין החוצה.
הערה: אם משתמשים בעכברים בוגרים, אין להשתמש במלקחיים מעוקלים ולא למשוך את העין. במקום זאת חותכים בזהירות סביב כדור הארץ באמצעות מספריים עדינים; לחתוך את עצב הראייה אבל לא לחתוך את העין עצמה. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את גלגל העין.
- ניקוי גלגלי עיניים
- טפחו את גלגל העין לזמן קצר לתוך צינור המכיל אתנול כדי למנוע נשיאת חיידקים מבעל החיים.
- שטפו את גלגל העין לזמן קצר בצלחת פטרי 10 ס"מ לפני שהניחו אותה בצלחת הבאר 24 על הקרח.
- חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5 לעיניים האחרות. שמור את צלחת הבאר על הקרח במהלך התהליך. מניחים שתי עיניים מבעל חיים אחד בצלחת הנתיחה המונחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה עם מקור אור.
- מיצוי רשתית
- תקן גלגל עין אחד על ידי תפיסת עצב הראייה ורקמת החיבור שמסביב לסקלרה עם מלקחיים עדינים של Dumont #5 ולחץ עליו בזהירות כנגד צלחת הנתיחה (קרנית כלפי מעלה).
- צרו חור במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 גרם כדי לאפשר גישה קלה יותר למספריים של Vannas.
- נתחו את הקרנית סביב הגוף הציליארי באמצעות מספריים של Vannas והסירו בזהירות את הקרנית, העדשה, הקשתית והגוף הזגוגי עם מלקחיים עדינים של Dumont #5. איור 2A ממחיש עין עם הרשתית בתוכה.
- נתחו את הסקלרה עם מספריים של ואנה עד שמגיעים לעצב הראייה. גזור את עצב הראייה וחלץ בזהירות את הרשתית באמצעות מלקחיים עדינים של Dumont #5.
- השתמש בזוג שני של מלקחיים עדינים מסוג Dumont #5 כדי לדחוף את הרשתית ולאפשר הסרה מלאה של הגוף הזגוגי. איור 2B ממחיש שתי רשתות שחולצו.
- העברה ושטיפה
- חותכים כ-2.5 ס"מ מקצה פיפטת העברה סטרילית כדי להגדיל את הקוטר. בעזרת קצה זה, להרים (למצוץ פנימה) רשתיות שלמות מבלי לפגוע ברקמה.
- מעבירים את הרשתיות לתוך צלחת פטרי סטרילית חדשה עם HBSS קר (4 מעלות צלזיוס) ומטלטלים את המנה (קדימה ואחורה, שמאלה וימינה).
- בעזרת קצה פיפטת ההעברה, דחפו בזהירות את הרשתיות כדי לשטוף את תאי האפיתל של פיגמנט הרשתית (RPE).
הערה: לחלופין, ניתן להסיר את כל הרשתית עם העדשה והגוף הזגוגי מכוס העין. לאחר מכן, ניתן להסיר את העדשה ואת הגוף הזגוגי מהרשתית שחולצה. אם הרשתית נקרעת, הקפידו לאסוף את כל החלקים לצורך דיסוציאציה; אחרת, לא יהיו מספיק כמויות של רקמות כדי לגדל שכבות של תאים נפגשים.
- מיד מניחים את הרשתית המבודדת בבאר חדשה ונקייה של צלחת 24 הבארות המלאה ב-1 מ"ל של HBSS. שמור את צלחת 24 הבאר על הקרח במהלך תהליך הנתיחה.
- חזור על שלבים 2.7-2.9 כדי לבודד את הרשתית השנייה.
3. דיסוציאציה של הרשתית
הערה: כל השלבים הבאים (עד לקצירת התאים) צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית A2 או B2 (BSC).
- הכינו את תערובת הדיסוציאציה של Papain/DNase I כדלקמן.
- עבור שש רשתיות, הוסיפו 75 μL של DNase I לתוך הצינור המכיל 750 μL של פאפאין (משלב 1.3) וערבבו בזהירות (תערובת דיסוציאציה).
- להכנת דגימה בודדת הנדרשת לפרוטוקול זה, חלקו את הנפח הכולל של 825 μL לשלושה aliquots: 275 μL של התערובת בצינור אחד של 1.5 מ"ל לכל עכבר (שתי רשתיות). חשב את הכמויות הנדרשות של DNase I ו- Papain בהתאם.
הערה: ניתן לנתק עד שש רשתיות בצינור אחד של תערובת Papain/DNase I. עם זאת, הכנת דגימות בודדות מביאה לפחות גושים ולצמיחה טובה יותר של התאים מאשר בדגימות משולבות.
- מעבירים שתי רשתיות לתערובת הדיסוציאציה של Papain/DNase I. השתמשו בפיפטת העברה עם קוטר קצה מוגדל (שלב 2.8.1), הרימו את הרשתיות, המתינו עד שהרשתיות ישקעו בתחתית הקצה, ואז שחררו את הרשתיות ללא HBSS מוגזם לתוך הצינור המכיל תערובת Papain/DNase I.
- מניחים על מנוטע ומדגרים אותו למשך 10 דקות בחממת תרביות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
- נתקו את התאים על ידי צניחה קפדנית למעלה ולמטה (בערך 20-30 פעמים) עם פיפטה של 1 מ"ל. לאחר שהתאים מנותקים (כלומר, וכתוצאה מכך נוצרת תמיסה הומוגנית ללא גושים), הוסיפו 275 μL של מעכב פרוטאזות אובומוקואידי מהערכה לדיסוציאציה של פפאין כדי לנטרל את הפפאין. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה.
הערה: אם שש רשתיות נותקו ב-825 μL של תערובת Papain/DNase I, נדרש 825 μL של אובומוקואיד. - צנטריפוגה את התערובת ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- הוסף גורם גדילה אפידרמלי (EGF, 1 μL לכל 1 מ"ל של מדיום הגדילה, משוחזר ב 200 מיקרוגרם /מ"ל ב- PBS) לנפח המחושב של מדיום גדילה (1 מ"ל לכל עכבר) שחומם מראש ב- 37 °C (37 °C).
הערה: בהתאם לתכנון הניסויי, ניתן להוסיף את סמן ההתרבות 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), כמו גם 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) או גורמים נדרשים אחרים בתחילת תקופת התרבות. - הסר את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה. אין לגעת בכדור בתחתית הצינור.
- הסר את ה-supernatant בזהירות ובאופן מלא. החייאת גלולת התא עם 500 μL של מדיום גדילה בתוספת EGF.
- העבר את מתלי התא לבאר אחת של הלוחית המסומנת ב-12 בארות (איור 2C). יש לשטוף את הצינור עם עוד 500 μL של מדיום הגדילה בתוספת EGF ולהוסיף אותו לבאר (נפח כולל של 1 מ"ל לבאר).
- חזור על שלבים 3.8 ו- 3.9 עם כל הדוגמאות האחרות.
- נדנדו את צלחת הבאר שלוש פעמים בזהירות (קדימה ואחורה; שמאלה, וימינה). מכניסים את הצלחת לחממה (37 מעלות צלזיוס, CO2).
הערה: אם משתמשים בעכברים מהונדסים, בצעו גנוטיפ עבור כל בעל חיים (איור 2D). זהה את Cre רקומבינאז בעכברים חיוביים ושליליים ותייג את הצלחת בהתאם. עבור פרוטוקול זה, רק תאים של עכברי דיווח חיובי של Cre רקומבינאז שימשו לשלבים הבאים. תאים של דגימות שליליות Cre מוקפאים ומשמשים ליישומים אחרים.
4. שלב הצמיחה
הערה: משך שלב הצמיחה הוא כ-4-5 ימים (איור 1B). כדי להוסיף נוזלים לבארות המכילות תאים, הפיפטה צריכה להצביע על דופן הבאר והנוזל צריך להשתחרר לאט כדי למנוע ניתוק תאים. אין לקטר ישירות על גבי התאים.
- יום אחד לאחר הדיסוציאציה, הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי בתוספת EGF.
- ביום השלישי, הסירו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל של HBSS (טמפרטורת החדר) כדי להסיר פסולת תאים. רוק בעדינות קדימה ואחורה משמאל לימין. הסר HBSS, חזור על שלב ההדחה והוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה מחומם מראש בתוספת EGF.
- עקוב אחר התאים מדי יום והערך את מצב הגדילה שלהם עד שהתאים יגיעו למפגש של 90%-100%. איור 3 מראה דוגמה לצמיחה טובה של MG לאורך זמן. בדוק אם יש זיהום אפשרי או מוות תאי (איור משלים 1). להשליך תרביות מזוהמות.
הערה: כדי לנטר ולתעד את מצב התא, צלם תמונות בהגדלה שונה באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצלמה מחוברת ומטרות של 4x, 10x או 20x. במחקר זה נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
5. הכנת כיסויים עם פולי-L-אורניתין (Poly-O) ומעיל למינין
הערה: שלב זה נחוץ רק אם מתבצעות תיוג אימונופלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר. כיסויי זכוכית עגולים (קוטר 12 מ"מ) נדרשים להדמיה נכונה. ניתן למצוא את פרוטוקול הציפוי גם בגליון הנתונים של המדיום העצבי (ראו טבלת חומרים).
- הניחו בזהירות כיסויים סטריליים במרכז כל באר של צלחת בעלת 24 בארות באמצעות מלקחיים סטריליים של דומונט #2AP.
הערה: מקם כיסויים במרכז הבאר. הצבת כיסויים קרוב לדופן הבאר תגרום לבעיות מתח פני השטח בשלבים הבאים. - להפשיר 2.5 מ"ל Poly-O aliquot בטמפרטורת החדר ולהניח 100 μL ממנו במרכז כל כיסוי.
- דגירה של צלחת הבאר למשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את Poly-O ושטף את הבאר עם כיסוי שלוש פעמים עם ~ 1 מ"ל של מים סטריליים.
- תנו לצלחת הבאר להתייבש למשך הלילה ב-BSC. להפשיר 2.5 מ"ל של Laminin ב 4 °C (84 °F) לילה.
- למחרת בבוקר, הוסיפו 100 μL של למינין במרכז כל כיסוי ודגרו במשך 4 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את הלמינין בזהירות ובאופן מלא.
- שמור על הצלחת ב 4 °C (64 °F) אם לא ניתן לבצע מעבר באופן מיידי.
הערה: ניתן לשמור את הכיסויים המצופים בצלחות מוכנות במשך מספר ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. מעבר תא כדי להסיר ניצולים עצביים
הערה: מעבר תאים נדרש כדי להסיר תאים עצביים, לא כדי להגדיל את אוכלוסיית התאים. גליה מתחלקת רק כמה פעמים ולא תגדל עוד יותר לאחר המעבר. אין לדלל את מתלי התאים. ניתן לפזר את התאים של באר מפגש אחת של צלחת בת 12 בארות על באר אחת של צלחת בת 12 בארות או שתי בארות של צלחת בת 24 בארות. כאשר נעשה שימוש בכיסויים מצופים, רק כשליש מהכיסוי מצופה. לכן, ניתן לקבל שישה כיסויים היושבים בצלחת של 24 בארות, עם תאים מפגשיים (כ-80%-90%) מבאר אחת של תאים מתמזגים של צלחת של 12 בארות. ניתן לבחור גם ביחסים אחרים כדי להגדיל או להקטין את צפיפות התאים. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בעכבר כתב Cre+ אחד [ניסוי אחד, שני טיפולים: miR-25 או control-miR; שכפולים טכניים n = 3 (שלושה כיסויים לכל טיפול), שכפול ביולוגי n = 1]. ניתן להגדיר את מספר השכפולים הטכניים והביולוגיים באופן שונה בהתאם לתכנון הניסוי.
- בדוק אם התאים הם 90%-100% confluent (גם בשולי הבאר; איור 3E,F).
- הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של HBSS (טמפרטורת החדר) לשטיפה. נדנדו בעדינות את הצלחת (קדימה ואחורה, שמאלה וימינה). הסר HBSS לחלוטין.
- הוסיפו 500 μL של תמיסה המכילה טריפסין שחוממה מראש (שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט חרוזי מתכת) כדי לנתק את התאים מהבאר. רוק בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין) ודגירה במשך 2 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
- העבר את הצלחת מהאינקובטור ל- BSC. תוך כדי הטיה, שאפו לתמיסה המכילה טריפסין ופזרו אותה בזהירות ובאיטיות על פני הבאר מספר פעמים עד שהתאים מתנתקים לחלוטין. החזיקו את הצלחת כנגד האור וודאו שלא נותרו תאים בתחתית.
- מעבירים את תרחיף התא הזה לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 8 דקות ב 4 ° C.
- הסר את הסופרנאטנט ובצע החייאה קפדנית של גלולת התא על ידי הוספת 600 μL (100 μL לכל באר עבור 6 בארות / כיסויים) של מדיום גדילה מחומם מראש (בתוספת EGF; 1:1000). וזינוק למעלה ולמטה ~ 30-40 פעמים.
הערה: ניתן להקפיא את התאים בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי ולהפשיר אותם בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים להפשרת קווי תאים. אם התאים מוקפאים, הם לא יוחזקו בהחייאה במדיום תוסף EGF (מדיום גדילה). הם יוחזקו מחדש במדיום בסיסי (ללא EGF) ובתמיסת הקפאה (יחס של 1/1). שלבים 6.1.1 עד 6.6.2 מתארים את השלבים להקפאת התאים. אם אין תאים קפואים, המשך עם שלב 6.7.- הכן תמיסת הקפאה על ידי ערבוב של 100 μL של DMSO ו- 400 μL של FBS (נפח כולל של 500 μL לכל באר / מדגם).
- בצעו החייאה של כדור התא ב-500 μL של מדיום גדילה מחומם מראש. הוסף את מתלי התא ל-500 μL של תמיסת הקפאה DMSO/FBS (נפח כולל של 1 מ"ל). שמור צינורות על קרח עד שכל הדגימות מעובדות. הקפיאו תאים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן אחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
- תאי זרעים על ידי הצבת 100 μL של תרחיף התא/מדיה של 600 μL (שלב 6.6) במרכזם של שישה כיסויים מצופים (ראו שלב 5) של הלוח בעל 24 הבארות. מניחים את הצלחת בזהירות באינקובטור ונותנים לתאים להתיישב.
הערה: 100 μL של תרחיף התא 600 μL (שנקטף מבאר אחת של צלחת של 12 בארות) יגרום למפגש תאים של 90%-100%, הנדרש לצורך טרנספקציה. - בדוק את התאים לאחר 3 שעות כדי לראות אם הם התיישבו על הכיסוי. הוסף 400 μL של מדיום גדילה בתוספת EGF.
הערה: תאים בדרך כלל מוכנים להעברה למחרת (איור 3G). אם לא נפגשים (90%-100%), השאירו אותם ליום אחר. אם עדיין לא confluent, אל תשתמש בהם עבור transfection. אם מתבצעים יישומים אחרים במורד הזרם, כגון פרופיל miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR או כתם מערבי, יש להעביר את התאים ללוחות של 12 בארות (יחס של 1:1; אין צורך בטיפול בצלחת) ולקטוף אותם לצורך מיצוי RNA/חלבון.
7. טרנספקציה
הערה: שלב הטרנספקציה מורכב משלב של 3 שעות במדיום טרנספקציה בלבד (הליכי טרנספקציות מתוארים במדריך הטרנספקציה שמגיע עם ריאגנט הטרנספקציה) ושלב מוארך שבו עדיין קיימים מגיב טרנספקציה ו- miRNAs, אך מתווספים מדיום עצבי עם התוספים הנדרשים (משך הזמן הכולל הוא יומיים; איור 1B). בפרוטוקול זה יעברו שש בארות: שלוש בארות יקבלו את התכנות מחדש miRNA miR-25 ושלוש בארות יקבלו את ה-miRNA הבקרהי.
- בדקו אם התאים הגיעו ל-90% מפגש ותעדו/תצלמו את התאים לפני ההעברה.
- הסר את מדיום הגדילה והוסף 500 μL של HBSS (טמפרטורת החדר) כדי לשטוף את התאים.
- הסר HBSS והוסף 400 μL של מדיום סרום מופחת המשמש לטרנספקציות. החזירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס.
- הכן את תערובת הטרנספקציה על ידי ביצוע ההוראות של פרוטוקול ריאגנט הטרנספקציה של היצרן. הכינו שתי תערובות: תערובת ריאגנטים של טרנספקציה ותערובת miRNA (ראו איור 1B להמחשה).
- הכינו את תערובת ריאגנט הטרנספקציה: עבור צלחת של 24 בארות, 49 μL של מדיום סרום מופחת ו-1 μL של ריאגנט טרנספקציה נדרשים לבאר אחת (50 μL בסך הכל). עבור שש בארות, 294 μL של מדיום סרום מופחת ו-6 μL של מגיב טרנספקציה משולבים ומעורבבים היטב על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה.
- הכינו תערובת חיקוי miRNA: עבור צלחת של 24 בארות, נדרש נפח כולל של 50 μL של תערובת החיקוי עבור באר אחת. שלוש בארות יקבלו את ה-miRNA הבקרה ושלוש הבארות האחרות יטופלו ב-miR-25. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בריכוז סופי של 200 ננומטר.
- עבור הטיפול ב-miR-25 (שלוש בארות), 150 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של miR-25 מחקה (תמיסת מלאי של 100 μM) משולבים ומעורבבים היטב על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. אינקובציה למשך 5 דקות
עבור הטיפול המחקה של הבקרה (שלוש בארות), 150 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של חיקויי בקרה-miRNA (תמיסת מלאי 100 μM) משולבים ומעורבבים היטב על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה. אינקובציה למשך 5 דקות
הערה: נפח החיקויים של miRNA תלוי בגורם הדילול ובריכוז הדרושים (20-500 ננומטר). ניתן להשתמש גם במעכבי miRNA (אנטגומירים), או במולקולות אחרות כולל פלסמידים. כמו כן, שילובים של מולקולות ניתנים להעברה.
- עבור הטיפול ב-miR-25 (שלוש בארות), 150 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של miR-25 מחקה (תמיסת מלאי של 100 μM) משולבים ומעורבבים היטב על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. אינקובציה למשך 5 דקות
- שלבו תערובת חיקוי miRNA ותערובת ריאגנט טרנספקציה. יש לערבב בזהירות על ידי צנרת איטית ויסודית על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (לפי הוראות היצרן).
- הוסיפו את תערובת הטרנספקציה הנ"ל בצורה טיפתית ולאט לאט על גבי התאים, קרוב למשטח המדיה בבאר באמצעות פיפטה של 20 μL. נדנדו את הצלחת בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין).
- אינקובציה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
- לאחר 3 שעות, הוסיפו מדיום עצבי לבארות (500 μL לכל באר) בתוספת 4-Hydroxytamoxifen (מלאי של 5 mM משוחזר עם 2.58 מ"ל של אתנול, ריכוז סופי של 250 ננומטר) כדי להפעיל את ה-Cre רקומבינאז ו-5-אתניל-2'-דאוקסיורידין (EdU, תמיסת מלאי של 10 mM משוחזרת עם 2 מ"ל של DMSO, ריכוז סופי של 1 μM) כדי לעקוב אחר התפשטות התאים.
אזהרה: 4-הידרוקסיטאמוקסיפן ו-EdU ידועים כמסרטן אנושי, טרטוגנים ומוטגנים. קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים לפני השימוש והרכב כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. בנה מחדש את שני הריאגנטים על פי המלצות היצרן. אין לשאוף את החומר/התערובת. סגור היטב לאחר השימוש. יש להיפטר מחומרי פסולת בהתאם לתקנות הלאומיות והמקומיות. לשטוף ידיים ופנים לאחר עבודה עם החומר. - דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים (איור 1B).
8. המרת תאים
הערה: שלב המרת התאים הוא בעל משך זמן של כ-5-6 ימים (איור 1B), אך תקופות ארוכות יותר אפשריות.
- בדוק את התאים מדי יום לאיתור אינדוקציה מוצלחת של ביטוי tdTomato, מוות פוטנציאלי של תאים ו/או זיהום. צפיפות התא אינה משתנה (איור 4). ניתן לראות לראשונה תאים בעלי תווית פלואורסצנטית אדומה קלושה יום אחד לאחר טיפול של 4-Hydroxytamoxifen. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נדרש כדי לנטר ולדמות את התאים.
הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש להדמיה חיה. התמונות צולמו עם מטרות של 4x, 10x או 20x. - יומיים לאחר ההעברה, הסר את המדיום והוסף 500 μL של תווך עצבי שחומם מראש בתוספת 4-Hydroxytamoxifen ו- EdU בכל באר.
- החליפו את המדיום במדיום טרי כל יומיים עד שהתאים נקצרים.
- צלם תמונות חיות לצורך הערכה והערכה של מספר התאים הפלואורסצנטיים האדומים (Ascl1 המבטאים) והשינויים המורפולוגיים שלהם (איור 4 ואיור 5A-C).
9. קצירת תאים: קיבוע לסימון אימונופלואורסצנטי
הערה: ניתן לקצור תאים עבור יישומים אחרים במורד הזרם, כולל בתפזורת או scRNA-Seq, RT-qPCR או כתם מערבי.
- הסר את המדיום והוסף 500 μL של HBSS קר (4 °C) לכל באר וטלטל את הצלחת בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין). הסר HBSS.
- תקן את התאים על ידי הוספת 500 μL של 2% Paraformaldehyde (PFA) ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- בצע תיוג אימונופלואורסצנטי על פי פרוטוקולים מבוססים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר P12 וכיצד לתכנת מחדש את התאים האלה עם miR-25 לנוירונים ברשתית באמצעות עכבר הכתב Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. שיטה זו שימשה בעבודה קודמת המדווחת בפירוט על miRNAs מתאימים אחרים (מחקים או מעכבים, כמולקולות בודדות או בשילוב) כדי לתכנת מחדש את MG ל-RPC שמאמצים לאחר מכן את מאפייני התא העצבי27. שיטה זו שונתה כדי לגדל תרביות מהר יותר ובכך למזער את השינויים התאיים הנגרמים על ידי הסביבה המלאכותית לאורך זמן 24,28,29.
דיסוציאציה ברשתית ושלב גדילה של תרביות MG ראשוניות
ניתן לזהות את ה-MG הראשון כבר ביום הראשון במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אור. ל-MG יש צורה צינורית ומוארכת וגופי תאים אפורים בהירים (איור 3A-D, ראשי חץ אדומים). עם זאת, רובם מכוסים בפסולת תאית בשלבים מוקדמים אלה. MG משתי רשתיות של עכבר אחד, הגדלות בבאר אחת של לוחית בת 12 בארות, מגיעות למפגש של 90%-95% תוך 4-5 ימים (איור 3E,F). עם הזמן, כל הפסולת העצבית תפונה, ושכבת תאים צפופה תהיה נוכחת. תאים אינם מוכנים למעבר אם תחתית הבאר אינה מתכנסת לחלוטין. עם זאת, המעבר לא צריך להיעשות מאוחר יותר מ 6 ימים במבחנה מאז glia לאבד את תכונות glial שלהם בתרבות עם הזמן. לפני טרנספקציה או כל טיפול אחר, יש לבדוק את התאים לגבי צפיפות וחיוניות. טרנספקציה צריכה להתבצע רק על 90%-95% תאים מתמזגים (איור 3G). לצורך תיוג אימונופלואורסצנטי וניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש לזרוע תאים על כיסויים מצופים.
השלב המוקדם והמאוחר של תקופת המרת התא
כבר ב-15 שעות לאחר הטרנספקציה ובטיפול ב-4-Hydroxytamoxifen, התאים הראשונים מתחילים לבטא פלואורסצנציה אדומה קלושה, כלומר, חלבון כתב פלואורסצנטי אדום tdTomato המונע תחת מקדם Ascl1 (המופעל). תאים המבטאים Ascl1 מכונים כעת גם תאי Ascl1-Tom+. ניתן להבחין בביטוי חזק יותר של Ascl1-Tom יומיים לאחר הטרנספקציה עם פלואורסצנציה אדומה גוברת לאורך זמן (איור 4). אפקט התכנות מחדש נראה כ-2 ימים בתרבית עם הרבה תאי Ascl1-Tom+ לכל שדה שנמצאים בטיפול ב-miRNA בתכנות מחדש: מוצג כאן עבור control-miR ו-miR-25 (איור 4B-B''' ואיור 4C-C''', בהתאמה). בשני הטיפולים, תאי Ascl1-Tom+ הם עדיין עגולים למדי וגדולים יחסית, עם מורפולוגיה יותר דמוית גליה/תאי אב. יתר על כן, האינדוקציה של הכתב הפלואורסצנטי האדום אינה משפיעה על צפיפות התאים של התרבית (עדיין 90%-95% מפגש).
שלושה עד חמישה ימים לאחר ההדבקה (איור 4A ואיור 5A), העלייה במספר תאי Ascl1-Tom+ בולטת יותר בבארות שטופלו ב-miR-25 (איור 5B-D) ומראה עלייה של פי ארבעה במספר לאחר טיפולי miR-25 בהשוואה לבקרות. יתר על כן, השינויים המורפולוגיים הראשונים הופכים גלויים לעין. שינויים אלה כוללים הקטנת גודל סומה של התא ופיתוח תהליכים עדינים. בעוד שבתנאי בקרה הרוב המכריע של התאים הם גדולים ושטוחים (דמויי גליה/אב קדמון, איור 5B-B''), תאים רבים עם גרעינים קטנים וכמה תהליכים קטנים הדומים לנוירונים ברשתית מופיעים בטיפול miR-25 (איור- 5C-C''). תאים דמויי נוירונים אלה מייצגים כ-70% מכלל אוכלוסיית Ascl1-Tom (15% בטיפול בקרה; איור 5E). התאים פחות צפופים עקב המרת תאים (תאים קטנים יותר דורשים פחות מקום). באופן מעניין, נראה שהתאים דמויי העצב האלה אפילו יוצרים רשתות זעירות (איור 5C"). בשלב זה, ניתן לקטוף תאים לצורך תיוג אימונופלואורסצנטי כדי לאשר את הזהות העצבית.
אישור הזהות העצבית
התאים מסומנים בנוגדנים נגד חלבון 2 הקשור למיקרוטובולים (Map2), סמן לחלבונים ציטוסקטליים ספציפיים לנוירון30,31, ונגד הומיאובוקס 2 (Otx2) הקשור למיקרוטובול כדי לאמת את הזהות העצבית 32,33. שני הסמנים שימשו גם במחקרי תכנות מחדש קודמים21,27. Otx2 הוא גורם שעתוק שנמצא ב-RPCs 34,35,36, תאים דו-קוטביים בוגרים 34,35,37,38,39, ופוטורצפטורים 35,36,37,38,40 . תיוג גרעיני של DAPI משמש כדי לנטרל את התרבויות. תיוג אימונופלואורסצנטי מראה ביטוי מועט עד אפסי של Map2 או Otx2 בתנאי בקרה (איור 6A-A''',C). עם זאת, לדגימות שטופלו ב-miR-25 יש תאי Map2+ ו-Otx2+ רבים (איור 6B-B'''). כימות של תמונות קונפוקליות מראה כי לאחר ביטוי יתר של miR-25, קיימים כ-40 תאים עצביים לכל שדה, לעומת חמישה תאים עצביים לכל שדה בבקרות (איור 6C, גודל שדה: 630 מיקרומטר x 630 מיקרומטר). התמונות צולמו עם מטרה של פי 20. התאים העצביים האלה מהווים כ-70% מכלל אוכלוסיית תאי Ascl1-Tom+ של הדגימות שטופלו ב-miR-25 (בקרה של כ-20%, איור 6D). כל תאי Ascl1-Tom+ דמויי העצב היו Map2+ ו-Otx2+, מה שאישר את הזהות העצבית. יתר על כן, המספר האבסולוטי של תאי Otx2+ ו-Map2+ היה גבוה יותר לאחר טיפולי miR-25 בהשוואה לטיפול ב-control-miRNA (miR-25: 60 תאים לכל שדה; בקרה-miR: 10 תאים לכל שדה; איור 6E).
יחד, התוצאות מראות כי ניתן לגדל תרבויות MG ולתכנת אותן מחדש באמצעות miRNAs. תוספת miR-25 משרה ביטוי Ascl1-Tom ב- MG ראשוני. MG רבים ממירים ל-RPCs שמאמצים מורפולוגיה עצבית ומבטאים את הסמנים העצביים Map2 ו-Otx2 לאחר מספר ימים.
איור 1: תכנון ניסויי ומהלך זמן של תרבית Müller glia ראשונית. (A) סכמטי של עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl, עכבר מדווח אבות רשתית המשמש למעקב אחר ההמרה של Müller glia (MG) לתאי אב רשתית (RPCs). (B) מהלך הזמן של תקופות התרבית המורכב משלב גדילה (כחול, 0-4/5 ימים במבחנה, div), שלב הטרנספקציה (סגול, 5/6-7/8 div) ושלב ההמרה של MG (צהוב, מתחיל 7/8 div). שלב גדילה: רשתיות מנותקות (שתי רשתיות של עכבר אחד) גדלות בבאר אחת של צלחת בת 12 בארות במדיום צמיחה. בסביבות היום ה-4/6, התאים מועברים לתוך צלחת של 24 בארות המכילה כיסויים מצופים. שלב הטרנספקציה: 5-7 תאים div (יום אחד לאחר המעבר) עוברים טרנספקציה עם miRNAs במשך יומיים במדיום טרנספקציה. קר רקומבינאז מופעל עם 4-הידרוקסיטאמוקסיפן (4-OHT). התפשטות התאים נמצאת במעקב עם EdU. שלב ההמרה של MG מתחיל יום אחד לאחר הטרנספקציה. תאים גדלים כיום בתווך העצבי עד הקציר (6-7 ימים לאחר טרנספקציות, dpTF). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דיסוציאציה רשתית וגנוטיפ. (A) כוסית עיניים עם קרנית שהוסרה, עדשה, קשתית וזגוגית. (ב) רשתיות מבודדות; תאי אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מוסרים לאחר שטיפה יסודית. (C) צלחת בעלת 12 בארות עם רשתיות מנותקות (שתי רשתיות לכל באר). (D) חיתוך של תמונת ג'ל גנוטיפ לדוגמה. גנוטיפ נדרש כדי לזהות את העכברים שיש להם ביטוי קר רקומבינאז מונע Ascl1 וישמשו למעקב אחר המרת תאים. סרגלי קנה מידה: 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: גליה ראשונית של מולר במהלך שלב הגדילה. (ב-ג) תמונות חיות (פאזה) של Müller glia (MG) במהלך שלב הגדילה לאחר 1 div (B), 2 div לאחר השינוי הבינוני (C), 3 div (D), 4 div לפני המעבר (E,F) ו-5 div, 1 יום לאחר המעבר ולפני הטרנספקציה (G). גופי תאי MG מסומנים על ידי ראשי חץ אדומים. לאחר 3 div, תרבויות הן 60%-80% מפגש (D), לאחר 4-5 div, תרבויות הן 90%-100% מפגש ומוכנות למעבר (E-F). לאחר המעבר על כיסויים, תרביות תאים צריכות להיות 80%-90% מפגש עבור טרנספקציה עוקבת (G). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר (A-D), 100 מיקרומטר (E), 200 מיקרומטר (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: שלבים מוקדמים בשלב ההמרה של Müller glia. (A) מהלך הזמן של תקופות התרבית בשלב ההמרה המודגש בצהוב (מתחיל 7/8 ימים במבחנה (div)). נקודת הזמן של הניתוח המוצגת באיור זה מסומנת על ידי הכוכב האדום: 7 div, 2 ימים לאחר transfection (dpTF). (ב-ג''''') תמונות חיות של תרביות מולר גליה (MG) בפלואורסצנציה פאזית ואדומה, פלואורסצנציה משולבת או אדומה יחידה. פלואורסצנציה אדומה מדמיינת את Ascl1 המבטאת MG (tdTomato+, מקוצרת Ascl1-Tom), יומיים לאחר הטרנספקציה עם חיקוי miRNA בקרה (שליטה-miR, B-B''') או miR-25 מחקה (C-C'''). אזורים ב-B/B' וב-C/C' מוצגים בהגדלה גבוהה יותר ב-B''/B''', C''/C'''. סרגלי קנה מידה 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: שלבי סיום בשלב ההמרה של Müller glia. (A) מהלך הזמן של תקופות התרבית במהלך שלב ההמרה המודגש בצהוב (מתחיל 7/8 ימים במבחנה (div)). נקודת הזמן של הניתוח המוצגת באיור זה מסומנת על ידי הכוכב האדום: 10 div, 5 ימים לאחר transfection (dpTF). (ב-ג'') תמונות חיות של תרביות מולר גליה (MG) בפלואורסצנציה פאזית ואדומה, פלואורסצנציה משולבת או אדומה יחידה. פלואורסצנציה אדומה מדמיינת את Ascl1 המבטאת MG (tdTomato+, מקוצר Ascl1-Tom), 5 ימים לאחר טרנספקציה (pTF) עם חיקויים של miRNA בקרה (control-miR, B-B'') או miR-25 מחקה (C-C''). סטים ב-B'/C' מוצגים בהגדלה גבוהה יותר ב-B''/C'', בהתאמה. (D) המספר המוחלט של תאי Ascl1-Tomato+ לכל שדה (10x; 1440 μm x 1080 μm) לאחר טיפול בבקרה-miRNA או miR-25, 2 ו-5 ימים לאחר הטרנספקציה (dpTF; n =1, חמש תמונות לכל באר נספרות; ממוצע ± S.D.). (E) אחוז התאים דמויי העצב Ascl1-Tomato+ של סך כל תאי Ascl1-Tomato+ לכל שדה (10x; 1440 μm x 1080 μm) לאחר טיפול בבקרה-miRNA או miR-25, 5 ימים לאחר טרנספקציה (5dpTF, n = 1, ממוצע ± S.D.). סרגלי קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אישור הזהות העצבית של תאים מתוכנתים מחדש. (A-A'''; B-B''') תיוג אימונופלואורסצנטי של תרביות Müller glia (MG) של עכבר ראשוני 5 ימים לאחר טרנספקציה שטופלו בחיקוי miRNA בקרה (שליטה-miR, A-A''') או miR-25 מחקה (B-B'''). התאים תוקנו עם 2% פרפורמלדהיד (PFA) והודגרו עם נוגדנים נגד RFP כדי לתייג את tdTomato, Map2 ו-Otx2 כדי לתייג נוירונים. תיוג גרעיני DAPI (כחול) שימש להכתמת כל גרעיני התאים. (ג-ה) כימות (n = 1; חמש תמונות לכל כיסוי נספרות; ממוצע ± S.D.) של המספר המוחלט של תאי Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ לכל שדה (C), אחוז תאי Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ של סך כל תאי Ascl1-Tom+ (D), והמספר המוחלט של תאי Otx2+Map2+ לכל שדה (E). התוצאות מראות מספר גבוה יותר של תאי עצב בטיפול miR-25 בהשוואה לבקרות. גודל שדה: 630 מיקרומטר x 630 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: מוות תאי וזיהום חיידקי. (א-א'') תמונות חיות של תרביות מולר גליה (MG) 3 צלילות מזוהמות בחיידקים. בסט 1 ב-A מוצג בהגדלה גבוהה יותר ב-A' ומציג גליה אטרופית ומתה. אינסט 2 ב-A מוצג ב-A'' עם גליה חיה. סרגלי קנה מידה:100 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר מנותקות לצורך תכנות מחדש של מחקרים באמצעות miRNAs. כפי שהוכח ואושר במגוון מחקרים קודמים, הרוב המכריע (80%-90%) של התאים שנמצאו בתרביות אלה הם MG 20,23,24. שיטה זו היא טכניקה חזקה ואמינה מאוד וניתן לשחזר בקלות את התוצאות אם הפרוטוקול עוקבים אחריו נכון21,27. עם זאת, הצמיחה המוצלחת ויעילות התכנות מחדש של התרבות תלויות במגוון גורמים.
ראשית, גיל העכבר ממלא תפקיד חשוב בצמיחת תאים מוצלחת. לכן, אם תרביות MG גדלות מעכברים מסוג בר או מעכברים מהונדסים הדומים לסוגי בר כמו עכברי כתבים, הגיל האחרון לגידול חד-שכבתי MG מתמזגים הוא P12. ב-P12, כל תאי העצב ברשתית וה-MG נבדלים זה מזה, ואין יותר RPCs ברשתית. סמני MG אקספרס בוגרים של MG כגון גלוטמין סינטאז או טרנספורטר אספרטט גלוטמט (GLAST)20,23,41,42. P12 MG בתרבית עדיין יכול להיכנס מחדש למחזור התא כאשר הוא נחשף ל-EGF, אך מספר המחזורים מוגבל אם כי מספיק כדי ליצור שכבות תאים מתכנסות במבחנה. עם זאת, זה יכול להתרחש כי אפילו P12 MG לא לגדול היטב כי EGF או רכיבים במדיום עלול להיות מושפל. דיסוציאציה לא שלמה (נתחים) יכולה גם לגרום לצמיחה פחותה או מתעכבת של MG. סיבה עיקרית לדיסוציאציה לא שלמה היא השתקה של ה-DNase שבו השתמשתי לדיסוציאציה של הרשתית על ידי טיפול קשה באנזים (צנרת מהירה, מערבולת וכו'). גם אם התאים גדלים היטב עד המעבר, התאים יכולים להיות פחות נפגשים לאחר המעבר. הסיבות לכך יכולות להיות טיפול קשה בתהליך המעבר שמוביל למוות מוגבר של תאים או משום שהתאים נזרעו בדלילות רבה מדי. מכיוון שהגליה אינה גדלה הרבה, תאים צריכים להיות מצופים באותו יחס כמו גדל, לא מדולל (בניגוד להליכי המעבר של קווי תאים מונצחים). יש לציין כי מכיוון שתרביות MG גדלות מהמרכז לפריפריה של באר, צפיפות תאים גבוהה יותר תמיד תימצא במרכז. לכן חובה לבדוק את השוליים של כל באר לפני המעבר כדי לוודא שכל הבאר מכוסה בתאים. יש לבצע מדידות ריכוז תאים כדי להבטיח עיבוד של כמויות מספיקות של תאים.
בנוסף, תרביות ראשוניות המתקבלות מעכברים ב-P6 ומטה לא יכילו שום MG, מכיוון ש-MG בדיוק עומד להבשיל בנקודת זמן זו. זה הודגם באמצעות ניתוח RNA-seq חד-תאי43. תיוג אימונופלואורסצנטי עם סמני MG בוגרים בגיל זה יאשר גם זאת. עם זאת, חלקם של RPCs הוא משמעותי ב-P6. התוצאות צריכות, אם כן, להתפרש בזהירות. יתר על כן, סמנים כגון סמני נימה ביניים וימנטין ונסטין אינם מתאימים לזיהוי MG ראשוני מכיוון שסמנים אלה באים לידי ביטוי גם באסטרוציטים 44,45,46, מיקרוגליה47,48, תאי אנדותל, ופריסיטים 49,50,51,52 ואינם ספציפיים ל-MG., GFAP, המתבטא באסטרוציטים ברשתית אך לא ב-MG של רשתיות לא פגומות, אינו סמן טוב ל-MG מתורבת. למרות שהוא מווסת כלפי מעלה ב- MG מנותק עקב הנזק המכני במהלך הדיסוציאציה, הוא מווסת לאחר 3 ימים בתרבית28.
מאחר ש-MG חולקים סמני RPC רבים, ההליך הבטוח ביותר להבטחת תרבית MG חזקה הוא שימוש בעכברים בעכברים ב-P12 או בעכברים מבוגרים יותר. למרות שפרוטוקול זה מתאר תרביות המתקבלות מעכבר P12 MG, ניתן לתרבת את MG של עכבר בוגר ולתכנת אותו מחדש27. עם זאת, יותר רקמה לכל באר צריכה להיות מצופה (ארבע עד שש רשתיות). הסיבה לכך היא כי גליה בוגרים לא מחלקים הרבה, גם אם הם נחשפים ל-EGF ול-10% סרום. מגעים מופחתים עם תאים יובילו למוות של תאים ולניוון תאים (תאים מתוחים, תאים מוגדלים). גליה בוגרת היא כלי נהדר לפרדיגמות של תרביות משותפות18 וצפיפות התאים עשויה שלא להיות חשובה כל כך ביישומים אלה. עם זאת, עבור יישומים במורד הזרם כגון טרנספקציה או התמרה, שכבות תאי מפגש הן דרישה.
מלבד גדילה לקויה, מוות תאי יכול להתרחש. אם מוות תאי מתרחש ללא סימנים ברורים, יש לשקול זיהום מיקופלסמה (גודל מיקופלסמה 0.1-0.3 מיקרומטר) ויש להשתמש בערכת זיהוי מיקופלסמה. שמירה על הפרדה בין כל דגימה (לא איגום דגימות) יכולה גם להפחית את הסיכון לזיהום צולב. עם זאת, חיידקים גדולים יותר יכולים גם להיות מועברים מבעל החיים ועלולים לגרום לזיהום למרות שכל העבודה נעשית בסביבה נקייה וסטרילית. מומלץ לטבול את גלגל העין לזמן קצר ב-70% אתנול ולשטיפה יסודית בצלחת פטרי נוספת של 10 ס"מ לפני ניתוח העין. כדי להשיג תרבות מוצלחת, זה הכרחי לעבוד בתנאים סטריליים שכן זיהום יכול לקרות במהירות. ברגע שחיידקים, שמרים או עובש/פטרייה נמצאים בצלחת, גם אם לא כל הבארות מושפעות, התרבית הולכת לאיבוד. זיהומים יגרמו למוות של תאים (איור משלים 1) וישפיעו על התאים, וכתוצאה מכך יהיו נתונים לא מייצגים.
מוות תאי יכול להיגרם גם על ידי ריאגנטים הנדרשים ליישומים במורד הזרם כגון Poly-O (או Poly-D-Lysine) המשמשים לציפוי כיסויים. חומרים אלה רעילים ושטיפות יסודיות נדרשות לפני השימוש בלמינין. כיסויים צריכים להידבק לתחתית הבאר, לא לצוף בתוך באר. יש להימנע מבועות אוויר. יתר על כן, ציפוי מלא עם Laminin הוא חיוני כדי להבטיח היצמדות התא לכיסוי. מחסור בלמינין יוביל גם לירידה בצפיפות התאים ו/או למוות של תאים.
לזיהוי גליה אמיתית שתוכנתה מחדש, יש להשתמש בעכברים מדווחים ובסמני התפשטות תאים המאפשרים מעקב אחר תאים, כגון EdU או BrdU. מכיוון שרשתיות שלמות מצופים, ניצולים עצביים נמצאים בכל התרבויות. עם זאת, הם מוסרים כמעט לחלוטין לאחר המעבר ברוב המקרים. עם זאת, יש לבצע תיוג EdU (או BrdU) כדי לאמת כי נוירונים מקורם בהתרבות MG/RPCs ואינם ניצולי נוירונים (פוסט-מיטוטיים). המספרים הקטנים של תאי העצב שנמצאים בבקרים המשמשים כאן הם ניצולים עצביים.
באופן מעניין, כמה תאי Ascl1-Tom+ נמצאים גם בטיפול הבקרה עם מספרים מעט הולכים וגדלים עם הזמן. תאים אלה יכולים להיות כמה MG לא בשלים למדי להביע Ascl1 כאשר מבודדים ותרבית. עם זאת, החלק של אוכלוסיית תאי Ascl1-Tom+ הוא קטן. יתר על כן, רוב תאי Ascl1-Tom+ אלה שנמצאו בטיפול הבקרה אינם מבטאים את Otx2 ו/או Map2 ושומרים על צורת תא שטוחה למדי. נראה כי לא מתרחשת התמיינות עצבית בתנאי בקרה. תאים עדינים מאוד דמויי נוירונים שנראים כאילו הם יוצרים רשתות נמצאים רק לאחר טיפול ב-miR-25.
הפרוטוקול המתואר כאן שימש במחקרים קודמים לבדיקת miRNAs עבור תכנות מחדש של MG21,27, והוא שונה מעט בשנים האחרונות ביחס ללוחות הבאר לגידול הגליה. כיום הם גדלים בצלחות של 12 בארות, במקום בצלחות של 6 בארות. ניתן לקבל מונו-שכבות מפגש בלוחות של 12 בארות לאחר 4/5 ימים (לעומת 6/8 ימים עם צלחות של 6 בארות), ולכן, תקופת התרבית הכוללת שמובילה לשינוי/התנוונות תאים מצטמצמת. גם חלון הזמן של הטרנספקציה מוארך. לפרוטוקולי טרנספקציה רגילים יש משך טרנספקציה של 3 שעות ולאחר מכן יש לבצע שינוי בינוני מלא כדי להבטיח את הישרדות התא. כל המולקולות מוסרות לאחר שינוי בינוני זה. בפרוטוקול הנוכחי, חלון הזמן הורחב וחשיפה ארוכה יותר ל-miRNA הותרה על ידי הוספת 50% תווך עצבי (בתוספת הגורמים הדרושים לאינדוקציה של Cre ומעקב אחר התפשטות תאים) למדיום ריאגנט הטרנספקציה. התאים היו בריאים ולא נתקלו בבעיות עם שינוי זה. נראה כי תוצאות הטרנספקציה טובות יותר עם זמן הטרנספקציה המוארך, אך נדרשים נתונים נוספים כדי לאשר תצפית זו.
יתר על כן, כל השלבים הנדרשים לסימון אימונופלואורסצנטי כדי לבצע מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית מתוארים כאן. לפיכך, יש להעביר את ה- MG על כיסויי זכוכית. מכיוון שהכיסויים קטנים יותר משטחה של צלחת באר בת 24, רק כשליש מהתאים שיכסו באר שלמה של צלחת בת 24 בארות מתאימים לכיסוי המצופה. עבור יישומים אחרים כגון qPCR, RNA-Seq או כתמים מערביים, תאים מועברים ביחס של 1:1, מטופלים ונקצרים בנקודת הזמן הרצויה.
כאמור, מערכת תרביות זו יכולה לשמש גם ליישומים אחרים, למשל, כדי לחקור התנהגות גליאלית, כולל מנגנוני הגנה עצביים, גליוזיס ו/או פרופיל mRNA, miRNA או חלבונים של גליה מתורבתת בדומה למחקרים שהשתמשו בפרדיגמות תרביות שונות במקצת אובמינים שונים 11,28,29,54 . יישומים אלה לא ידרשו מדיום עצבי כדי להבטיח הישרדות עצבית לאחר תכנות מחדש, וגם לא תוספת של EdU כדי לדמיין את התפשטות התאים. במקום זאת יש להשתמש במדיום נמוך בסרום ללא תוספי תזונה עצביים.
למרות ששיטה זו חזקה ואמינה, בדומה לכל מערכות התרבות הראשוניות יש לה מגבלות; אלה הם אורך חיים מוגבל של התאים, התנוונות תאים מתקדמת לאורך זמן28, והעובדה שמדובר במערכת תרבית מלאכותית דו-ממדית שאינה יכולה לחקות את ההקשר הפיזיולוגי ביחס לשניהם, סוגי תאי רשתית אחרים ומטריצה חוץ-תאית. לכן, לאחר זיהוי המועמדים המובילים והריכוזים היעילים ביותר שלהם בתרביות ראשוניות של MG, יש לבצע תרביות של אקספלנט רשתית, מערכת תרבית תלת-ממדית הדומה לרקמת הרשתית. לתרביות אקספלנט יש גם תקופות תרבית מוגבלות ותאים באקספלנטים מתנוונים גם כן עם הזמן. עם זאת, הם מאפשרים את המחקר של MG בסביבתם התלת מימדית הטבעית וניתן לבצע אותם בגילאים שונים המשקפים את השלב ההתפתחותי של החיה 23,32,55,56.
יחד, מחקר זה מדווח על תרביות MG המשמשות לניטור הפוטנציאל של ה-RPC miRNA miR-25 לתכנת מחדש את MG לתאים דמויי נוירונים, המאומתים על ידי תיוג אימונופלואורסצנטי. פרוטוקול זה שימש בעבודות הקודמות 21,24,27 והוא שיטה נוכחית במבחנה כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של MG. בסך הכל, תרביות ראשוניות של MG הן טכניקה חזקה ומאפשרות תוצאות הניתנות לשחזור20,21. למרות שביטוי יתר של miRNA עבור תכנות מחדש של MG מתואר כאן באופן בלעדי, גורמים אחרים כגון מולקולות קטנות, דנ"א (או פלסמידים או ארוזים בווקטורים נגיפיים), נוגדנים לעיכוב חלבונים32, או תרכובות ספציפיות יכולים לשמש/להיבדק בתרביות ראשוניות של MG. יש גם ספקטרום רחב של יישומים במורד הזרם, כולל פרופיל miRNA24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21, או כתמים מערביים20. יתר על כן, תרביות ראשוניות של MG מאפשרות תצפית ומעקב יומיומיים אחר התאים. זה יכול להוות יתרון משמעותי לקביעת נקודות זמן, למשל, עבור ההתחלה, משך הזמן ו/או הסוף של תגובה מסוימת או של תגובה תאית מסוימת. התנהגות נודדת או התפשטות, כמו גם פרדיגמות הקשורות לפציעה/נזק לתאים (לדוגמה, מחיקת miRNA גלובלית בתרביות MG)32 ניתן לחקור ולנתח בתרביות הראשוניות של MG כדי לזהות מנגנונים ומסלולים בסיסיים. לכן, תרביות MG הן כלי רב עוצמה לחקר MG ברמה המולקולרית והתאית לפני היישום במערכות in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
פטנט הכולל חלק מהממצאים בדו"ח זה הוגש על ידי אוניברסיטת וושינגטון עם הממציאים ניקולאס ג'ורסטאד, סטפני ג' וואהל ותומאס א' רה. הפטנט נקרא ''שיטות והרכבים לעידוד התחדשות הרשתית.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר אן ביטון ולכל חברי המעבדה על התייחסותם לכתב היד. תודה מיוחדת לד"ר טום רה, ג'וליה פולק וראס טיילור על הצגת התרבויות הראשוניות של MG ככלי סינון ל- S.G.W. במהלך הכשרת פוסט-דוקטורט באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. המחקר מומן על ידי מענק תוכנית החדשנות של האימפריה (EIP) ל- S.G.W. וקרנות סטארט-אפ מ- SUNY אופטומטריה ל- S.G.W., כמו גם פרס R01EY032532 ממכון העיניים הלאומי (NEI) ל- S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
