Summary
Müller glia primaire culturen verkregen uit het netvlies van muizen vormen een zeer robuust en betrouwbaar hulpmiddel om de gliale omzetting in retinale voorlopercellen na microRNA-behandeling te bestuderen. Afzonderlijke moleculen of combinaties kunnen worden getest voordat ze vervolgens in vivo worden toegepast.
Abstract
Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies en kunnen functioneren als een regeneratieve bron voor retinale neuronen. Bij lagere gewervelde dieren zoals vissen vindt MG-gedreven regeneratie van nature plaats; bij zoogdieren is echter stimulatie met bepaalde factoren of genetische/epigenetische manipulatie vereist. Aangezien MG slechts 5% van de retinale celpopulatie uitmaakt, is er behoefte aan modelsystemen die de studie van deze celpopulatie uitsluitend mogelijk maken. Een van deze modelsystemen zijn primaire MG-culturen die reproduceerbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder moleculen / factorscreening en -identificatie, testen van verbindingen of factoren, celmonitoring en / of functionele tests. Dit model wordt gebruikt om het potentieel van muizen-MG te bestuderen om te converteren in retinale neuronen na suppletie of remming van microRNA's (miRNA's) via transfectie van kunstmatige miRNA's of hun remmers. Het gebruik van MG-specifieke reportermuizen in combinatie met immunofluorescente etikettering en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) bevestigde dat 80% -90% van de cellen in deze culturen MG zijn. Met behulp van dit model werd ontdekt dat miRNA's MG kunnen herprogrammeren in retinale voorlopercellen (RPC's), die vervolgens differentiëren in neuronaal-achtige cellen. De voordelen van deze techniek zijn dat miRNA-kandidaten kunnen worden getest op hun efficiëntie en uitkomst voordat ze in in vivo toepassingen worden gebruikt.
Introduction
De Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies. Ze hebben vergelijkbare functies in vergelijking met andere glia in andere delen van het centrale zenuwstelsel, zoals het handhaven van de water- en ionhomeostase, het voeden van neuronen en het beschermen van het weefsel. MG hebben nog een fascinerend kenmerk: hoewel ze volwassen glia zijn, brengen ze nog steeds veel genen tot expressie die tot expressie komen in retinale voorlopercellen (RPC's) tijdens de late ontwikkeling 1,2. Deze gelijkenis wordt verondersteld de reden te zijn voor de natuurlijk voorkomende op MG gebaseerde neuronale regeneratie in het netvlies van vissen na retinale schade 3,4. Tijdens dit proces komt MG opnieuw in de celcyclus en de-differentieert in RPC's die vervolgens differentiëren in alle zes soorten retinale neuronen. Hoewel dit fenomeen van nature voorkomt bij vissen, zet mg van zoogdieren niet om in neuronen 5,6. Ze kunnen echter worden geherprogrammeerd. Van een verscheidenheid aan factoren is aangetoond dat ze MG herprogrammeren in RPC's / neuronen; een van deze factoren is de basis helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactor achaete-scute homoloog 1 (Ascl1) die betrokken is bij visregeneratie 7,8. Bij muizen komt Ascl1 alleen tot expressie in RPC's tijdens retinogenese, maar is afwezig in volwassen MG- of retinale neuronen9.
Het direct in vivo herprogrammeren van cellen is niet alleen methodologisch uitdagend, maar vereist ook goedkeuring van een instellingscommissie voor dierverzorging en -gebruik. Om goedkeuring te krijgen, zijn voorlopige gegevens nodig over de gebruikte of gewijzigde factor(en), concentraties, off-target effecten, onderliggende mechanismen, toxiciteit en efficiëntie. Celkweeksystemen maken het mogelijk om deze criteria te testen voordat ze in in vivo modellen worden gebruikt. Bovendien, aangezien MG slechts ongeveer 5% van de gehele retinale celpopulatie10 omvat, maken MG-culturen de studie van hun functie11 en hun gedrag mogelijk, inclusief migratie12,13, proliferatie14, stressreactie op letsel / schade15,16, hun interactie met andere celtypen zoals microglia17 of retinale ganglioncellen (RGC's)18, of hun neurogene potentieel 19,20,21. Veel onderzoekers gebruiken onsterfelijke cellijnen voor hun studies, omdat ze een onbeperkt proliferatief potentieel hebben en gemakkelijk kunnen worden onderhouden en getransfecteerd. Primaire cellen hebben echter de voorkeur voor biologisch relevante testen dan vereeuwigde cellen, omdat ze echte celkenmerken hebben (gen- en eiwitexpressie) en, nog belangrijker, ze vertegenwoordigen een bepaald stadium in ontwikkeling en hebben daarom een "leeftijd". De leeftijd van een dier (en bijgevolg van de cellen verkregen van een dier) is een bijzonder cruciale factor bij cellulaire herprogrammering, omdat de plasticiteit van cellen afneemt met het gevorderde stadium van ontwikkeling22.
Dit protocol beschrijft in detail hoe primaire MG met miRNA's kan worden geherprogrammeerd als een huidige in vitro methode voor het bestuderen van regeneratie. Dit MG primaire kweekmodel werd in 2012 opgericht om celproliferatiekenmerken van MG te evalueren bij P53 knock-out muizen (trp53-/- muizen)23. Er werd aangetoond dat gekweekte MG hun gliale kenmerken behouden (d.w.z. expressie van S100β-, Pax6- en Sox2-eiwitten geëvalueerd via immunofluorescente etikettering), en dat ze lijken op in vivo MG (microarray van FACS-gezuiverde MG)23. Kort daarna werden gliale mRNA en eiwitexpressie gevalideerd en bevestigd in een andere benadering met behulp van virale vectoren20. Een paar jaar later werd bevestigd dat de overgrote meerderheid van de cellen in deze culturen MG zijn met behulp van de MG-specifieke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mouse24. Bovendien toonde kwantificering van de set miRNA's in zowel FACS-gezuiverde MG als gekweekte primaire MG aan dat de niveaus van MG miRNA's (mGLiomiRs) niet veel variëren in gekweekte MG tijdens de groeifase. Langgerekte kweekperioden veroorzaken echter veranderingen in miRNA-niveaus en bijgevolg in mRNA-niveaus en eiwitexpressie, aangezien miRNA's translationele regulatoren zijn25.
In 2013 werd dit MG-cultuurmodel gebruikt om een verscheidenheid aan transcriptiefactoren te testen met betrekking tot hun vermogen om MG te herprogrammeren in retinale neuronen20. Ascl1 bleek een zeer robuuste en betrouwbare herprogrammeringsfactor te zijn. Overexpressie van Ascl1 via virale vectoren veroorzaakte morfologische veranderingen, expressie van neuronale markers en de verwerving van neuronale elektrofysiologische eigenschappen. Wat nog belangrijker is, de inzichten en resultaten verkregen uit deze eerste in vitro experimenten werden met succes overgebracht naar in vivo toepassingen22,26 wat aantoont dat primaire MG-culturen een solide en betrouwbaar hulpmiddel vormen voor initiële factorscreenings en evaluatie van gliale kenmerken voorafgaand aan in vivo implementatie.
Een paar jaar geleden werd aangetoond dat het met de hersenen verrijkte miRNA miR-124, dat ook sterk tot expressie komt in retinale neuronen, Ascl1-expressie kan induceren in gekweekte MG21. Ascl1-expressie in levende cellen werd gevisualiseerd via een Ascl1 reportermuis (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Een reportermuis is een genetisch gemanipuleerde muis waarvan een reporter-gen in zijn DNA is ingebracht. Dit reporter-gen codeert voor een reporter-eiwit, dat in deze studie tdTomato is, een rood fluorescerend eiwit. Dit reporter-eiwit rapporteert de expressie van een gen van belang, in dit geval Ascl1. Met andere woorden, cellen die Ascl1 tot expressie brengen, worden rood. Aangezien Ascl1 alleen tot expressie komt in RPC's9, maakt deze Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl muis het mogelijk om mg-conversie te volgen in Ascl1-expresserende RPC's, wat betekent dat converterende cellen rode fluorescerende tdTomato-reportereiwitten tot expressie zullen brengen. Dit is onomkeerbare etikettering omdat het DNA van deze cellen is veranderd. Bijgevolg zal elke daaropvolgende neuronale differentiatie worden gevisualiseerd omdat het tdTomato-label in differentiërende cellen blijft. Als Ascl1-expressie mg-afgeleide RPC's (met tdTomato-label) differentiëren in neuronen, zullen deze neuronen nog steeds hun rode label hebben. Deze muis maakt daarom niet alleen de etikettering van MG-afgeleide RPC's mogelijk voor live-cell imaging, maar maakt ook fate mapping en lineage tracing van deze MG-afgeleide (rode) RPC's mogelijk. Meer recent werd de set miRNA's in RPC's geïdentificeerd en werden MG-culturen van Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter-muizen gebruikt om het effect van deze miRNA's op herprogrammeringscapaciteit en efficiëntie te screenen en te testen27. Eén kandidaat, de RPC-miRNA miR-25, bleek in staat om gekweekte MG te herprogrammeren in Ascl1-expressie (Ascl1-Tomato+) cellen. Deze geherprogrammeerde cellen nemen in de loop van de tijd neuronale kenmerken aan, waaronder neuronale morfologie (kleine somata en korte of lange fijne processen), expressie van neuronale transcripten gemeten via scRNA-Seq, evenals expressie van neuronale eiwitten gevalideerd via immunofluorescente etikettering27.
Hier beschrijft het protocol hoe MG te kweken en te transfecteren van P12-muizen aangepast van het vorige werk 21,24,27. Gekozen voor dit protocol is het eerder genoemde miRNA miR-25, een miRNA dat sterk tot expressie komt in RPC's, met lage expressieniveaus in MG of retinale neuronen. Om miR-25 te overexpressie te geven, worden murine miR-25-mimiek, d.w.z. kunstmatige miRNA-moleculen gebruikt. Als controle worden mimics van een miRNA van Caenorhabditis elegans gekozen, die geen functie hebben in zoogdiercellen. Visualisatie van de omzetting van MG in RPC's werd bereikt via de RPC reporter muis (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), een muis met gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stammen). Deze kweek kan echter worden uitgevoerd met alle muizenstammen, inclusief wildtype stammen. In de afgelopen jaren is het oorspronkelijke protocol aangepast om de duur van de groeifase en de algehele kweekperiode te verminderen en een robuustere gliacelstatus te garanderen en de mate van cellulaire degeneratie, die optreedt in langdurige kweekperioden, te minimaliseren. Het reguliere transfectietijdvenster werd ook verlengd van 3 uur naar 2 dagen. Zoals eerder vermeld, hoewel het huidige protocol MG-culturen beschrijft als een hulpmiddel voor regeneratiestudies, is de methode niet alleen nuttig voor het testen van herprogrammeringsfactoren, maar kan deze ook worden aangepast voor andere toepassingen, waaronder studies over MG-migratie of proliferatief gedrag, letsel / celschade gerelateerde paradigma's en / of de identificatie van onderliggende mechanismen en paden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het SUNY College of Optometry.
OPMERKING: Dit kweekprotocol bestaat uit drie fasen: groei, transfectie en conversiefase. Een samenvatting van het algemene protocol met de tijdlijn wordt gegeven in figuur 1.
1. Bereiding van media en alle benodigde reagentia
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een A2- of B2-bioveiligheidskast (BSC). Tijdens de groeifase wordt een hoog serum groeimedium gebruikt dat bestaat uit een basaal neuronaal medium aangevuld met epidermale groeifactor (EGF). Voor de conversiefase wordt een neurofysiologisch basaal medium met een laag serum, aangevuld met neuronale supplementen, gebruikt om neuronale differentiatie en overleving te garanderen.
- Bereid groeimedium voor (gebruikt tijdens de groeifase) door 200 ml basaal neuronaal medium aan te vullen met 20 ml foetaal runderserum (FBS, 10%), 1 ml L-glutamine (0,5%), 2 ml penicilline / streptomycine (1%) en 2 ml N2-supplement (1%). Voer steriele filtratie uit (filtereenheden met een poriegrootte van 0,22 μm). Verwarm het medium voor gebruik voor in een metalen kraalbad van 37 °C.
- Bereid neuronaal medium (gebruikt tijdens de conversiefase) volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) door 100 ml serumvrij neurofysiologisch basaal medium aan te vullen met 2 ml B27 neuronaal supplement (2%), 1 ml N2-supplement (1%), 20 μL 100 ng / ml hersengeoduceerde neurotrofe factor (BDNF, reconstitute in 0,1% runderserumalbumine (BSA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, eindconcentratie 20 ng/ml), 20 μl van 100 ng/ml van gliacellen afgeleide neurotrofe factor (GDNF, reconstituet in steriele Hanks' Balanced Salt Solution [HBSS], eindconcentratie 20 ng/ml), 500 μl van 100 mg/ml dibutyryl-cAMP (reconstituet in DMSO), 70 μl ascorbinezuur (reconstituet in steriel PBS) en 1,5 ml penicilline/streptomycine. Voer steriele filtratie uit (filtereenheden met een poriegrootte van 0,22 μm). Voorverwarm medium voor gebruik in een metalen kraalbad van 37 °C.
OPMERKING: Deze media kunnen gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Reconstitueer Papaïne, DNase I en Ovomucoïde reagentia die nodig zijn voor retinale dissociatie volgens het protocol van de fabrikant. Aliquot 750 μL Papaïne in steriele buizen van 1,5 ml, 75 μL DNase I in steriele buisjes van 0,6 ml en 750 μL ovomucoïde proteaseremmer in buisjes van 2 ml. Vries Papaïne en DNase I aliquots in bij -20 °C en bewaar ovomucoïde aliquots bij 4 °C om afbraak van de reagentia te voorkomen. Ontdooi bij kamertemperatuur vlak voor gebruik.
OPMERKING: Papaïne, DNase I en Ovomucoid zijn te vinden in een kit genaamd Papain Dissociation System (zie Tabel van materialen). - Poly-L-ornithine (Poly-O) en Laminine reconstitueren voor coverslipcoating als immunofluorescente etikettering wordt uitgevoerd volgens de instructies van het gegevensblad (Poly-O: 0,1 mg/ml in steriel water; Laminine: verdun 1,2 mg / ml na 1:50 in DMEM). Aliquot Poly-O en Laminin (2,5 ml) en vries aliquots in bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur vlak voor gebruik.
OPMERKING: Stap 1.4. is alleen vereist als immunofluorescente etikettering en laserscanmicroscopie wordt uitgevoerd.
2. Muizen en weefselextractie
OPMERKING: Voor deze herprogrammeringsstudies is de Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl muis gemaakt door een Ascl1CreERT muis (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) te kruisen met een tdTomatoSTOPfl/fl muis (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Deze muis heeft een gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stam). Het genotype van deze muis is weergegeven in figuur 1A. Alle stammen kunnen voor dit protocol worden gebruikt.
- Draag handschoenen en ontsmet de werkruimte, inclusief dissectiemicroscoop en alle fijne gereedschappen (Dumont # 5 fijne en Dumont # 7 gebogen tang, fijne schaar en Vannas-schaar) met 70% ethanol. Ontsmet een 10 cm siliconen gecoate zwarte dissectieschaal door deze gedurende 20 minuten bloot te stellen aan UV-licht.
- Bereiding van gerechten en borden voor weefselextractie
- Bereid een plaat met 24 putten voor oogverzameling en monsterscheiding (twee ogen per muis in één putje, gelabeld met muis-ID's) met ~ 1 ml koude HBSS (4 °C) per putje. Leg de 24-well plaat op ijs.
- Vul een steriele petrischaal van 10 cm (om te wassen) en de ontsmette, met siliconen gecoate dissectieschaal met enkele ml koude HBSS (4 °C) om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig bedekt is met HBSS.
- Bereid een steriele buis van 1,5 ml met 1 ml 70% ethanol.
- Bereid een kweekplaat met 12 putten voor door de plaat te labelen met kweeknummer, datum, stam en alle vereiste informatie.
- Euthanaseer P12-muizen met behulp van een goedgekeurde methode.
- Oogverwijdering
- Houd de muiskop voorzichtig met de duim en wijsvinger rond het oog.
- Gebruik Dumont #7 gebogen tang, ga voorzichtig achter de oogbol en klem de oogzenuw. Haal voorzichtig het oog eruit.
OPMERKING: Als volwassen muizen worden gebruikt, gebruik dan geen gebogen tang en trek niet aan het oog. Knip in plaats daarvan voorzichtig rond de oogbol met een fijne schaar; snijd de oogzenuw door, maar snijd het oog zelf niet door. Gebruik een tang om de oogbol voorzichtig te verwijderen.
- Oogbolreiniging
- Dompel de oogbol kort in een ethanolhoudende buis om overdracht van bacteriën van het dier te voorkomen.
- Was de oogbol kort in de petrischaal van 10 cm voordat u deze in de 24 putplaat op ijs plaatst.
- Herhaal stap 2.4 en 2.5 voor de andere ogen. Houd de putplaat tijdens het proces op het ijs. Plaats twee ogen van één dier in de dissectieschaal die onder een dissectiemicroscoop met een lichtbron wordt geplaatst.
- Retina-extractie
- Fixeer één oogbol door de oogzenuw en het omliggende bindweefsel rond de sclera te grijpen met Dumont #5 fijne tang en druk deze voorzichtig tegen de dissectieschaal (hoornvlies naar boven).
- Maak een gat in het midden van het hoornvlies met behulp van een naald van 30 G om de Vannas-schaar gemakkelijker toegankelijk te maken.
- Ontleed het hoornvlies rond het ciliaire lichaam met een Vannas-schaar en verwijder hoornvlies, lens, iris en glasachtig lichaam voorzichtig met Dumont # 5 fijne tang. Figuur 2A illustreert een oogschelp met het netvlies erin.
- Ontleed de sclera met een Vannas-schaar totdat de oogzenuw is bereikt. Klem de oogzenuw vast en haal het netvlies voorzichtig tevoorschijn met een dumont #5 fijne tang.
- Gebruik een tweede paar Dumont #5 fijne tangen om tegen het netvlies te duwen en het glasvochtlichaam volledig te verwijderen. Figuur 2B illustreert twee geëxtraheerde netvliezen.
- Overbrengen en wassen
- Snijd ongeveer 2,5 cm van de punt van een steriele transferpipet om de diameter te vergroten. Gebruik deze tip om hele netvliezen op te pakken (op te zuigen) zonder het weefsel te beschadigen.
- Breng de netvliezen over in een nieuwe steriele petrischaal met koude HBSS (4 °C) en schommel de schaal (heen en weer, links en rechts).
- Gebruik de transferpipetpunt en duw de netvliezen voorzichtig rond om retinale pigmentepitheelcellen (RPE) af te spoelen.
OPMERKING: Als alternatief kan het hele netvlies met lens en glasachtig lichaam uit de oogschelp worden verwijderd. Vervolgens kunnen de lens en het glasachtig lichaam van het geëxtraheerde netvlies worden verwijderd. Als het netvlies is gescheurd, zorg er dan voor dat u alle stukken verzamelt voor dissociatie; anders zullen er onvoldoende hoeveelheden weefsel zijn om confluente cellagen te laten groeien.
- Plaats het geïsoleerde netvlies onmiddellijk in een nieuwe, schone put van de 24-well plaat gevuld met 1 ml HBSS. Houd de 24-well plaat op het ijs tijdens het dissectieproces.
- Herhaal stap 2.7-2.9 om het tweede netvlies te isoleren.
3. Retina dissociatie
OPMERKING: Alle volgende stappen (tot de celoogst) moeten worden uitgevoerd in een A2- of B2-bioveiligheidskast (BSC).
- Bereid het papaïne/DNase I dissociatiemengsel als volgt.
- Voeg voor zes netvliezen 75 μL DNase I toe aan de buis met 750 μL Papaïne (vanaf stap 1.3) en meng voorzichtig (dissociatiemengsel).
- Voor individuele monstervoorbereiding die nodig is voor dit protocol, splitst u het totale volume van 825 μL in drie aliquots: 275 μL van het mengsel in één buis van 1,5 ml per muis (twee netvliezen). Bereken de benodigde hoeveelheden DNase I en Papain dienovereenkomstig.
OPMERKING: Maximaal zes netvliezen kunnen worden gedissocieerd in één tube Papaïne / DNase I-mengsel. Individuele monstervoorbereiding resulteert echter in minder klonten en een betere celgroei dan in gecombineerde monsters.
- Breng twee netvliezen over naar het papaïne/DNase I-dissociatiemengsel. Gebruik een transferpipet met een vergrote tipdiameter (stap 2.8.1), pak de netvliezen op, wacht tot de netvliezen zich aan de onderkant van de punt nestelen en laat vervolgens de netvliezen zonder overmatig HBSS los in de buis met papaïne/DNase I-mengsel.
- Plaats op een nutator en incubeer deze gedurende 10 minuten in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
- Dissociëer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren (ongeveer 20-30 keer) met een pipet van 1 ml. Nadat cellen zijn gedissocieerd (d.w.z. resulterend in een homogene oplossing zonder brokken), voegt u 275 μL ovomucoïde proteaseremmer uit de Papain Dissociation Kit toe om de Papain te neutraliseren. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Als zes netvliezen werden gedissocieerd in 825 μL Papaïne/DNase I-mengsel, is 825 μL ovomucoïde vereist. - Centrifugeer het mengsel bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Voeg epidermale groeifactor (EGF, 1 μL per 1 ml van het groeimedium, gereconstitueerd bij 200 μg/ml in PBS) toe aan het berekende volume groeimedium (1 ml per muis) voorverwarmd bij 37 °C.
OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen de proliferatiemarker 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), evenals 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) of andere vereiste factoren aan het begin van de kweekperiode worden toegevoegd. - Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge. Raak de pellet aan de onderkant van de buis niet aan.
- Verwijder het supernatant voorzichtig en volledig. Resuspendeer de celpellet met 500 μL EGF-aangevuld groeimedium.
- Breng de celsuspensie over in een put van de gelabelde 12-well plaat (figuur 2C). Spoel de buis af met nog eens 500 μL van het met EGF aangevulde groeimedium en voeg deze toe aan de put (totaal volume van 1 ml per putje).
- Herhaal stap 3.8 en 3.9 met alle andere voorbeelden.
- Schommel de putplaat drie keer voorzichtig (heen en weer; links en rechts). Plaats de plaat in de incubator (37 °C, CO2).
OPMERKING: Als transgene muizen worden gebruikt, voer dan genotypering uit voor elk dier (figuur 2D). Identificeer Cre-recombinase positieve en negatieve muizen en label de plaat dienovereenkomstig. Voor dit protocol werden alleen cellen van Cre-recombinasepositieve reportermuizen gebruikt voor de volgende stappen. Cellen van Cre-negatieve monsters worden ingevroren en gebruikt voor andere toepassingen.
4. Groeifase
OPMERKING: De groeifase duurt ongeveer 4-5 dagen (figuur 1B). Voor het toevoegen van vloeistoffen aan putten die cellen bevatten, moet de pipet naar de wand van de put wijzen en moet de vloeistof langzaam worden vrijgegeven om celloslating te voorkomen. Pipetteer niet direct op de cellen.
- Verwijder een dag na dissociatie het medium en voeg 1 ml vers met EFG aangevuld groeimedium toe.
- Verwijder op dag 3 het medium en voeg 1 ml HBSS (kamertemperatuur) toe om celresten te verwijderen. Schommel zachtjes heen en weer van links naar rechts. Verwijder HBSS, herhaal de wasstap en voeg 1 ml voorverwarmd EGF-aangevuld groeimedium toe.
- Controleer de cellen elke dag en evalueer hun groeistatus totdat de cellen 90% -100% samenvloeiing bereiken. Figuur 3 toont een voorbeeld van goede MG-groei in de loop van de tijd. Controleer op mogelijke besmetting of celdood (aanvullende figuur 1). Gooi besmette culturen weg.
OPMERKING: Als u de celstatus wilt controleren en opnemen, maakt u afbeeldingen met verschillende vergrotingen met behulp van een lichtmicroscoop met een aangesloten camera en 4x, 10x of 20x objectieven. In deze studie wordt een fluorescentiemicroscoop gebruikt.
5. Bereiding van coverslips met poly-L-ornithine (Poly-O) en Laminin-vacht
OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als immunofluorescente etikettering en confocale laserscanmicroscopie worden uitgevoerd. Ronde glazen afdekplaten (12 mm diameter) zijn vereist voor een goede beeldvorming. Het coatingprotocol is ook te vinden in de neuronale medium datasheet (zie Tabel van materialen).
- Plaats steriele coverslips voorzichtig in het midden van elke put van een 24-well plaat met behulp van steriele Dumont #2AP tang.
LET OP: Plaats coverslips in het midden van de put. Het plaatsen van coverslips dicht bij de wand van een put zal oppervlaktespanningsproblemen veroorzaken voor de volgende stappen. - Ontdooi een 2,5 ml Poly-O aliquot bij kamertemperatuur en plaats er 100 μL van in het midden van elke coverslip.
- Incubeer de putplaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C.
- Verwijder Poly-O en was de put met de coverslip drie keer met ~1 ml steriel water.
- Laat de putplaat een nacht drogen in de BSC. Ontdooi 2,5 ml Laminin bij 4 °C 's nachts.
- Voeg de volgende ochtend 100 μL Laminin toe in het midden van elke coverslip en incubeer gedurende 4 uur in een incubator van 37 °C.
- Verwijder de Laminin voorzichtig en volledig.
- Houd de plaat op 4 °C als het passeren niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.
LET OP: De gecoate coverslips in geprepareerde platen kunnen enkele dagen bij 4 °C worden bewaard.
6. Celpassage om neuronale overlevenden te verwijderen
OPMERKING: Celpassage is nodig om neuronale cellen te verwijderen, niet om de celpopulatie te vergroten. Glia delen slechts een paar keer en zullen na passage niet verder groeien. Verdun de celsuspensies niet. De cellen van een confluente put van een 12-well plaat kunnen worden verdeeld over een put van een 12-well plaat of twee putten van een 24-well plaat. Wanneer gecoate coverslips worden gebruikt, is slechts ongeveer een derde van de coverslip gecoat. Daarom kunnen zes coverslips in een 24-well plaat, met confluente cellen (~ 80% -90%) worden verkregen uit één put van confluente cellen van een 12-well plaat. Andere verhoudingen kunnen ook worden gekozen om de celdichtheid te verhogen of te verlagen. Voor dit protocol wordt één Cre+ reportermuis gebruikt [één experiment, twee behandelingen: miR-25 of control-miR; technische replicaties n = 3 (drie coverslips per behandeling), biologische replicaat n = 1]. Het aantal technische en biologische replicaties kan verschillend worden gedefinieerd, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
- Controleer of de cellen 90%-100% confluent zijn (ook aan de rand van de put; Figuur 3E,F).
- Verwijder het medium en voeg 1 ml HBSS (kamertemperatuur) toe om te wassen. Schommel de plaat voorzichtig (heen en weer, links en rechts). Verwijder HBSS volledig.
- Voeg 500 μL van een voorverwarmde trypsinehoudende oplossing (voorverwarmd bij 37 °C in een metalen kralenbad) toe om de cellen van de put los te maken. Schommel zachtjes (heen en weer, van links naar rechts) en incubeer gedurende 2 minuten in een incubator van 37 °C.
- Verplaats de plaat van de incubator naar BSC. Tijdens het kantelen, aspirateer de trypsine-bevattende oplossing en verspreid deze voorzichtig en langzaam over de put meerdere keren totdat de cellen volledig loskomen. Houd de plaat tegen het licht en zorg ervoor dat er aan de onderkant geen cellen achterblijven.
- Breng deze celsuspensie over in een steriele buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet voorzichtig door toevoeging van 600 μL (100 μL per putje voor 6 putjes/coverslips) voorverwarmd groeimedium (aangevuld met EFG; 1:1000). en pipetteren op en neer ~ 30-40 keer.
OPMERKING: De cellen kunnen op dit moment worden ingevroren bij -80 °C of in vloeibare stikstof en ontdooid volgens standaardprotocollen voor het ontdooien van cellijnen. Als cellen worden ingevroren, worden ze niet geresuspendeerd in EFG-aangevuld medium (groeimedium). Ze worden geresuspendeerd in basismedium (zonder EFG) en vriesoplossing (1/1-verhouding). In de stappen 6.1.1 tot en met 6.6.2 worden de stappen beschreven voor het bevriezen van de cellen. Als er geen cellen zijn bevroren, gaat u verder met stap 6.7.- Bereid de vriesoplossing door 100 μL DMSO en 400 μL FBS (totaal volume van 500 μL per put/monster) te mengen.
- Resuspendeer de celpellet in 500 μL voorverwarmd groeimedium. Voeg de celsuspensie toe aan 500 μL DMSO/FBS-vriesoplossing (totaal volume van 1 ml). Bewaar buisjes op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt. Vries cellen in bij -20 °C gedurende 1 uur en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.
- Zaadcellen door 100 μL van de 600 μL cel/media suspensie (stap 6.6) in het midden van zes gecoate coverslips (zie stap 5) van de 24-well plaat te plaatsen. Plaats het bord voorzichtig in de couveuse en laat de cellen bezinken.
OPMERKING: 100 μL van de 600 μL celsuspensie (geoogst uit één put van een 12-well plaat) zal resulteren in 90% -100% celconfluentie, die nodig is voor transfectie. - Controleer de cellen na 3 uur om te zien of ze zich op de coverslip hebben gevestigd. Voeg 400 μL groeimedium aangevuld met EFG toe.
OPMERKING: Cellen zijn meestal klaar voor transfectie de volgende dag (figuur 3G). Als ze niet samenvloeien (90%-100%), laat ze dan nog een dag staan. Als ze nog steeds niet samenvloeien, gebruik ze dan niet voor transfectie. Als andere downstream-toepassingen worden uitgevoerd, zoals miRNA-profilering, RNA-Seq, RT-qPCR of western blot, moeten cellen worden doorgegeven aan 12-wellplaten (1: 1-verhouding; geen plaatbehandeling vereist) en geoogst voor RNA / eiwitextractie.
7. Transfectie
OPMERKING: De transfectiefase bestaat uit een 3 h-fase in transfectiemedium alleen (transfectieprocedures worden beschreven in het transfectiehandboek dat bij het transfectieregens wordt geleverd) en een langwerpige fase waarin transfectiereagens en miRNA's nog steeds aanwezig zijn, maar neuronaal medium met vereiste supplementen wordt toegevoegd (totale duur is 2 dagen; Figuur 1B). In dit protocol worden zes putten getransfecteerd: drie putten ontvangen het herprogrammerende miRNA miR-25 en drie putten ontvangen het controle-miRNA.
- Controleer of de cellen 90% samenvloeiing hebben bereikt en registreer/ beeld de cellen vóór de transfectie.
- Verwijder het groeimedium en voeg 500 μL HBSS (kamertemperatuur) toe om de cellen te wassen.
- Verwijder HBSS en voeg 400 μL gereduceerd serummedium toe dat wordt gebruikt voor transfecties. Plaats de plaat terug in een incubator van 37 °C.
- Bereid het transfectiemengsel volgens de instructies van het transfectiereagensprotocol van de fabrikant. Maak twee mengsels: transfectiereagensmengsel en miRNA-mengsel (zie figuur 1B ter illustratie).
- Bereid het transfectiereagensmengsel: Voor een 24-wellsplaat zijn 49 μL gereduceerd serummedium en 1 μL transfectiereagens nodig voor één put (50 μL in totaal). Voor zes putten worden 294 μL gereduceerd serummedium en 6 μL transfectiereagens gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren.
- Bereid miRNA-nabootsingsmengsel: Voor een 24-wellsplaat is een totaal volume van 50 μL van het mimische mengsel vereist voor één put. Drie putten krijgen het controle-miRNA en de andere drie putten worden behandeld met miR-25. Voor dit protocol wordt een eindconcentratie van 200 nM gebruikt.
- Voor de miR-25-behandeling (drie putjes) worden 150 μL gereduceerd serummedium en 3 μL miR-25-mimics (100 μM stockoplossing) gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 min.
Voor de controle-mimicsbehandeling (drie putjes) worden 150 μL gereduceerd serummedium en 3 μL control-miRNA-mimics (100 μM stockoplossing) gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 min.
OPMERKING: Het volume van miRNA-nabootsingen is afhankelijk van de verdunningsfactor en de benodigde concentratie (20-500 nM). miRNA-remmers (antagomiRs), of andere moleculen waaronder plasmiden, kunnen ook worden gebruikt. Ook zijn combinaties van moleculen mogelijk om getransfecteerd te worden.
- Voor de miR-25-behandeling (drie putjes) worden 150 μL gereduceerd serummedium en 3 μL miR-25-mimics (100 μM stockoplossing) gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 min.
- Combineer miRNA-nabootsingsmengsel en transfectiereagensmengsel. Meng voorzichtig door langzaam en grondig te pipetteren door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (volgens de instructies van de fabrikant).
- Voeg het bovenstaande transfectiemengsel druppelsgewijs en langzaam bovenop de cellen toe, dicht bij het mediaoppervlak in de put met behulp van een pipet van 20 μL. Schommel de plaat zachtjes (heen en weer, van links naar rechts).
- Incubeer gedurende 3 uur in een incubator van 37 °C.
- Voeg na 3 uur neuronaal medium toe aan de putten (500 μL per put) aangevuld met 4-Hydroxytamoxifen (5 mM stam gereconstitueerd met 2,58 ml ethanol, 250 nM eindconcentratie) om het Cre-recombinase en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU, 10 mM stamoplossing gereconstitueerd met 2 ml DMSO, 1 μM eindconcentratie) te activeren om de celproliferatie te volgen.
LET OP: 4-Hydroxytamoxifen en EdU staan bekend als kankerverwekkende stoffen, teratogenen en mutagene stoffen voor de mens. Lees het veiligheidsinformatieblad voor gebruik en draag handschoenen, een bril en een laboratoriumjas. Reconstitueer beide reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Inhaleer de stof/het mengsel niet. Sluit na gebruik goed. Afvalmateriaal moet worden verwijderd volgens nationale en lokale voorschriften. Was handen en gezicht na het werken met de stof. - Incubeer gedurende 2 dagen in een incubator van 37 °C (figuur 1B).
8. Celconversie
OPMERKING: De celconversiefase heeft een duur van ongeveer 5-6 dagen (figuur 1B), maar langere perioden zijn mogelijk.
- Controleer cellen dagelijks op succesvolle inductie van tdTomato-expressie, mogelijke celdood en/of besmetting. De celdichtheid verandert niet (figuur 4). Eerste vage rode fluorescerende cellen kunnen 1 dag na de behandeling met 4-Hydroxytamoxifen worden waargenomen. Een fluorescerende microscoop is nodig om de cellen te bewaken en in beeld te brengen.
OPMERKING: In deze studie wordt een fluorescentiemicroscoop gebruikt voor live beeldvorming. Foto's worden gemaakt met 4x, 10x of 20x objectieven. - Verwijder twee dagen na transfectie het medium en voeg 500 μL voorverwarmd neuronaal medium toe, aangevuld met 4-Hydroxytamoxifen en EdU in elk putje.
- Vervang het medium om de dag door een vers medium totdat de cellen geoogst zijn.
- Maak live beelden voor evaluatie en beoordeling van het aantal rode fluorescerende (Ascl1-expressie) cellen en hun morfologische veranderingen (figuur 4 en figuur 5A-C).
9. Celoogst: fixatie voor immunofluorescente etikettering
OPMERKING: Cellen kunnen worden geoogst voor andere downstream-toepassingen, waaronder bulk of scRNA-Seq, RT-qPCR of western blot.
- Verwijder het medium en voeg 500 μL koud HBSS (4 °C) per putje toe en schommel de plaat voorzichtig (heen en weer, van links naar rechts). Verwijder HBSS.
- Fixeer de cellen door 500 μL 2% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voer immunofluorescente etikettering uit volgens vastgestelde protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft hoe MG uit de retinas van P12-muizen kan groeien en hoe deze cellen met miR-25 kunnen worden geherprogrammeerd tot retinale neuronen met behulp van de Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermuis. Deze methode werd gebruikt in eerder werk dat in detail andere geschikte miRNA's (mimics of remmers, als enkele moleculen of in combinatie) rapporteerde om MG te herprogrammeren in RPC die vervolgens neuronale celkenmerken aannemen27. Deze methode is aangepast om culturen sneller te laten groeien en zo de cellulaire veranderingen veroorzaakt door de kunstmatige omgeving in de loop van de tijd te minimaliseren 24,28,29.
Retinale dissociatie en groeifase van primaire MG-culturen
De eerste MG kan al op dag één in vitro worden opgemerkt met behulp van een lichtmicroscoop. MG hebben een buisvormige, langwerpige vorm en lichtgrijze cellichamen (figuur 3A-D, rode pijlpunten). De meeste van hen zijn echter bedekt met cellulair puin in deze vroege stadia. MG van twee netvliezen van één muis, gekweekt in één putje van een 12-well plaat, bereiken 90% -95% samenvloeiing binnen 4-5 dagen (figuur 3E, F). Na verloop van tijd zal al het neuronale puin worden opgeruimd en zal een dichte cellaag aanwezig zijn. Cellen zijn niet klaar voor passage als de bodem van de put niet volledig samenvloeit. Passage mag echter niet later dan 6 dagen in vitro worden gedaan, omdat de glia na verloop van tijd hun gliale kenmerken in cultuur verliezen. Vóór transfectie of een andere behandeling moeten cellen worden gecontroleerd op dichtheid en vitaliteit. Transfectie mag alleen worden uitgevoerd op 90%-95% confluentcellen (figuur 3G). Voor immunofluorescente etikettering en confocale microscopieanalyse moeten cellen worden gezaaid op gecoate coverslips.
Vroege en late fase van de celconversieperiode
Al 15 uur na transfectie en 4-Hydroxytamoxifenbehandeling beginnen de eerste cellen zwakke rode fluorescentie tot expressie te brengen, d.w.z. tdTomato rood fluorescerend reportereiwit aangedreven onder de (geactiveerde) Ascl1 promotor. Ascl1-expressiecellen worden nu verder aangeduid als Ascl1-Tom+ cellen. Robuustere Ascl1-Tom-expressie kan 2 dagen na transfectie worden waargenomen met toenemende rode fluorescentie in de loop van de tijd (figuur 4). Het herprogrammeringseffect wordt rond 2 dagen zichtbaar in cultuur met veel Ascl1-Tom+ cellen per veld gevonden in de herprogrammerende miRNA-behandeling: hier weergegeven voor controle-miR en miR-25 (respectievelijk Figuur 4B-B''' en Figuur 4C-C'''). In beide behandelingen zijn Ascl1-Tom+ cellen nog vrij rond en relatief groot, met een meer glia/voorlopercelachtige morfologie. Bovendien heeft de inductie van de rode fluorescerende reporter geen invloed op de celdichtheid van de cultuur (nog steeds 90%-95% confluent).
Drie tot vijf dagen na transfectie (figuur 4A en figuur 5A) wordt de toename van het aantal Ascl1-Tom+ cellen duidelijker in de met miR-25 behandelde putten (figuur 5B-D) met een viervoudige toename van het aantal na miR-25-behandelingen in vergelijking met controles. Bovendien worden de eerste morfologische veranderingen zichtbaar. Deze veranderingen omvatten vermindering van de cel somagrootte en de ontwikkeling van fijne processen. Terwijl in controleomstandigheden de overgrote meerderheid van de cellen groot en plat is (glial / voorloperachtig, figuur- 5B-B''), verschijnen veel cellen met kleine kernen en verschillende kleine processen die lijken op retinale neuronen in de miR-25-behandeling (figuur- 5C-C''). Deze neuronale cellen vertegenwoordigen ongeveer 70% van de totale Ascl1-Tom-populatie (15% in controlebehandeling; Figuur 5E). Cellen zijn minder dicht door celconversie (kleinere cellen hebben minder ruimte nodig). Interessant is dat deze neuronaal-achtige cellen zelfs kleine netwerken lijken te vormen (figuur 5C''). Op dit moment kunnen cellen worden geoogst voor immunofluorescente etikettering om de neuronale identiteit te bevestigen.
Bevestiging van neuronale identiteit
Cellen worden gelabeld met antilichamen tegen microtubule-geassocieerd eiwit 2 (Map2), een marker voor neuron-specifieke cytoskeletale eiwitten30,31, en tegen Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) om neuronale identiteit te valideren32,33. Beide markers werden ook gebruikt in eerdere herprogrammeringsstudies 21,27. Otx2 is een transcriptiefactor gevonden in RPC's 34,35,36, volwassen bipolaire cellen 34,35,37,38,39 en fotoreceptoren 35,36,37,38,40 . DAPI nucleaire etikettering wordt gebruikt om de culturen tegen te gaan. Immunofluorescente etikettering toont weinig tot afwezige Map2- of Otx2-expressie in controleomstandigheden (figuur 6A-A''',C). miR-25 behandelde monsters hebben echter veel Map2+ en Otx2+ cellen (Figuur 6B-B'''). Kwantificering van confocale beelden laat zien dat na miR-25 overexpressie ongeveer 40 neuronale cellen per veld aanwezig zijn in vergelijking met vijf neuronale cellen per veld in controles (Figuur 6C, veldgrootte: 630 μm x 630 μm). De foto's zijn gemaakt met 20x objectief. Deze neuronale cellen vormen ongeveer 70% van de totale Ascl1-Tom+ celpopulatie van de met miR-25 behandelde monsters (controle ~20%, figuur 6D). Alle neuronale ascl1-Tom+ cellen waren Map2+ en Otx2+, wat de neuronale identiteit bevestigt. Bovendien was het absolute aantal Otx2+ en Map2+ cellen hoger na miR-25 behandelingen in vergelijking met control-miRNA behandeling (miR-25: 60 cellen per veld; control-miR: 10 cellen per veld; Figuur 6E).
Alles bij elkaar tonen de resultaten aan dat MG-culturen kunnen worden gekweekt en geherprogrammeerd met miRNA's. miR-25 suppletie induceert Ascl1-Tom expressie in primaire MG. Veel MG worden omgezet in RPC's die een neuronale morfologie aannemen en de neuronale markers Map2 en Otx2 na een paar dagen tot expressie brengen.
Figuur 1: Experimenteel ontwerp en tijdsverloop van een primaire Müller-gliacultuur. (A) Schematische weergave van de Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-muis, een retinale voorloperreportermuis die wordt gebruikt om de omzetting van Müller-glia (MG) in retinale voorlopercellen (RPC's) te volgen. (B) Tijdsverloop van de kweekperioden bestaande uit groeifase (blauw, 0-4/5 dagen in vitro, div), transfectiefase (paars, 5/6-7/8 div) en MG-conversiefase (geel, start 7/8 div). Groeifase: gedissocieerde netvliezen (twee netvliezen van één muis) worden gekweekt in één putje van een 12-well plaat in een groeimedium. Rond dag 4/6 worden cellen gepasseerd in een 24-well plaat die gecoate coverslips bevat. Transfectiefase: 5-7 div (1 dag na passage) cellen worden getransfecteerd met miRNA's gedurende 2 dagen in transfectiemedium. Cre-recombinase wordt geactiveerd met 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). Celproliferatie wordt gevolgd met EdU. Mg conversie fase start 1 dag na transfectie. Cellen worden nu gekweekt in het neuronale medium tot de oogst (6-7 dagen na transfecties, dpTF). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Retinale dissociatie en genotypering. (A) Oogschelp met verwijderd hoornvlies, lens, iris en glasvocht. (B) Geïsoleerde netvliezen; retinale pigmentepitheelcellen (RPE) worden verwijderd na een grondige wasbeurt. (C) 12-well plaat met gedissocieerde netvliezen (twee netvliezen per put). (D) Uitsnede van een genotyperingsgel afbeeldingsvoorbeeld. Genotypering is nodig om de muizen te identificeren die Ascl1-gedreven Cre-recombinase-expressie hebben en zal worden gebruikt voor het volgen van celconversie. Schaalbalken: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Primaire Müller-glia tijdens de groeifase. (A) Tijdsverloop van kweekperioden tijdens de groeifase (0-4/5 dagen in vitro (div)) blauw gemarkeerd. (B-G) Live beelden (fase) van Müller glia (MG) tijdens de groeifase na 1 div (B), 2 div na de mediumverandering (C), 3 div (D), 4 div vóór passage (E,F) en 5 div, 1 dag na passage en vóór transfectie (G). MG-cellichamen worden aangegeven met rode pijlpunten. Na 3 div zijn culturen 60% -80% confluent (D), na 4-5 div zijn culturen 90% -100% confluent en klaar om te worden gepasseerd (E-F). Na passage op coverslips moeten celculturen 80% -90% confluent zijn voor daaropvolgende transfectie (G). Schaalstaven: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vroege stadia in de Müller glia conversiefase. (A) Tijdsverloop van kweekperioden tijdens de conversiefase gemarkeerd in geel (start 7/8 dagen in vitro (div)). Het tijdstip van analyse in deze figuur wordt aangegeven door de rode ster: 7 div, 2 dagen na transfectie (dpTF). (B-C''') Live beelden van Müller glia (MG) culturen in fase en rode fluorescentie, gecombineerd of enkele rode fluorescentie. Rode fluorescentie visualiseert Ascl1 die MG (tdTomato+, afgekort Ascl1-Tom) tot expressie brengt, 2 dagen na transfectie met ofwel controle-miRNA-mimics (control-miR, B-B''') of miR-25-mimics (C-C'''). Gebieden in B/B' en C/C' worden weergegeven in hogere vergroting in B''/B''', C''/C'''. Schaalbalken 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Eindstadia in de Müller glia conversiefase. (A) Tijdsverloop van kweekperioden tijdens de conversiefase gemarkeerd in geel (start 7/8 dagen in vitro (div)). Het analysetijdstip in deze figuur wordt aangegeven door de rode ster: 10 div, 5 dagen na transfectie (dpTF). (B-C'') Live beelden van Müller glia (MG) culturen in fase en rode fluorescentie, gecombineerd of enkele rode fluorescentie. Rode fluorescentie visualiseert Ascl1 dat MG (tdTomato+, afgekort Ascl1-Tom) tot expressie brengt, 5 dagen na transfectie (pTF) met controle-miRNA-mimics (control-miR, B-B'') of miR-25-mimics (C-C''). Inzetstukken in B'/C' worden weergegeven in een hogere vergroting in respectievelijk B''/C''. (D) Het absolute aantal Ascl1-Tomato+ cellen per veld (10x; 1440 μm x 1080 μm) na controle-miRNA of miR-25 behandeling, 2- en 5-dagen na transfectie (dpTF; n =1, vijf beelden per put worden geteld; gemiddelde ± S.D.). (E) Percentage neuronale ascl1-tomaat+ cellen van totale Ascl1-Tomato+ cellen per veld (10x; 1440 μm x 1080 μm) na controle-miRNA of miR-25 behandeling, 5 dagen na transfectie (5dpTF, n = 1, gemiddelde ± S.D.). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Bevestiging van de neuronale identiteit van geherprogrammeerde cellen. (A-A'''; B-B''') Immunofluorescente etikettering van primaire Müller glia (MG) culturen van muizen 5 dagen na transfectie behandeld met controle-miRNA-mimics (control-miR, A-A''') of miR-25-mimics (B-B'''). Cellen werden gefixeerd met 2% paraformaldehyde (PFA) en geïncubeerd met antilichamen tegen RFP om tdTomato, Map2 en Otx2 te labelen om neuronen te labelen. DAPI nucleaire etikettering (blauw) werd gebruikt om alle celkernen te kleuren. (C-E) Kwantificering (n = 1; vijf afbeeldingen per coverslip worden geteld; gemiddelde ± S.D.) van het absolute aantal Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ cellen per veld (C), percentage Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ cellen van totale Ascl1-Tom+ cellen (D), en het absolute aantal Otx2+Map2+ cellen per veld (E). De resultaten tonen een hoger aantal neuronen in de miR-25-behandeling in vergelijking met controles. Veldgrootte: 630 μm x 630 μm. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Celdood en bacteriële besmetting. (A-A'') Live beelden van Müller glia (MG) culturen 3 div besmet met bacteriën. Inzet 1 in A wordt weergegeven in hogere vergroting in A' en toont atrofische, dode glia. Inzet 2 in A wordt getoond in A'' met levende glia. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe MG kan worden gekweekt uit gedissocieerde netvliezen van muizen voor herprogrammeringsstudies met behulp van miRNA's. Zoals aangetoond en bevestigd in een verscheidenheid aan eerdere studies, is de overgrote meerderheid (80% -90%) van de cellen in deze culturen MG 20,23,24. Deze methode is een zeer robuuste en betrouwbare techniek en de resultaten kunnen gemakkelijk worden gereproduceerd als het protocol correct wordt gevolgd21,27. De succesvolle groei en herprogrammeringsefficiëntie van de cultuur zijn echter afhankelijk van verschillende factoren.
Ten eerste speelt de leeftijd van de muis een belangrijke rol bij succesvolle celgroei. Daarom, als MG-culturen worden gekweekt uit wild-type muizen of transgene muizen die lijken op wilde typen zoals reportermuizen, is de nieuwste leeftijd om confluente MG-monolagen te laten groeien P12. Bij P12 zijn alle retinale neuronen en de MG gedifferentieerd en zijn er geen RPC's meer aanwezig in het netvlies. MG express rijpe MG markers zoals glutamine synthetase of glutamaat aspartaat transporter (GLAST)20,23,41,42. Gekweekte P12 MG kan nog steeds opnieuw in de celcyclus komen wanneer het wordt blootgesteld aan EFG, maar het aantal cycli is beperkt, zij het voldoende om confluente cellagen in vitro te vormen. Toch kan het voorkomen dat zelfs P12 MG niet goed groeit omdat EFG of componenten in het medium kunnen worden afgebroken. Onvolledige dissociatie (brokken) kan ook resulteren in minder of vertraagde MG-groei. Een belangrijke oorzaak voor onvolledige dissociatie is inactivatie van de DNase die ik gebruikte voor retinale dissociatie door harde behandeling van het enzym (snel pipetteren, vortexen, enz.). Zelfs als de cellen goed groeien tot de passage, kunnen cellen na passage minder confluent zijn. Redenen hiervoor kunnen harde behandeling zijn tijdens het passageproces dat leidt tot verhoogde celdood of omdat de cellen te dun zijn gezaaid. Omdat de glia niet veel groeien, moeten cellen in dezelfde verhouding worden geplaatst als gekweekt, niet verdund (in tegenstelling tot passaging-procedures van onsterfelijke cellijnen). Van belang, omdat MG-culturen groeien van het centrum naar de periferie van een put, zullen hogere celdichtheden altijd in het centrum worden gevonden. Het is daarom noodzakelijk om de marges van elke put vóór de passage te controleren om ervoor te zorgen dat de hele put wordt bedekt door cellen. Celconcentratiemetingen moeten worden uitgevoerd om de verwerking van voldoende hoeveelheden cellen te waarborgen.
Bovendien zullen primaire culturen verkregen uit muizen op P6 of jonger geen MG bevatten, omdat MG op het punt staat om op dit moment te rijpen. Dit werd aangetoond via eencellige RNA-seq-analyse43. Immunofluorescente etikettering met volwassen MG-markers op deze leeftijd zal dit ook bevestigen. De fractie van RPC's is echter aanzienlijk op P6. De resultaten moeten daarom zorgvuldig worden geïnterpreteerd. Bovendien zijn markers zoals de intermediaire filamentmarkers vimentine en nestine niet geschikt om primaire MG te identificeren, omdat deze markers ook tot expressie komen in astrocyten 44,45,46, microglia 47,48, endotheelcellen en pericyten 49,50,51,52 , en zijn niet MG-specifiek. GFAP, uitgedrukt in retinale astrocyten maar niet in MG van onbeschadigde netvliezen, is geen goede marker voor gekweekte MG. Hoewel het wordt geupreguleerd in gedissocieerde MG als gevolg van de mechanische schade tijdens dissociatie, wordt het na 3 dagen in cultuur gedownreguleerd28.
Aangezien MG veel RPC-markers deelt, is de veiligste procedure om een robuuste MG-cultuur te garanderen, het gebruik van muizen op P12 of oudere muizen. Hoewel dit protocol culturen beschrijft die zijn verkregen uit P12-muis MG, kan MG voor volwassen muizen worden gekweekt en geherprogrammeerd27. Er moet echter meer weefsel per put worden verguld (vier tot zes netvliezen). Dit komt omdat volwassen glia niet veel delen, zelfs als ze worden blootgesteld aan EGF en 10% serum. Verminderde celcontacten zullen leiden tot celdood en celdegeneratie (uitgerekte cellen, vergrote cellen). Volwassen glia zijn een geweldig hulpmiddel voor co-kweekparadigma's18 en celdichtheid maakt misschien niet zoveel uit in deze toepassingen. Voor downstream-toepassingen zoals transfectie of transductie zijn confluentcellagen echter een vereiste.
Naast verminderde groei kan celdood optreden. Als celdood optreedt zonder duidelijke tekenen, moet mycoplasmabesmetting worden overwogen (mycoplasmagrootte 0,1-0,3 μm) en moet een mycoplasmadetectiekit worden gebruikt. Door elk monster gescheiden te houden (geen monsters te poolen) kan ook het risico op kruisbesmetting worden verminderd. Grotere bacteriën kunnen echter ook van het dier worden overgedragen en kunnen besmetting veroorzaken, ook al wordt al het werk gedaan in een schone, steriele omgeving. Het wordt aanbevolen om de oogbol kort in 70% ethanol te dopen en een grondige wasbeurt in een extra petrischaaltje van 10 cm voordat u het oog ontleedt. Om een succesvolle cultuur te bereiken, is het noodzakelijk om onder steriele omstandigheden te werken, omdat besmetting snel kan gebeuren. Zodra bacteriën, gisten of schimmels / schimmels in een plaat worden gevonden, zelfs als niet alle putten zijn aangetast, gaat de cultuur verloren. Besmettingen zullen celdood veroorzaken (aanvullende figuur 1) en zullen de cellen aantasten, wat resulteert in niet-representatieve gegevens.
Celdood kan ook worden veroorzaakt door reagentia die nodig zijn voor downstream-toepassingen zoals Poly-O (of Poly-D-Lysine) die worden gebruikt om coverslips te coaten. Deze stoffen zijn giftig en grondige wasbeurten zijn vereist voordat Laminin wordt gebruikt. Coverslips moeten aan de bodem van de put blijven plakken en niet in een put drijven. Luchtbellen moeten worden vermeden. Bovendien is een volledige coating met Laminin cruciaal om de celhechting aan de coverslip te garanderen. Gebrek aan Laminine zal ook leiden tot minder celdichtheid en / of celdood.
Voor de identificatie van echte geherprogrammeerde glia moeten reportermuizen en celproliferatiemarkers worden gebruikt die celtracking mogelijk maken, zoals EdU of BrdU. Omdat hele netvliezen zijn verguld, zijn neuronale overlevenden aanwezig in alle culturen. Ze worden echter in de meeste gevallen bijna volledig verwijderd na passage. Niettemin moet EdU (of BrdU) labeling worden uitgevoerd om te valideren dat neuronen afkomstig zijn van prolifererende MG / RPC's en geen neuronale overlevenden zijn (post-mitotisch). De kleine aantallen neuronen die worden aangetroffen in de controles die hier worden gebruikt, zijn neuronale overlevenden.
Interessant is dat een paar Ascl1-Tom + -cellen ook aanwezig zijn in de controlebehandeling met licht toenemende aantallen in de loop van de tijd. Deze cellen kunnen een vrij onrijpe MG-expressie Ascl1 zijn wanneer ze worden geïsoleerd en gekweekt. De fractie van deze Ascl1-Tom+ celpopulatie is echter klein. Bovendien drukken de meeste van deze Ascl1-Tom+ cellen die in de controlebehandeling worden aangetroffen otx2 en/of map2 niet uit en behouden ze een vrij platte celvorm. Er lijkt geen neuronale differentiatie op te treden onder controleomstandigheden. Zeer delicate neuronale cellen die netwerken lijken te vormen, worden pas gevonden na behandeling met miR-25.
Het hier beschreven protocol werd in eerdere studies gebruikt om miRNA's te testen op MG-herprogrammeringvan 21,27 en is de afgelopen jaren enigszins gewijzigd met betrekking tot de putplaten om de glia te laten groeien. Ze worden nu gekweekt in 12-well platen, in plaats van 6-well platen. Confluente monolagen kunnen na 4/5 dagen worden verkregen in 12-well platen (versus 6/8 dagen met 6-well platen) en daarom wordt de totale kweekperiode die leidt tot celverandering / degeneratie verminderd. Het transfectietijdvenster is ook langwerpig. Reguliere transfectieprotocollen hebben een transfectieduur van 3 uur waarna een volledige mediumverandering moet worden uitgevoerd om de overleving van de cel te garanderen. Alle moleculen worden na deze mediumverandering verwijderd. In het huidige protocol werd het tijdvenster verlengd en werd een langere blootstelling aan de miRNA's toegestaan door 50% neuronaal medium (aangevuld met de factoren die nodig zijn voor cre-inductie en celproliferatietracking) toe te voegen aan het transfectiereagensmedium. De cellen waren gezond en er werden geen problemen ondervonden met deze modificatie. Het lijkt erop dat de transfectieresultaten beter zijn met de langgerekte transfectietijd, maar er zijn meer gegevens nodig om die waarneming te bevestigen.
Bovendien worden alle stappen beschreven die nodig zijn voor immunofluorescente etikettering om confocale laserscanmicroscopie uit te voeren. Daarom moet de MG worden doorgegeven op glazen afdekplaten. Omdat de coverslips kleiner zijn dan het oppervlak van een 24-well-plaat, past slechts ongeveer een derde van de cellen die een volledige put van een 24-well plaat zouden bedekken op de gecoate coverslip. Voor andere toepassingen zoals qPCR, RNA-Seq of western blots worden cellen in een verhouding van 1:1 gepasseerd, behandeld en geoogst op het gewenste tijdstip.
Zoals eerder vermeld, kan dit kweeksysteem ook worden gebruikt voor andere toepassingen, bijvoorbeeld om gliaal gedrag te bestuderen, waaronder neuroprotectieve mechanismen, gliose en / of om mRNA, miRNA of eiwitten van gekweekte glia te profileren, vergelijkbaar met de studies die enigszins andere kweekparadigma's of soortengebruikten 11,28,29,54 . Deze toepassingen zouden geen neuronaal medium vereisen om neuronale overleving na herprogrammering te garanderen, noch de toevoeging van EdU om celproliferatie te visualiseren. In plaats daarvan moet een laag serummedium zonder neuronale supplementen worden gebruikt.
Hoewel deze methode robuust en betrouwbaar is, vergelijkbaar met alle primaire kweeksystemen, heeft het beperkingen; Dit zijn een beperkte levensduur van de cellen, progressieve celdegeneratie in de loop van de tijd28, en het feit dat het een 2-dimensionaal, kunstmatig kweeksysteem is dat de fysiologische context niet kan nabootsen met betrekking tot beide, andere retinale celtypen en extracellulaire matrix. Daarom moeten, na het identificeren van topkandidaten en hun meest efficiënte concentraties in MG primaire culturen, retinale explantculturen, een 3-dimensionaal kweeksysteem dat lijkt op het retinale weefsel, worden uitgevoerd. Explantculturen hebben ook beperkte kweekperiodes en cellen in explantaten degenereren ook in de loop van de tijd. Ze maken echter de studie van MG in hun natuurlijke 3-dimensionale omgeving mogelijk en kunnen op verschillende leeftijden worden uitgevoerd die het ontwikkelingsstadium van het dier weerspiegelen 23,32,55,56.
Alles bij elkaar rapporteert deze studie over MG-culturen die worden gebruikt om het potentieel van het RPC-miRNA miR-25 te monitoren om MG te herprogrammeren in neuronale cellen, gevalideerd door immunofluorescente etikettering. Dit protocol werd gebruikt in de vorige werken 21,24,27 en is een huidige in vitro methode om het regeneratieve potentieel van MG te bestuderen. Over het algemeen zijn MG primaire culturen een robuuste techniek en maken reproduceerbare resultaten mogelijk 20,21. Hoewel miRNA-overexpressie voor MG-herprogrammering hier uitsluitend wordt beschreven, kunnen andere factoren zoals kleine moleculen, DNA (plasmiden of verpakt in virale vectoren), antilichamen voor eiwitremming32 of specifieke verbindingen worden gebruikt / getest in MG primaire culturen. Er is ook een breed spectrum van downstream-toepassingen, waaronder miRNA-profilering24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 of western blots20. Bovendien maken MG primaire culturen dagelijkse observatie en bewaking van de cellen mogelijk. Dit kan een aanzienlijk voordeel zijn voor het bepalen van tijdspunten, bijvoorbeeld voor het begin, de duur en/of het einde van een bepaalde reactie of celrespons. Migratie- of proliferatief gedrag en aan letsel/celbeschadiging gerelateerde paradigma's (bijvoorbeeld wereldwijde miRNA-deletie in MG-culturen)32 kunnen worden bestudeerd en geanalyseerd in MG-primaire culturen om onderliggende mechanismen en routes te identificeren. Daarom zijn MG-culturen een zeer krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van MG op moleculair en cellulair niveau voordat ze in in vivo systemen worden geïmplementeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Een patent met enkele van de bevindingen in dit rapport is aangevraagd door de Universiteit van Washington met uitvinders Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl en Thomas A. Reh. Het patent is getiteld ''Methoden en samenstellingen om retinale regeneratie te stimuleren.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Ann Beaton en alle lableden voor hun input over het manuscript. Speciale dank gaat uit naar Drs. Tom Reh, Julia Pollak en Russ Taylor voor het introduceren van MG primaire culturen als een screeningsinstrument voor S.G.W. tijdens postdoctorale training aan de Universiteit van Washington in Seattle. De studie werd gefinancierd door de Empire Innovation Program (EIP) Grant aan S.G.W. en start-upfondsen van SUNY Optometry tot S.G.W., evenals de R01EY032532 award van het National Eye Institute (NEI) aan S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
