Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man kan ta bilder ved å kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi av sebrafiskens embryonale seksjoner. In situ hybridisering ble utført før kryoseksjonering, etterfulgt av antistofffarging. Det er nyttig å påvise uttrykksmønstre av to gener hos sebrafisk hvis det er mangel på antistoffer.
Abstract
Som virveldyr har sebrafisken vært mye brukt i biologiske studier. Sebrafisk og mennesker deler høy genetisk homologi, noe som gjør det mulig å bruke det som en modell for menneskelige sykdommer. Genfunksjonsstudie er basert på påvisning av genuttrykksmønstre. Selv om immunhistokjemi tilbyr en kraftig måte å analysere proteinuttrykk på, begrenser det begrensede antallet kommersielt tilgjengelige antistoffer i sebrafisk anvendelsen av costaining. In situ hybridisering er mye brukt i sebrafiskembryoer for å oppdage mRNA-uttrykk. Denne protokollen beskriver hvordan man kan ta bilder ved å kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi for sebrafiskembryoseksjoner. In situ hybridisering ble utført før kryoseksjonering, etterfulgt av antistofffarging. Immunhistokjemi og avbildning av et enkelt kryosnitt ble utført etter in situ hybridisering. Protokollen er nyttig for å avdekke ekspresjonsmønsteret til to gener, først ved in situ transkriptdeteksjon og deretter ved immunhistokjemi mot et protein i samme seksjon.
Introduction
Sebrafisken er en kraftig virveldyrmodell for studier av utvikling og genetikk 1,2. Sebrafisk og mennesker deler høy genetisk homologi (70% av genene deles med det menneskelige genomet), noe som gjør det mulig å bruke det som en modell for menneskelige sykdommer3. Hos sebrafisk er det ganske vanlig å oppdage uttrykksmønstrene til to gener og deres romlige forhold. Immunhistokjemi ble først brukt i 1941 for å oppdage patogener i infisert vev ved å bruke FITC-merkede antistoffer4. Målproteinet i vevsseksjonen merkes først med et primært antistoff, og seksjonen blir deretter merket med et sekundært antistoff mot det primære antistoffets vertsart immunoglobulin. Antistofffarging er en robust tilnærming for å oppdage lokalisering av proteiner, som gir høy optisk oppløsning på intracellulært nivå. Antallet tilgjengelige antistoffer er imidlertid svært begrenset hos sebrafisk. En fersk studie viser at omtrent 112 000 antistoffer er kommersielt tilgjengelige for mus; Imidlertid har svært få antistoffer vist seg å være pålitelige i sebrafisk5.
I stedet, i sebrafisk, har in situ hybridisering blitt mye brukt for analyse av genuttrykksmønster. Denne metoden ble først brukt til å vurdere genuttrykk i Drosophila-embryoer på 1980-tallet6,7, og siden da har denne teknologien blitt kontinuerlig utviklet og forbedret. I utgangspunktet ble radiomerkede DNA-prober brukt til å oppdage mRNA-transkripter; Den romlige oppløsningen var imidlertid relativt lav, og det var potensielle helserisikoer forårsaket av radioaktiviteten. Deretter er in situ-hybridisering avhengig av RNA-probene merket med digoksigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), som er konjugert til alkalisk fosfatase (AP) eller detektert ved fluorescerende tyramidsignalforsterkning (TSA) 8,9. Selv om TSA har blitt brukt til å oppdage to eller tre gener, er DIG-merking av RNA-prober og antiDIG AP-konjugert antistoff fortsatt svært følsomme, stabile og mye brukte tilnærminger for in situ hybridisering. Derfor er kommersialiserte antistoffer kombinert med DIG-merkede in situ-sonder nyttige for å gi innsikt i proteinlokalisering og ekspresjon av ett gen.
Helmonterte embryoer kan ikke avsløre det romlige forholdet mellom gener på grunn av den lave optiske oppløsningen, selv om sebrafiskembryoer er små og gjennomsiktige10. Derfor er seksjonering nødvendig for å analysere ekspresjonsmønstrene til gener på intracellulært nivå. Kryoseksjonering har vært mye brukt i sebrafisk, da det er lett å utføre og effektivt kan bevare antigenet. Derfor tilbyr in situ-hybridisering kombinert med immunhistokjemi i sebrafiskkryoseksjoner en kraftig måte å analysere uttrykksmønstrene til to gener på. En kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi er anvendt på sebrafisk11. Imidlertid ble proteinase K-behandling brukt til å forbedre sondepenetrasjonen på bekostning av antigenintegritet. For å overvinne denne begrensningen bruker denne protokollen oppvarming for å indusere antigeninnhenting. Denne protokollen gjelder ikke bare embryoer av forskjellige stadier og vevsseksjoner av forskjellige tykkelser (14 μm hodeseksjoner og 20 μm ryggmargsseksjoner), men den har også blitt verifisert ved å bruke gener uttrykt i to organer, inkludert hodet og ryggmargen.
Denne artikkelen vil beskrive hvordan man kombinerer in situ hybridisering og antistofffarging i sebrafiskembryoer i kryoseksjoner. Allsidigheten til denne protokollen er demonstrert ved å bruke en rekke in situ hybridisering-immunhistokjemi kombinasjoner, inkludert in situ hybridiseringsprober for to forskjellige nevroner. Denne metoden er egnet for å oppdage mRNA og protein i forskjellige regioner og embryoer av forskjellige aldre, samt uttrykksmønstrene til to gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Innsamling av sebrafiskembryoer
- Sett opp et par sebrafisk i avlstanker kvelden før eggene skal hentes, den ene en transgen sebrafisk og den andre en AB villtype sebrafisk (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB villtype eller Tg (hb9:egfp) X AB villtype) (se materialfortegnelsen). Bruk en diagonal plastskillevegg for å skille mann og kvinne for å utelukke fysisk tilgang. Neste dag, sett den øvre delen av avlstanken inn i en ren nedre del fylt med ferskvann, og fjern skillelinjen til avlstanken. La fisken pare seg i 10-20 min, og samle eggene etter at de har sunket til bunnen av avlstanken.
- Dyrkning av embryoene i E3 embryomedium (se materialtabellen) som inneholder metylenblått (1 ml 0,05 % metylenblått i 1 l E3 embryomedium) ved 28,5 °C.
- Behandle embryoene ved 24 timer etter befruktning (hpf) med fenyltiourea (PTU, se materialtabellen) for å forhindre pigmentdannelse.
MERK: Dyr av begge kjønn brukes i eksperimenter.
2. In situ hybridisering
MERK: Vannet som brukes i trinn 2.1-2.11 er dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann (se materialfortegnelsen).
- Fiks ~10 embryoer med 0,5-1 ml ferskt 4% paraformaldehyd (PFA, se materialtabellen) i et 1,5 ml mikrofugerør ved 4 °C over natten i 12-14 timer.
MERK: Protokollen for in situ hybridisering er noe modifisert fra tidligere publisert litteratur12. PFA må tilberedes og oppbevares ved 4 °C innen en uke etter bruk eller i en måned ved -20 °C. Alle de følgende trinnene in situ hybridisering ble utført ved bruk av 1,5 ml mikrofugerør. - Bruk pinsett for å fjerne huden på bare embryoer eldre enn 48 hpf.
MERK: Huden fjernes for å lette penetrasjonen av RNA-sonder i bagasjerommet av embryoer eldre enn 48 hpf. - Dehydrer embryoene gradvis ved å vaske med 25%, 50% og 75% metanol i 1x fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 suksessivt (PBST, se materialtabellen) i 5 minutter hver ved romtemperatur. Vask deretter embryoene i 5 minutter i 100% metanol ved romtemperatur. Inkuber embryoene i 100% metanol ved -20 ° C i minst over natten i 12-14 timer.
MERK: Dehydrerte embryoer kan lagres i 100% metanol ved -20 °C i 6 måneder. - Rehydrer embryoene gradvis ved å vaske med 75%, 50% og 25% metanol i PBST suksessivt i 5 minutter hver ved romtemperatur. Vask embryoet tre ganger med PBST i 5 minutter hver ved romtemperatur.
- Fordøy embryoene med 10 μg/ml proteinase K (se materialtabellen) i PBST ved romtemperatur (se tabell 1).
- Vask embryoene med PBST i 5 minutter. Utfør dette vasketrinnet tre ganger.
- Refiks de vaskede embryoene i 4% PFA i 15 minutter ved romtemperatur.
MERK: Dette trinnet stopper fordøyelsen fordi PFA inaktiverer proteinase K. Sørg for at prøven blandes forsiktig for å utsette alle embryoene for PFA; Rørene kan plasseres på deres sider for jevnt fordelt embryoer i løsningen. Denne PFA trenger ikke å være frisk (den kan oppbevares i kjøleskap i opptil 2 uker). - Vask embryoet tre ganger med PBST, inkuber i 5 minutter under hver vask.
- Utføre prehybridisering av embryoene ved å inkubere med prehybridiseringsløsning (preHYB, se materialtabellen) ved 65 °C i 5 minutter. Erstatt preHYB med hybridiseringsløsning (HYB, se materialfortegnelsen) og prehybridiser i minst 4 timer i HYB.
MERK: Før du fortsetter med prehybridisering, forvarm oppløsningene til 65 °C. Formamid (se materialfortegnelsen) brukes til å opprettholde vevets form og struktur. Formamid forhindrer også binding av ikke-homologe fragmenter ved lave temperaturer. - Varm sonden (Insm1a eller 5-HT2C) i HYB i 5 minutter ved 95 °C før tilsetning til embryoene. Bruk sonden ved 1 μg/ml HYB. Fjern så mye preHYB som mulig uten å la embryoene komme i kontakt med luften, og tilsett forvarmet sonde i HYB til røret som inneholder embryoene.
MERK: En merket RNA-sonde kan brukes til å hybridisere med en mål-mRNA-sekvens i embryoene. Derfor kan sonden brukes til å oppdage uttrykket av et gen av interesse og plasseringen av mRNA. - La sonden hybridisere over natten (12-14 timer) ved 50-70 °C.
MERK: Hybridiseringstemperaturen er forskjellig for forskjellige sonder. - Neste dag aspirerer sondeoppløsningen med en pipette og oppbevarer den i et rør ved -20 °C slik at den kan gjenbrukes mange ganger.
- Vask embryoene som følger:
- Vask embryoene i 15 minutter med 100 % HYB ved 65 °C.
- Vask embryoene sekvensielt med 75%, 50% og 25% HYB i 2x standard saltvannsitrat inneholdende 0,1% Tween-20 (SSCT, se materialfortegnelsen) i 15 minutter hver ved 65 °C.
- Vask embryoene i 15 minutter i 2x SSCT ved 65 °C.
- Vask embryoene i 15 minutter i 0,2x SSCT ved 65 °C.
- Vask embryoene to ganger i 10 minutter i maleinsyrebuffer inneholdende 0,02% Tween-20 (MABT, se materialtabellen) ved romtemperatur.
- Blokker hybridiserte og vasket embryoer i minst 2 timer ved romtemperatur med 2% blokkerende løsning-1 (se materialtabellen).
- Erstatt blokkeringsoppløsningen-1 med antidigoksigenin AP (1:4,000 fortynning, se materialfortegnelsen) i en frisk 2% blokkerende løsning-1 og rist over natten i 12-14 timer ved 4 ° C.
- Vask embryoene fire ganger i 30 minutter i MABT ved romtemperatur.
MERK: Fjern BM lilla (se materialfortegnelsen) fra kjøleskapet under den tredje vasken og rist den av og til under de påfølgende vaskene. - Vask embryoene to ganger i 10 minutter i NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, se materialtabellen).
- Bruk en pipette for å fjerne så mye NTMT som mulig fra embryoene. Bytt ut med BM lilla AP-substrat og flekk embryoene ved romtemperatur i mørket. Overvåk fargeendringene hvert 30. minutt for å kontrollere fargegraden.
MERK: Den spesifikke fargetiden er forskjellig og må justeres i henhold til hver sonde. Inkubering av embryoene ved 37 °C kan akselerere reaksjonen. Inkubering av embryoene ved 4 °C kan øke reaksjonstiden og kan gjøres over natten. - Når den er utviklet i ønsket grad, stopp reaksjonen ved å skylle kort med NTMT to ganger. Etter in situ hybridisering, skyll embryoene med PBST tre ganger i 20 minutter.
3. Innebygging
- Dypp embryoene i 5% sukrose i 1x PBS (se materialtabellen) over natten i 12-14 timer ved 4 ° C.
- Bytt oppløsningen som dekker embryoene til 15% sukrose i 1x PBS og inkuber over natten i 12-16 timer ved 4 ° C.
- Bytt oppløsningen som dekker embryoene til 30% sukrose i 1x PBS og inkuber i 1-2 dager ved 4 °C.
MERK: Inkuber i denne løsningen til embryoene synker til bunnen av røret. - Fyll en kryomold med optimalt skjæretemperaturmedium (OCT) (se materialfortegnelsen). Overfør embryoene i 30% sukrose til kryomold med OCT medium. Rør dem for å fjerne sukrose fra embryoene.
- Overfør embryoene til en ny kryomold for vev og fyll den forsiktig med OCT-medium, unngå dannelse av bobler.
- Senk hvert embryo, skyv det til bunnen av kryomolden, og plasser hvert embryo i ønsket retning (enten dorsal-ventral eller lateral). Hold embryoene i en rett linje.
MERK: Det anbefales sterkt å plassere bare ett embryo i hver kryomold (se materialfortegnelsen). - Plasser de innebygde embryoene i kryomolds i et etanolbad med tørris.
- Oppbevares ved -80 °C minst over natten i 12-14 timer.
MERK: Kryomoldene kan oppbevares ved -80 °C i minst en måned.
4. Kryoseksjonering
- Sett kryoseksjonene med en kryostat til -20 °C.
- Fjern prøveblokken fra kryomolen og legg den i kryostaten. Plasser OCT medium på undersiden av den kjølte chucken og legg blokken på toppen.
- Forsikre deg om at prøveblokken er parallell med barberbladet. Trim forsiktig av overflødig OCT medium rundt prøven.
- Skjær i 12-20 μm tykke seksjoner ved hjelp av en kryostat. Overfør raskt seksjonene til glassbilder slik at hvert lysbilde har 3-4 seksjoner. La prøvene oppnå romtemperatur, og oppbevar seksjonene i en forseglet lysbildeboks ved -80 °C for senere bruk.
5. Immunfarging
MERK: GFP-farging utføres på seksjonene.
- Vask lysbildene som inneholder seksjonene med PBS i 5 min.
- Varm citratbufferen til koking i mikrobølgeovn.
- Plasser lysbildene i bufferen og fortsett å varme opp for å holde løsningen nær koking i ca. 20 minutter.
MERK: Dette trinnet hjelper i antigen henting. Vevet forblir intakt selv ved høye temperaturer, noe som forbedrer fargekvaliteten ved å forhindre folding, skade eller løsrivelse av vevet. - La prøvene avkjøles sakte til romtemperatur før neste trinn. Tøm overflødig løsning, tørk forsiktig området rundt hver seksjon med et stykke vev, og tegn en sirkel rundt seksjonen med en vannavvisende penn (se materialtabellen) for å danne en hydrofob barriere. Vær forsiktig så du ikke tørker vevsseksjonene.
- Vask lysbildene to ganger med PBS, rug i 10 minutter under hver vask.
- Blokker i 2 timer i blokkeringsløsning-2 (se materialtabellen) ved romtemperatur.
- Pipettes primære antistoffløsning (monoklonal mus α-GFP, 1:250, se materialfortegnelsen) per lysbilde og inkuber lysbildene i en immunhistokjemisk våtboks ved 4 °C over natten.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS, rug i 10 minutter under hver vask.
- Tøm overflødig PBS. Inkuber lysbildene med passende sekundært antistoff (1:400, se materialtabellen) i 1 time ved romtemperatur i PBS.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS, rug i 10 minutter under hver vask.
- Tøm overflødig PBS, pipetter monteringsmediet på lysbildet og monter med et skyvedeksel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen kan brukes til samtidig å undersøke uttrykksmønsteret til ett mRNA og ett protein. Figur 1 viser den eksperimentelle arbeidsflyten. 5-HT2C-reseptoren er en subtype av 5-HT-reseptoren bundet av nevrotransmitteren serotonin (5-hydroksytryptamin, 5-HT). Det er utbredt i sentralnervesystemet (CNS) og kan betydelig regulere en rekke hjernefunksjoner, inkludert appetitt, humør, angst og reproduktiv oppførsel13. Ekspresjonen av 5-HT2C i CNS ble detektert av den transgene linjen Tg (foxp2: egfp-caax), hvor foxP2-nevroner er merket med fluoresceingrønt fluorescerende protein (GFP). GFP ble ikke uttrykt i villtype sebrafisk, men bare i den transgene linjen. Samtidig påvisning av ekspresjonen av RNA (5-HT2C, sonden for htr2c, figur 2A) og protein (GFP, antiGFP, figur 2B) kan brukes til protein- og mRNA-kolokaliseringsanalyse.
Insulinomassosiert 1a (insm1a), en sink-finger transkripsjonsfaktor, ble først identifisert fra tumorreduksjonsbiblioteket og spilte flere funksjoner i dannelsen og differensieringen av virveldyrets sentrale og perifere nervesystem og nevroendokrine system. Nylige studier har vist at insm1a er en viktig regulator for utvikling av motornevron. Ekspresjonen av insm1a i sebrafiskens ryggmarg og motornevroner ble detektert av den transgene linjen Tg (hb9: egfp), der hb9-nevroner er merket med fluorescein GFP. GFP ble ikke uttrykt i villtype sebrafisk, men bare i den transgene linjen. Samtidig påvisning av ekspresjon av RNA (insm1a, sonden for insm1a, figur 3A) og protein (GFP, antiGFP, figur 3B) kan brukes til protein- og mRNA-kolokaliseringsanalyse. Denne protokollen ble vellykket brukt til å oppdage samlokalisering av protein og RNA for å forstå deres romlige forhold.
Figur 1: Disposisjon av metoden. Dette flytskjemaet viser en eksperimentell arbeidsflyt. Arbeidsflyten kan fullføres på minst 9 dager (se antall dager øverst til høyre i hver fase i arbeidsflyten), selv om noen trinn kan fullføres i en lengre periode, som beskrevet i protokollen. Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; O / N = over natten; RT = romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Helmonterte embryoer farget med 5-HT2C sonde og GFP antistoff i Tg (foxP2:egfp-caax). Lysfelt (A), fluorescerende (B) og sammenslåtte bilder (C) viser 5-HT2C (sonden for htr2c, A) og GFP (antiGFP, B) uttrykk i foxP2-nevroner og aksonkanaler. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Helmonterte embryoer farget med insm1a-sonde og GFP-antistoff i Tg (hb9:egfp). Lysfelt (A), fluorescerende (B) og sammenslåtte bilder (C) viser insm1a (sonden for insm1a, A) og GFP (anti-GFP, B) uttrykk i hb9-nevroner. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Embryo | Tid |
| 24 hk | 2 min |
| 30 hk | 3 min |
| 36 hk | 5 min |
| 48 hk | 10 min |
| 72 hk | 15 min |
| 96 hk | 45 min |
| 4-5 dpf | 60 min |
Tabell 1: Proteinase K fordøyelsestid for sebrafiskembryoer. Forkortelser: hpf = timer etter befruktning; DPF = dager etter befruktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen foreslår en kombinasjon av in situ hybridisering og immunhistokjemi, et viktig skritt i samlokaliseringsforsøkene på sebrafiskembryoer. Denne metoden fungerer som en enkel og effektiv måte å samtidig analysere ett mRNA og ett protein. In situ hybridisering og antistofffarging ble utført på sebrafiskembryoer. I motsetning til flere protokoller publisert tidligere14,15,16, ble immunfluorescens og immunhistokjemi brukt til å utforske proteinuttrykk. Få sebrafiskspesifikke antistoffer er tilstrekkelig validert for bruk i avsnitt17. Tidligere studier har bare brukt én teknikk: immunfluorescens, immunhistokjemi eller in situ hybridisering. Kombinere in situ hybridisering og immunhistokjemi for å analysere RNA og protein overvinner begrensningene i en hvilken som helst teknikk. Det første trinnet var in situ hybridisering, som i stor grad beskytter mRNA mot nedbrytning. Antigenuthenting ble indusert ved oppvarming for å unngå forstyrrelse ved proteinase K-behandling av antistoffbinding under immunhistokjemisk farging. Hvorvidt denne tilnærmingen fungerer for alle antigener, vil kreve ytterligere testing. Bilder av seksjonene viste at 5-HT2C-reseptoren ble uttrykt i foxP2-nevroner og at insm1a-reseptoren ble uttrykt i hb9-nevroner.
Helmontert in situ hybridisering bevarer i stor grad integriteten til prøvene. In situ hybridisering etterfulgt av snitting kan redusere inkubasjonstiden for antistofffarging. I tillegg kan antistofffarging etter in situ hybridisering bidra til å unngå fluorescensslukking.
Følgende spesifikke trinn er avgjørende for at eksperimentet skal lykkes. Det første kritiske trinnet er å refikse embryoet i 4% PFA. Dette trinnet stopper proteinase K-reaksjonen fordi PFA inaktiverer proteinase K. Prøvene skal blandes forsiktig for å utsette alle embryoer for PFA; Røret kan også plasseres på siden slik at embryoene fordeles jevnt i løsningen. Det andre kritiske trinnet er behandlingen av embryoet under OCT-implantasjon. Embryoene skal ordnes i en bestemt retning (enten dorsal-ventral eller lateral), og holde dem rette slik at de kan kuttes i seksjoner fra omtrent samme område for alle embryoer. En liten nål brukes til å lage små, bevisste bevegelser i det viskøse OCT-mediet for å lokalisere embryoet og fjerne bobler.
Det er flere potensielle modifikasjoner som kan brukes på det beskrevne scenariet. Fordøyelsestiden til proteinase K in situ hybridisering kan bestemmes i henhold til de forskjellige utviklingsstadiene til sebrafiskembryoene (tabell 1). I tillegg er tykkelsen på kryoseksjonene svært fleksibel og kan bestemmes i henhold til eksperimentelle krav. Selv om det er spådd at denne tilnærmingen vil være egnet for et bredt spekter av eksperimenter, har den noen potensielle begrensninger. Den vellykkede utførelsen av denne prosedyren avhenger av å opprettholde en komplett prøve gjennom to påfølgende eksperimenter. Det er flere mulige pausepunkter i denne protokollen. De dehydrerte embryoene kan lagres i 30% sukroseoppløsning ved -20 °C i flere måneder14. På samme måte kan de preparerte lysbildene lagres i en lysbildeboks ved -20 °C i mer enn 1 år14. De frosne blokkene kan oppbevares ved -80 °C i tre måneder.
Denne protokollen for in situ hybridisering kombinert med immunhistokjemi har vist seg å være vellykket i å oppdage 5-HT2C og insm1a-uttrykk i sebrafiskembryoer og kan enkelt påføres en rekke vev på forskjellige utviklingsstadier. I tillegg kan denne protokollen brukes på nevroner eller glialceller, noe som gir en robust undersøkelsesmetode for nevrologer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) og Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
