Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية للأقسام الجنينية لأسماك الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. من المفيد الكشف عن أنماط التعبير عن جينين في الزرد إذا كان هناك ندرة في الأجسام المضادة.
Abstract
كفقاريات ، تم استخدام الزرد على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية. يشترك الزرد والبشر في التماثل الوراثي العالي ، والذي يسمح باستخدامه كنموذج للأمراض البشرية. تعتمد دراسة وظائف الجينات على الكشف عن أنماط التعبير الجيني. على الرغم من أن الكيمياء الهيستولوجية المناعية توفر طريقة قوية لفحص تعبير البروتين ، إلا أن العدد المحدود من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا في الزرد يقيد تطبيق التلطيخ. يستخدم التهجين في الموقع على نطاق واسع في أجنة الزرد للكشف عن تعبير mRNA. يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية لأقسام أجنة الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتصوير تشريح واحد بعد التهجين في الموقع . البروتوكول مفيد لكشف نمط التعبير لجينين ، أولا عن طريق الكشف عن النسخ في الموقع ثم عن طريق الكيمياء الهيستولوجية المناعية ضد بروتين في نفس القسم.
Introduction
الزرد هو نموذج قوي للفقاريات لدراسات التنمية وعلم الوراثة1،2. يشترك الزرد والبشر في التماثل الجيني العالي (70٪ من الجينات مشتركة مع الجينوم البشري) ، مما يسمح باستخدامه كنموذج للأمراض البشرية3. في الزرد ، من الشائع جدا اكتشاف أنماط التعبير عن جينين وعلاقتهما المكانية. تم استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية لأول مرة في عام 1941 للكشف عن مسببات الأمراض في الأنسجة المصابة عن طريق تطبيق الأجسام المضادة التي تحمل علامة FITC4. يتم تمييز البروتين المستهدف في قسم الأنسجة أولا بجسم مضاد أولي ، ثم يتم تمييز القسم بجسم مضاد ثانوي ضد أنواع الغلوبولين المناعي المضيف للجسم المضاد الأساسي. تلطيخ الأجسام المضادة هو نهج قوي للكشف عن توطين البروتينات ، والذي يوفر دقة بصرية عالية على المستوى داخل الخلايا. ومع ذلك ، فإن عدد الأجسام المضادة المتاحة محدود للغاية في الزرد. أظهرت دراسة حديثة أن ما يقرب من 112000 جسم مضاد متاح تجاريا للفئران. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عددا قليلا جدا من الأجسام المضادة يمكن الاعتماد عليها في الزرد5.
بدلا من ذلك ، في الزرد ، تم تطبيق التهجين في الموقع على نطاق واسع لتحليل نمط التعبير الجيني. تم استخدام هذه الطريقة لأول مرة لتقييم التعبير الجيني في أجنة ذبابة الفاكهة في ثمانينيات القرن العشرين 6,7 ، ومنذ ذلك الحين ، تم تطوير هذه التكنولوجيا وتحسينها باستمرار. في البداية ، تم استخدام مجسات الحمض النووي ذات العلامات الإشعاعية للكشف عن نسخ mRNA. ومع ذلك ، كانت الدقة المكانية منخفضة نسبيا ، وكانت هناك مخاطر صحية محتملة ناجمة عن النشاط الإشعاعي. بعد ذلك ، يعتمد التهجين في الموقع على مجسات الحمض النووي الريبي الموسومة بالديجوكسيجينين (DIG) أو الفلوريسئين (Fluo) ، والتي يتم اقترانها بالفوسفاتيز القلوي (AP) أو يتم اكتشافها بواسطة تضخيم إشارة التيراميد الفلوري (TSA) 8,9. على الرغم من استخدام TSA للكشف عن جينين أو ثلاثة جينات ، إلا أن وضع العلامات على DIG لتحقيقات الحمض النووي الريبي والأجسام المضادة المترافقة antiDIG AP لا تزال مناهج حساسة للغاية ومستقرة ومستخدمة على نطاق واسع للتهجين في الموقع. لذلك ، فإن الأجسام المضادة التجارية جنبا إلى جنب مع المجسات في الموقع التي تحمل علامة DIG مفيدة لتوفير نظرة ثاقبة حول توطين البروتين والتعبير عن جين واحد.
لا يمكن للأجنة الكاملة أن تكشف عن العلاقة المكانية بين الجينات بسبب الدقة البصرية المنخفضة ، على الرغم من أن أجنة الزرد صغيرة وشفافة10. وبالتالي ، فإن التقسيم ضروري لتحليل أنماط التعبير عن الجينات على المستوى داخل الخلايا. تم استخدام التشريح بالتبريد على نطاق واسع في الزرد لأنه سهل الأداء ويمكن أن يحافظ على المستضد بشكل فعال. لذلك ، يوفر التهجين في الموقع جنبا إلى جنب مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية في عمليات التبريد لأسماك الزرد طريقة قوية لتحليل أنماط التعبير لجينين. تم تطبيق مزيج من التهجين في الموقع والكيمياء المناعية على الزرد11. ومع ذلك ، تم استخدام علاج البروتيناز K لتعزيز تغلغل المسبار على حساب سلامة المستضد. للتغلب على هذا القيد ، يستخدم هذا البروتوكول التسخين للحث على استرجاع المستضد. لا ينطبق هذا البروتوكول فقط على الأجنة ذات المراحل المختلفة وأقسام الأنسجة ذات السماكات المختلفة (أقسام الرأس 14 ميكرومتر وأقسام الحبل الشوكي 20 ميكرومتر) ، ولكن تم التحقق منه أيضا باستخدام الجينات المعبر عنها في عضوين ، بما في ذلك الرأس والحبل الشوكي.
سوف تصف هذه المقالة كيفية الجمع بين التهجين في الموقع وتلطيخ الأجسام المضادة في أجنة الزرد في عمليات التبريد. يتم إثبات تنوع هذا البروتوكول باستخدام عدد من تركيبات التهجين والكيمياء الهيستولوجية المناعية في الموقع ، بما في ذلك مجسات التهجين في الموقع لخليتين عصبيتين مختلفتين. هذه الطريقة مناسبة للكشف عن mRNA والبروتين في مناطق مختلفة والأجنة من مختلف الأعمار ، وكذلك أنماط التعبير عن جينين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة نانتونغ (رقم S20191210-402).
1. مجموعة من أجنة الزرد
- قم بإعداد زوج من أسماك الزرد في أحواض تربية في الليلة السابقة لجمع البيض ، أحدهما من الزرد المعدل وراثيا والآخر من نوع الزرد البري AB (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB من النوع البري أو Tg (hb9: egfp) X AB من النوع البري) (انظر جدول المواد). استخدم حاجزا بلاستيكيا قطريا لفصل الذكر والأنثى لمنع الوصول المادي. في اليوم التالي ، قم بتركيب الجزء العلوي من خزان التربية في جزء سفلي نظيف مملوء بالمياه العذبة ، وقم بإزالة مقسم خزان التكاثر. اترك السمك يتزاوج لمدة 10-20 دقيقة ، واجمع البيض بعد غرقه في قاع حوض التكاثر.
- استزراع الأجنة في وسط الجنين E3 (انظر جدول المواد) التي تحتوي على أزرق الميثيلين (1 مل من 0.05٪ أزرق الميثيلين في 1 لتر من وسط الجنين E3) عند 28.5 درجة مئوية.
- عالج الأجنة في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) باستخدام phenylthiourea (PTU ، انظر جدول المواد) لمنع تكوين الصباغ.
ملاحظة: تستخدم الحيوانات من كلا الجنسين في التجارب.
2. التهجين في الموقع
ملاحظة: المياه المستخدمة في الخطوات 2.1-2.11 هي مياه معالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) (انظر جدول المواد).
- إصلاح ~ 10 أجنة مع 0.5-1 مل من بارافورمالدهايد الطازج 4٪ (PFA ، انظر جدول المواد) في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل عند 4 درجات مئوية طوال الليل لمدة 12-14 ساعة.
ملاحظة: عدل بروتوكول التهجين في الموقع تعديلا طفيفا من الأدبيات المنشورةسابقا 12. يجب تحضير PFA طازجا وتخزينه عند 4 درجات مئوية في غضون أسبوع واحد من الاستخدام أو لمدة شهر واحد عند -20 درجة مئوية. تم تنفيذ جميع الخطوات التالية في التهجين في الموقع باستخدام أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 مل. - استخدم الملقط لإزالة جلد الأجنة التي يزيد عمرها عن 48 حصانا فقط.
ملاحظة: تتم إزالة الجلد لتسهيل تغلغل مجسات الحمض النووي الريبي في منطقة جذع الأجنة التي يزيد عمرها عن 48 hpf. - قم بتجفيف الأجنة تدريجيا عن طريق غسلها ب 25٪ و 50٪ و 75٪ ميثانول في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.1٪ Tween-20 على التوالي (PBST ، انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأجنة لمدة 5 دقائق في ميثانول 100٪ في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأجنة في ميثانول 100٪ عند -20 درجة مئوية لمدة ليلة على الأقل لمدة 12-14 ساعة.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة المجففة في ميثانول 100٪ عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. - إعادة ترطيب الأجنة تدريجيا عن طريق الغسيل باستخدام 75٪ و 50٪ و 25٪ من الميثانول في PBST على التوالي لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. اغسل الجنين ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة.
- هضم الأجنة مع 10 ميكروغرام / مل بروتيناز K (انظر جدول المواد) في PBST في درجة حرارة الغرفة (انظر الجدول 1).
- اغسل الأجنة باستخدام PBST لمدة 5 دقائق. نفذ خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات.
- ثبت الأجنة المغسولة في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذه الخطوة توقف الهضم لأن PFA يعطل البروتيناز K. تأكد من خلط العينة بلطف لتعريض جميع الأجنة ل PFA ؛ يمكن وضع الأنابيب على جوانبها لتوزيع الأجنة بالتساوي في المحلول. لا يجب أن يكون PFA طازجا (يمكن تبريده لمدة تصل إلى 2 أسابيع). - اغسل الجنين ثلاث مرات باستخدام PBST ، واحتضانه لمدة 5 دقائق أثناء كل غسلة.
- إجراء التهجين المسبق للأجنة عن طريق الحضانة بمحلول ما قبل التهجين (preHYB ، انظر جدول المواد) عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استبدل preHYB بمحلول التهجين (HYB ، انظر جدول المواد) وقم بالتهجين المسبق لمدة 4 ساعات على الأقل في HYB.
ملاحظة: قبل الشروع في التهجين المسبق ، سخن المحاليل مسبقا إلى 65 درجة مئوية. يستخدم Formamide (انظر جدول المواد) للحفاظ على شكل وهيكل الأنسجة. يمنع Formamide أيضا ارتباط الشظايا غير المتماثلة في درجات حرارة منخفضة. - سخني المسبار (Insm1a أو 5-HT2C) في HYB لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية قبل إضافته إلى الأجنة. استخدم المسبار عند 1 ميكروغرام / مل HYB. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من preHYB دون السماح للأجنة بالتلامس مع الهواء ، وأضف مسبارا مسخنا مسبقا في HYB إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة.
ملاحظة: يمكن استخدام مسبار الحمض النووي الريبي المسمى للتهجين مع تسلسل mRNA المستهدف في الأجنة. لذلك ، يمكن استخدام المسبار للكشف عن التعبير عن الجين محل الاهتمام وموقع mRNA. - اسمح للمسبار بالتهجين طوال الليل (12-14 ساعة) عند 50-70 درجة مئوية.
ملاحظة: تختلف درجة حرارة التهجين باختلاف المجسات. - في اليوم التالي ، قم بشفط محلول المسبار باستخدام ماصة وتخزينه في أنبوب عند -20 درجة مئوية بحيث يمكن إعادة استخدامه عدة مرات.
- اغسل الأجنة على النحو التالي:
- اغسل الأجنة لمدة 15 دقيقة باستخدام HYB بنسبة 100٪ عند 65 درجة مئوية.
- اغسل الأجنة بالتتابع باستخدام 75٪ و 50٪ و 25٪ HYB في 2x سترات ملحية قياسية تحتوي على 0.1٪ Tween-20 (SSCT ، انظر جدول المواد) لمدة 15 دقيقة لكل منهما عند 65 درجة مئوية.
- اغسل الأجنة لمدة 15 دقيقة في 2x SSCT عند 65 درجة مئوية.
- اغسل الأجنة لمدة 15 دقيقة في 0.2x SSCT عند 65 درجة مئوية.
- اغسل الأجنة مرتين لمدة 10 دقائق في محلول حمض الماليك الذي يحتوي على 0.02٪ Tween-20 (MABT ، انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة.
- سد الأجنة المهجنة والمغسولة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول مانع بنسبة 2٪ -1 (انظر جدول المواد).
- استبدل محلول الحجب -1 بمضاد الديغوكسيجينين AP (تخفيف 1: 4000 ، انظر جدول المواد) في محلول مانع جديد بنسبة 2٪ -1 ورجه طوال الليل لمدة 12-14 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الأجنة أربع مرات لمدة 30 دقيقة في MABT في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بإزالة BM الأرجواني (انظر جدول المواد) من الثلاجة أثناء الغسيل الثالث ورجه من حين لآخر أثناء الغسلات اللاحقة. - اغسل الأجنة مرتين لمدة 10 دقائق في NTMT (0.1 م Tris-HCl ، 0.1 M NaCl ، 1٪ Tween-20 ، انظر جدول المواد).
- استخدم ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من NTMT من الأجنة. استبدل بركيزة BM الأرجواني AP وقم بتلطيخ الأجنة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. راقب تغيرات اللون كل 30 دقيقة للتحكم في درجة الصباغة.
ملاحظة: يختلف وقت الصباغة المحدد ويحتاج إلى تعديل وفقا لكل مسبار. يمكن أن يؤدي احتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية إلى تسريع التفاعل. يمكن أن يؤدي احتضان الأجنة عند 4 درجات مئوية إلى زيادة وقت رد الفعل ويمكن إجراؤه بين عشية وضحاها. - بمجرد تطويره إلى الحد المطلوب ، أوقف التفاعل عن طريق الشطف لفترة وجيزة باستخدام NTMT مرتين. بعد التهجين في الموقع ، شطف الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة.
3. التضمين
- اغمر الأجنة في 5٪ سكروز في 1x PBS (انظر جدول المواد) طوال الليل لمدة 12-14 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قم بتغيير المحلول الذي يغطي الأجنة إلى 15٪ سكروز في 1x PBS واحتضانه طوال الليل لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- تغيير المحلول الذي يغطي الأجنة إلى 30٪ سكروز في 1x PBS واحتضانه لمدة 1-2 أيام عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: احتضان في هذا المحلول حتى تغرق الأجنة في قاع الأنبوب. - املأ جهاز التبريد بوسط درجة حرارة القطع المثلى (OCT) (انظر جدول المواد). انقل الأجنة في 30٪ سكروز إلى cryomold باستخدام وسط OCT. حركهم لإزالة السكروز من الأجنة.
- انقل الأجنة إلى cryomold جديد للأنسجة واملأه برفق بوسط OCT ، وتجنب تكوين الفقاعات.
- اغمر كل جنين ، وادفعه إلى قاع القالب البردي ، وضع كل جنين في الاتجاه المطلوب (إما الظهري البطني أو الجانبي). الحفاظ على الأجنة في خط مستقيم.
ملاحظة: يوصى بشدة بوضع جنين واحد فقط في كل كريومولد (انظر جدول المواد). - ضع الأجنة المضمنة في قوالب التبريد في حمام الإيثانول المثلج الجاف.
- يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل على الأقل لمدة 12-14 ساعة.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بقوالب التبريد عند -80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
4. التشريح بالتبريد
- اضبط عمليات التقطيع بالتبريد باستخدام cryostat على -20 درجة مئوية.
- قم بإزالة كتلة العينة من cryomold وضعها في cryostat. ضع وسط OCT على قاعدة الظرف المبرد وضع الكتلة في الأعلى.
- تأكد من أن كتلة العينة موازية لشفرة الحلاقة. قم بقص وسط OCT الزائد بعناية حول العينة.
- تقطع إلى أقسام بسمك 12-20 ميكرومتر باستخدام cryostat. انقل الأقسام بسرعة إلى شرائح زجاجية بحيث تحتوي كل شريحة على 3-4 أقسام. اسمح للعينات بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزين الأقسام في صندوق منزلق مغلق عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
5. تلطيخ المناعة
ملاحظة: يتم إجراء تلطيخ GFP على الأقسام.
- اغسل الشرائح التي تحتوي على الأقسام باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- تسخين العازلة سترات حتى الغليان في الميكروويف.
- ضع الشرائح في المخزن المؤقت واستمر في التسخين للحفاظ على المحلول بالقرب من الغليان لمدة 20 دقيقة تقريبا.
ملاحظة: تساعد هذه الخطوة في استرجاع المستضد. تظل الأنسجة سليمة حتى في درجات الحرارة العالية ، مما يحسن جودة التلوين عن طريق منع طي الأنسجة أو تلفها أو انفصالها. - دع العينات تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الخطوة التالية. قم بتصريف المحلول الزائد ، وجفف المنطقة المحيطة بكل قسم بعناية بقطعة من الأنسجة ، وارسم دائرة حول القسم بقلم طارد للماء (انظر جدول المواد) لتشكيل حاجز كاره للماء. احرص على عدم تجفيف أقسام الأنسجة.
- اغسل الشرائح مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، واحتضانها لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة.
- كتلة لمدة 2 ساعة في حجب الحل -2 (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة.
- محلول الأجسام المضادة الأولية للماصة (الفأر أحادي النسيلة α-GFP ، 1: 250 ، انظر جدول المواد) لكل شريحة واحتضان الشرائح في صندوق رطب مناعي كيميائي عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، واحتضانها لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة.
- استنزاف PBS الزائدة. احتضان الشرائح بالجسم المضاد الثانوي المناسب (1: 400 ، انظر جدول المواد) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في PBS.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، واحتضانها لمدة 10 دقائق أثناء كل غسلة.
- قم بتصريف PBS الزائد ، وقم بسحب وسيط التثبيت على الشريحة ، وقم بتركيبه باستخدام غطاء منزلق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص نمط التعبير ل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي. مستقبل 5-HT2C هو نوع فرعي من مستقبلات 5-HT المرتبطة بالناقل العصبي السيروتونين (5-هيدروكسي تريبتامين ، 5-HT). يتم توزيعه على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ويمكن أن ينظم بشكل كبير مجموعة متنوعة من وظائف الدماغ ، بما في ذلك الشهية والمزاج والقلق والسلوك الإنجابي13. تم الكشف عن التعبير عن 5-HT2C في الجهاز العصبي المركزي بواسطة الخط المعدل وراثيا Tg (foxp2: egfp-caax) ، حيث يتم تمييز الخلايا العصبية foxP2 بواسطة بروتين الفلورسنت الأخضر الفلوريسئين (GFP). لم يتم التعبير عن GFP في الزرد من النوع البري ولكن فقط في الخط المعدل وراثيا. يمكن استخدام الكشف المتزامن عن التعبير عن الحمض النووي الريبي (5-HT2C ، مسبار htr2c ، الشكل 2A) والبروتين (GFP ، antiGFP ، الشكل 2B) لتحليل التمركز المشترك للبروتين والحمض النووي الريبوزي المرسال.
تم تحديد 1a المرتبط بورم الأنسولين (insm1a) ، وهو عامل نسخ إصبع الزنك ، لأول مرة من مكتبة الحد من الورم ولعب العديد من الوظائف في تكوين وتمايز الجهاز العصبي المركزي والمحيطي للفقاريات ونظام الغدد الصم العصبية. أظهرت الدراسات الحديثة أن insm1a هو منظم مهم لتطور الخلايا العصبية الحركية. تم الكشف عن التعبير عن insm1a في الحبل الشوكي الزرد والخلايا العصبية الحركية بواسطة الخط المعدل وراثيا Tg (hb9: egfp) ، حيث يتم تمييز الخلايا العصبية hb9 بواسطة fluorescein GFP. لم يتم التعبير عن GFP في الزرد من النوع البري ولكن فقط في الخط المعدل وراثيا. يمكن استخدام الكشف المتزامن عن التعبير عن الحمض النووي الريبي (insm1a ، مسبار insm1a ، الشكل 3A) والبروتين (GFP ، antiGFP ، الشكل 3B) لتحليل التمركز المشترك للبروتين والحمض النووي الريبي المرسال. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح للكشف عن التمركز المشترك للبروتين والحمض النووي الريبي لفهم علاقتهما المكانية.
الشكل 1: الخطوط العريضة للطريقة. يعرض هذا المخطط الانسيابي سير عمل تجريبي. يمكن إكمال سير العمل في غضون 9 أيام على الأقل (راجع عدد الأيام في الزاوية اليمنى العليا من كل مرحلة في سير العمل) ، على الرغم من أنه يمكن إكمال بعض الخطوات في فترة أطول ، كما هو موضح في البروتوكول. الاختصارات: PFA = بارافورمالدهيد. O / N = بين عشية وضحاها ؛ RT = درجة حرارة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أجنة كاملة التركيب ملطخة بمسبار 5-HT2C وجسم مضاد GFP في Tg (foxP2: egfp-caax). تظهر الصور ذات المجال الساطع (A) والفلورسنت (B) والصور المدمجة (C) تعبير 5-HT2C (مسبار htr2c ، A) و GFP (antiGFP ، B) في الخلايا العصبية foxP2 والمسالك المحورية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: أجنة كاملة التركيب ملطخة بمسبار insm1a وجسم مضاد GFP في Tg (hb9: egfp). تظهر الصور ذات المجال الساطع (A) والفلورسنت (B) والصور المدمجة (C) تعبير insm1a (مسبار insm1a ، A) و GFP (مضاد GFP ، B) في الخلايا العصبية hb9. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الاجنه | الوقت |
| 24 حصان | 2 دقيقة |
| 30 حصان | 3 دقائق |
| 36 حصان | 5 دقائق |
| 48 حصان | 10 دقائق |
| 72 حصان | 15 دقيقة |
| 96 حصان | 45 دقيقة |
| 4-5 dpf | 60 دقيقة |
الجدول 1: وقت هضم البروتيناز K لأجنة الزرد. الاختصارات: hpf = ساعات بعد الإخصاب. dpf = أيام بعد الإخصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقترح هذا البروتوكول مزيجا من التهجين في الموقع والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وهي خطوة مهمة في تجارب التوطين المشترك على أجنة الزرد. تعمل هذه الطريقة كطريقة سهلة وفعالة لتحليل mRNA واحد وبروتين واحد في وقت واحد. تم إجراء التهجين في الموقع وتلطيخ الأجسام المضادة على أجنة الزرد. على عكس العديد من البروتوكولات المنشورة سابقا14،15،16 ، تم استخدام التألق المناعي والكيمياء الهيستولوجية المناعية لاستكشاف تعبير البروتين. تم التحقق من صحة عدد قليل من الأجسام المضادة الخاصة بأسماك الزرد بشكل مناسب لاستخدامها في القسم17. استخدمت الدراسات السابقة تقنية واحدة فقط: التألق المناعي أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية أو التهجين في الموقع. إن الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتين يتغلب على قيود أي تقنية واحدة. كانت الخطوة الأولى هي التهجين في الموقع ، والذي يحمي الرنا المرسال بشكل كبير من التدهور. تم استرجاع المستضد عن طريق التسخين لتجنب الاضطراب عن طريق علاج البروتيناز K لربط الأجسام المضادة أثناء التلوين المناعي الكيميائي. ما إذا كان هذا النهج يعمل مع جميع المستضدات سيتطلب المزيد من الاختبارات. أظهرت صور الأقسام أن مستقبل 5-HT2C تم التعبير عنه في الخلايا العصبية foxP2 وأن مستقبل insm1a تم التعبير عنه في الخلايا العصبية hb9.
يحافظ التهجين الكامل في الموقع بشكل كبير على سلامة العينات. يمكن أن يؤدي التهجين في الموقع متبوعا بالتقسيم إلى تقليل وقت الحضانة لتلطيخ الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد تلطيخ الأجسام المضادة بعد التهجين في الموقع في تجنب التبريد الفلوري.
الخطوات المحددة التالية ضرورية لنجاح التجربة. الخطوة الأولى الحاسمة هي إعادة إصلاح الجنين في 4٪ PFA. توقف هذه الخطوة تفاعل بروتيناز K لأن PFA يعطل بروتيناز K. يجب خلط العينات بلطف لتعريض جميع الأجنة إلى PFA ؛ يمكن أيضا وضع الأنبوب على جانبه بحيث يتم توزيع الأجنة بالتساوي في المحلول. الخطوة الثانية الحاسمة هي علاج الجنين أثناء زرع OCT. يجب ترتيب الأجنة في اتجاه معين (إما ظهري بطني أو جانبي) ، مع إبقائها مستقيمة بحيث يمكن تقطيعها إلى أقسام من نفس المنطقة تقريبا لجميع الأجنة. تستخدم إبرة صغيرة لعمل حركات صغيرة واعية في وسط OCT اللزج لتحديد موقع الجنين وإزالة الفقاعات.
هناك العديد من التعديلات المحتملة التي يمكن تطبيقها على السيناريو الموصوف. يمكن تحديد وقت هضم البروتيناز K في التهجين الموضعي وفقا لمراحل النمو المختلفة لأجنة الزرد (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، فإن سمك عمليات التجميد مرن للغاية ويمكن تحديده وفقا للمتطلبات التجريبية. في حين أنه من المتوقع أن يكون هذا النهج مناسبا لمجموعة واسعة من التجارب ، إلا أن له بعض القيود المحتملة. يعتمد التنفيذ الناجح لهذا الإجراء على الحفاظ على عينة كاملة من خلال تجربتين متتاليتين. هناك العديد من نقاط التوقف المحتملة في هذا البروتوكول. يمكن تخزين الأجنة المجففة في محلول السكروز بنسبة 30٪ عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر14. وبالمثل ، يمكن تخزين الشرائح المعدة في صندوق شرائح عند -20 درجة مئوية لأكثر من 1 سنة14. يمكن تخزين الكتل المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة ثلاثة أشهر.
وقد ثبت أن هذا البروتوكول للتهجين في الموقع جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية ينجح في الكشف عن تعبير 5-HT2C و insm1a في أجنة الزرد ويمكن تطبيقه بسهولة على مجموعة متنوعة من الأنسجة في مراحل النمو المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية ، مما يوفر نهجا استقصائيا قويا لعلماء الأعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة نانتونغ للعلوم والتكنولوجيا في الصين (MS12019011) ، ومؤسسة نانتونغ للعلوم والتكنولوجيا في الصين (JC2021058) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
